KR20140123553A - 면역원성 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엔. 메닌자이티디스 (N. meningitidis) 혈청군 X로부터의 캡슐형 다당류를 포함하는 면역원성 다당류 단백질 포합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 포합 반응에 의해 제조된 엔. 메닌자이티디스 X 다당류-캐리어 단백질 포합체에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 혈청군 X로부터의 캡슐형 당류 및 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터의 1개 이상의 캡슐형 다당류를 포함하는 다가 수막구균 다당류 단백질 포합체 조성물에 관한 것으로, 여기서 i) 다당류 A, C, W135 및 X는 기계적으로 사이징 (sizing)되는 반면, 다당류 Y는 화학적으로 사이징되고, ii) 모든 당류는 시안화 포합 화학에 의해 링커를 통해 캐리어 단백질에 포합되어 있고, iii) 최종 포합체 중 단백질에 대한 모든 당류의 비율은 0.2와 0.6 사이이고, iv) TT, DT 및 CRM197로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 상이한 캐리어 단백질을 사용한다.

Description

면역원성 조성물{Immunogenic Composition}
나이세리아 메닌자이티디스 (Neisseria meningitidis) (수막구균)은 그람 음성 인간 병원체이다. 이는 뇌수막염 및 간혹 뇌수막염이 없는 패혈증을 야기하는 인두에 콜로니를 형성한다. 이는 비록 수막구균을 명백하게 구분하는 하나의 특징이 모든 병원성 수막구균에 존재하는 다당류 캡슐의 존재이지만, 엔 고노로이에 (N. gonorrhoeae)와 밀접하게 관련되어 있다. 유기체의 캡슐형 다당류에 근거하여, 엔. 메닌자이티디스 (N. meningitidis)의 12개의 혈청군이 확인되었다 (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y 및 Z).
혈청군 A ('MenA')는 사하라 사막 이남의 아프리카에서 전염 질환의 가장 흔한 원인이다. 혈청군 B 및 C는 선진국에서 대부분의 사례에 책임이 있으며, 나머지의 사례는 혈청군 W135 및 Y에 의해 발생된다.
다당류 (PS)만을 사용하는 백신은 비교적 낮은 면역원성을 가진다. 다당류의 비교적 낮은 면역원성을 해결하기 위해, PS 백신을 단백질 캐리어에 포합시켜(conjugating) 어린이들에서 면역원성을 증가시키고 장기간 보호를 제공한다. 수많은 수막구균 포합체 (conjugate) 백신은 이미 승인되어 전세계적으로 판매되고 있다. "나이세리아 메닌자이티디스 포합체"로서 공지된 이러한 백신의 예는, 1가 수막구균 A 포합체 (MenAfriVac), 1가 수막구균 C 포합체 (Meningitec) 및 4가 A C Y W 수막구균 포합체 (Menveo 및 Menactra)이다.
캡슐형 다당류는 분류에 사용될 뿐만 아니라, 예방접종에 사용되어 왔다. 혈청군 A, C, Y 및 W135로부터의 캡슐형 다당류의 주사용 4가 백신은 수년 동안 공지되어 왔고, 인간 사용이 허가되었다. 비록 청소년 및 성인에게 효과적이지만, 이는 불충분한 면역 반응 및 단기간의 보호를 유발하고, 유아에게 사용될 수 없다. Mencevax ACWY™와 Menomune™둘 다는 이들의 동결건조된 형태로부터 한번 재구성될 때 각각 정제 다당류 50μg을 함유한다. 혈청군 A, C, W135 및 Y의 캡슐형 당류를 또한 포합체의 형태로 배합하여 4가 백신, 예를 들면, 특별 Menactra™제품을 제공한다. 또한, 포합된 혈청군 A 다당류는 MenAfriVac™으로서 인간 사용이 승인되었고, 혈청군 C 올리고당류는 Menjugate™, Meningitec™및 NeisVac-C™으로서 인간 사용이 승인되었다.
엔. 메닌자이티디스 혈청군 X 균주는 1960년대에 최초로 개시되었고, 북미, 유럽, 호주 및 중국에서 침습성 수막구균 질환의 몇 가지 경우에서 분리되었다. 엔. 메닌자이티디스 혈청군 X 균주의 발생은 니제르, 케냐 서부 및 북부 가나에서 보고되었다. 엔. 메닌자이티디스 혈청군 X 균주는 영국군 신병 사이에서 콜로니 형성에 매우 효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Abdullah Kilic et al.; Neisseria meningitidis Serogroup X Sequence Type 767 in Turkey; Journal Of Clinical Microbiology, Nov. 2010, p.4340-4341; Vol.48, No.11] 참조). 수많은 아프리카 국가에서의 반복된 대량 예방접종은 혈청군 X 균주로 인한 수막구균 질환에 의한 콜로니 형성에 기여했을 수도 있으며 수막구균 질환의 변화된 프로파일을 야기했을 수도 있는 것으로 보고되었다 (문헌 [Gagneux, S. P et al.; Prospective study of a serogroup X Neisseria meningitidis outbreak in northern Ghana. J. Infect. Dis. 185: 618-626; 2002] 참조).
