JPS58211660A - フコ−ス抗原を識別する抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新しい抗体、詳゛シ＜は、フコース抗原を識別
でき、消イヒ器癌等の癌細胞殊にヒト大胆癌細胞及びマ
ウス　テラトカルシノーマ細胞と特異反応性を有し、消
化器等の癌腫（特に大腸癌）の測定、診断を可能とする
癌関連抗体の製造法に関する。

最近細胞分化のある段階において、哺乳動物細胞表面上
に特異な糖抗原が表現され、かかる糖抗原と反応性を有
する抗体として、全細胞をイムノ−ゲンとして用いた細
胞融合技術により得られるモノクロナール抗体（Ｃｅｌ
ｌ、Ｖｏｌ、１４．７７５−７８３（１９７８）　、Ｐ
ｒｏｃ、、　Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ、、　ＵＳＡ。

Ｖ　ｏｆ、７５．　Ｎ　ｏ、１１．５５６５−５５６９
　（１９７８）及びＮａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２９２．ｌ５６−１５８　（１９８１）　）及
びある患者の面清中に存在する抗体（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｓ、、　１３１，１８５−１９５　（１９８１
）　、）が提案された。本発明者らは上記各報告に関連
して、独自に研究を重ねる過程において、特定の糖鎖を
有機合成し、これをハプテン基として糖抗原を作成した
所、該糖抗原由来の抗体が消化器癌等の癌細胞特にヒト
大腸癌及びマウス　テラトカルシノーマ細胞と特異選択
的に反応し、従って該抗体の利用によれば癌細胞の認識
、測定等及びこれによる癌の診断が行ない得るという新
しい知見を得た。本発明はこの知見を基礎として完成さ
れたものである。

即ち本発明はα−フコピラノシル−（１→３）−１−、
（１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基
を含有するオリゴ糖とキャリアー蛋白との複合体からな
る糖抗原を哺乳動物に投与し、生成する抗体を採取する
ことを特徴とするフコース抗原を識別覆る抗体の製造法
に係る。

以下不発明におけるフコース抗原の製造、該抗原からの
抗体の製造並びに該抗体を含む癌診断用キット、その利
用による癌関連糖鎖の測定乃至癌の診断法につき順次説
明する。

本発明に係るフコース抗原の製造においては、ハブテン
としてα−フコピラノシル−（１→３）−１−（１→４
）−又は−（１→６）°−ガラクトピラノシル基を含有
するオリゴ糖を用いることを必須とする。上記オリゴ糖
の必須構成糖とするフコピラノースとガラクトピラノー
スとの結合は、α１→３、α１→４又はα１→６結合を
示し、特にα１→３結合が好ましい。また上記６オリゴ
糖はそのガラクトピラノシル基に更に他の糖鎖が結合し
ていてもよく、該他の糖鎖を構成する糖としては代表的
には例えばグルコビラノースを挙げることができる。該
ガラクトピラノシルとグルコビラノースとの結合は、α
又はβのいずれでもよい。

また、上記各構成糖は、０体又は１体のいずれであって
もよい。

本発明に好適なオリゴ糖の具体例としては、例えば以下
のものを例示できる。

０−α−し一フ］ピラノシル−く１→３）−〇−β−Ｄ
−ガラクトピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコビ
ラノース（３′−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクト
ース） ○−α−Ｌ−フコピラノシルーく１→４）−′Ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコ
ビラノース（４′−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラク
トース） Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−〇−β−Ｄ
−ガラクトピラノシルー（１→４）−α−Ｄ−グルコビ
ラノース（６′−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクト
ース） 上記オリゴ糖は公知であるかまたは公知の各種方法によ
り容易に製造することができる（Ｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒａ＋、　Ｂｕｌｌ　、　２９（４）　１０７６
−１０８２　（１（１８１）及び第３回糖質シンポジウ
ム講演要旨集第９０〜９１頁、演題４３「人乳オリゴ糖
の合成」、昭和５５年８月参照）、。

