JPS62190074A - ヒトの癌に付随したジフコガングリオシドを規定するハイブリド−マ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒトの癌の検出と治療に役立つモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系に関するもので
ある。

［発明の背景］ 細胞表面のグリコスフィンゴリピド類の化学組成、新陳
代謝および組織構成における大きな変化は、腫瘍発往時
の変換に伴う共通の躾表象を特徴づけるものである。ヒ
トの種々な癌を標的とじたモノクローナル抗体に関する
最近の研究から、通常、ヒトの癌に成る種の糖脂質が蓄
積されることが明らかになった。例えば黒色腫でのＧＤ
１ガングリオシド、バーキットリンパ腫におけるＧｂｓ
、結腸直腸癌、胃癌および膵臓癌におけるシアロシル−
Ｌｅａガングリオシド、および結腸直腸癌および肝癌で
の６Ｃフコガングリオシド（ＶＩ’ＦｕＣ■３ＮｅｕＡ
ＣｎＬＣε）などである（総説については、）ｌａｋａ
ｍｏｒｉ、Ｓ、等、Ｊ　、　Ｎａｔ＋、ｃａｎｃｅｒ　
Ｉ　ｎ８ｔ、　　７１：　　２３１−２５１．１９８３
を参照）。ごく最近、ジーまたはトリフコシル化型２鎖
を有する糖脂質が非常に種々のヒトの癌に見出され（Ｊ
　　　ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　　２５９　：　４６７２−４６８０．１９
８４＞　、またモノフコモル化型２鎖とはジーおよびト
リフコシル化型２鎖を区別可能なモノクローナル抗体が
得られている（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ　ｈｅｍ、　
　２５９　：　４６８１−４６８５．１９　　。

８４）。このような抗体の１つであるＦＨ４は、胃員お
よび結凪・直風における種々の腺癌に共通であるジフコ
シル化型２鎖を有する抗原と反応するが、しかしながら
、正常である胃腸および泌尿生殖器における上皮組織の
少数梯類の細胞に限られている。ヒトの腺癌のガングリ
オシド類に関する他の研究ではシアロシル２→６ラクト
ネオテトラオシルセラミドが大量蓄積されるのが証明さ
れており（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：　　Ｎ
８１９−　１１８２２．１９８３）　、またガングリオ
シド６Ｂおよびガングリオシド６Ｃと呼ばれる他の新規
な複雑なフコガングリオシド類の大量蓄積が報告されて
いる（旦−ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏｐｈ　ｓ、　Ｒｅｓ
、　Ｑｏｓｍｕｎ、ユ１３：　　７９１−７９８．１９
８３）。従って、ガングリオシド６Ｂを単離同定すると
共に、この構造を蜆定するハイブリドーマ抗体を増殖さ
せて、正常組織および変化した組織におけるその特異性
および反応性を確立することが望まれる。

［発明の概要］ 本発明は、ヒトの結腸腺癌中に蓄積されるが、正常結腸
粘膜中には存在しないフコガングリオシド６Ｂを標的と
したモノクローナルＩＯＭ抗体（ＦＨ６）を分泌するハ
イブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８８７３）を
提供するものである。

抗体ＦＨ６の標的である６Ｂガングリオシドの構造は次
の通りである。

ＮｅｕＡｃ　ａ　２→３Ｇａｌβ１−＋４ＧＩｃＮＡｃ
β１→■ １”ｕｃα１ ３Ｇａｌβ１−＋４ＱＩｃＮＡＣβ１−＋３Ｇａｌβ１
→Ｆｕｃα１ ４　Ｇ　Ｉｃβ１−）１Ｃｅｒ 抗体ＦＨ６を分泌するハイブリドーマは、ガングリオシ
ド６　Ｂ　（Ｗ’　ＮｅＵＡＣＶ’　ｍ３Ｆｕｃ２ｎＬ
Ｃｓ）との反応性と、他の糖脂質、例としてごく近縁の
構造を有する、例えばシアロシルラクトネオテトラオシ
ルセラミド（ＩＶ’　ＮｅｕＡｃｎＬｃ　４　）、シア
ロシルラクトフコペンタオシ（ＩＩＩ）セラミド（ＴＶ
３ＮｅｕＡＣｌｌｌ３Ｆｕｃ　ｎｌ　Ｃ４）　、シアロ
シルラクトフコペンタオシ（ＩＩ）セラミド（シアロシ
ル−Ｌｅａグリコリピド：ＩＶ”　ＮｅｕＡｃ　ＩＩＩ
’　ＦｕｃＬｃ４）、および６Ｃフコガングリオシド（
シアロシル２→６フコガングリオシド：ＶＩＧＮｅｕＡ
ｃ　ｍ”　Ｆｕｃ　ｎＬｃ　６　）が含ｔｎるｍ脂質と
のｍ反応性とによって選定された。抗体ＦＨ６は、結腸
癌、肺癌および乳癌を含む広範囲のヒトの癌との高い反
応性を示すが、しかし成人のほとんどの正常細胞〈但し
特に顆粒球を除く〉とは反応しない。

６Ｂガングリオシドは癌抗原の有効なマーカであるので
、抗体ＦＨ６は各種癌の診断テストや治療の遂行や監視
にも実用的価値を有する。

［実施例］ 糖脂質の呼び方および略名については、本明細書では、
純粋化学および応用化学の国際ユニオン命名委員会の推
奨に基づき、［１２：　　４５５−４６３．１９７７の
記載に従った。

本発明は６日フコガングリオシド（ＶＩ”ＮｅｕＡｃ　
Ｖ’　ｍ”　Ｆｕｃ２　　ｎｌ−ｃ　６　）と特異的に
結合シ得るモノクローナル抗体の産生能力を有するハイ
ブリドーマ細胞を提供するものである。ハイブリドーマ
細胞系Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、　ＨＢ　８８７３はフコガ
ングリオシド類Ｗ３　ＮｅｕＡｃ　７ａ　ｍ’　ＦＵＣ
２ｎＬｃ　ｓおよびＮｅｕＡｃ　ｖＢ　ｌ：ｕｃ　ｎｌ
ｃ　＠　、と特異的に反応するが、しかしＩＶ３　Ｎｅ
ｕＡｃ　ｍ３Ｆｕｃ　ｎｌｃ　４　、ｒＶ”　　Ｎｅｕ
Ａｃ　　ＩＩ［’　　ＦｕｃＬｃ　ｓ　　、ＶＩ’　　
ＮｅｕＡｃ　　ＩＩＩ”ＦｔｌＣｎＬＣ８、Ｖ’　　Ｉ
［ｒ’　　Ｆｕｃ２　　ｎＬｃ６　　、ＩＶ３　　Ｎｅ
ｕＡｃｎｌ　ｃ　４または■３　ＮｅｕＡ（ｎＬｃ　６
との特異的反応性は有しないＩＧＭモノクローナル抗体
（ＦＨ６）を発現する（第１表および実施例３および４
を参照）。

／″ 、７／ ７′ ７・′ （第１表の脚注） 本　　Ｉ　　　Ｒａｕｖａｌａ、　　　＠　　　　、Ｊ
、　　　　　　　、ｉｏｌ、　　　Ｑｈｅｍ、　　　　
　２５１ニア５１７−７５２０．１９７６ 京　　２　　ＭａＱｎａｎｉ、　　　Ｊ、　　　　Ｌ、
　　　等　　　、　　　　　　　　　　　　ｉｏｌ　　
　　　　ｈｅｍ　　　　。

２５７　：　１４３６５−１４３６９．１９８２Ｆａｌ
ｋ、Ｋ　、　Ｅ　、等、３　ｉｏｃｈｅｍ、　３１ｏｐ
ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｇｕｕｎ、　　１１０　：　
３８３−３９１．１９８３本　３　　＠　ａｋｏｓｏｒ
ｉ、Ｓ、　　等　、　　　ｉｏｃｈｅｍ　　　　　ｉｏ
　　ｈ　　ｓｅｓ、　Ｃｏｗ＋ｓｕｎ、　　１１３　：
　　７９１−７９８．１９８３傘４１−１ａｋｏＩｏｒ
ｉ、Ｓ、等、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２５９゜
：　４６７２−４６８０．１９８２ 抗体ＦＨ６は、結腸癌、肺癌および乳癌を含む種々のヒ
トの癌細胞と強い反応性を示すが、はとんどの正常成人
細胞（但し、特に顆粒球を除く）とは反応しない。ＦＨ
６で規定される抗原は、癌抗原の有効なマーカであるの
で、抗体ＦＨ６は種々の癌の診断テストや、治療の遂行
や監視に実用的価値がある。例えば、抗体Ｆ：°６は放
射性核秒と結合させて、哺乳動物の体内に導入し、癌細
胞の存在場所を映做化したり、放射線療法の履行が可能
である。抗体ＦＨ６は癌治療に使用する抗腰瘍薬とも結
合する。