혈청군 B, C, Y 및 W135 수막구균의 캡슐형 다당류는 시알산 유도체로 이루어져 있다. 혈청군 B 및 C 수막구균은 각각 (α2-8)- 및 (α2-9 239)-연결된 폴리시알산을 발현하는 반면, D-글루코오스 또는 D-갈랄토오스와 시알산의 교대 서열은 혈청군 Y 및 W135 엔. 메닌자이티디스에 의해 발현된다. 대조적으로, 혈청군 A 수막구균의 캡슐은 (α1-6)-연결된 N-아세틸만노스아민 6-포스페이트인 반면, 엔. 메닌자이티디스 혈청군 X는 (α1-4)-연결된 N-아세틸글루코스아민 1-포스페이트의 캡슐형 중합체를 합성한다 (문헌 [Yih-Ling Tzeng et al.; Genetic Basis for Biosynthesis of the (134)-Linked N-Acetyl-D-Glucosamine 1-Phosphate Capsule of Neisseria meningitidis Serogroup X; Infection And Immunity, Dec. 2003, p.6712-6720; Vol.71, No.12] 참조).
기존 수막구균 포합체 백신은 A C Y W135 다당류에 근거한다. 지난 5년 동안 아프리카 뇌수막염 벨트에서의 MenX 질환의 발병률 증가[1,4]는 미래의 전염병을 예방하고 제어하기 위해 선택된 지역에서의 MenX 다당류 포합체 백신의 개발 및 도입을 보증한다.
수막구균 X에 대한 포괄적 혈청유병률 및 구조 데이터의 사용가능성에도 불구하고, X 다당류를 포함하는 상업적으로 실행가능한 포합체 백신은 이들에 대한 정제, 포합 및 제형화 안정성 측면에 대한 극도로 제한적인 성공으로 인해 아직 개발되지 않는 것으로 초기에 보고되었다. 이는 특히 나이세리아 메닌자이티디스 X 다당류를 함유하는 나이세리아 메닌자이티디스 포합체의 대규모 제조를 위한 확장가능한 포합 공정을 적용할 때 각종 파라미터를 성공적으로 다루고 제어하기 위한 추가의 도전을 제공한다.
본 발명은 확장가능하고 효율적인 포합 공정을 사용함으로써 혈청군 X로부터의 수막구균 다당류 포합체를 기반으로 한 1가 또는 다가 면역원성 조성물을 제조하는 것이 가능하다는 놀라운 발견으로부터 이루어졌다.
본 발명은 i) 다당류 사이징 (sizing), ii) 9와 9.5 사이의 pH에서 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 분자량을 가지는 사이징된 다당류의 CPPT 기반 활성화, iii) 약 2분 내지 5분의 기간 후 ADH 첨가, 이어서 4시간 내지 20시간의 항온처리, iv) MES 완충액과 EDAC의 존재 하에 0.75와 1.5 사이의 비율로 ADH 활성화된 다당류와 정제된 비활성화 캐리어 단백질의 반응, 이어서 3시간 내지 4시간의 항온처리를 포함하는 포합 반응에 의해 제조된 엔. 메닌자이티디스 X 당류-캐리어 단백질 포합체에 관한 것으로, 상기 포합 반응은 2℃ 내지 8℃에서 수행되고, 포합체 수율은 20% 내지 약 30%이고, 최종 포합체 중 단백질에 대한 당류의 비율은 0.2 내지 약 0.6인 것을 특징으로 한다.
대안적으로, 엔. 메닌자이티디스 X 당류-캐리어 단백질 포합체는 또한 i) 다당류 사이징, ii) 9와 9.5 사이의 pH에서 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 분자량을 가지는 사이징된 다당류의 CPPT 기반 활성화, iii) 2분 내지 3분 후 0.5와 2 사이의 단백질에 대한 당류의 비율로 ADH 활성화된 캐리어 단백질의 첨가, 이어서 2시간 내지 20시간의 항온처리를 포함하는 포합 반응에 의해 제조될 수 있으며, 상기 포합 반응은 22℃ 내지 약 25℃에서 수행되고, 포합체 수율은 5% 내지 약 10%인 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 혈청군 X로부터의 캡슐형 당류 및 혈청군 A, C, W135 및 Y로부터의 1개 이상의 캡슐형 다당류를 포함하는 다가 수막구균 다당류 단백질 포합체 조성물에 관한 것으로, 여기서 i) 다당류 A, C, W135 및 X는 기계적으로 사이징되는 반면, 다당류 Y는 화학적으로 사이징되고, ii) 모든 당류는 시안화 포합 화학에 의해 링커를 통해 캐리어 단백질에 포합되어 있고, iii) 최종 포합체 중 단백질에 대한 모든 당류의 비율은 0.2와 0.6 사이이고, iv) TT, DT 및 CRM197로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 상이한 캐리어 단백질을 사용한다.
도 1은 Men X Ps (215 kDa)가 하이드라진 유도체화된 TT에 포합될 때 포합 반응의 오버레이를 도시한 것이다.
도 2는 Men X Ps (215 kDa)가 하이드라진 유도체화된 TT에 포합될 때의 정제된 포합체를 도시한 것이다.
도 3은 Men X Ps (326 kDa)가 ADH 유도체화된 TT에 포합될 때 포합 반응의 오버레이를 도시한 것이다.