上記オリゴ糖をハブテンとし、これに結合されるキャリ
アー蛋白としては、通常抗原の作成に当り慣用される高
分子の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。例
えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン（Ｒ８Ａ）　
、ウサギ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ
血清アルブミン、卵白アルブミン等の動物のアルブミン
類、馬血清グロブリン、生血溝グロブリン、ウサギ血清
グロブリン、ヒトチログロブリン、ヒツジ血清グロブリ
ン、卵グロブリン等の動物のグロブリン類、馬チログロ
ブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブリン、ヒ
トチログロブリン、ヒツジチログロブリン等の動物のチ
ログロブリン類、馬ヘモグロブリン、牢ヘモグロブリン
、ウサギヘモグロブリン、ヒトヘモグロブリン、ヒツジ
ヘモグロブリン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘ
モシアニン類、回虫より抽出された蛋白質（アスカ−リ
ス抽出物、特開昭５６−１６４１４号参照）、エデスチ
ン（ｅｄｅｓｔｉｎ　）　、ポリリジン、ポリグルタミ
ン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオル
ニチンを含む共重合体等を挙げることができる。

上記ハプテン（オリゴ糖）とキャリアー蛋白との反応は
公知の各種方法例えば（Ａ　、＞イソチオシアネートカ
ップリング法、（Ｂ）ジアゾカップリング法、（Ｃ）ア
ミド結合法、（Ｄ’　）還元的アミノ化法、（Ｅ）グア
ニジンカップリング払等に従い実施できる（　Ａ　ｄｖ
ａｎｃｅｓ　　ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　ａｎｄ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
Ｖ　ｏｆ、３７．ｐ２２５−２８１　（１９８０）　、
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＶ、Ｖ
ｏｌｌ、Ｃｏｍｐｌｅｘ　　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
ｓ、　Ｐａｒｔ　Ｃ，ｐｌｓ５−１７５　（１９７Ｂ）
　、蛋白質核酸酵素　Ｖ　ｏｌ、２５．　Ｎ　ｏ、８゜
ｐ７０７−７２４　（１９８０）及びＡ　ｒｃｈｉｖｅ
ｓ　　ｏｆ　　Ｂ　ｉｏ　−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ
ｄ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌ、２０５．　Ｎｏ
、２　。

ｐ３３８−３９５　（１９８０）　）。

上記イソチオシアネートカップリング法（Ａ法）は、還
元的アミン化反応（例えばハプテンにβ−（ｐ−アミノ
フェニル）エチルアミン等のジアミン誘導体及びＮａ　
ＢＨＡ　、Ｎａ　ＢＨ３ＣＮ等の遠元側を反応させる）
により製造される化合物にチオフォスゲンを反応させた
のち、得られるイソチオシアネート体にキャリアー蛋白
をカップリング反応させることにより実施される。上記
還元的アミン化反応は、適当な不活性溶媒例えば０．２
モルリン酸カルシウム（ｐＨ＝８）等の緩衝液、水、生
理食塩水又はメタノール、エタノール等のアルコール中
、０〜４０℃３で３時間〜３日間で好適に進行する。ま
た還元的アミン化反応により得られる化合物とチオフォ
スゲンとの反応は、適当な不活性溶媒例えば水、０．１
モル炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ＝８）又は生理食
塩水中−１０℃〜至温にて３０分〜２時間で好適に進行
する。

更にイソチオシアネート体とキャリアー蛋白との反応は
、適当な不活性溶媒例えば水、生理食塩水又は０．１モ
ル炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ＝９．５）中で一り
０℃〜苗温にて１５〜２０時間で好適に進行する。

ジアゾカップリングａ（Ｂ法）は、例えば上記Ａ法の還
元的アミン化反応により製造された化合物に亜硝酸ナト
リウムと塩酸又は硫酸等のジアゾ化剤を反応ざ°せて製
造されるジアゾ化合物に、キャリアー蛋白をカップリン
グ反応させることにより実施される。上記ジアゾ化反応
は、適当な不活性溶媒例えば水、生理食塩水又は塩酸水
溶液等の鉱酸水溶液中、−１０〜−２０℃にて１０〜６
０分で好適に進行する。またジアゾ化合物とキャリアー
蛋白とのカップリング反応は一１０〜２０℃にて２〜６
時間で好適に進行する。

アミド結合法（Ｃ法）は例えばハプテンのアルデヒド基
を酸化銀等の酸化剤で酸化して糖カルボン酸としたのち
、該糖カルボン酸とキャリアー蛋白のアミン基と、をア
ミド結合反応させることにより実施される。アミド結合
反応は、通常のベプタイドのアミド結合生成反応により
、例えば１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド等の脱水剤を用いた脱水縮合反応によ
り実施できる。この脱水縮合反応は、適当な不活性溶媒
例えば１モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）等
の緩衝液中、Ｏ℃〜室温にて３〜１２時間で好適に進行
する。