モノクローナル抗体ＦＨ６はさらに、免疫組織学手法に
よる細胞の検出に用いるもので、６日フコガングリオシ
ドを表示する検出可能なマーカと結合し得る。このマー
カは、従来法に周知である蛍光団、酵素、発色団、助酵
素、化学発光物質、酵素抑制剤および放射性核種から選
択可能である。

例えば生検により得られた細胞は、ＦＨ６７−カ複合体
と接触でき、かつ細胞表面に残存するいかなるマーカも
、未反応の反応抗体が細胞から洗い去られた後に、標準
法によって検出可能である。

正常なヒト顆粒球は抗体Ｆ’Ｈ６を用いて同様にして検
出可能であり、血清中の腫瘍付随抗原も、標準免疫分析
法により、但し抗体ＦＨ６を用いて血清中で検出可能で
ある。

次に、本発明の特徴および利点を実施例に基づいて詳し
く、従って当業者に理解されるように説明するが、これ
ら実施例は、特に本発明の精神から逸鋭しない限り、本
明細書により開示された特許により保護されるべき範囲
を限定するものではない。

ここに６Ｂガングリオシドの単離法および特徴を記述し
たが、これは　　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩ１２５９（１６）
　：　　１０５１１−１０５１７．１９８４に記載のも
ので参考までに記述した。簡単に要約すると、モノシア
ロガングリオシド類をヒトの結錫癌組織、特にヒトの結
飄腺癌Ｆ　Ｔ　７５−６２０およびＦ　Ｔ　７５−８４
５の肝臓への転移生成物（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｐ　ｒｏｃ
ｕｒｅｍｅｎｔ　　ｐ　ｒｏｇｒａｒａ　ＪＪａｔｉｏ
ｎａｌ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ
　）から抽出した。この抽出物は、高速液体クロマトグ
ラフ法（ＨＰＬＣ）に２回かけて精製し、６Ｂおよび６
Ｃのみを含有し、他のガングリオシドを一切含まない分
画を分離した。この分画はさらに念入りの高速薄層クロ
マトグラフ法（ＨＰＴＬＣ）によって精製し、６Ｂガン
グリオシドの純粋標本を得た。均質な６Ｂガングリオシ
ドの構造は、メチル化分析法、バーメチル化化合物直接
プローブ質量分光法、界面活性剤の存在無しでのシアリ
ダーゼによる加水分解、および脱シアル化コア糖脂質に
ついての２穆のモノクローナル抗体、ＦＨ３およびＦＨ
４による固体相数射線免疫法とによって決定された。

６Ｂガングリオシドは、ジフコシルラクトノルへキサオ
シルセラミド（ＩＩＩ３Ｖ’　Ｆｕｃ２　　ｎＬｃ６）
のモノシアＯ誘導体、即ちｍ３Ｖ’　Ｆｕｃ２　　ｎＬ
ｃ６の末端Ｇａｌ残基にシアロシル２→３結合したもの
、即ち、Ｖｌ’　ＮｅｕＡｃ　Ｖ’　ｌｌｌ３Ｆｕｃ２
　　ｎｌｃ′６（第１表に示す構造１）として同定され
た。６Ｂガングリオシドの脂肪酸組成は大部分が短鎖の
非ヒドロキシル化脂肪酸であることを特徴としている。

モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得るた
め、Ｋ　６ｈｌｅｒおよびＭ　１ｌｓｔｅｉｎにより発
表された原方法（Ｎ　ａｔｕｒｅ　　（ｏｎｄ　　　ユ
阻：４９５−４９７．１９７５）の変法ＬＪ、−上一ソ
し−ｙｅａ−、ユ阻：１００８−１０１９．１９７９＞
が実施された。

実施例１において単離し構造決定した６Ｂフコガングリ
オシドを３ａｌｓｏｎｅｌｌａ　ｇ＋１ｎｎｅｓｏｔａ
　　（Ｊ　。

ＥＸＩ）、　Ｍａｄ、　　１５０：　１００Ｂ−１０１
９，１９７９、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ（２，ミー：
　　１１６−　１２２．１９７１）に吸着させ、次いで
免疫源として用いた。精製した６Ｂガングリオシド（Ｖ
ｌ”　ＮｅｕＡｃ　ｙｓ　ＩＩＩ”　Ｆｕｃ２　　ｎＬ
ｃ　ｓ　）２０μＱを含有するエタノール溶液５０μＰ
を８００μｃ　（７）１１！ＩＩ！塩緩衝食塩溶Ｋｌ　
（ＥＩＨ７，４）　ト’ＩＩ　合Ｌ／、この溶液に、さ
らに別に調製した酸処理したＳＪｉｎｎｅｓｏｔａ（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　　１４：２７２５−２７３３
．１９７５＞　　２５０μｇを燐酸塩緩衝溶液の、２５
０μｅ中に懸濁したものと混和した。かくして得られた
全体混和物を４０℃で充分に混合した。この糖脂質５μ
９を含有する懸濁液を初日にＢａ１ｂ／Ｃマウスに静脈
注射し、その後４日毎に計３回、該糖脂質を２μΩづつ
含有する投与量にて注射を行なった。

宿主牌臓細胞と、市販のマウス骨髄腫５Ｐ−２細胞との
融合を最終の注射後３日目に実施した。

ハイブリドーマ類は、各穫薬剤、精製された■３Ｎｅｕ
Ａｃ　Ｖ’　ＩＩＩ’　Ｆｕｃ２ｎ１ｃ　ｓ糖脂質（１
０ｎ＜１／穴）、コレステロール（３０ｎＱ／穴）およ
びレシチン（５０ｎａ／穴）でもって塗布された９６穴
プレート（［）ｙｎａｔｅｃｂ　　Ｊ　　ｓ＋５ｕｎｏ
ｌｏｎ　　ｐｌａｔｅ　　、［）ｙｎａｔｅｃｈ　　Ｌ
　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ　Ｉｅｘａｎｄｒｉａ、
　Ｖ　Ａ　）上でクローンされた。クローニングは繰返
し実施した。

ＦＨ６抗体を分泌したハイブリドーマは、実施例３およ
び４に記載したように幾つかのクローンから選択された
。ＦＨ６を産生するハイブリドーマの腹水は１　：　２
５，０００の力価を有していた。

モノクローナル抗体ＦＨ６を分泌するハイブリドーマは
６Ｂガングリオシドとの反応性およびごく近縁の構造を
有する他のフコガングリオシド類とのクロス反応性の欠
如とによって選択された。

第１表はこの分析法に用いられた数種のフコガングリオ
シド類の構造を示すもので、構造１は上述したように６
Ｂガングリオシドである。構造２はＪ、　　Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、２５１　　：　７５１７−７５２０．１９７
６に記載のようにヒトのＷｉｌ＋から調製されるシアロ
シルラクトフコベンタオシル（ＩＩＩ）セラミド（ＩＶ
３ＮｅｕＡｃ　ｍ３Ｆｕｃ　ｎＬｃ　４）である。構造
３はシアロシルラクトフコベンタオシル（Ｕ）セラミド
（Ｓ　１ａｌｏｓｙｌ　　Ｌ　ｅａ：　■３ＮｅｕＡＣ
ＩＩ［’　　ＦＵＣＬＣｓ　　）であり、これはヒトの
結麗癌組織（ＦＴ６２０）からＪ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　　２５７：　　１４３６５−１４３６９，１９８
２：Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ、ｔｌｏ：　　３８３−３９１．１９８３に
記載の方法で調勢される。構造４は６Ｃフコガングリオ
シド（Ｖｌ’　ＮｅｕＡｃ　ｍ９ＦｕｃｎＬｃｓ）であ
り、これはＪ　、　８　ｉｏｌ、Ｃｈｅｗ。