도 4는 Men X Ps (326 kDa)가 ADH 유도체화된 TT에 포합될 때의 정제된 포합체를 도시한 것이다.
도 5는 Men X Ps (120 kDa)가 ADH 유도체화된 TT에 포합될 때 포합 반응의 오버레이를 도시한 것이다.
도 6은 Men X Ps (120 kDa)가 ADH 유도체화된 TT에 포합될 때의 정제된 포합체를 도시한 것이다.
도 7은 본래 수막구균 X 다당류의 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 8은 Men X Ps (510 kDa)가 ADH로 활성화되고 정제된 TT에 포합될 때 포합 반응의 오버레이를 도시한 것이다.
도 9는 Men X Ps (510 kDa)가 ADH로 활성화되고 정제된 TT에 포합될 때의 정제된 포합체를 도시한 것이다.
도 10은 Men X Ps (250 kDa)가 ADH로 활성화되고 정제된 TT에 포합될 때 포합 반응의 오버레이를 도시한 것이다.
도 11은 Men X Ps (250 kDa)가 ADH로 활성화되고 정제된 TT에 포합될의 정제된 포합체를 도시한 것이다.
"다가 면역원성 조성물"이란 다음을 의미한다.
조성물 I은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 디프테리아 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메 닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함한다.
조성물 II는 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디 스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체를 포함한다.
조성물 III은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함하고, 캐리어 단백질로서 파상풍 톡소이드를 함유하는 포합체는 캐리어 단백질로서 CRM197을 함유하는 포합체의 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌음을 특징으로 한다.
조성물 IV는 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함한다.
조성물 V는 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함한다.
따라서, 제1 실시형태에서, 상기 조성물은 혈청군 A, C, Y, W135 및 X 당류를 0.5ml 복용량당 0.5μg 내지 10μg, 0.5μg 내지 5μg, 또는 0.5μg 내지 2μg의 양으로 포함할 수 있다.
제1 실시형태의 또 다른 측면에서, 상기 조성물은 혈청군 A 당류 10μg, 혈청군 C 당류 5μg, 혈청군 W135 당류 5μg, 혈청군 Y 당류 5μg 및 혈청군 X 당류 5μg을 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 다가 면역원성 조성물은 혈청군 A 당류 5μg, 혈청군 C 당류 5μg, 혈청군 W135 당류 5μg, 혈청군 Y 당류 5μg 및 혈청군 X 당류 5μg을 포함할 수 있다.
따라서, 제2 실시형태에서, 1개 이상의 엔. 메닌자이티디스 당류 포합체는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 이들 둘 다의 혼합물에 임의로 흡착되거나, 보조제에 임의로 흡착되지 않을 수 있다.
제2 실시형태의 하나의 측면은 상기 조성물은 0.5ml 복용량당 Al+++의 20μg 내지 300μg, 20μg 내지 200μg, 또는 25μg 내지 150μg의 양으로 알루미늄 염 보조제를 첨가할 수 있는 것이다.
제2 실시형태의 또 다른 측면은 0.5ml당 Al+++의 25μg 내지 125μg의 양으로 알루미늄 염 보조제를 첨가할 수 있는 것이다.
본 발명의 제3 실시형태는 상기 조성물이 티오머살 및 2-페녹시에탄올로부터 선택된 보존제를 포함할 수 있는 것이다.
제3 실시형태의 하나의 측면은 상기 조성물이 인산나트륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 더 포함할 수 있는 것이다.
본 발명의 제4 실시형태는 상기 다가 면역원성 조성물이 완충된 액체 형태 또는 동결건조된 형태일 수 있는 것이다.
제4 실시형태의 하나의 측면은 상기 동결건조된 면역원성 조성물이 a) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; b) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; c) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; 및 d) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%로부터 선택된 안정제 배합물을 포함할 수 있는 것이다.
제4 실시형태의 또 다른 측면은 상기 동결건조된 면역원성 조성물이 트리스 및 포스페이트로부터 선택된 완충액을 더 포함할 수 있는 것이다.
따라서, 제5 실시형태에서, 상기 다당류 A, C, W 및 X는 기계적으로 사이징되어 100 kDa와 600 kDa 사이, 100 kDa와 400 kDa 사이, 바람직하게는 100 kDa와 200 kDa 사이, 가장 바람직하게는 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 분자량을 가질 수 있다. 균질화, 미세유동화 및 고압 세포 파쇄와 같은 기계적 사이징 방법이 바람직하다.
제5 실시형태의 또 다른 측면에서, 상기 다당류 Y는 산 가수분해, 알칼리 분해, 과요오드산염에 의한 산화, 오존 분해, 효소 가수분해, 초음파 처리 및 전자빔 단편화로부터 선택된 방법에 의해 화학적으로 사이징되어 90 kDa와 110 kDa 사이의 평균 분자량을 가질 수 있다. 바람직하게는, 화학적 사이징은 60℃ 내지 80℃의 온도에서 아세트산나트륨을 사용하여 수행된다.
제6 실시형태에서, 각각의 엔. 메닌자이티디스 당류는 시안화 포합 화학에 의해 헤테로 또는 호모-이작용성 링커 (hetero or homo-bifunctional linker)를 통해 캐리어 단백질에 포합되어 있다.
