JPS58213722A - フコ−ス抗原の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は糖抗田（、詳しくは特定の糖鎖をハブテン基と
して含有Ｊる糖抗原であって、消化器癌等の癌細胞殊に
ヒト大腸癌細胞及びマウス　テラ１〜カルシノーマ細胞
と特異反応性を右し、消化器等の癌Ｎｉｊ　（特に大腸
癌）の診断に有用である新しい癩関連抗体を装造づるた
めの糖抗ＩＩ；（の製造法に関Ｊる１゜ 最近細胞分化のある段階におい（、咄乳動物細胞表面ト
に特Ｗな糖抗涼が表視され、かかる糖抗Ｉｊｌｔと反応
＋１を有１」る抗体として、全細胞をイムノーゲンとし
くｌ用いた細胞融合技術にＪ、り得られる’Ｅ／’７１
１ナール抗体（Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ、１４．７７５−　７
８３（１９７８）　　、　Ｐｒｏｃ、、　　Ｎａｔｌ、
、　　Δ　（、］（Ｌ、　　Ｌ）　ＳＡ。 Ｖ　ｏｌ、７５．　Ｎ　Ｏ，１１，５５Ｇ５−５り６９
　（１９７８）　ＭびＮａｔｕｒｅ。 Ｖｏｌ、２９２，１５６−Ｈ＋８　（１９８１）　）及
びある愚者の血清中に存在する抗体（Ｅｘａ、　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｓ、、　１３１，１８５−１９５　（１９８１
）　）が提案された。本発明者らは上記各報告に関連し
Ｃ１独自に研究をφねる過程において、特定の糖鎖を有
機合成し、これをハプテン基として糖抗涼を作成した所
、該糖抗原由来の抗体が消化器癌等の癌細胞特にヒト大
腸癌及びマウス　テラ１〜カルシノーマ細胞と特異選択
的に反応し、従って該抗体の利用によれば癌細胞の認識
、測定等及びこれによる癌の診断が行ない得るという新
しい知見を得た。本発明はこの知見を基礎として完成さ
れたものである。 即ら本発明はα−フ二１ビフノシルー　（１→３）、−
（１−１４）−又は　（１−ｐ６）　　がラクトピラノ
シル基を含有するＡリボ糖をハブテンとし、これを１Ｖ
リアー屯白ど反応さｔＩＣ糖抗涼を得ることを特徴とり
るフコース抗原の製造法に係る。 以下本発明にＡ３　Ｌｊるフコース抗原の製造、該抗原
からの抗体の製造並びに該抗体を含む癌診断用−ｔ　’
／ト、イの利用による癌関連糖鎖の測定乃至層の詮断法
につき順次説明する。 本発明に係るノ：］〜ス抗原の製造においでは、ハブテ
ンとしてα−フコピラノシル−（１−〉３　）−１＝　
（１シ４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基
を含有するオリゴ糖を用いることを必須とＪる。Ｌｉ己
オリゴ糖の必須構成糖どするフコｌピラノースとカラク
１〜ピラノースとの結合は、α１−→Ｊ３、α１→１１
又はα１→６結合を示（ハ特にα１→３結合））（好ま
しい。また１−記Ａリゴ糖はイのがラクトピラノシル基
に更に仙の糖鎖が結合してい−（もよく、該他の糖鎖を
構成する糖としては代表的には例えばグルコビラノース
を挙げることができる。該カラク１〜ピラノースとグル
：１ピラノースとの結合は、α又はβのいずれぐもよい
。 また、上記各構成糖は、Ｄ体又は１体のいずれであって
もよい。 本発明に０７５８　＜にオリ−［糖の１１体例とし−Ｃ
は、例えば１スートのものを例−示できる。 〇−α−１−一）］］ピラノシルー１．３）−〇−β−
１〕−ガラク１〜ピラノシル−（１−＝　４　＞−−Ｃ
λ−Ｄ−グルコ１ピラノース（３−−α−川用−〕］ピ
ラノシルーαｉラク１〜−ス）０−ｔｘ−ｉ−ノコピラ
ノシル−（１→４）−〇−β−Ｄ−・ガラクトピラノシ
ル−（１→１−α−Ｄ−グルコビラノース（４′−α−
１ノコピラノシル−α−ラクトース） ０−（χ−１−一フコビラノシルー（１−＝６）−〇−
β−Ｄ・−ガラクトピラノシル−＜１−ｓ＞−α−１’
）−グルコビラノース（６−−α−Ｌ゛）１ピラノシル
−ｕ−ラクトース） Ｆ記Ａり１糖は公知であるがまたは公知の各種１ノ仏に
Ｊ、すｈ′易に製造するごどがでさる（ＣｈｅｍＰｌ＋
ａｒ１１．８ｔ＋ＩＩ　、　２９（４）　１０７６−１
０８２　（１９８１）及び第３回糖質シンポジウム講演
要旨集菌９０〜９１負、鋳題４３［人乳Ａリボ糖の合成
Ｊ　、ｙｔ和５５年８月参照］。 ト記Ａリーｒ納をハフＪンとし、これに結合されルヤ１
アリＩ　　ｆｆｚ自とし−（は、通常抗Ｄ′Ａの作成に
当り慣用される高分子の天然もしくは合成の蛋白質を広
＜　ｉＵｒ用（・きる。例えば馬血清アルブミン、生血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン、ヒ１
〜面清アルｌミン、ヒツジ血清アルブミン、卵白アルブ
ミン等の動物のフルアミン類、馬面清グ［１プリン、牛
面漬グロブリン、つＩＪ′ギ血消グロブリン、ヒト面清
グ「ｌプリン、ヒツジ血消グ［］ｌプリン卵グ［１プリ
ン等の動物のグロブリン類、馬ヂ１］グｒ、ｊ−７リン
、牛チログロブリン、ウリギヂログ［１プリン、ヒＩ〜