還元的アミン化法（Ｄ法）は例えばハプテンにキャリア
ー蛋白及びＮａ　Ｂ　ＨＡ　、　Ｎａ　ＲＨ３ＣＮ等の
還元剤を反応させる口とにより実施される。

還元的アミノ化反応の条件としては、前ｋＡ法の還元的
アミノ化反応の条件を採用できる。

上記Ａ〜Ｄ法において各試薬の使用量は、原料に対して
少なくとも等モル量程度、通常好ましくは過剰量とされ
る。

かくしてオリゴ糖とキャリアー蛋白とが結合した所望の
糖抗原（フコース抗原）を製造できる。

反応終了後得られる糖抗原は常法に従い、例えば透析法
、ゲル濾過法、分別沈澱等により容易に単離精製できる
。上記のごとくして得られる糖抗原のうちでは、特にキ
ャリアー蛋白１モルに対してオリゴ糖が平均２０〜２５
モル結合したものが好適である。

上記で得られる糖抗原による抗体の作成は、常法に従い
該抗原を哺乳動物に投与し、生体内に産生される抗体を
採取する方法を採用できる。抗体の製造に供される哺乳
動物としては、特に制限はなく例えばウサギ、モルモッ
ト、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ等を例示できる
。抗体の産生は例えば上記抗原の所定量を生理食塩水で
適当１度に希釈し、これに必要に応じてフロイントの不
完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバント等
のアジュバントを混合し、得られる懸濁液を投与するこ
とにより行なわれる。上記投与は皮下、筋注、腹腔内、
静脈内、経口等、好ましくは皮下、腹腔内、静脈内経路
で行なわれる。投与回数、投Ｍ１等は常法に従い適宜に
決定できる。例えばウサギに上記懸濁液を皮内注躬（抗
原の量として０．０５〜５ｎ＋ｏ／回）し、以後２週間
毎に１〜１０ケ月、好ましくは１〜３ケ月間投与し免疫
化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与
後抗体が多量産生される時期、通常上記最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化された動物から採血し、これを遠
心分離後血清を分離採取することにより行われる。また
上記血清は更に塩析、吸収法、アフイニテイクロマトグ
ラフイー等の通常の精製手Ｄ１こより精製してもよい。

かくして精製された抗体は、α−フコピラノシル−（１
→３＞−、−１１→４〉−又は−（１→６）−ガラクト
ピラノシル基を特異的に認識できる抗体である。特に本
発明においてハプテンとして３−一〇−Ｌ〜フコピラノ
シルーα−ラクトースを用いた時には、Ｏ−α−Ｌ〜フ
コピラノシル−（１→３）−〇−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル基を認識できる特異性の高い抗体が、ハプテンと
して４−一α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクトースを
用いた時には、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル＝（１→４
）−〇−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基をＨ１できる特
異抗体が、またハプテンとして６′″−α−１−フコピ
ラノシル−α−ラクトースを用いた時には、０−α−Ｌ
−フコピラノシル−（１→６）−〇−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル基をＩＩできる特異抗体が各々製造できる。

上記で製造された抗体は、消化器癌等の癌細胞例えばヒ
ト大腸癌細胞及びマウス　テラトカルシノーマ幹細胞と
は結合するが、正常組織例えば大胆粘膜、肝臓、胆嚢、
膵臓、肺臓、甲状線、胸腺、リンパ節、筋肉、結合組織
、血管等のヒト正常組織や小腸、大腸、肝臓、腎臓、副
皐丸、卵巣等のマウス正常組織等とは結合しない特徴を
有している。

更に不発明者らの研究によれば、消化器癌等の癌腫特に
大腸癌細胞によって、α−フコピラノシル−（１→３）
−１く１→４）−又は−（１→６）−ガラクトピラノシ
ル基を有する癌関連糖鎖が産生され、かつ癌患者の体液
中にもこれが存在することが見出された。従ってα−フ
コピラノシル−（１→３）−１−く１→４）−又は−（
１→６）−ガラクトピラノシＪＬ４基を特異的に認識で
きる抗体の利用によれば、癌細胞もしくは癌組織上の又
は体液中の癌関連糖鎖を免疫反応（抗原抗体反応）によ
り測定することができ、これにより癌の診断をすること
ができる。本発明はかかる癌関連糖鎖の測定方法乃至癌
の診断方法及びこれらに利用する癌診断用キットをも提
供するものである。