제6 실시형태의 하나의 측면에서, 상기 사이징된 다당류는 이에 한정되는 것은 아니지만 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디늄 테트라플루오로보레이트 ('CDAP'), p-니트로페닐시아네이트 및 N-시아노트리에틸암모늄 테트라플루오로보레이트 ('CTEA')로부터 선택된 시안화 시약을 사용하여 활성화된다. 바람직한 포합 방법에서, 시안화 시약은 CDAP 이외의 것이며, 1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CPPT), 1-시아노-이미다졸 (1-CI), 1-시아노벤조트리아졸 (1-CBT), 2-시아노피리다진-3(2H)-온 (2-CPO), 또는 이들의 작용성 유도체 또는 변형체 (functional derivative or modification)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
제6 실시형태의 또 다른 측면에서, 상기 활성화된 다당류 또는 캐리어 단백질, 특히 다당류는 하이드라진, 카보하이드라자이드, 염화하이드라진, 디하이드라자이드 또는 이들의 혼합물과, 바람직하게는 아디프산 디하이드라자이드와 반응한다.
카보디이미드 반응을 사용하여, 예를 들면, EDC의 존재 하에 하이드라진, 카보하이드라자이드, 석시닐 디하이드라자이드, 아디프산 디하이드라자이드, 염화하이드라진 (예를 들면, 하이드라진 디하이드로클로라이드) 또는 임의의 다른 디하이드라자이드와의 반응에 의해, 하이드라자이드기를 단백질상의 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 카복실기를 통해 단백질에 도입할 수 있다. EDC를 촉매로 사용하여 하이드라진 또는 디하이드라자이드에 의해 단백질 반응물을 활성화시키고 변형시킨다. EDC를 포함하는 모든 수용성 카보디이미드를 촉매로 사용할 수 있다. EDC-촉매된 단백질은 일반적으로 중합하고 침전하는 경향을 가진다 (문헌 [Schneerson et al., Infect. Immun. 1986, 52: 519-528; Shafer et al., Vaccine 2000; 18(13): 1273-1281; and Inman et al., Biochemistry 1969; 8: 4074-4082] 참조).
제7 실시형태에서, 상기 다가 수막구균 다당류 단백질 포합체 조성물은 2개 이상의 상이한 유형의 캐리어 단백질에 개별적으로 포합된 A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, Y 및 Z로부터의 다당류를 함유한다. 캡슐형 당류를 수막구균 혈청군 A, C, W135, Y 및 X로부터 선택하여, 상기 조성물은 이들 5개의 혈청군 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개로부터의 당류를 포함한다. 특정 조성물은 혈청군 A 및 X; 혈청군 X 및 W135; 혈청군 X 및 Y; 혈청군 C 및 X; 혈청군 A, Y 및 X; 혈청군 C, X 및 W135; 혈청군 X, Y 및 W135; 혈청군 A, C 및 X; 혈청군 Y, C 및 X; 혈청군 A, W 및 X; 혈청군 Y, W135, C 및 X; 혈청군 Y, W135, A 및 X; 혈청군 C, W135, A 및 X; 혈청군 Y, C, A 및 X; 혈청군 A, C, Y, W135 및 X로부터의 당류를 포함한다. 적어도 혈청군 X를 포함하는 조성물이 바람직하며, 5개의 모든 혈청군으로부터의 당류를 포함하는 조성물이 가장 바람직하다.
제7 실시형태의 측면에서, 상기 캐리어 단백질은 이에 한정되는 것은 아니지만 CRM197, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 이. 콜라이 (E. coli) LT, 이. 콜라이 ST, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터의 내독소 A, 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모라이신, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA), 폐렵구균 부착 단백질 (PsaA), 폐렴구균 표면 단백질 BVH-3 및 BVH-11, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)의 방어 항원 (PA), 바실러스 안트라시스의 무독화된 부종 인자 (EF) 및 치사 인자 (LF), 난 알부민, 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH), 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 캐리어 단백질의 배합물은 파상풍 톡소이드와 디프테리아 톡소이드, 및 CRM197과 파상풍 톡소이드를 포함한다.
제3 실시형태의 또 다른 측면에서, 포합 반응은 아디프산 디하이드라자이드, ε-아미노헥산산, 클로로헥산올 디메틸 아세탈, D-글루쿠로놀락톤, 시스타민 및 p-니트로페닐에틸 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 링커를 사용한다.
포합 후, 포합체는 특히 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리, 한외여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 황산암모늄 분획을 포함한 임의의 표준 기술에 의해 미반응 단백질 및 다당류로부터 정제될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [P. W. Anderson, et. al., (1986) J. Immunol. 137: 1181-1186; 및 H. J. Jennings and C. Lugowski, (1981 ) J. Immunol. 127: 1011-1018] 참조).