チログロブリン、ヒツジヂ［１グロブリン等の動物のチ
［１グロブリン類、馬ヘモグロブリン、９ヘモグロブリ
ン、ウサギｌ＼−Ｅグ

【′１１リン、ヒ１〜ｌ＼モグ［
ｌプリン、ヒツジヘモグロブリン等の動物のへ七グ［１
プリン類、動物のｌ＼ｔジノ／二ン類、回虫ｊ、り抽出
された蛋白質（アスカ−リス抽出物、特開１に１５６−
１６４１４号参照）、Ｔデスチン（ｅｄｅｓ＋ｉｎ　）
　、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミ
ン酸共小合体、リジン叉はＡルニチンを含む共重合体等
を挙げることができる。 −Ｉ記ハプナン（オリゴ糖）とキャリアー蛋白との反応
は公知の各種り法例えば（Ａ）イソチオシアネー１〜カ
ップリング法、（Ｒ）ジ？ゾノｊツブリング法、（Ｃ）
７ミド結合法、（Ｄ　）　還元的アミノ化法、（１−）
グアニジンカップリング法等に従い実施できる（　Ａ　
ｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｏｈｅｕ＋１ｓｔｒｙ　　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌ、３７．ｐ２２５−２８１（１９８０）
　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、Ｖｏｌｌ、Ｃｏｍｐｌｅｘ　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅｓ、　Ｐａｒｌｃ、　ｐ１！１５−１７５　（１９
７８）　、蛋白質核酸酵素　Ｖｏｌ、２５．Ｎｏ、８゜
ｐ７０７−７２４　（１９８０）　＆びＡ　ｒｃｈｉｖ
ｅｓ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏ　−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａ
ｎｄ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌ、２０５．　Ｎ
ｏ、２　。 ｐ３３８−３９５　（１９８０）　）　。 ト記イソチオシアネートカップリング法（Ａ法）は、；
’Ｑ　７１；的７ミノ１ヒ反応（例えばハブアンにβ−
（ｐ　−−７／ミ、／〕］−ニル）丁チルｊ′ミン等の
ジアミンｊ４１体績びＮａ　［３Ｈａ　、Ｎａ　Ｒ１１
３ＯＮ等）還元剤を艮応さゼる）により製造される化合
物にチオフォスゲンを陵応さＩたのち、得られるイソチ
Ａシアネート体（ごキャリアー蛋白をカップリング反応
させること（、ｌより実施される。−Ｆ配還元的アミノ
化反応番、１、適当な不活性溶媒例えば０．２モルリン
酸カルシウム（ｐＨ＝８）等の緩衝液、水、生理食塩水
又はメタノール、１タノール等のアル］−ル中、０〜７
′ＩＯ℃にて３１Ｐｆ間〜３日間で好適に進（１−４６
゜ｉｔ　７．：還元的アミノ化反応により得られる化合
物とチオフォスゲンとの反応は、適当な不活＋ｉ溶媒例
え（，１水、０．１モル炭酸水素す１〜リウム水溶液（
ρＮ　＝　８　）又は生理食塩水中−１０°０〜室温に
（３０分〜２藺間で好適に進行する。 史にイソチΔジノ′ネー１一体とキャリアー蛋白との反
応ＬＬ、適当イｘ不活竹溶媒例えば水、ｌト即食塩水叉
は０，１モル灰酸水累ナトリウム水ＦＩ液（（）Ｈ・’
９．５）中【　１０℃へ・室温にて１５〜２０時間（゛
好適に進行りる。 ジ）Ｉシカツノリング法（Ｂ法）は、例えば［記へ法の
還元的−）′ミノ化反応によりシ１造された化合物に曲
硝酸寸トリウムと塩酸又は硫酸等のジ？ゾ化剤を反１ト
・さμ（製造されるジ）′ゾ化合物に、−１Ａ７リアー
蛋白をカップリング反応させることにより実施される。 上記ジアゾ化反応は、適当な不活スＩｌ溶媒例えば水、
生理食塩水又は塩酸水溶液等の鉱酸水溶液中、−１０〜
−２０℃にて１０〜６０（）′Ｃ好適に進行する。また
ジアゾ化合物どキ（７リアー蛋白とのカップリング反応
は一１０〜２０℃にて２〜６時間で好適に進行する。 アミド結合法（Ｃ法）は例えばハプテンのアルデヒド基
を酸化銀等の酸化剤で酸化して糖カルボン酸としたのち
、該糖カルボン酸とキャリアー蛋白の７ミノ基とをアミ
ド結合反応させることにＪ、ｅ）実／＋１！！される。 ７ミド結合反応は、通常のベブタイドのツノミド結合生
成反応により、例えば１−■チル−３−（ジメチルアミ
ツブ［１ヒル）−カルボジイミド等のＩＢ２水剤を用い
た１１１２水縮合反応により実施できる。１この脱水綜
合反応は、適当な不活性溶媒例えば１干ル酊酸プ１〜リ
ウム緩−１故（ｒｌＨ−５，５）等の緩衝液中、Ｏ℃〜
室調にて３〜１２時間でりｆ適に進行する。 還元的ｉ）ミノ化法（「）法）は例えばハブテンにキＡ
７リノ７−山山及びＮａ　５ｌ−１４、Ｎａ　Ｂｔ−１
ａ　ＣＮ等の）マ元剤を反応さｔすることにより実施さ
れる。 還元的アミノ化反応の条件としては、前記Ａ法の）駐７
［的）／ミノ化反応の条件を採用できる。 ］記Ａ〜１）法においで各試薬の使用聞は、原料に対し