ユ５９　：　　１０５１１−１０５１７．１９８４　；
　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　ｉｏ　ｈｙｓ、Ｒｅｓ、　　
Ｃｏ＋ｕｕｎ、１１３：　　７９１−　７９８．１９８
３に記載のようにヒトの結腸組織から調製される他、６
Ｂガングリオシドから分Ｍされる。構造５は６Ｂガング
リオシドのアシアロコア（Ｖ’　ｍ３Ｆｕｃ２ｎＬＣｓ
）である（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２５９　：
４６７２−４６８０．１９８４）。この分析に用いられ
る他のフコガングリオシド類には次のものが含まれる。

即ち、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　　２５９　：
　４６７２−４６８０．１９８４に記載に従ってヒトの
癌から調製されるジフコシルラクトノルへキサオシルセ
ラミド（ＩＩＩ３　Ｖ３　Ｆｕｃ２ｎｌ−ｃ６）および
Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ　ｈｅｍ、　　２５４　：８２
２３−８２２９．１９７９に記載のようにヒトの赤血球
から調製されるシアロシル２→３ラクトネオテトラオシ
ルセラミド（シアロシルパラグロボシド；■”　Ｎｅｕ
Ａｃｎｌｃ　４　）が含まれる。

ＨＰＴＬＣ上に分離された上述の糖脂質類は、Ｍ　ａｏ
ｎａｎ＋等の原方法＜Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、　１
０９　：　　３９９−４０２．１９８０）の変法（Ｊ　
、　　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２５７　：　　１４８６５−
　１４８７４．１９８２）に従い免疫染色された。糖脂
質および抗体の使用量をできるだけ少量とするために小
型ＨＰＴＬＣプレートを使用した。

１３　ａｋｅｒ　　ＨＰ　Ｔ　Ｌ　Ｃプレート（Ｊ、　
７．　ＢａｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　、　）をガ
ラスカッタで５ｓ６ｃｍ片に切断し、各糖脂質サンプル
につき（約０．２〜０．３ｕｏ　）を注射針（）ｌａｉ
ｉｌｔｏｎ　Ｑｏ、、　Ｒｅｎｏ、Ｎ　Ｖ　）にて基線
上に３〜４１１範囲内に二重プレート上に作った。０．
０２％ＣａＣＱ２を含有するクロロホルム／メタノール
／水（５０：　４０：　１０）溶剤にて糖脂質バンドを
生成した。対照クロマトグラム上に複数個のスポットが
０．２％オルシノール含有２Ｎ硫酸溶液によって検出さ
れた（第１図ａ）。二重プレートはＦＨ６培養物の非稀
釈上溝にて免疫吟色した（第１図ｂ）。

代表的結果を第１図に示す。第１図ａに示す精製フコガ
ングリオシド類のＨＰＴＬＣのパターンは次の通りであ
る。即ちレーン１は６Ｂガングリオシド（第１表の構造
１）；レーン２は６Ｃガングリオシド（第１表の構造４
）、レーン３は■３ＮｅｕＡｃ　［１３Ｆｕｃ　ｎｌ−
ｃ　４　　（第１表の構造２）；レーン４はｍ’　Ｖ３
　ＦＵＣ２ｎＬ　ｃ　６−　：レーン５はｌＶ３　Ｎｅ
ｕＡｃｎＬｃ　４　　：レーン６はシアロシル−Ｌｅａ
（第１表の構造３）。ＦＨ６培養物の非稀釈上清にて免
疫染色された二重プレートを第１図すに示した。抗体Ｆ
Ｈ６は６Ｂガングリオシドとのみ反応した（レーンへ）
。

その後の研究では、モノクローナル抗体ＦＨ６がシアリ
ルモノフコシルラクトノルへキサオシルセラミド（Ｖｌ
’　ＮｅｕＡｃ　７ｓ　Ｆｕｃ　ｎＬｃ　ｓ　　、７Ｂ
ガングリオシド：　Ｂ　１ｏｃｈｅｔ　Ｂ　ｉｏ　ｈ　
ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｓｍｕｎ、　　１１３：　　７９
１−　７９８．１９８３＞とも反応することが示されて
いる。抗体ＦＨ６の７Ｂガングリオシドとの反応性は、
６Ｂガングリオシドとの反応の場合と比較して約半分で
あった。これらの研究は、また類縁構造を有するその他
の糖脂質のいずれもが抗体ＦＨ６とは反応しないことを
確認するものである。

モノクローナル抗体ＦＨ６の特異性は、抗ｙＲ棉釈液と
共に、抗体稀釈液との同相放射線免疫分析法によって決
定された。固相放射線免疫分析法は、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｓ、　４３：　４９９７−５００５．１９８３ニ記載
された方法によりビニール帯片（Ｃｏ５ｔａｒ　Ｌ　ａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃａ５ｂｒｉｄｏｅ、　Ｍ　
Ａ　）を使用して行なった。抗体稀釈液との反応性（第
２図Ａ）は１０ｎ（ｌの糖脂質、５０ｎＯのレシチンお
よび３０ｎｇのコレステロールを１穴当り塗部して決定
された。原抗体はＦＨ６ハイブリドーマの培養上清の２
倍稀釈液であった。抗原稀釈液（第２図Ｂ）との反応性
を決定するに当っては糖脂質抗原の原濃度は１２５ｎｇ
／穴で、１２個の穴に対し順次２倍稀釈した。ざらに各
穴に、ＦＨ６ハイブリドーマの培養上清の１：３０稀釈
液濃度の抗体液を適用した。

以上によって得られた代表的結果を第２図Ａおよび第２
図Ｂに示した。黒丸（・）は６Ｂガングリオシドに対す
る反応が陽性である場合を示し、これに対して白三角（
△）は同反応が陰性で、次のガングリオシド類の場合に
認められた。即ち、ＩＶ３ＮｅｕＡｃ　［［’　Ｆｕｃ
　ｎｌ−ｃ　４　　（第１表の構造２）、シアロシル２
→３ラクトネオテトラオシルセラミド（ＩＶ３ＮｅＵＡ
ＣＬＣ４）　、６Ｃガングリオシド（第１表の構３！４
）、シアロシル２→３ラクトノルヘキサオシルセラミド
（ＩＶ”　ＮｅｕＡｃｎＬｃ　ｓ　　；Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　　Ｂｉｏ　　ｈ　　ｓ、　　Ｒｅｓ、　　　ｏｍｍ
ｕｎ、　１１３：　　　７９１−７９８．１９８３に記
載されたヒトの癌細胞組織から調製される。）である。

６Ｂガングリオシドのアシアロコアとの反応性（陰性）
についてのデータは図示していない。

抗体Ｆｌ−１６の免疫グロブリンサブクラスは、Ｃａｐ
ｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｃｏｃｈｒａｖ
ｉｌｌｅ　、ＰＡ　）から購入したサブクラス−特異性
抗体を用いて決定した。ＦＨ６はＩｏＭ抗体であること
が決定された。

ＦＨ６と幾つかのヒト腫瘍細胞系との反応性をＦＨ４抗
体の場合との比較で検討した。ＦＨ４抗体は、Ｊ、Ｂｉ
Ｏ２，ＣＭＩｍ、　　２５９（７）：４６８１−４６８
５．１９８４、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、ユ５９：　　
５０６−５２０　。

１９８４に記載のように、コア構造のジフコシル化ラク
トノルへキサオシルセラミド（ＩＩＩ”　Ｖ”　Ｆｕｃ
２ｎＬｃｓ）により確認される。

第３図の縦座標に示すヒトの腫瘍細胞系は次の通りであ
る。即ち、胃癌細胞系、ＭＫＮ列：肺癌細胞系；ＱＧお
よびＰＣ列二表皮性腫瘍細胞ＧＴ−４；卵巣腺癌５Ｋ−
ＯＶ３：Ｂ細胞系、Ｐ　ｒｅｎｔｉｃｅおよびＫ　ａｓ
ｎｅｒ　Ｈヒトの線雑芽細胞、Ｃｒｏｗｆｏｒｄおよび
Ｗｌ−３８；単球性白血病細胞系ＴＨＰ−１；ヒトの線
維芽Ｌ−５＝ヒトの奇形癌腫２１０２　：およびヒトの
頚癌Ｈｅ　Ｌａである。これら細胞系の起源にツイテは
、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　ユ胆：４６８１
−４６８５．１９８４に記載の諸論文において報告され
ている。細胞はＬ　ｔｎｂｒｏプレート（Ｆ　ＩＯＷ　
Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ、ｖ　ｃ　Ｌ　ｅａｎ、　
Ｖ　Ａ　）上にゲルタールアルデヒドによって固定され
、また抗体の結合はＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　　２
５９　（７）　　：　４６８１−４６８５．１９８４の
２記に従って決定された。