제8 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 추가의 비-수막구균 다당류 단백질 포합체를 더 포함할 수 있는데, 사용하기 위한 상기 다당류 및 올리고당류는 이에 한정되는 것은 아니지만 혈청군 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F의 폐렴구균 다당류; 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) b형 다당류 폴리리보실리비톨 포스페이트; 혈청형 III 및 V의 B군 연쇄상구균 다당류; 및 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) Vi 다당류로부터 선택될 수 있다. 폐렴구균 및 B군 연쇄상구균 혈청형의 다른 다당류도 또한 본원에 사용하기에 적합하며, 다른 T-비의존성 다당류 및 올리고당류 항원, 예를 들면, A군 연쇄상구균, 포도상구균, 장구균, 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 이. 콜라이, 슈도모나스 아에루기노사 및 바실러스 안트라시스로부터 유래된 다당류 또는 올리고당류도 적합하다. 세균 다당류 및 올리고당류가 특히 바람직하지만, 그람 (-) 세균 지질다당류 및 지질올리고당류 및 이들의 다당류 및 올리고당류 유도체, 및 바이러스 다당류 및 올리고당류도 또한 사용된다.
본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 제공되고 제시될 수 있다. 조성물은 바이알로 제공될 수 있거나, 조성물은 미리 충전된 주사기 (ready-filled syringe)로 제공될 수 있다. 주사기는 바늘이 있거나 바늘이 없이 공급될 수 있다. 주사기는 단일 복용량의 조성물을 포함하는 반면, 바이알은 단일 복용량 또는 다중 복용량을 포함할 수 있다. 주사용 조성물은 일반적으로 액체 용액 또는 현탁액이다. 대안적으로, 조성물은 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액을 위한 고체 형태 (예를 들면, 동결건조됨)로 존재할 수 있다.
실시예
실시예 1:
수막구균 X 다당류의 제조
a) 발효 및 수막구균 X 다당류의 정제
발효기의 최적 조건 하에서 연속식 유가 발효 방식 (continuous fed-batch fermentation mode)에 적합한 발효 배지를 사용하여, 엔. 메닌자이티디스 균주 (8210 및 9601)로부터 수막구균 X 다당류를 수득한다. 또한, 수막구균 X 캡슐형 다당류는 전형적으로 CTAB 기반 침전, 에탄올 (96%) 처리, 이어서 심층 여과, 탄소 여과, CaCl2 침전, 에탄올 (96%) 처리 및 한외 여과의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
b) 수막구균 X 다당류의 사이징
정제된 수막구균 X 다당류에 약 30 kpsi 내지 40 kpsi의 압력 하에 WFI에서 기계적 사이징 (일정한 시스템 세포 파쇄기)의 1회 내지 2회 통과를 실시한다.
실시예 2:
캐리어 단백질에 대한 수막구균 X 다당류의 포합
a) 하이드라진 유도체화된 파상풍 톡소이드 ( TT )에 포합된 다양한 평균 분자량의 수막구균 X 다당류
첫째로, SEC HPLC 상의 평균 분자량 215kD인, 균질화된 X (균주 9601)의 다당류 (30 mg/ml) 45mg을 CDAP (아세토니트릴 중에 100 mg/ml로 용해됨) 90mg으로 활성화하고, 혼합물의 pH를 1M NaOH에 의해 9.5로 조정하였다. 이어서, 3분 후, 하이드라진 활성화된 TT (1M NaCl 중의 30 mg/ml) 67.5mg을 반응물에 첨가하였다. 반응을 HPLC 상에서 모니터링하고, 18시간까지 계속하였다. 18시간 후, 글리신을 첨가하여 반응을 정지시키고 (quench), 10mM 트리스, pH 7.2 중에서 300kD TFF 막의 정용여과에 의해 조 포합체를 정제하였다. 이동상으로서 PBS를 사용하여 유속 1 ml/min으로 Shodex 컬럼 SB-804 HQ 및 SB-805 HQ를 순차적으로 사용하였다. 다당류 농도 및 단백질 농도를 각각 인 분석법 및 변형 로우리 분석법으로 결정하였다.
둘째로, SEC HPLC 상의 평균 분자량 326kD인, X (균주 8210)의 다당류 (2M NaCl 중의 24 mg/ml) 60mg을 CPPT (아세토니트릴 중에 114 mg/ml로 용해됨) 150mg으로 활성화하고, 혼합물의 pH를 2.5M NaOH에 의해 9.5로 조정하였다. 이어서, 3분 후, ADH 활성화된 TT (2M NaCl 중의 37 mg/ml) 37.5mg을 반응물에 첨가하였다. 반응을 HPLC 상에서 모니터링하고, 5시간까지 계속하였다. 5시간 후, 글리신을 첨가하여 반응을 정지시키고, 10mM PBS, 이어서 10mM 트리스, pH 7.2 중에서 500kD TFF 막의 정용여과에 의해 조 포합체를 정제하였다.
또한, SEC HPLC 상의 평균 분자량 120kD을 가지는, X (균주 8210)의 다당류 (1M NaCl 중의 20 mg/ml) 200mg을 CPIP (아세토니트릴 중에 114 mg/ml로 용해됨) 400mg으로 활성화하고, 혼합물의 pH를 1M NaOH에 의해 9.5로 조정하였다. 이어서, 3분 후, ADH 활성화된 TT (30 mg/ml) 150mg을 반응물에 첨가하였다. 반응을 HPLC 상에서 모니터링하고, 4시간까지 계속하였다. 4시간 후, 글리신을 첨가하여 반응을 정지시키고, 10mM PBS, 이어서 10mM 트리스, pH 7.2 중에서 300kD TFF 막의 정용여과에 의해 조 포합체를 정제하였다.