て少なくとも等モル昂程葭、通常好ましくは過剰憂ど８
れる。 かくしてＡリボ糖とキャリアー蛋白とが結合しＩこ所望
の糖抗原（）］−ス抗原）を製造Ｃぎる。 艮応終了後得られる糖抗原は常法に従い、例えば透析法
、ゲル蘭過法、分別沈澱等にｊ、り容易に中１ｉｌｌｌ
精製Ｃ′きる。上記のこと、クシで得られる糖抗原のう
らでは、４５１．Ｔ　Ｉ’　ｒリアー蛋白１上ルに対し
てＡリボ糖が］ｌ均２０〜２５モル結合したものが好適
（゛ある。 上記で得られる糖抗原による抗体の作成は、律法に従い
該抗原４−哺乳動物に投すし、生体内に産１１−される
抗体を抹取り−る方法を採用できる。抗体の製造に供さ
れる哺乳動物としでは、特に制限はなく例えば゛ウサー
１゛、七ルモ゛ンｉ・、ンウス、ヒ゛ンジ、ヤギ、ウシ
、つ？等を例示できる。抗体の産生は例え１、ば上記抗
原の所定量を生理食塩水で適当Ｓ度に希釈し、これに必
要に応じて）［］インドの不完全？シュバント又はフロ
イントの完全アシコバント等のアジニ１バントを混合し
、１５ｊられる懸濁液を投うすることにより１１なわれ
る。上記投与は皮下、筋汀、腹腔内、静脈内、経口等、
好ましくは皮下、腹腔内、静脈内経路で行なわれる。投
与回数、投句昂等は常法に従い適宜に決定できる。例え
ばつ（Ｊ−ギに上記懸濁液を皮内注銅（抗原の聞として
０．０５・〜５ＩＯ／回）し、以後２週間毎に１〜１０
ケ月、好ましくは１〜３ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投！Ｅｉｑｉ抗体
が多吊産牛される簡明、通常１記最終投与の１−２週間
経過後、免疫化された動物から採血し、これを速心分−
］後白油を分離採取Ｊることに、」、り行われる６、ま
ノご１６Ｉ：白油は史に塩析、吸収法、）７ノイニテイ
クロマ１へケラフィー等の通常の精製手段により精製し
てもよい、。 かくして精製された抗体は、α−フ］ビラノシルー（１
→３）−、−（１→４）−又は−（１→６）−がラフ１
〜ピラノシル基を特異的に認識できる抗体（゛ある。特
に本発明においてハブテンとしく３′−α−１−７コど
ラノシルーα−ラク１〜−スを用い）ご１１冒こは、Ｏ
−α−１−７］ピラノシル−（１−３＞−０−β−Ｄ−
がラクトピラノシル基を認識でさる特異性の高い抗体が
、ハプテンとしく４″−（χ−１−７−］ピラノシルー
Ｃχ−ラク１〜−スを用いｉＪ時には、０−α−１−ツ
ー１ピラノシル−〈１−〉４）−〇−β−Ｄ−ガラクＩ
へじラノシルＨｔ　４−認識できる特胃抗体が、またハ
ブアンどして６−−α−１−フ］ピラノシルーα−ラク
ｌ〜−スを用いたＩＬ’ｌには、０−α−１−一フ］ピ
ラノシル−〈１→６）−〇−β−Ｄ−ノｆ−７りトピラ
ノシル基を１認識できる特巽抗体が各々製造（・きる。 １−記（゛製造された抗体は、消化器癌等の陥細胞例え
ばヒ１〜人腸癌細胞及びマウス　テラ１〜カルシノーン
幹細胞とは結合Ｊるが、正常組織例えば大１１ｆｓ　粘
膜、１１１臓、胆ｉ＆、ｒｆ４臓、肺臓、甲状線、胸腺
、リンパｉｉｉ　、筋肉、結合組織、血管等のし１〜ｉ
常組織や小腸、大腸、肝臓、腎臓、副翠丸、卵巣等のマ
ウスｉ［常組織等とは結合しない特徴を有し１いる。 更に本発明者らの（σ］究によれば、消化器癌笠の癌腫
特に大腸癌細胞によって、α−７］ピラノシル−（１→
３）−、（１→４）−父は−（１→６）−がラフ１〜ピ
ラノシル基を有する癌関連糖鎖が産ｔ１され、かつ癌患
者の体液中にもこれが存在することが見出された。従っ
てα−フ］ピラノシルー（１→：”、）　　、−（１→
４）−又は−（１→６）−ガうり１〜ピラノシル基を特
異的に認識できる抗体の利用にＪ：れば、癌細胞もしく
は癌組織１−の又は体液中の癌関連糖鎖を免疫反応（抗
原抗体反応）により測定Ｊることができ、これにＪ：り
癌の診断をすることができる。本発明はかかる癌関連糖
鎖の測定ｌｊ法乃〒癌の診ｌＸ１ｉ　Ｐｉ法及びこれら
に利用する癌診断用キラ１−をも提供するものである、
。 本発明のｌ’　Ｎ１３癌関連糖鎖の測定枝び癌の診断に
利用される抗体としＣは、前記のことくして得られる抗
体叩ちα−フ］ピラノシルー（１→３）−１−（１→４
）−又は−（１→６）−万うクトピラノシル基を特異的
に認識できる抗体をいずれも使用で゛きる。４体的には
Ｏ−α−１−−７］ピラノシル−（１÷：’、）−０−
β−Ｄ−ガラク］・ピラノシル基を認識Ｊる抗体（以下
「抗体−■」とする）、０−α−１−−−７１ピラノシ
ル−（１−）４）−０−β−１）−ガラク１−ピラノシ
ル基を認識Ｊる抗体（以下１−抗体−■」とする）　、
０−α−１−７＝１ピラノシル−（１→６）−〇−β−
Ｄ−ガラクト１で→ノシル林を１する抗体（以下「抗体
−■」、七（）ろ）を今けることがＣきる。これらのう
らでは抗１４１１がｏｒ　、ｉ：ｔ、い。まＩこ癌関連
糖ｕ１とは、α−フー１ピラノシル　（１→３）−１−
（１→４）−又は−（１−→６）−万うク］〜ピラノシ
ル基をｉＪる糖山自及び　又は糖脂質を挙げることがで