本発明の上記癌関連糖鎖の測定及び癌の診断に利用され
る抗体としては、前記のごとくして得られる抗体即ちα
−フコピラノシル−（１→３）−１−（１→４）−又は
−（１→６）−ガラクトピラノシル基を特異的に認識で
きる抗体をいずれも使用できる。具体的にはＯ−α−Ｌ
−フコピラノシル−（１→３）−０−Ｂ−Ｄ−ガラクト
ピラノシル基を認ｉする抗体（以下「抗体−■」とする
）、Ｏ−α−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−〇−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル基を認識スる抗体（以下「抗
体−■」とする）、０−α−Ｌ−フコピラノシル−（１
→６）−〇−β−Ｄ−ガラクトピラノシル基を認識する
抗体（以下「抗体−■」とする）を挙げることができる
。これらのうちでは抗体−■が好ましい。また癌関堺糖
鎖とは、α−フコピラノシル−（１，→３）−１−く１
→４）−又は−〈１→６）−力ラクトピラノシル基を有
する糖蛋白及び７・′又は糖脂質を挙げることができる
。

本発明の癌関連糖鎖の測定は、通常の方法に従い、例え
ば具体的には以下の如くして行なわれる。

即ち測定材料として細胞及び／又は組織片を使用する場
合は、通常の間接免疫法に従い行われる。

この方法によれば、生理食塩水又は通常のリン酸塩緩衝
液（ＰＢＳ）等の緩衝液中に浮遊した細胞に、又はガラ
ススライド上に固定化した組織切片に、本発明の抗体を
免疫反応させ、細胞又は組織片を上記緩衝液で充分に洗
浄後、常法通りに標識抗体法により、又は標識プロティ
ンへの使用により、細胞又は組織片に結合した本発明抗
体の有無を調べればよい。

標識抗体法においては、本発明の抗体を製造した動物種
の抗原に対する標識抗体、例えば標識抗ウサギ免疫グロ
ブリンＧ抗体、同抗マウス免疫グロブリンＧ抗体、同抗
ヤギ免疫グロブリンＧ抗体等を適宜選択して使用するこ
とができる。上記標識抗体及び標識プロティンＡの標識
剤としては、各種の螢光標識物質又は酵素標識物質を利
用できる。代表的螢光物質としては、例えばフルオレツ
セイン・イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチ
ルローダミン・イソチオシアナート（ＴＲｉ　ＴＣ）、
置換ローダミン・イソチオシアナート（ＸＲＩＴＣ）、
ローダミンＢ・イソチオシアナー１−、ジクロロトリア
ジンフルオレッセイン（ＤＴＡＦ）等を、酵素標識物質
としては、例えばパーオキシダーゼ＜ＰＯＸ）、マイク
ロパーオキシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロ力ル
ポキシペブチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸
説ホ素酵素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−＼ａｓ
ｅ　、　ｐ　−Ｎａ５ｅ等をそれぞれ挙げることができ
る。これらで標識化された抗体又はプロティンへとして
は、市販のもの又は常法に従って作成したもののいずれ
を使用してもよい〔へｃｔａＥ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
ｓ　ｕｐｐｌ、、ユ６８，２０６　（１９７２）及びｐ
　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔ、　Ａ　ｃａｄ、３　ｃｉ、、Ｉｊ
　Ｓ　Ａ　、　５７，７１３　（１９６７）参照］。水
沫においては、前記本発明の抗体で処理した細胞又は組
織片に、前記と同様の緩衝液で予め希釈した標識抗体あ
るいは標識プロティンＡを反応させ、前記と同様にして
細胞又は組織片を充分に洗浄後、細胞又は組織片上に存
在する標識活性り螢光活性又は酵素活性）を常法に従い
測定する。

測定材料として体液を使用する場合もまた常法に従うこ
とができる。ここで体液としては例えば血液、細胞組織
液、リンパ液、胸水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄
液、唾液等又は前記の細胞又は組織片の可溶化後の遠心
上清等を使用することができる。上記細胞又は組織片の
可溶化後の遠心上清は、通常の方法例えばホモジネート
沫や可溶化剤を用いる可溶化の後、これを遠心分離して
上清を採取することにより得ることができる。また血液
を使用する場合は、通常血清又は血漿として使用するの
が好ましい。測定に用いられる体液の量は、０．１〜１
０ｍ１程度採取すればよい。