b) ADH 로 활성화되고 정제된 비활성화된 파상풍 톡소이드 ( TT )에 포합된 다양한 분자량의 수막구균 X 다당류
첫째로, SEC HPLC 상의 평균 분자량 510kD을 가지는, X (균주 8210)의 다당류 (2M NaCl 중의 27 mg/ml) 200mg을 CPPT (아세토니트릴 중에 114 mg/ml로 용해됨) 400mg으로 활성화하고, 혼합물의 pH를 2.5M NaOH에 의해 9.5로 조정하였다. 이어서, 3분 후, ADH 1.5g (카보네이트 완충액 중의 100 mg/ml)을 첨가하고, 반응을 4시간까지 계속하였다. 4시간 후, 글리신을 첨가하고, 반응 혼합물을 8kD TFF 막 상에서 정용여과하였다. 또한, ADH-Men X 다당류를 농축하였다. 이러한 다당류 44mg (7.5 mg/ml)에 정제된 TT (0.9% NaCl 중의 37.5 mg/ml) 및 MES pH 6.0 완충액을 첨가하여, MES의 최종 완충액 세기를 100mM로 하고, 이어서 EDAC 37.5mg (100mM MES 중에 용해됨, pH 6.0)을 첨가하였다. 반응을 4시간 동안 계속하고 HPLC 상에서 모니터링하였다. Akta 크로마토그래피 시스템 (GE Amersham) 상에서 Toyopearl HW65 수지를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 비결합된 다당류를 제거하였다. 피크 프로파일 및 당류-단백질 비율에 기초하여 분획을 회수하여 모았다.
둘째로, SEC HPLC 상의 평균 분자량 250kD을 가지는, X (균주 8210)의 다당류를 18 mg/ml까지 농축하였다. 200mg의 양을 CPPT (아세토니트릴 중에 114 mg/ml로 용해됨) 296mg으로 활성화하고, 혼합물의 pH를 2.5M NaOH에 의해 9.5로 조정하였다. 이어서, 3분 후, ADH 1.12g (카보네이트 완충액 중의 100 mg/ml)을 첨가하고, 반응을 4시간까지 계속하였다. 4시간 후, 글리신을 첨가하고, 반응 혼합물을 8kD TFF 막 상에서 정용여과하였다. 이어서, ADH-Men X 다당류를 농축하였다. 또한, 이러한 다당류 200mg (7.5 mg/ml)에 정제된 TT (0.9% NaCl 중의 36.7 mg/ml) 및 MES pH 6.0 완충액을 첨가하여, MES의 최종 완충액 세기를 100mM로 하고, 이어서 EDAC 200mg (100mM MES 중에 용해됨, pH 6.0)을 첨가하였다. 반응을 4시간 동안 계속하고 HPLC 상에서 모니터링하였다. 10mM PBS, 이어서 10mM 트리스, pH 7.2 중에서 500kD TFF 막의 정용여과에 의해 조 포합체를 정제하였다.
Figure pct00001
상기 데이터에 의하면, 약 20% 내지 30%의 최종 포합체 수율은 i) 약 100 kDa 내지 200 kDa의 평균 분자량의 수막구균 X 다당류, ii) ADH 활성화된 수막구균 X 다당류, iii) 비활성화된 TT, iv) 포합 반응 동안 0.5와 2 사이의 단백질에 대한 당류의 비율, v) 시안화 시약으로서의 CPPT, vi) 2℃ 내지 8℃에서의 포합 반응 항온처리, 및 vi) 최종 포합물 중 0.2와 0.6 사이의 단백질에 대한 당류의 비율을 사용하여 수득될 수 있는 것으로 나타난다.
실시예 3:
캐리어 단백질 CRM197 에 대한 수막구균 A, C, Y 및 W135 다당류의 포합
적합한 시안화 시약 (CDAP 또는 CPPT)을 사용하여 100과 200 사이의 평균 분자량을 가지는 정제된 수막구균 다당류 A, C, Y 및 W135를 1 미만의 단백질에 대한 당류 바율로 CRM197에 포합시켰다. 10mM PBS 50 용적 및 10mM 트리스 50 용적에 의한 300kD TFF 상의 정용여과에 의해 포합체를 추가로 정제하였다.
실시예 4:
2개의 상이한 캐리어 단백질을 함유하는 Men A, C, Y, W135 및 X 포합체 의 동결건조 및 제형
트레할로오스, 수크로오스 및 락토오스와 각종 배합으로 엔. 메닌자이티디스 포합체, 시트르산나트륨 및 트리스 완충액을 함유하는 동결건조된 제형을 제조하였으며, 여기서 유리 다당류 함량은 범위 내에 있었으며, 수분 함량은 2% 미만이었다. 상기 안정제 배합물은 a) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; b) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; c) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; 및 d) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%로부터 선택되었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 5:
Men X 당류 포합체를 함유하는 수막구균 1가 및 다가 포합체 조성물의 생물학적 활성
체중 16g 내지 20g의 6마리의 암컷 스위스 알비노 마우스를 각각의 제형으로 면역시켰다. 마우스를 0일, 14일 및 28일에 피하로 면역시켰다. 각각의 마우스를 1 및 2주 후 2차 면역시킨 후 채혈하였다 (21일 및 35일).