きる。。 本発明の癌関連糖鎖の測定は、通常の方法に従い、例え
ば員体的には」ソ下の如＜ＬＴ行／ｊわれる。 即ｔ）測定＋４１１１としくＩＩＩ胞及び・′又は１１
織片を使用Ｊる場合は、通常の間接艶疫法に従い１１わ
れる、。 この方法によれは、生理食塩水又は通常のリン酸塩緩衝
液（ＰＢＳ）等のＭ函液中に浮遊した細胞に１又はガラ
ススライド１に固定化した組織切片に、本発明の抗体を
免疫反応ざけ、細胞又は組織片を［記緩物液で充分に洗
浄後、常法通りに標識抗体法により、又は標識プ目ナイ
ンへの使用にＪす、細胞又は絹１１ν１に結合した本発
明抗体の有無を調べればよい。 標識抗体法においては、本発明の抗体を製造した動物種
の抗原に対する標識抗体、例えば標識抗ウサギ免疫グロ
ブリンＧ抗体、同抗マｒ”ノス免疫グ［１プリンＧ抗体
、同抗ヤギ免疫η（］プリンＧ抗体等を適宜選択して使
用づることがぐぎる。１記標胤抗体及び標識ブ［］ティ
ンＡの標識剤とし′−（は、各種の螢光標識物質又は＾
イ素標識物質を利用できる。代表的螢光物質としては、
例えばフルＡレツ１！イン・イソブオシｊ’　ｔ　−ｔ
〜（ＦＩＴ％Ｇ＞、テトラメチル１コーダミン・イソヂ
オシア１−＋・（１−ＲＩ　Ｉ　に）　、胃４Ｉｉ！＋
１−グミン・イソ”Ｊ　Ａシアナート（ＸＲＩＴＣ）、
ｎ−ダミン１３・イソチＡシｉ’　ｊ　−１−、ツク［
’１０１〜す７ジンフルオレツセイン（ＤＴＡＦ）等を
、酵素標識物質としては、例えばパーＡ１シダーゼ（Ｐ
ＯＸ）　、マイクロパーイキシグーピ、キモトリプシノ
ーゲン、プロカルボ１シベプチダーぜ、グリレロアルデ
ヒドー３−リンＨｍ２水素酵素、アミラーゼ、ボスホリ
ラーゼ、Ｄ　−Ｎ　ａｓｅ　、Ｆ）−Ｎ　ａｓｅ等をそ
れぞれ挙げることができる。これらで−標識化された抗
体又はプロテｆン△としては、市販のもの又は常法に従
って作成したもののいずれを使用してもよい（Ａｃｔａ
。 に面ｏｃｒｉｎｏ１．ｓ　ｕｐｐｌ、、　１６８，２０
６　（１’）γ２）及び１’　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔ、　Ａ
　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　５７−．７１
３　（１９６７）参照］。水沫においでは、前記本発明
の抗体で処理した細胞又は組織片に、前記と同様の糾栴
液で多め希釈した標識抗体あるいは標識ブロー１インＡ
を反応させ、前記と同様にして細胞又は組織片を充分に
洗浄後、細胞又は組織片１に存（１りる標識活性（螢光
活１′／１には酵素活性）を常法に従い測定υる。 １１１１１定口斜とし−Ｃ（４液を使１［１する場合も
また常法に従うことができる。ここで体液としては例え
ば血液、細胞組織液、リンパ液、１水、腹水、羊水、胃
液、尿、膵液、髄液、唾液等又は前記の細胞又はＩＩＨ
片のｉＪ溶化後の遠心上清等を使用することができる。 上記細胞又は４１１織片の可溶化後の遠心上清は、通常
の方法例えばホモシネ−１〜法や可溶化剤を用いる可溶
化の後、これを遠心分離して上清を採取することにより
得ることができる。また血液を使用〕する場合は、通常
血清又は面漿どし°Ｃ使用り“るのが好ましい。測定【
こ用いられる体液のｔＩｊは、０．１〜１０１稈度採１
１ｉ２７１ればＪ、い３、上記各種体液を測定材料とす
る本発明方法は、通常の競合法によるラジオイノ１ノア
ツセイ法（Ｒ１へ）又は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によ
り行うのが好ましい。これら方法の操作、手順等は通常
の方法に従うことができる。即ら通常の溶媒中、一定品
の標準抗原、Ｗ、識抗原及び抗体を競合艮応ざ１！、次
いで抗原抗体結合物（免疫複合体））及び非結合抗原を
分離し、ぞのいずれか一方の標識活性を測定し、既知ｉ
１ｉ’ｌｌの標Ｑｊ抗除に対する標準曲線を作成Ｊる。 同様に標準抗原の代りに温石未知の被検試料（体液）を
使用してその標識活性を測定し、前記標準曲線より被検
試料中の使用した抗体に対重る免疫感受性物質（癌関連
糖鎖）ωを定吊号ることができる。 標準抗原としては、使用する抗体に免疫感受性を右Ｊる
物質（抗原乃至そのハプテン）を使用することができる
。該ハプテンとしては、例えば抗体−１を使用りる場合
には、３−−一α−１−−フー１ピラノシル−Ｃχ−ラ
クトースを、抗体−■を使用りる揚台には、４′−α−
１−７コビラノシルーα−シクト−スを、抗体−ｍを使
用づ°る場合には、６−ｔｘ−１−ノＴ１ピラノシル１
．−α　−ツクドースを例示【・きる。、１：た抗原ど
し−Ｃは１，２各ハプテンに灼応Ｊる抗原、具体的には
後記Ｊる抗原の製造例で得られる如き上記ハブテンとキ
ャリアー蛋白、例え番ｒＫ１】ｌ　ｌ）−ｒ３ｓＡどの
結合物を例示することができる。 標識抗Ｄｌとしでは、標準抗原を例えば１２！ｉｌもし
くは３１１等の放射性物質又は前述した各種酵素標識物