上記各種体液を測定材料とする本発明方法は、通常の競
合法によるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）又は酵素
免疫測定法（ＥＩＡ＞により行うのが好ましい。これら
方法の操作、手順等は通常の方法に従うことができる。

即ち通常の溶媒中、一定量の標準抗原、標識抗原及び抗
体を競合反応させ、次いで抗原抗体結合物（免疫複合体
）及び非結合抗原を分離し、そのいずれか一方の標識活
性を測定し、既知濃度の標準抗原に対する標準曲線を作
成する。同様に標準抗原の代りに濃度未知の被検試料（
体液）を使用してその標識活性を測定し、前記標準曲線
より被検試料中の使用した抗体に対する免疫感受性物質
（癌関連糖鎖）量を定量することができる。

標準戦歴とし又は、使用する抗体に免疫感受性を有する
物質（抗原乃至そのハプテン）を使用することができる
。該ハプテンとしては、例えば抗体−■を使用可る場合
には、３−−α−１−フコピラノシル−α−ラクトース
を、抗体−■を使用する場合には、４′−α−Ｌ−フコ
ピラノシルーα−ラクトースを、抗体−■を使用する場
合には、６′−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクｉ・
−スを例示できる。また抗原としては上記各ハブテンに
対応する抗原、具体的には後記する抗原の製造例で得ら
れる如き上記ハブテンとキャリアー蛋白、例えばＰ　］
　Ｐ−ＢＳＡとの結合物を例示づることかできる。

標識抗原としては、標準抗原を例えば１２５　Ｉもしく
は３日等の放射性物質又は前述した各種酵素標識物質等
で標識化したものを使用すればよい。

標準抗原に上記放射性ヨードを導入して標識化覆る場合
は、例えば前記抗原の製造において説明したイソチオシ
アネート体くハブテン−イソチオシアネート結合物）又
はこれとキャリアー蛋白との結合物、具体的には後記す
る抗原の製造例で得られる如さ３″−１４−一又は６−
−α−１−フコピラノシル−α−ラクトース−ＰＩＰ、
又はこれとＢＳＡとの結合物を、ポルトン−ハンター（
Ｂｏｌｔｏｎ　−Ｈｕｎｔｅｒ　）試薬を用いて常法通
りに標識化することができる（　Ｊ　、　Ｂ　！Ｏ１，
Ｃｈｅｌ１１．，２５４゜９３４９−９３５１　（１９
７９）参照）。またクロラミンＴを用いる酸化的ヨード
化法（Ｎ　ａｔｕｒｅ、ユ旦、４９５頁（１９６２）　
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ　、　８９，１１４頁（１９
６３）　）によってヨード化されたチロシン基を前記の
イソチオシアネートカップリング法により前記ＰＩＰ基
に結合させたもの、あるいはＢＳＡＪＩのチロシン残塁
を同様にヨード化したものを使用することもできる。ま
た、３日を導入する場合も常法に従い、前記標準抗原を
例えばＮａ８３Ｈｚを用いた還元反応に付でことにより
又は（Ｃ’　Ｈ２ＣＯ）２０によりアセチル化すること
により標識化された標識抗原を得ることができる。前記
測定系の溶媒としては、免疫反応に悪影響を与えないも
の、例えば水、生理食塩水、０．１モル１リス塩酸緩衝
液（Ｄ　）−１＝７．５）、０．１モルリン酸塩緩衝液
（ｐ　Ｈ＝７．４）等のｐＨが６〜７．８のＭ衝液が好
ましい。上記免疫反応は、常法に従い４５℃以下、好ま
しくは４〜４０℃、１〜４０時間程時間待われる。反応
によって生成した免疫複合体と非結合抗原との分離は、
公知の方法によって例えばデキストラン−活性炭法の後
、あるいは前記抗体に対する第２抗体例えば上記方法に
おいてウサギ抗体を使用する場合はヤギ抗つサー；ｌｏ
Ｇ抗体等を反応させた後、遠心分離法によって分離すれ
ばよい。

以下、上記測定法の゛−具体例を挙げて更に詳述する。

後記抗原の製造例で得られる３−−α−１−−フコピラ
ノシル−α−ラクトース−ＰＩＰの５〜１０μＱをポル
トンハンター試薬を用い１２５　Ｉで標識して〈室温、
約６０秒）、標識抗原を製造する。標準抗原として３′
−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクトースを、また抗
体として抗体−■を使用する。０．５％ＢＳＡ及び０．
０２％ＮａＮ、、を含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｒ＋
Ｈ＝／）０．２ｍｌ、上記標識抗原０．１ｍ１（約１ｏ
ｏｏ。