항체의 적정을 비드 기반 분석법 및 SBA로 수행하였다. 6마리의 마우스 모두로부터의 예비 면역화 혈청 샘플을 혼합하여 이후 연구 4로부터의 각각의 제형에 대하여 단일 혼주 혈청을 제조하고, 또한 각각의 제형에 대하여 스위스 알비노 혈통에 속하는 6마리의 마우스 모두로부터의 후 면역화 혈청 샘플을 혼합하여 각각 마우스 1+2, 마우스 3+4 및 마우스 5+6으로부터의 혈청을 사용하여 풀 (pool) 1, 2 및 3을 제조하였다. 각각의 풀을 전체 IgG 역가 (다중 비드 기반 분석법) 및 기능성 항체 역가 (SBA)에 대해 분석하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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상기 마우스 면역원성 데이터는 1가 X-파상풍 톡소이드 포합체 및 X-파상풍 톡소이드 포합체를 함유하는 다가 포합체의 액체 및 동결건조된 조성물이 면역원성인 것으로 밝혀졌음을 나타낸다. 또한, X-파상풍 톡소이드 포합체 1μg, 염화나트륨, 티오머살 및 Al+++ 125μg을 함유하는 1가 액체 조성물은 최적의 면역원성 반응을 제공한다. 또한, A-CRM197, C-CRM197, Y-파상풍 톡소이드, W-CRM197 및 X-파상풍 톡소이드 포합체와 5개의 모든 당류 각각 1μg, 염화나트륨, 티오머살 및 Al+++ 25μg을 함유하는 액체 다가 조성물 0.5ml는 최적의 면역원성 반응을 제공한다. 따라서, 이러한 5가 포합체 조성물에서, 캐리어 단백질로서 파상풍 톡소이드를 함유하는 포합체는 캐리어 단백질로서 CRM197을 함유하는 포합체의 면역원성을 증강시키는 것으로 밝혀졌다.
개시된 본 발명의 원리를 적용할 수 있는 수많은 가능한 실시형태를 고려하여, 예시된 실시형태는 단지 본 발명의 바람직한 예이고 본 발명의 범위를 한정하지 않는 것으로 인식되어야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음 청구항에 의해 정의된다. 따라서, 본 발명자들은 이들 청구항의 범위 및 취지 내에 속하는 모든 것을 발명으로서 주장한다.

Claims (37)

  1. 엔. 메닌자이티디스 (N. meningitidis) X 다당류-단백질 포합체 (conjugate)를 포함하는 면역원성 조성물로서,
    상기 캡슐형 당류는 8210 및 9601로부터 선택된 엔. 메닌자이티디스 균주로부터 유래된 것인, 면역원성 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 1개 이상의 추가의 다당류 포합체는 혈청군 A, B, C, W135 및 Y로부터 유래된 엔. 메닌자이티디스 캡슐형 당류를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 엔 . 메닌자이티디스 X 균주는 8210, 9601, 9592, 9554 및 2526으로부터 선택되는 것인, 면역원성 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 5개의 다당류 모두를 포합하기 (conjugating) 위한 2개 이상의 상이한 캐리어 단백질을 사용함으로써 엔. 메닌자이티디스 혈청군 A, C, W135, Y 및 X의 각각의 캡슐형 다당류를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  5. 청구항 1 또는 청구항 4에 있어서, 상기 각각의 엔. 메닌자이티디스 당류는 TT, DT, CRM197, TT의 단편 C, 단백질 D, OMPC 및 뉴모라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 캐리어 단백질에 포합되어 있는 것인, 면역원성 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 각각의 엔. 메닌자이티디스 당류는 TT, DT 및 CRM197로 이루어진 군으로부터 선택된 캐리어 단백질에 포합되어 있는 것인, 면역원성 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 각각의 엔. 메닌자이티디스 당류는 TT 및 DT로 이루어진 군으로부터 선택된 캐리어 단백질에 포합되어 있는 것인, 면역원성 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 디프테리아 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌 자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함하고, 캐리어 단백질로서 파상풍 톡소이드를 함유하는 포합체는 캐리어 단백질로서 CRM197을 함유하는 포합체의 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌음을 특징으로 하는 것인, 면역원성 조성물.
  10. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이 티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  11. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자 이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  12. 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 (a) 혈청군 A 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (b) 혈청군 C 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (c) 혈청군 Y 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, (d) 혈청군 W135 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 CRM197 (ii)의 포합체, 및 (e) 혈청군 X 엔. 메닌자이티디스의 캡슐형 당류 (i)와 파상풍 톡소이드 (ii)의 포합체를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  13. 청구항 4에 있어서, 상기 각각의 캡슐형 다당류는 100 kDa와 600 kDa 사이의 평균 크기를 가지는 것인, 면역원성 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 각각의 캡슐형 다당류는 100 kDa와 300 kDa 사이의 평균 크기를 가지는 것인, 면역원성 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 각각의 캡슐형 다당류는 100 kDa와 200 kDa 사이의 평균 크기를 가지는 것인, 면역원성 조성물.
  16. 청구항 4에 있어서, 혈청군 A, C, W135 및 X 후-사이징 (post-sizing)으로부터의 3개 이상의 엔. 메닌자이티디스 다당류는 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 크기를 가지는 것인, 면역원성 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 후-사이징은 고압 세포 파쇄 시스템을 사용하여 수행되는 것인, 면역원성 조성물.