第３図に関して、ＦＨ６抗体の反応性（左パネル）は肺
癌細胞系ＰＣ９（斜線を施した棒）にて表示された最高
反応性に対する百分率にて表示した。比較のため、ＦＨ
４抗体の反応性は右パネルに示したが、この場合、Ｍ　
Ｋ　Ｎ　７４が示す最高反応性に対する百分率で表示し
た。抗体ＦＨ６は柵々の細胞系に、特に肺癌細胞系につ
いて高い反応性を示したが、これらはＦ）−１４に対し
ては陰性であった。

！」Ｌ ６Ｂガングリオシドは、第１表に示すように、ジフコシ
ルラクトノルへキサオシルセラミド（ｍ”　Ｖ’　ＦＬ
ＩＣ２ｎＬＣｓ　）　（７）ｔ−／シフ０１ｅＪｌ１体
トシて明白に同定された。この独特な構造を有する６Ｂ
ガングリオシドがヒトの腺癌中に蓄積するが、他方正常
な結腸粘膜には存在しないこと（下記参照）は、バンド
４糖脂質（これは６Ｂガングリオシドと同じコア炭水化
物構造を有する）がヒトの各穫腺癌において蓄積すると
云う既報の観察と矛盾しない（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ
　ｈｅｍ、　　２５９　：　４６７２−４６８０．１９
８４：Ｊ　　８組−ｍ底Ｌ　ユ阻：　４６８１−４６８
５　。

１９８４）。

６Ｂガングリオシドのアシアロコア炭水化物は、バンド
４糖脂質におけるジフコシルラクトノルへキサオシルと
同一であるけれども、６Ｂガングリオシドの脂肪酸プロ
フィル（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

ユ距：　　１０５１１−　１０５１７．１９８４）はバ
ンド４糖脂質のそれと比較して興味ある差を示した。６
Ｂガングリオシドの大部分の脂肪酸はＣ〈３５％）お１
Ｇ’０ よびＣ（１０％）であり、および６Ｂガングリオシドは
α−オキシ脂肪酸を全く含有せず、また長鎖の脂肪酸も
評価できるほどの量を含有しなかった。他方、“４ｂ”
（バンド４の大側分画は主成分（Ｃ，２仝覆α−０Ｈ（
６１％〉およびＣ１４：　ｌα−０ｆ−１（１４％））
と同様な長鎖α−オキシ脂肪酸類を有しており、また°
’４ｄ”（バンド４糖脂質の別の大側分画）はＣα−オ
キシ脂肪酸の８５％＋Ｃ：Ｏ も有していた。”４ａ”７７３よび°’４ｅ”のみに短
鎖の非オキシ脂肪酸が存在するが、両方ともバンド４糖
脂質の小側分画であった。中性糖脂質類とそれらのシア
ロシル誘導体類との間の脂肪酸組成物についてのこの明
確に対比されるプロフィルは、短鎖の非オキシ脂肪酸類
を含有する中性糖脂質類が選択的にシアリル化されて６
Ｂガングリオシドになることを示している。末端の炭水
化物構造とセラミドの脂肪酸プロフィルとの同様な相関
楔係については、既にヒトの赤血球膜のガングリオシド
類および中性Ｌｅｘ糖脂質で記載されている（　　、　
　ｉｏｌ、　　ｈｅｍ、　　ユ５６：　　１０９６７−
　１０９７２．１９８１）。６Ｂガングリオシドは、Ｈ
ＰＴＬＣにおいて、アシアロコア中性糖脂質よりも移動
が迅速であった。この関係は、多くのガングリオシドが
、それらのアシアロコアよりも移動が遅いのと逆である
が、しかしヒト赤血球の０９フコガングリオシと同様で
ある（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２５４　
：　８２２３−８２２９．１９７９）。脱シアリル化に
よって導入された著しい構造変化は、６Ｂおよび０９両
ガングリオシドのＨＰＴＬＣ上のこの異常な挙動を説明
するものとして示唆される。既に実証されているモノク
ローナル抗体ＦＨ４はコア構造のジフコシル化されたラ
クトノルへキサオシルセラミド（ＩＩ［３Ｖ”　Ｆｕｃ
２　　ｎｌｃｇ　）を膚定するのに対し、モノクローナ
ル抗体ＦＨ６は、ＦＨ４によって認識されるフコガング
リオシド構造の反対の部分をＷｔ識する。抗体ＦＨ６は
、同一端末構造をもつ短鎖糖脂質、即ち、シアロシルラ
クトフコベンタオシル（ＩＩＩ）セラミドとはクロス反
応をしない。なお、この抗原は以前にヒト腎臓から単離
され、構造が明らかにされている（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏ
ｌ、ｃｈｅｌｌｌ、　　ユ■ニア５１７−７５２０．１
９７６）。シアロシルラクトフコベンタオシル（ＩＩＩ
）セラミドのＦｌ−１６との反応性の欠如は、ＦＨ６が
長鎖を有するキャリヤ炭水化物を要求することを示すか
、或いは第２フコシル残基によって、６Ｂガングリオシ
ドの構造が、次のように即ちＦｌ−１６によって認識さ
れる端末決定因子が露出されるように変化されることを
示す。このような構成は、シアロシルラクトフコベンタ
オシル（ＩＩＩ）セラミドには存在しないかも知れない
。

この本質的に異なる反応性は驚くべきことではない。そ
れはモノクローナル抗体の１つＦＨｌは、短い炭水化物
鎖（ラクトフコペンタオシル（ＩＩＩ）セラミド）を有
するＸ決定因子と反応するのではなくて、長い炭水化物
鎖を有する同一のＸ決定因子と強く反応するからである
（　Ｊ　、　８　ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５９　：　４６８１−４６８５．１９８４）。興味あ
ることに、種々の腫瘍細胞系の抗体ＦＨ６との反応性は
、第３図に示すようにＦＨ４との反応性と比べてより広
範囲で強い。特に、ＦＨ４と反応しない肺癌細胞（ＰＣ
系列およびＱＧ系列）はＦＨ６とは強く反応する。若干
の腫瘍細胞はコア構造を合成することができるが、末端
ガラクトースをシアリル化することができず、これに対
して他のｌｌ瘍細胞ポピユレーションは、抗体ＦＨ６が
特異的に反応する６Ｂフコガングリオシドを完成するこ
とが可能である。

若干の研究によれば、ＦＨ４抗体により規定される構造
は、６０〜１０日までの胎児の胃鳳上皮に高度に発現し
ているが、その後では、胃腸上皮の一層の発育につれて
激的に低減する。なお。成人の胃腸上皮では、抗原の発
現は、主として胃腸上皮における特殊な型の細胞に限ら
れるが、しかし抗原は結鵬の上皮では発現してはいない
。胃！！および結腸置部に関係する癌腫におけるＦＨ４
の高頻度の発現は、ＦＨ４の発現が腫瘍胎児性であるこ
とを明らかに示している。ＦＨ６によって規定される抗
原も腫瘍胎児性であることが明白に期持される。種々の
正常な組織およびｍｖａの組織におけるＦｌ４およびＦ
ｌ６によって規定された二つの構造の分布に関してのさ
らに広範囲な研究について以下に報告する。６Ｂフコガ
ングリオシドの合成には次の二型の生化学反応が必要と
される。即ち、（ｉ　）ガラクトシルβ１→４またはＮ
−アセチルグルコサミニルβ１→３結合のいずれかを通
してのグリコジル化によって実施されるＮ−アセチルラ
クトサミニル単位の傾延長：（ｉｔ）恐らく定性的に変
化するフコシルトランスフェラーゼを通してのＧｌｃＮ
Ａｃ！ｌ毎のα１→３フコシル化：および（ｆｉｔ　）
末端ガラクトシル残基のα２→３シアリル化である。第
１の反応は正常組織に発生するが、これは癌組織におい
て強められるかも知れない。第２反応はヒトの種々の癌
で非常に強くなるようである。Ｆｌ４により規定される
構造を高度に有する組織のすべてが、必ずしもＦｌ−１
６により規定されるフコガングリオシドの存在を示すわ
けではなく、従ってＦｌ４により規定される構造のシア
リル化反応は成る種の悪性癌では非常に強くなる場合が
あるが、他の場合にはそのようなことはない。