質等で標識化したものを使用すればよい。 標準抗原に上記放剣性ミ１−ドを尋人して標識化する場
合は、例えば前記抗原の製造において説明したイソチオ
シアネート体くハブデンーイソチオシアネー１〜結合物
）又はこれと主１アリア−蛋白との結合物、具体的には
後記する抗原の製造例ぐ得られる如き３′−１４′〜又
は６′−α−１−−７］ピラノシル−α−ラクＩ・−ス
ーｐｔｐ、又はこれど１３８　Ａとの結合物を、ポル１
〜ンーハンター（Ｓｏ目００−１旧＋ｔｅｒ　）試桑を
用いて常法通りに標識化ヴることがぐきるＣ、ｊ　、　
Ｆ３　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、２５４゜９３４９−、９３
５１　（１９７９）参照〕。またり［１ラミンＴを用い
る酸化的ヨード化法（Ｎ　ａｔｕｒｅ、　１９４．　４
９５頁（１９（３２’ｌ　、１１１０Ｃ１１ｅ１１．　
Ｊ　、　８９，１１４與（１９６３）　）に、Ｊ、つ（
」−ド化されたチ［ｌシン槙を前記のイ＼ノヂＡシアネ
ートカップリング法にまり前記Ｐ　Ｉ　Ｐ基に結合さけ
たもの、あるいはＢＳＡ棋のヂ１：１シン残鳥４１Ｋｊ
ｉｉＪ様にヨード化したものを使用することもできる。 また、３Ｈ４−税入する場合も常法に従い、前記標ｔ％
（抗＋１７ｔを例えばＮａ　Ｒ３ｆｌ、を用いた還元ｔ
ｓ＜　応ＩＣイ・Ｉ　−６コトニ、Ｊ：　Ｖ）　又ハ（
Ｃ３トｌ３ＣＯ）２０によりＩセチル化づることにより
ｍ識化された標識抗原を得ることができる。前記測定系
（７）溶Ｗ、！：しでは、免疫反応に悪影響を与えない
もの、例えは水、生理食塩水、０．１モルトリス塩酸緩
絢液（ｒｌ、ｌ−１＝＝７．５）　、０．１モルリン酸
塩緩衝液（ρＮ＝７．４）等のｐｌ−１が６〜７．８の
Ｍ衝液か好ましい。上記免疫反応は、常法に従い４５℃
以ト、好ましくは４〜／ＩＯ°０．１〜４０時間程時間
待われる。反応によって生成した免疫複合体と非結合抗
原どの分１ｉ１１１は、公知の方法に上って例えはデキ
ストラン　活性疾法の後、あるいは前記抗体に灼Ｊ６第
２抗体例えば１−開方法に＝ＨいＣウリギ抗体を使用η
る場合はヤギ抗つリギＩｕＧ抗体鋳を反応ｉ＼ｌ！　１
．：　（４Ｑ、遠心分離法によ−）１分１ｉ１１１−２
１ればよい。 以ト、１記測定法の一員体例を挙げ（史に訂述１する１
、 後記抗１ｔｉミのＩ！Ａ造例（得られる３−−α　１−
〕Ｉじ゛フッシルーα　ラフ１〜−スーＰＩＰの５〜１
０１１ｇをポル１〜ンハンター試薬を用い１２５１で標
識して〈室温、約６０秒〉、標識抗原を製造する。標準
抗原としてコ）−−α−川用−フ］ピラノ、シル−α−
ラフ１〜−スを、また抗体としＣ抗体−Ｉを使用−ｃＪ
　Ｚ）。０．５％ＢＳＡ及び０．０２％Ｎａ　Ｎａを含
む０．１Ｍリン酸塩緩ＴｈＭ（ｌｌＨ＝７）０．２ｍｌ
、上記標識抗＋ｊｊ’　０．１　ｎ＋１　（１９’Ｊ　
１１００００ｃｐ　）　、適当濃度の抗体−Ｔ　Ｏ、１
ｍｌ及ヒ各４１６亀の標ｉ１抗原０．ｊｍｌを４℃、２
４　時［イ＞　＋　１１へ−１・りる。次いで、０．１
ｍｌ正常ブタ而清白油（’１．！’ｉｍｌデキス１ヘラ
ンー活性炭懸濁液を加えて４℃Ｆ３０分放置後遠心分子
ｌｉｔ　（３０００ｒｐｍ　、３０　分）りるかあるい
は、過当温順Ｉ７ｒ抗つザ＝ｌ−１０Ｃ抗体０．１ｍｌ
を加え４℃、２４１１８間インキュベー１〜後同様にし
て遠心５＞離して、免疫複合体及びジ１結合抗ハハを分
１１．．’ｅの放０４活１／！を測定覆る。棉４■抗Ｄ
ハの各濃度ｔこ刊しくでの放ｑ」活ｆノ１を求めるが、
あるいは用いた抗イホの力１ｔｌｌｉに相当する抗体と
標準抗原どの結合子（１３０）を１００９６としノ、二
どきの抗体ど標識べ１−ｆドどの結合体（１３）の自分
率を求め、標準曲線を作成する。また温石未知の試料を
標準抗原の代りに使用して同様にして故躬活性Ｙは自分
率を求め、この値から前記標準曲線を利用して、試料中
の癌関連糖鎖の定量を行なうことができる。また１−開
方法によって、体液中の３′″−α−１−−−−ノロピ
ラノシル−α−ガラクトピラノシル阜を右りる’Ｊｆ４
関連糖鎖の測定が可能である。 史に１”記（こおいて抗体−■又は抗体−■を使用し、
罰応Ｊる抗ＩＩ：］系（標識抗原及び標準抗原）を使用
しく同様にしく測定Ｊることにより、体液中の４−α−
１−−ノ１ピラノシルーα−ガラクトピラノシル基叉は
６−−（χ−１−−）］］ピラノシルーα−万ラク１〜
ピーツノシルをｆｌづる癌関連糖鎖を測定で゛きる。 本発明の１ｈ【：測定法を実ｆｌｆ！！ｉｌるのに特に
便利なＩ）法は、血漿’ｌ’血清のＪ、うむ体液中の癌
関連糖鎖＾！を決定りるｌＪめの一１ツｌ−を使用Ｊ６
ｈ法である。 このＪ、うむ４：ツ１〜には、癌関連糖鎖と特異的に抗
１［；」抗体反１ト）をりる抗体即ちα−ラフ−１ピラ
ノシルー１→３）−１−（１→４）−又は−（１→６）
−ガラクトピラノシル基を特異的に認識できる抗体を含
有せしめることが重要である。この抗体試薬には、グリ
セ【］−ルやウシ血清蛋白のような安定化剤及び／又は
保存剤を添加づることができる。 好ましくは、この抗体試薬は凍結融解したものであり、