  18. 청구항 4에 있어서, 혈청군 Y 후-화학적 사이징 (post-chemical sizing)으로부터의 엔. 메닌자이티디스 다당류는 90 kDa와 110 kDa 사이의 평균 크기를 가지는 것인, 면역원성 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 후-화학적 사이징은 60℃ 내지 80℃의 온도에서 아세트산나트륨을 사용하여 수행되는 것인, 면역원성 조성물.
  20. 청구항 4에 있어서, 상기 각각의 엔. 메닌자이티디스 당류는 시안화 포합 화학에 의해 헤테로 또는 호모-이작용성 링커 (hetero or homo-bifunctional linker)를 통해 캐리어 단백질에 포합되어 있는 것인, 면역원성 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 링커는 ADH인 것인, 면역원성 조성물.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시안화 시약은 1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CPPT), 1-시아노-이미다졸 (1-CI), 1-시아노벤조트리아졸 (1-CBT), 2-시아노피리다진-3(2H)-온 (2-CPO), 또는 이들의 작용성 유도체 또는 변형체 (functional derivative or modification)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 면역원성 조성물.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 엔 . 메닌자이티디스 X 당류-파상풍 톡소이드 포합체는 i) 다당류 사이징, ii) 9와 9.5 사이의 pH에서 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 분자량을 가지는 사이징된 다당류의 CPPT 기반 활성화, iii) 약 2분 내지 3분의 기간 후 ADH 첨가, 이어서 4시간 내지 20시간의 항온처리, iv) 정용여과에 의한 미반응 ADH 제거, 및 v) MES 완충액과 EDAC의 존재 하에 0.75와 1.5 사이의 비율로 ADH 활성화된 다당류와 정제된 비활성화 캐리어 단백질의 반응, 이어서 3시간 내지 4시간의 항온처리를 포함하는 포합 반응에 의해 제조되고, 상기 포합 반응은 2℃와 8℃ 사이의 온도에서 수행되고 최종 포합체 중 단백질에 대한 당류의 비율은 0.2와 0.6 사이인 것인, 면역원성 조성물.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 엔 . 메닌자이티디스 X 당류-파상풍 톡소이드 포합체는 i) 다당류 사이징, ii) 9와 9.5 사이의 pH에서 100 kDa와 150 kDa 사이의 평균 분자량을 가지는 사이징된 다당류의 CPPT 기반 활성화, iii) 2분 내지 3분 후 0.5와 2 사이의 단백질에 대한 당류의 비율로 ADH 활성화된 캐리어 단백질의 첨가, 이어서 2시간 내지 20시간의 항온처리를 포함하는 포합 반응에 의해 제조되고, 상기 포합 반응은 22℃ 내지 약 25℃에서 수행되고 최종 포합체 중 단백질에 대한 당류의 비율은 0.2와 0.6 사이인 것인, 면역원성 조성물.
  25. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 혈청군 A, C, Y, W135 및 X 당류를 0.5ml 복용량당 0.5μg 내지 10μg, 0.5μg 내지 5μg, 또는 0.5μg 내지 2μg의 양으로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 조성물은 혈청군 A 당류 10μg, 혈청군 C 당류 5μg, 혈청군 W135 당류 5μg, 혈청군 Y 당류 5μg 및 혈청군 X 당류 5μg을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 조성물은 혈청군 A 당류 5μg, 혈청군 C 당류 5μg, 혈청군 W135 당류 5μg, 혈청군 Y 당류 5μg 및 혈청군 X 당류 5μg을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  28. 청구항 25에 있어서, 1개 이상의 엔. 메닌자이티디스 당류 포합체는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 이들 둘 다의 혼합물에 임의로 흡착되거나, 보조제에 임의로 흡착되지 않는 것인, 면역원성 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 0.5ml 복용량당 Al+++의 20μg 내지 300μg, 20μg 내지 200μg, 또는 25μg 내지 150μg의 양으로 알루미늄 염 보조제를 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 조성물은 0.5ml당 Al+++의 25μg 내지 125μg의 양으로 알루미늄 염 보조제를 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  31. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 티오머살 및 2-페녹시에탄올로부터 선택된 보존제를 더 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 인산나트륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  33. 청구항 1 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류 포합체는 완충된 액체 형태인 것인, 면역원성 조성물.
  34. 청구항 1 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당류 포합체는 동결건조된 형태인 것인, 면역원성 조성물.
  35. 청구항 34에 기재된 동결건조된 면역원성 조성물로서,
    안정제 배합물은 a) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; b) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; c) 수크로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%; 및 d) 트레할로오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v), 락토오스 2% (w/v) 내지 5% (w/v) 및 시트르산나트륨 0.25% 내지 0.75%로부터 선택되는 것인, 동결건조된 면역원성 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 조성물은 트리스 및 포스페이트로부터 선택된 완충액을 더 포함하는 것인, 동결건조된 면역원성 조성물.
  37. 나이세리아 메닌자이티디스 (Neisseria meningitidis) 감염으로 인한 질병에 대한 인간 숙주의 면역 방법으로서,
    상기 면역 방법은 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신을 면역보호량으로 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는 것인, 인간 숙주의 면역 방법.
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