モノクローナル抗体ＦＨ６によって規定される抗原の分
布が、！癌組織の場合と比較して、成人および胎児の正
常組織において決定された。

’ｐｓｒｖｙ’ｓａ 糺１　外科手術で得た成人の明らかに正常範囲にある組
織２０例、およびヒトの梗々の癌組Ｉａ６θ例を試料と
して用いた。これらはＳｗｅｄｉｓｈ　　Ｈｏｓｐｉｔ
ａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　　ｃｅｎｔｅｒ　　、５ｅａｔ
ｔｌｅ、　ＷＡの外科および病理、およびＪａｐａｎ　
　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　ＬａｄｏｒａｔＯｒ
ｉｅｓ　　、Ｔａｋａｓａｋｔ、Ｊａｐａｎｒ得られた
。これら試料のすべては、原発性癌組織も隣接の正常組
織も早期患者の外科手術の際に得られたものである。組
織は、下記の″組織切片の調製″の記載に従って、直ち
に処理して、“凍結切片”または“ホルマリン固定パラ
フィン包埋切片”を調製した。１４［１のヒトの胚と胎
児をｔｉｅ　［）　１ｖｉｓｉｏｎ　ｏｆＨｕａ＋ａｎ
　　　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｔｅｒａｔ
ｏｌｏｇｙ　　　、Ｄｅｐａｒｔｓｅｎｔ　　ｏｆ　　
　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　　、　　ＬＪｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　　ｏｆ　　　Ｗａｓｈｔｎｇｔｏｎ　、　３ｅａ
ｔＮｅ、　ＷＡ″から得た。これら胚と胎児は３８日〜
１２７日令であって、“ｉ、Ｆｌｏｏｋ等（編集者）　
ｐｐ、２９−４４　、Ａｃａｄｅｇ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
　、Ｎ　Ｙ　、１９７１”の記載に従って集め段階的に
処理した。

および　の　薬　ジフコシルガングリオシド６Ｂを標的
とするＩｇＭモノクローナル抗体ＦＨ６は実施例２にて
述べたようにして得た。培養上清または腹水からの抗体
を飽和硫酸アンモニウム溶液２容を添加することによっ
て沈澱させた。

沈澱物を水に溶解後、Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　
６　Ｂカラムを流過させた。、得られたｌｏＭ分画く分
画２５〜３５、各分画の容量は５層ｅ）をＣＬ６８カラ
ムを用いて再びクロマトグラフ法を行なった。次いで、
ＰＢＳ　（燐酸塩Ｍ衡量ｊＨＩＥ　：　１０１Ｍ＋７）
ＩＩ酸’／　−１緩衝液（ｔ）Ｈ７，０）を含む食塩溶
液１４０１Ｍ　）に対して透析し、これに０．１％牛面
清アルブミンの添加によって安定化させた。抗体の最終
濃度は１００μＱ／ａｔに調節されたが、これはほぼ腹
水の１０倍稀釈液に匹敵した。セイヨウワサビ・ペルオ
キシダーゼと結合する二次抗体（マウス免疫グロブリン
を標的とする兎免疫グロブリン）はＡ　ｃｃｕｒａｔｅ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ　、
　Ｎ　Ｙ　）から購入した。免疫染色の感度を増大する
ためのビオチニル抗体およびアビジンを含むＶ　ｅｃｔ
Ｏ８ｔａｉｎ　Ａ　ＢＣｋｆｔはｖｅｃｔｏｒ　　１−
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　　Ｉ　ｎｃ、　　（［３
ｕｒ１ｉｎｇａｍｅ　、　ＣＡ　）から入手した。

相」帆Ｗ放」ユ」Ｌ製−手術時に得られた新鮮な標本を
ＯＣＴ：ｌンパウンド（Ｔ　１ｓｓｕｅ　−Ｔｅｋ　　
Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ　、　Ｍｉｌｅｓ　　１ａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　、　　ｌ　ｎｃ、　、　Ｎａｐｅｒｖｉ
ｌｌｅ、　Ｉ　Ｌ　）に埋込み、ドライアイス−アセト
ン中で凍結してからＲｅｖｃｏフリーザ内に一８０℃に
て使用時まで保蔵した。４〜６μ輸厚さの切片をクリオ
スタットにて作製した。各切片はオブジェクチフグラス
上で室温にて３０分間乾燥し、アセトン中にて４℃で１
０分間固定し、ＰＢＳで４℃で洗滌した。ホルマリン固
定パラフィン切片（６〜８μｍの厚さンも、３　ｈｅｅ
ｈａｎ、　Ｄ　、　Ｃ、等、糺！おける手法の理論と　
　（７ｈｅｏｒ　　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　
　　ｔｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　、　Ｅｄ、２．１）
ｌ）、　５９−８８゜Ｔｈｅ　　Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ
　　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　、１９８０）に記載
の確立されている手法に従い燐酸塩緩衝ホルマリンで固
定し、かつパラフィンで包埋した組織から作製した。組
織の切片は４℃で５分間キシレン中にて脱パラフイン化
し、エタノール中で脱水し、次いでＰＢＳで洗滌した。

さらに、凍結切片またはホルマリン−パラフィン包埋切
片を、正常な兎Ｉｆ［ｌＷ４または馬血清を１５％含む
ＰＢＳと共に至瀧で２時間放置することによってブロッ
クし、この後以下に述べるように免疫染色を行なった。

ｉｓ　　ａ　　正常な兎血清または馬血清でブロックさ
れた切片は、−次抗体ＦＨ６（非稀釈培地上清または２
０倍稀釈腹水として〉と共に１８時間、湿潤な閉室で４
℃にて接触放置した後、ＰＢＳにて３回、４℃にて洗滌
した。各洗滌は５分間づつ行なった。次いでこの切片を
ペルオキシダーゼ結合２数抗体（１：３０稀釈）と共に
湿潤な閉室にて室温で１時間接触放置した後、ＰＢＳ中
で４℃で３回上述と同様に洗滌した。続いて、０．０３
％３．３′　　−ジアミノベンジジン（Ｓ　ｉａｍａ　
　Ｃｈｅ＊ｔｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ
Ｏ）および０．００８％過酸化水素を含む０．０５　Ｍ
　トリス塩酸緩衝液（＋１）−１７，６）中に、洗滌後
の切片を入れて接触放置して、抗体の接着したのを検出
した。Ｖｅｃｔｏｓｔａｉｎ　Ａ　Ｂ　Ｃｋｉｔの適用
に先立ち、切片を、ビオチニル残基を含有する抗マウス
ＩｏＭ馬抗体で、次いでアビジン−ビオチニルψセイヨ
ウワサビ・ペルオキシダーゼでもって処理した。なお、
いずれの場合も、１０分間染色後、切片を蒸溜水で洗滌
し、ヘマトキシリンで優染色し、エタノールで脱水し、
キシレンで洗った。各染色実験毎に対照として、（ａ）
−次抗体無しに処理された切片、および（ｂ　）正常マ
ウス血清処理された切片を用いた。

凍結切片およびパラフィン包埋切片の両方の免疫染色に
ついて、パラフィン包埋標本からの切片の作成中におけ
るグリコリピド抗原の除去能と云う観点から比較を行な
った。免疫反応性について、凍結切片と、パラフィン包
埋切片との間には、胎児標本の場合も、成人標本の場合
も有意差は無かった。

払−Ｕ 胎児および成人の正常な組織のＦＨ６抗体による染色の
結果については第２表に概要した。

第２表に関して、ＦＨ６による抗原の散在する弱い、し
かし歴然たる免疫染色が、種々の成育段階にあるヒトの
胚および胎児からの非常にさまざまの組織切片の上皮域
において認められた。しかし、これまでのテスト結果に
よれば、正常な成人組織の上皮域または股部においては
、腎臓の近位尿細管の上皮細胞が明白に染色陽性であっ
たのを例外として、染色は認められなかった。さらに、
白液細胞の内、顆粒球は明瞭に染色陽性であったが、リ
ンパ球、事理および赤血球は陰性であった。