ギッ１−には水溶性もしくは水と混和しうる溶媒を含有
させることができる。更にこの抗体試薬には、再構成さ
れた試薬系を〜定のｌ’ｌ　Ｈに保つための緩衝液及び
７／又は使用前に試料が悪化づるのを防ぐための保存剤
及び、′又は安定剤を添加する（二とｈ＜　’Ｐさる１
、緩衝液は一ヘツ１−試桑の必須成分どは考えられない
が、本発明の測定法を実施する際に、１１１１を６・〜
７．Ｅ３とするｂのを用いるのが９ｆ床しい。また再構
成剤は好Ｊニジ＜は水を含ｌυだもの（・あるか、水の
一部又は９部を水と混和しつる溶媒で置き換えることも
できる。水と混和しつる溶媒は当業者に周知′Ｃあり、
例えばグリセリン、７７ルｊ−ル類、グリニ１−ル類、
グリー］−ルニ［−チル類等を使用できるが、もちろん
これらに−限定されない。 か＜シーＣ本発明によれば癌関連糖鎖を有利に測定づる
ことができる。測定された癌関連糖鎖レベルを健康人の
当該レベルと比較することにより、被検者にお（プる初
期から未明の消化器等の癌腫、特に大腸癌を診１１ｉ−
Ｕることができる。従って本方法は特に癌の早期発見に
極めて有用（・ある。 以下本発明を更に詳しく説明するため糖抗原（］］ＴＩ
−ス抗原及び抗体の製造例を挙げる。 抗原の製造例１ （１）３−一α−１−フ］ピラノシルーα−ラク１−−
スーツ１ネチルアミン誘尋体の製造３−−α−１−ノー
１ピラノシル−α−ラクトース０．１ミリモル及びβ−
（ｐ−アミノフェニル）Ｉ−チルアミン：３．５ミリモ
ルを密閉容器に入れ、室温ｒ−１５時間撹拌して反応さ
せた。Ｍ！Ｔタノール（１，ｈｎ＋Ｉを反応混合液に加
え、次いで水素化ホウ累１トリウム１２ｍｇを懸濁させ
た純エタノール１１を）１１１えＷ　？ｌｎｆ　’（−
”ｙ＋　１１５間撹拌しＩＣ６次い−（・水４１を加え
て希釈し、水冷下に氷酢酸を滴Ｙ　シー（ｐＨ計）、６
に調整した１、減圧下にＴタノールを留人後水を加え（
５１とした反応混合液をセファデックスＧ−１０カラム
（２，５ｘ　１００ｃｍ）に通し、ン １Ｍ酢酸−ピリジン緩衝液（ｐＨ＝５．０）で溶出した
。溶出液を５１づつ分画ｌノ（、各画分につぎ）］−ノ
ール硫酸反応による中性糖の測定及び（）Ｄ２　ｏ　５
１１１１１での吸光麿測定を行ない、くれそれのピーク
が一致する自分を集めて凍結乾燥しＩＣ８凍結試料を２
ｍＭ酢酸−ピリジン緩衝液（＋）ｌ−１５，０＞に溶解
し、ワットンンＣＭ　５２カラム（０、５Ｘ　２　ＯＣ
Ｒ＋）に通じ、同緩衝液で未反応原料（３−−ｔｘ　−
１−−７］ピラノシル−α〜ラクトース）を溶出後、０
．１Ｎアンモニア水で溶出した。溶出液を２０滴（約０
．６ｍ１）づつ分画し、各両分につさ４−記と同様にし
て中性糖測定、及び０１）２　ｕ　、ｎ１ｌｌでの吸光
痘測定を行＜Ｋい、ピークが一致する両分を採取し凍結
乾燥した。 か＜　Ｌ　’（３−一α−Ｌ−）］］ピラノシル−α−
ラフ・−ス−）「ネチルアミン誘導体を得た。このもの
の糖組成は、万ズクｏ　ｖ　ｌ−グラ゛ノ、イー（１３
ｉｏｃｂｅｍ、　ｆ３１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｃｆａ、、
２２２，３３９−３４７）及び高速液体り［Ｊ−Ｎ／　
ｌ−グラフィー（Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＲｉｏ
ｌｏｏｙ、　９０．４４１−４４４　　（１９８２）　
）により確認できＩＪｏ （２）　３−−　（ｘ−１，−７：１ピラノシル〜α−
ラフ（〜−スー１）−イソチＡシアネー１〜−フ■ネチ
ルアミン誘導体（３＝、−（χ−１−フコピラノシルー
α−ラクトース−ＰＩＰ）の製造 」記（１）て得Ｉこ３−−α−Ｌ−フー１ピラノシルー
α−うり１−一スーノエネヂルアミンｊｌＮ１体の２５
　ｔｔモルを、０．１Ｍ炭酸水索す１〜リウ１８水溶液
（１１ｔｉ　＝　８．　（’）　＞　２ｍｌに溶解して
、チオホスゲン６５μｔルを倉むりｎ　ｌ”ｌポルノ、
２．５＋１１１．）に由騎し、１的間激しく撹拌した。 反応混合物を遠沈管に移し、り１１１１ホルム２１で２
１回抽出し、過剰のヂＡボスゲンを除去し、水層を集め
、窒素ガスを通しく残存りるり［１０ホルムを除去した
。 かくして３″　−α−Ｌ−）］］ピラノシルーα−フタ
ドースー〇イソチオシアネーｉ・−フ■ネチルノアミン
誘導体を水Ｍ′液として収１１シた。 （３）　：”、′″−α−１−α−１−−フ］ピラノシ
ルーα−ス−１’ｌ−イソチオシアネート−フェネチル
アミン誘導体と牛血清アルブミンとのｈツノリング反応
による糖抗原（３−一α−１−）〕〕ピラノシル−α−
ラフ１〜−スー１’　Ｉ　Ｐ　−Ｂ　Ｓ　Ａ　）の製造
１記（２）で得た水性液を、牛白油アルブミン（ＢＳＡ
）０．２μモルを含む０．５Ｍ塩塩化上トリウム−０，
１ｔ？Ａ酸水素−ノートリウム水溶液（＋）ｌ−１・−
９，５）に加え、室温で１８時間撹拌して反応ざＵた。 反応混合液をダルベツコ−処理のＰＢＳ（−）（生理ｆ
：１塩水−リンｔｌ塩緩酌液）２１に対しく透析して、
未反応の３−−α−１−ノ］ピラノシルーα−ラク（−
−ノー０−イソチＡシアネ−１・−７丁ネヂルアミン誘
尋体を除去した。 透析液を１２時間毎に３３回交１＠後、透析された液（
ごつさ、ｌ］−り一法及びフ」ノール橘酸及応を（１な
い、ぞれぞれの蛋白量及び中性糖の定ムｌを行なった。 イの結果得られた糖抗原は、！Ｉ而白油ルｌミン（１３
ｓＡ）ＩＥルに対して３′−α−１−−−フ−１ピラノ
シル糖鎖が約２０土ル結合していＩＣ８かくしＣ目的と
する糖抗原液を１９だ。これを凍結保存した（これを「
抗原−■」とＪる）。 抗原の製造例２ 前記５、抗、ｌ畠の製造例１において、３′−α−１−
ノコピラノシル−Ｃに一ラクトースに変えて４′−（Ｘ
　−１，−−ノコピラノシル−α−ラタトースを用い（
同様にしＣ目的とする糖抗原液を得た。これを凍結保存
した（これを［抗原−■１とＪる）。 この糖抗原は、牛血清アルブミン（Ｒ８Ａ）１モルに約
して４′−α−１−フ］ピラノシル糖鎖が約２５土ル結
合してい！、：。 抗１６ｉの製造例；〕 前記抗原の！′Ｊ込例１において、３′−α−１，−フ
ーＩピラノシルーα−ラクトースに費えて６−−α　１
−ノ」ピラノシル−α−ラク１〜−スを用い（同様にし
′Ｃ目的と４る糖抗原液を得た。これを凍結保（Ｊ−シ
た（これを「抗原−Ｉ［［ｌと（る）。 この糖抗昧は、生血清アルアミン（＋３ＳＡ）１ｔルに
一４シ（６−−α−Ｌ−）ニー１ピラノシル糖鎖が約２
３土ル結合していた。 抗体のｆＪ造例に ］−シーラント白兎の７ツトパツド（ｔｏ（ｉｔｐａｄ
ｓ）に、」−記抗原の製造例１で得た抗原−■の０．４
ＩＯを含む一ノロインド完全補助液１１をン１０・１し
た。３週間後向績の抗原−■含有７０インド完全補助液
を）％躬し、この操作を２週間１１こ３回繰り返した。 第３回目（最終）の注射から１０１１後に、試験＃物か
ら採面し、遠心性態１して抗血清を採取して目的の抗体
を得た。これを「抗体−■」どする。抗体−Ｉ　Ｌｔ　
−７０℃に保存される。また−１−記で得られた抗血清
を凍結乾燥して抗体−■の乾燥品を得た。 抗体の製造例２ 前記抗）３？ｔの製造例２で得た抗ハト−■を用い、抗
体の製造例１と同様にして目的の抗体（抗血清）を得た
。これを［抗体−ＩＩＪと号る。 抗体の製造例３ 前記抗原の製造例３で得た抗原−■を用い、抗体の”１
５４例１と同様にして目的のＶｃ体（抗血清）を百だ。 これを［抗体−■］とする。 以下、抗体の特異性試験例につき詳述する。 （抗体の特異性試験　■〉 （１）　各種細胞を遠心性１ｉ１１ｔ　（５００Ｘ（＋
　）　Ｌ、、、リン＠塩緩衝生理良塩水（カルシウムイ
オン及びマグネシウムイオン含有、ｐＨ＝７．２）の５
０１ｒ’＋　６！　ｃ　２１ｏｌ洗浄覆る。得られる１
１胞を［記すン酸塩緩＄１乍８１良塙本（、１％（Ｖ　
／ｖ）溢陵となるよ・）に懸渇ｃキｔ！、この懸濁液５
０７ノ１に、抗体の製造柄゛１−３で１ｊ４　／こ抗体
（抗体−Ｉｍ−■）の−ｆれぞれを予めリンｕ　Ｙ＝　
Ｉｍ　ｍ　４１−即食塩水（）」ルシウｌいイオン及び
マグネシウムイオン含有）で２０容積１８に希駅し／、
：ｂの、５／１まス→照として同様に楯釈されたｌ−浴
用血清を混合し、各混合波を４℃下１助間−イン％、　
、１　ｉ＼−１−りる。イの後置細胞をリン酸塩ｋ　綾
１　’ｌ’　ＩＩｌ！　ｌｌｉ　ｊ品ｔｊζ（カルシウ
ムイオン及びマグンシウｉｘイオンＲイ］、　１１　＋
−１＝　７．２＞　１７）　１００１８１ｍ’（−洗’
ｔ’ｆ　Ｌ／　、ン入にｌ’　ｉ　−Ｉ　Ｃが共有した
羊ＩＩ！ＬＬＣＩ　’Ｊ　Ｇ（、−（ルス　イＣ−グ（
Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅ＋Ｉａ　）社製〕の１１．０希釈１）
シ４−用いて４℃下１１１：１１間インキ］ベー１〜？
ｌる。引き続き１，１記すンＭ塩ｕ　！ｊ９：理食塩水
食塩水＝７．２＞の１００倍量で２回洗浄後、各ｌｌｉ
胞を溝削螢光顕微鏡（４リンバスモデル１３１１−ＲＦ
’１−１８．オリンパス光学社製）で観察し、富士カフ
ーフィルムＡＳＡ’１００（冨１フイルムネ１￥Ｊ）で
線側する。 （２）　癌又は１Ｆ常組織を迅）中（Ｊ凍結し、クリＡ
スタツｔ−（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　（’）ｐｔｉｃａ１
社製）により、超ａ　１．ＩＣハを得る。これをガラス
スラーイド上にアセ１ヘンで１分間固定して検体とし、
史にＦＩ丁〇−竺「杭先１ｏＧの代り＆Ｔ　ｒ　Ｉ　１
　（’、　、　、￥杭先１　り　Ｇ　−Ｆ　（ａｂ）　
−２（（’；ａＤ１１ｅ１社！Ｖ）を使用して、Ｌ記と
ｌｌｉ１様番、ニして試験Ｊる。 ■記（１）及び（２）において、用いた各細胞又は組織
片と抗体−■−−■との艮応ｔｑを調べた結束を各抗体
んにＦ２第１表に示１゜第１人にお１する呂１す１．卜
１１１に−）いてのｉｌｌ’　１Ｉｌｌｉ記Ｓ３は、ぞ