興味あることは、ＦＨ６抗原のアシアロコアを標的とす
るＦＨ４抗体が正常な顆粒球とは染色を行なわないが、
非常に弱い染色しか示さなかったことである。

モノクローナル抗体ＦＨ６による癌組織の染色結果につ
いては第３表に纒めた。

第３表　癌組織のモノクローナル抗体による染色ＦＨ６
を用いての染色テストは、胃、乳房、肺、および置部の
種々の癌の７６症例の内４４症例からの組織切片につい
て陽性であったが、それ等の染色強度はＦＨ４抗体によ
って規定されるジフコシル型２鎖抗原のそれ〈データは
示していない）と比較した場合、比較的弱かった。抗体
ＦＨ６による染色テストの最高陽性頻度は乳癌（浸潤性
管癌）において認められ、８６％であった。

第４図は、胎児組織および癌組織の抗体ＦＨ６との免疫
組織学的染色の典型的なものを示すもので、第４図Ａは
７２日令胎児小謁のパラフィン切片のそれである。内腔
に面する上皮層（矢印）において強い染色の認められる
ことに注目されたい。

第４図Ｂは５４日令胎児結腸のパラフィン包埋切片の染
色像で、内腔に面する上皮（矢印）で強い染色陽性が認
められる。第４図Ｃは結腸の腺癌の凍結切片のそれで、
染色は専ら癌細胞塊（大きい矢印）でのみ認められた。

また内腔に面する尖端細胞質において特殊の強い反応が
認められた。第４図りは胃の腺癌のパラフィン包埋切片
で、強い染色陽性が癌細胞塊（大きい矢印）に認められ
、他方、隣接の正常粘膜の細胞および組織では陰性であ
った（小矢印）。第４図Ｅは乳癌の浸潤性線管癌腫のパ
ラフィン包埋切片のもので、腫瘍細胞（矢印）のみが染
色陽性で、これとは対照に、隣接の正常組織は陰性であ
った。第４図Ｆは良分化置部腺癌のパラフィン包埋切片
で、管状構造を形成する癌細胞が強く染色された。

抗体ＦＨ６によって染色された組織の場合、抗原の分布
の特徴として、非常に高密度に染色された領域が、腺癌
の内腔に面する腫瘍細胞層の尖端表面に在るのを特徴と
している。典型的な例が第４図Ｃに見られる。抗原は分
化腺癌において現われるが、未分化ｌｌ瘍には、それら
の起原に関係なく認められない。ＦＨ６によって染色さ
れなかった若干の胃癌、結腸癌、肺癌および乳癌は、低
分化癌であった。抗原の発瑛と、腫瘍組織の分化度と間
の相関は、既に、ＦＨ４により規定されるジフコシル型
２鎖抗体の発瑛について報告されている（Ｊ、　ＥＸＩ
）、　Ｍｅｄ、１５９　：　５０６−６２０．１９８４
）　。

考　　　察 成る研究結果によれば、ジーまたはトリフコシル型２鎖
構造（ＩＩＩ”　Ｖ”　ｌ”ｕｃ２　　ｎＬＣｓ　　：
　ｍ３Ｖ３■３Ｆｕｃ３　　ｎｌ−Ｃ＠　）を有する糖
脂質抗原はモノクローナル抗体であるＦＨ４およびＦＨ
５によって制定される（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　　２５９　：　４６８１−４６８５．１９８４）
。ヒトの穫々の癌組織と同様に、成人および胎児の正常
組織の様々なものについて、免疫ペルオキシダーゼ染色
は、上記抗原の発坦が腫瘍胎児性であることを示した。

即ち上記の抗原は、固体発生の成る段階で最高に現われ
るが、器官形成の完成後に非常に退行し、成人の組織に
おいては、成る種の細胞、例えば胃上皮の壁細胞、バー
ネト（ｐａｎｅｔｈ’ｓ）細胞、および小腸における基
底顆粒細胞のみに現われる。これに対して、ジーまたは
トリフコシル型２鎖を有する上記の糖脂質抗原は、ヒト
の種々の腺癌、たとえば胃癌、結腸癌および乳癌におい
て強く現われる。

ＦＨ６によって規定される抗原は、ここでは長型２鎖と
同様にジーまたはトリフコシル型２鎖によって担持され
るシアリル−Ｘ（またはシアリル−１６’）として同定
される。矩型２鎖（ｎｌ−Ｃ４）によって担持されるシ
アリル−Ｘ決定因子は抗体ＦＨ６とは反応しなかった。

これは、類似の抗体ＣＳ　Ｌ　Ｅ　ＸＩ　　がすべての
シアリル−Ｘ決定因子と、即ちこれらのキャリア構造に
関係無しに、反応するのと対照である（　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、　４４　：　５２７９−５２８５．１９８４
＞。従って、抗体ＦＨ６を用いて免疫組織学によって決
定された抗原分布は、Ｃ８Ｌ　Ｅ　ＸＩ　　抗体によっ
て規定されるものとは完全に区別されなければならない
。

興味ある他のモノクローナル抗体は抗体Ｎ−１９抗体Ｎ
　−１９−９により規定されるシアリル−Ｌｅａは非常
に種々のｍｓ、特に膵臓癌を含む胃腸系腫瘍で検出され
ｒａす（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４２　：　４８２０
−４８２３．１９８２＞　、そして正常組織におけるそ
の分布は特殊な部位、例えば膵臓の管状上皮、胃の陰窩
域、および唾液腺に限られている（土跋吐蛙吐２　：　
　２１９−２２９．１９８３）　、最近、抗体Ｎ　−１
９−９により着定される高レベルの抗原が精液中に認め
られた（Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　３６５：　
　６１３−６１７．１９８４）。

第４表は、上述のものを含めた種々の研究結果を纏めた
もので、正常組織、腫瘍組織および癌患者血清それぞれ
における、構造的に類縁の腫瘍付随抗原であるシアリル
−Ｌｅａ　シアリル−１６Ｘ　、シアリルダイマー性Ｌ
ｅＸ　およびダイマー性ＬｅＸの出現を比較したもので
ある。

（第４表の脚注） ネ’　　Ｐｈ　５ｉｏｌ、　　Ｃｈｅｓ＋、３６５：　
　６１３−　６１７．１９８４京　　２　　Ｃａｎｃｅ
ｒ　　　Ｒｅｓ、　　４４：　　５２７９−５２８５　
　．１９８４ネ３本研究 本　　’　　　Ｊ　　、　　　Ｂ　　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ
、　　　　　２５９：　　４６８１−４６８５　　．１
９８４本５旦刃１」」巨　２　’：　　２１９−　２２
９．１９８３本Ｇｍ瘍組織での、発瑛率は、総テスト症
例数に対する免疫組織検査陽性症例の百分率を示す。

本　フ　　Ｃａｎ　Ｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　　４２　　：
　　４８２０−　４８２３　．１９８２ネ”ＮＲ：報告
されていない 京９未発表のデータ 本メ血清中の抗原レベルを表わす百分率、即ち総テスト
症例数に対する陽性症例数の百分率を指示する。正常レ
ベルより高い抗原レベルを示した症例を陽性として判定
した。

本＋＋０内の数値は第１期の症例 本ｔ２Ｒｕｉｂａｌ　Ａ、等、要約束（要約８０）、第
ＸＩ期年次総会会報、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　３ｗｅｄ
ｅｎ　、　１９８３年　９月１１日〜１５日 抗体ＦＨ６により規定される抗原の出現および分布の特
徴を纏めると次の通りである。

（ａ　）ヒトの胃腸部においてＦＨ６により規定される
抗原の出現頻度は、ＦＨ４、ＣＳ　Ｌ　Ｅ　ＸＩ　　、
およびＮ　−１９−９により規定されるそれと比較して
低い。他方、肺癌および乳癌におけるＦＨ６抗原の出現
頻度はＦＨ４抗原のそれと比較して明白に高い。

（ｂ　）成人の正常組織においては、ＣＳ　Ｌ　Ｅ　Ｘ
ＩおよびＮ　−１９−９がＦＨ６による染色陽性を示す
胃腸上皮組織および腺上皮組織を含めて、ＦＨ６による
染色は本質的に認められなかった。成人の正常組織にお
けるＦＨ６陽性部位は顆粒細胞および腎臓の１尿細管に
限られている。これに対して、ＦＨ４抗原が、壁細胞、
胃上皮の幽門域、基底顆粒細胞および小鳥のバネート細
胞においても、腎臓の近位曲屈細管やヘンレー係蹄の薄
い脚と同様に認められた。正常な顆粒球は細胞螢光分析
法においてＦＨ４抗体で非常に弱く染色されたく正。

Ｌ肱肚蛙、旦４　：　２４９８−２５０６．１９８５＞
。Ｎ　−１９−９により規定されるシアリル−１ｅａは
正常な精液、胆臓上皮、膵臓の線管上皮、および唾液腺
に豊富に存在する。Ｃ３ＬＥＸ１　により規定されるシ
アリル−ＬｅＸ　は、曲屈細管、ヘンレー係蹄および顆
粒球においての他、食道粘膜、結膜の陰画、膵臓の腺胞
細胞および肝細胞にも存在する。

（Ｃ）胎児組織では、ＦＨ６抗原が、これまで試験され
た種々の上皮組織において、染色の強度は弱いけれども
、広い出現が認められている。胎児組織では背馳上皮お
よび肺上皮においてＦＨ６により散在的に染色が認めら
れ、これはＦＨ４抗原が特殊の病巣部位に限られている
のとは著しい対比をなしている。

かくして、抗体Ｆｌ−１６の反応性は構造的に類縁の腫
瘍付随抗ｙＡ４種、即ちシアリル−Ｌ　ｅ　ａ、シアリ
ル−１６Ｘ１ダイマー性Ｌ　ｅ　Ｘ　およびシアリルダ
イマー性１−６Ｘの出現状態によって独特に規定される
。　。

実施例　８ 、　血　　の　　ＦＨによ　　　される原のレベルの決
Ｉ 種々の癌患者２４名の血漿をＶ　ｅｔｅｒａｎｓ　Ａ　
ｄｍｔｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ病院（Ｓ　ｅａｔｔｌｅ、
　Ｗ　Ａ　）の腫瘍科から入手した。また血清は、１１
７名の癌患者、１７名の正常被検者、および３９名の急
性および慢性炎症患者から京都大学医学部で採取した。

癌患者からの血漿および血清は、第１期にあった早期胃
癌の群を除いて、第３期または第４期の患者のものであ
った。試料は直ちに放射免疫測定法にて分析された。

血清中の抗原のレベルは、非標識抗体ＦＨ６を塗布ぎれ
て血清と反応したポリスチレン製プラスチックピーズ表
面に１２５１標識抗体Ｆｌ−１６を結合させて定量した
。抗体ＦＨ６はＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００を通
すゲル濾過を施すことによってＩ！観すると共に（＋！
Ｊ　］ヨードで標識した。プラスチックピーズは、Ｊ　
、　Ｍｅｄ、　Ｖ　１ｒｏｌ、　２　：　７７−８７．
１９７８の記載に従って精製抗体ＦＨ６を塗布された。

血清の試料２０ｕ　ｔを５０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，５）２００Ｉ区と混合し、この混合物をＦＨ６で塗
布されたプラスチックピーズと一緒に１８時１’［１２
５℃にて時々回転をしながら接触保持した。この後、プ
ラスチックピーズを緩衝液（ｐＨ４，５，５０■Ｍクエ
ン酸塩）で３回洗滌し、次いで、５０−Ｍクエン酸緩衝
液（ＤＩ−１４，５）に溶かＬ／　タ２００μｇ　１７
）１２５１−標識ＦＨ６抗体と共に３時間２５℃にて回
転しながら接触保持した。分析１回につき与えられる１
２５Ｉ−ＦＨ６の放射能は約１００，０００ｃｐｓで、
ビーズ上に残留する放射能を先と同じ緩衝液で３回洗滌
後計数した。

以上の試験から、種々の癌患者の血清中には、炎症疾患
や正常被検者の場合と比較して有意に高いレベルの抗原
が存在すると云う結果が待られた。

正常被検者の血清中に存在する抗原のレベルは１゜００
０ａｐｌ以下であった。これらの結果については、第５
図に纏めた。高い抗原レベルを示した癌患者は既に進ん
だ病剤（第ｍ￥ｌＡおよび第■期）にあった。第１期お
よび第■期の胃癌患者の群では、陽性症例が低頻度であ
ることを示した。血漿中の抗原レベルの定量は、ＦＨ６
抗体と非特異的反応性である（このデータは表に示して
ない）未知の血漿成分の存在によって妨害ぎれる。

若干の癌患者の血清中に含まれるＦＨ６抗原のレベルは
、急性や慢性の炎症疾患を有する患者および正常被検者
の血清と比較して高く、他方多くの癌症例における抗原
レベルは正常レベルと同じ獣まであった。自涜抗原の高
いレベルは、肺、胃、結腸、肝、および膵の８癌の患者
の場合に高頻度に認められた。抗原発現の頻度は乳癌組
織において非常に高かったが、乳癌患者の血清中レベル
は比較的低かった。内情抗原の検出可能レベルは、因子
の数、例えば抗原の遊離性、ｍ１ｍの座位および進行段
階、腫瘍の組織学的特性等と相関関係がある。従って、
血清中の抗原レベルは腫瘍組織における抗原の発珊度を
牟純に反映するものではない。ＦＨ６抗原のアシアロコ
アを表示するＦＨ４抗原は多くの胃腸腫瘍において高頻
度に出現するが、しかし胃腸関連腫瘍をもつ患者の大部
分では、血清または血漿中の抗原レベルが正常被検者の
場合と同じであった（データは示していない）。ＧＤ３
画一抗原は高い頻度で黒色腫に認められるけれどレベル
は若干の癌症例の場合に明白に高いものが認められるが
、しかし高い抗原レベルを示す症例は、大抵は第ｍ期お
よび第■期の患者の場合である。第１期の早期胃癌患者
の群は１６％に陽性抗原レベルが認められた。高レベル
抗原の頻度は、Ｎ−１９−９，１１５よびＣＳ　Ｌ　Ｅ
　ＸＩ　抗体についてのデータとは正確には比較できな
い。第■期および第■期息者のシアリル−Ｌｅａおよび
シアリル−ＬｅＸの最近の分析結果では、胃腸や肺の癌
の場合と比較して類似の検出率を得たが、若干の症例で
は、両抗原は互いに補足し合うように検出された（Ω−
ａｎｓｅｒ　Ｒｅｓ、　４５：　　４３５−４３７．１
９８５＞　。他方、第１期および第■期患者のＮ　−１
９−９抗体によるシアリル−ＬｅｃＬ抗原の検出率は非
常に低かった（胃癌の第１期は０％、第■期は１６％）
　、（Ｑｕｅｎｔｍｅｉｅｒ、Ａ　、等、胃癌の検出、
病段階の決定および追跡における炭水化物抗原１９−９
および癌胎児抗原。

要約集；癌研究における進歩（要約２１）。第灯年次総
会の会報、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ、１９
８３年９月１１日〜１５日）。これは第５図に示すよう
に、早期胃癌症例に対する環データと類似する。明白に
多くの技術的改善、例えば信号増幅による改善が、抗体
ＦＨ６により規定される抗原を含む腫瘍付随抗原を、早
期癌轡者の血清中に検出するのに必要である。

血清抗原の免疫学的に検出可能なレベルに影冒する要因
は未知である。腫瘍から血液に流入する度合および血清
中に免疫複合体の存在する度合が考慮され得る。癌患者
の高い抗原レベルの頻度は比較的低く、かつ瑛方法によ
りＦＨ６を用いて検査する場合は第ｍ期および第■期で
のみ明白に認められるけれども、抗体ＦＨ６はＩｆ［ｌ
清試料を用いてのヒトの癌の診断になお有用であり、特
に複数個の腫瘍マーカ用の抗体と組合せる場合、および
一層鋭敏な方法が開発される場合に有用である。

他方、ｉｉｔｍ中に在って、血液へ流入しない抗原は診
断目的や治療目的上のｅ＊＊抗体に対する一層良き標的
であるべきで、その理由は、腫瘍から流入する抗原が抗
体プローブまたは免疫前を標的とするのに失敗する主要
な原因であるからである（旦−ｃｔｅｎｃｅ、　　２１
９：　　６４４−６５０．１９８３）。