れぞれ次のことる示１゜ １・・・・染色像が認められる１゜ −・・・・染色像が認められ１１−い。 第　　１　　表 １Ｆ常細胞 ンウス赤面球　　　−−一〜 マウスリンパ球　　−−− マウス稗細胞−−−−−− マウス胸腺細胞　　−−−−− ヒト赤面法 （タイ−／’ＩＩ）　　　−−− （タイツ１Ｏａ）　　−−− ンウス−Ｔう１−カルシノーマ ｔ＝　−、９−ｔ　　　　　− ８ＳＴ−Ｍ　＋　−１−十 −１７」旨　崩為−−−− １１１１ｉ１４−　　　　−　　　　−−胆のう　　　
　　　−−−− 眸　　瞼　　　　　　　　　　−−− 肺　　臓　　　　　　　　　　−− 甲状線　　　　　　−− 胸　　腺　　　　　　　　　　−一一一リンパ節　　　
　　−−−一 筋　　肉　　　　　　　　　　　−一一−結合組織　　
　　　−−−〜 而　　菅　　　　　　　　　　　−−−ＩＭ　　１１　
１）１ ヒト大腸ｉノデノ カルシノーマ　　　−１　　　　　）−＋（手術片） 尚ニー記におい（抗体−’ｒ−−−ｔｉ＋の代りに対照
どして使用した正常兎面清の場合は、１べて染色像は認
められなか−）ノこ。 （３）　［記（２）の試験で染色像が認められたヒ］・
人１％ｌｚ７ノ））ルシノーマ（手術片）を検体としＣ
１抗体−■を使用し、第−反応時に０．２Ｍこ３−一α
−１−ノー：１ピラノシル−α−ラク１−−ス、０．２
Ｍラクトース、０．２Ｍフコース又は１０１１（１，／
ｌｉｅ　Ｓ　Ａ　＋を存在させ、上記（２）と同様にし
て試験した。ぞの結束、染色像は３′−α−Ｌ−°ノー
１ピラノシルーα−ラクトースにより減弱されるが、ラ
クト−久、フコース及びＢ　Ｓ　Ａでは染色像に変化は
認められなかった。 く抗体の特異牲誠談　Ｉ〉 Ａ−チテ【］−イ＜　０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）二手拡
散分析法により、抗体−１〜抗体−■の特異性を以下の
通り講ぺた。ＩＩＩら、１％寒天ゲル（０，０１モルｌ
−リス塩Ｍ緩軽ｉ液（ｐＨ＝７．６）中に２％トリトン
Ｘ−１００，０，１５Ｍ−Ｎａ　（］　、フフェニルメ
ルルスルニルノルオライド５０μｇ／−１及び０．０５
％ＮａＮうを含む寒天ゲル）をスライドグラス１−に積
層し、その中央に抗体を買さ、周辺にぞれぞれ２０１ｔ
　ｇの、３−一−α−１−゛ノコピラノシル−α−ラク
トース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ、４　′−α−１−−ノ」
ピラノシル−α−ラク１−−スーＰｌ））Ｆ３ＳＡ、６
′−α−１−−ノ］ピラノシルーα−シクＩ・−スーＰ
ＩＰ−ＢＳＡ、α−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｆ）　−Ｉ　
Ｓ　Ａ及びＢＳＡを含む水溶液を置き、拡散試験を行な
った。 結東を第１図〜第３図に示η。第１図は抗体−１の拡散
状態を示１図であり、第２図は杭体−■の拡散状態を示
す図であり、＝にだ第３図は抗体−■の拡散状態を示す
図である。各回において（ａ）は３−−一α−し一７コ
ピラノシルーα　ラクトース−ＰＩＰ−１１８Ａ、（ｂ
　）は４−−α−１−ノーＩピラノシルーα−ラクトー
ス−ＰＩＰ１３ＳＡ、（Ｃ＞は６゛−α−１−−７］ど
ラノシルーα−ラク１−−ス−ｒ’　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ、
　　（１１）はα−うクト−ス−１）　Ｉ　Ｐ−ＲＳ　
Ａ及び（ｅ　）はＢＳＡをそれぞれ承°す。各図より次
のことが判る。即ち、抗体−Ｔは、３−−α−１−フコ
ピラノシル−α−ラク；・−スーＰＩＰ−ｎＳＡとは沈
降線を形成するが、仙の抗「ｇミとは沈降線を形成しな
い。抗体−■は、４゛　、α−１−一一ノ１ピラノシル
ーα−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ　−ＢＳ　Ａとは沈降線
を形成−４るが、伯の抗ＩＩＩとは沈降線を形成しない
、１抗体−■は、６−−−α−Ｌ−−７コヒラノシルー
α−、ラクトース−Ｐ　ｌ　１）−［３Ｓへとは沈降線
を形成覆るが、他の抗原とは沈降線を形成しイｔい。尚
上記試験においτ、抗体−１１は前記抗体のＨ３％例で
得られたもの１１当り０．４ＩＩ１ｇのＢＳＡを加えて
４℃、−晩放胃後速心分−１１）で１精を採取し、抗［
３ＳＡ抗体を除去した後に、上記試験に使用した。 図１ｎ１の簡単／、＾説明 第１図乃〒第３図は、本発明の抗体−１へ・抗体−■の
二車拡散分析法による拡散状態を示１図である。１ （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ■　α−−−ノー］ピラノシル−（１→３）−、−（１
   →４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシル格を含
   有゛りる４リイ糖をハプテンとし、これをキャリｊ′−
   蛋白と反応させて糖抗原を得ることを特徴とりる゛ノー
   ゛１−ス抗；東のｌｌｌ造法。