抗体ＦＨ６により規定される抗原はヒトの分化した癌に
高度に限局され、また正常組織におけるその限局された
存在は良く特定される。例えば、°抗体ＦＨ６はヒト結
腸癌の免疫組織学的検出に対し高度に特異的である（第
４図Ｃを参照）。ヒト結腸癌の免疫組織学的検出用のＦ
Ｈ６抗体を用いての広範囲の研究結果は、近位および遠
位の両結謁癌に対し高度に特異性であることを示してい
る。

かくして、放射標識された抗体ＦＨ６は、生体内（ｉｎ
　　ｖｉｖｏ）において１ｌＩＩの在所を映像化するの
にも特に有用である。例えば、ｌ−１２３のような放射
性核種は、標準の方法、例えばＢｏｌｔｏｎ　−Ｈｕｎ
ｔｅｒ試薬を使用するものを適用して抗体に結合され得
る。放射標識抗体は過当なキャリア溶液中に混和可能で
、哺乳動物体に、例えば静脈または直腸に注射可能であ
る。その後、シンチレーション検出器、例えばガンマカ
メラを用いて走査を行ない、標識ＦＨ６抗体と反応する
抗原を担持する腫瘍組織を定位することが可能である。

抗体ＦＨ６は癌の免疫治療を実効あらしめるのに適する
。抗体ＦＨ６は放射性核種または抗腫瘍薬に結合可能で
、従って哺乳動物へ、例えば静脈注射すると、抗体ＦＨ
６と反応する抗原を担持する腫瘍組織を標的化すると共
に、これら放射性核種や抗腫瘍薬をその腫瘍組織に送達
可能である。

抗体ＦＨ６はまた、生体内〈、堕、■正）でも試験管内
（ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ）でも、ヒトの顆粒球および白血
病白血球に対する免疫調節剤または分化誘発因子を検出
またはそれらに送達するのに有用でもある。例えば、抗
体ＦＨ６は、インクフエロン、レチノイド類（レチン酸
、レチノール）、酪酸、その他の標的細胞の分化を誘発
したり、機能の多様性を与える作用薬と結合可能である
。このようにして、高度に悪性の癌細胞を低悪性細胞、
或いは非悪性細胞へ転化させることが可能である。正常
な顆粒球も同様に、抗体ＦＨ６を例えば免疫抑制剤と結
合することによって標的化されかつ制御され、治療効果
を挙げることが可能である。

以上、本発明を実施の態様、実施例をもって説明したが
、通常の当ｉｓにとって、以上の記述に基づいて、そこ
に記述された組成物および方法について梯々の変化、等
何物との置換、および変更が可能であり、それ故、以上
に関する特許によって与えられる保護は添付された特許
請求の範囲に含まれる規定およびこれらと等価のものに
のみ限定されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製フコガングリオシド類のＨＰＴＬＣパター
ンを示す図。 第２図は種々のフコガングリオシド類のモノクローナル
抗体ＦＨ６との反応性を実証する二つのグラフで、（Ａ
）は抗体稀釈液との反応性、（Ｂ）は抗原稀釈液との反
応性を示す。 第３図は両抗体ＦＨ６（左パネル）およびＦＨ４（右パ
ネル）の種々のヒト腫瘍細胞系の反応性を比較表示した
一対の棒グラフ。 第４図は胎児組織および癌組織の、検出可能なマーカに
結合された抗体ＦＨ６による典型的な免疫組織学染色状
態を示す６個の顕微鏡写真（Ａ−Ｆ）。 第５図は癌患者および正常被検者の各血清中に含有され
るもので抗体ＦＨ６と反応する抗原のレベルを示すチャ
ートで、テストの対象となった思考の癌種および人数（
カッコ内）は左縦軸に配列し、反応性のレベルは横軸に
表示し、陽性比（％）は右側縦軸に配列した。 特許出願人　　フレッド　ハッチンソン　キャンサー　
リサーチ　センター 代理人弁理士　古　　村　　　悟 図面の浄古（内容に変更なし） ａ、　　　　　　　　　　ｂ。 第１図 セ坏躊辺−謹敷 糀厚搏テＬ・逆数 第２図

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）フコガングリオシドVI＾３ＮｅｕＡｃＶ＾３III
   ＾３Ｆｕｃ＿２ｎＬｃ＿６と特異的に結合できるモノク
   ローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ細胞系。
2. （２）VI＾３ＮｅｕＡｃＶ＾３III＾３Ｆｕｃ＿２ｎＬ
   ｃ＿６および：ＮｅｕＡｃＶ＾３ＦｕｃｎＬｃ＿６とか
   らなる群から選択されるフコガングリオシドと特異的に
   結合できるが、IV＾３ＮｅｕＡｃIII＾３ＦｕｃｎＬｃ
   ４、IV＾３ＮｅｕＡｃIII＾４ＦｕｃＬｃ＾４、VI＾６
   ＮｅｕＡｃIII＾３ＦｕｃｎＬｃ＿６、Ｖ＾３III＾３Ｆ
   ｕｃ＿２ｎＬｃ＿６、IV＾３ＮｅｕＡｃｎＬｃ＿４また
   はVI＾３ＮｅｕＡｃｎＬｃ＿６とは特異的結合をしない
   モノクローナル抗体を産生可能である特許請求の範囲第
   （１）項に記載のハイブリドーマ細胞系。
3. （３）ハイブリドーマ細胞系がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ８
   ８７３である特許請求の範囲第７項に記載のハイブリド
   ーマ細胞系。
4. （４）特許請求の範囲第（１）項に記載のハイブリドー
   マ細胞系により産生されるモノクローナル抗体。
5. （５）特許請求の範囲第（１）項に記載のハイブリドー
   マ細胞系により産生されるＩｇＭ抗体。
6. （６）放射性核種と結合した特許請求の範囲第（４）項
   に記載のモノクローナル抗体。
7. （７）抗腫瘍薬、免疫制御剤、或いは分化誘発剤と結合
   した特許請求の範囲第（４）項に記載のモノクローナル
   抗体。
8. （８）特許請求の範囲第（６）項に記載の組成物の有効
   量を哺乳動物体に投与する段階と、その後に、シンチレ
   ーシヨン検出器で哺乳動物体を走査する段階とからなる
   哺乳動物体内の癌細胞座位の映像法。
9. （９）特許請求の範囲第５項に記載の組成物の有効量を
   哺乳動物体に投与する段階からなる癌治療法。
10. （１０）特許請求の範囲第（７）項に記載の組成物の有
    効量を哺乳動物体に投入する段階からなる癌治療法。
11. （１１）特許請求の範囲第（７）項に記載の組成物の有
    効量を体内へ投入する段階からなる免疫治療法。
12. （１２）検出可能なマーカと結合した特許請求の範囲第
    （４）項に記載のモノクローナル抗体。
13. （１３）検出可能なマーカが酵素、発色団、発蛍光団、
    助酵素、化学発光物質、酵素指示薬、および放射性核種
    からなる群から選択される特許請求の範囲第（１２）項
    に記載のモノクローナル抗体。
14. （１４）フコガングリオシドVI＾３ＮｅｕＡｃＶ＾３I
    II＾３Ｆｕｃ＿２ｎＬｃ＿６を発現する細胞の免疫組織
    学的検出法において、 （ａ）上記細胞を特許請求の範囲第（１２）項に記載の
    抗体と接触させる段階、 （ｂ）上記細胞から未反応抗体を除去する段階、および （ｃ）その後に、細胞上の未反応抗体に結合した検出可
    能なマーカを検出する段階 とからなる上記方法。
15. （１５）上記細胞が癌細胞である特許請求の範囲第（１
    ４）項に記載の方法。
16. （１６）上記細胞が結腸癌細胞である特許請求の範囲第
    （１５）項に記載の方法。
17. （１７）上記細胞が顆粒球である特許請求の範囲第（１
    ４）項に記載の方法。
18. （１８）血清を腫瘍付随抗原を標的とする抗体と接触さ
    せる段階、および抗体と抗原との間での反応を検出する
    段階を含む血清中の腫瘍付随抗原の検出法において、上
    記血清を特許請求の範囲第（４）項に記載の抗体と接触
    させることからなる改善された検出法。