ｃｐｍ　）　、適当濃度の抗体−ＩＯ，１ｍｌ及び各種
濃度の標準抗原０．１１を４℃、２４時間インキュベー
トする。次いで、０．１１正常ブタ血清及び０．５１デ
キストラン−活性炭懸濁液を加えて４℃下３０分放置後
遠心分離（３００Ｏｒｐｍ　、３０分）するかあるいは
、適当濃度のヤギ抗つサギＩｐＧ抗体０．１ｍｌを加え
一４℃、２４時間インキュベート後同様にして遠心分離
して、免疫複合体及び非結合抗原を分離し、その放射活
性を測定する。標準抗原の各濃度に対してその放射活性
を求めるが、あるいは用いた抗体の力価に相当する抗体
と標準抗原との結合率（ＢＯ）を１００％としたときの
抗体と標識ペプチドとの結合体（Ｂ）の百分率を求め、
標準曲線を作成する。また濃度未知の試料を標準抗原の
代りに使用して同様にして放射活性又は百分率を求め、
この値から前記標準曲線を利用して、試料中の癌関連糖
鎖の定量を行なうことかできる。また上記方法によって
、体液中の３−一〇−し一フコピラノシルーα−がラク
トピラノシル基を有する癌関連糖鎖の測定が可能である
。

更に上記において抗体−■又は抗体−■を使用し、対応
する抗原系（標識抗原及び標準抗原）を使用して同様に
して測定することにより、体液中の４′−α−Ｌ−フ］
ピラノシル−α−カラクトビラノシル基又は６−−α−
１−一フコビラノシルーα−ガラクトピラノシル基を有
する癌関連糖鎖を測定できる。

本発明の上記測定法を実施するのに特に便利な方法は、
血漿や血清のような体液中の癌関連糖鎖量を決定するた
めのキットを使用する方法′である。

このようなキットには、癌関連糖鎖と特異的に抗原抗体
反応をする抗体即ちα−フコピラノシル−（１→３）−
１−（１→４）−又は−（１→６）−がラクトピラノシ
ル基を特異的に認識できる抗体を含有せしめることが重
要である。この抗体試薬には、グリセロールやウシ血清
蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を添加すること
ができる。

好ましくは、この抗体試薬は凍結融解したものであり、
キットには水溶性もしくは水と混和しうる溶媒を含有さ
せることができる。更にこの抗体試薬には、再構成され
た試薬系を一定のｐＨに保つための緩衝液及び７／又は
使用前に試料が悪化するのを防ぐための保存剤及び／又
は安定剤を添加することができる。緩衝液はキット試薬
の必須成分とは考えられないが、本発明の測定法を実施
する際に、ｌ）Ｈを６〜７．８とするものを用いるのが
好ましい。また再構成剤は好ましくは水を含んだもので
あるが、水の一部又は全部を水と混和しつる溶媒で置き
換えることもできる。水と混和しうる溶媒は当・業者に
周知であり、例えばグリセリン、アルコール類、グリコ
ール類、グリコールエーテル類等を使用できるか、もち
ろんこれらに限定されない。

かくして本発明によれば癌関連糖鎖を有利に測定するこ
とができる。測定された癌関連糖鎖レベルを健康人の当
該レベルと比較することにより、被検者における初期か
ら末期の消化器等の癌腫、特に大腸癌を診断することが
できる。従って本方法は特に癌の早期発見に極めて有用
である。

以下本発明を更に詳しく説明づるため糖抗原（フコース
抗原）及び抗体の製造例を挙げる。

抗原の製造例１ （１）３＝−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクトース
−フェネチルアミン誘導体の製造３′−α−Ｌ−フコピ
ラノシルーα−ラクトースＯ６１ミリモル及びβ−（ｐ
−アミノフェニル）エチルアミン３．５ミリモルを密閉
容器に入れ、室温で１５時間撹拌して反応させた。純エ
タノールＱ、５ｍｌを反応混合液に加え、次いで水素化
ホウ素ナトリウム１２１１１（ｌを懸濁させた純エタノ
ール１ｍｌを加え室温で５時間撹拌した。次いで水４＋
ｎｌを加えて希釈し、水冷下に木酢′酸を滴下してＩＩ
ＩＨ５，６に調整した。減圧下にエタノールを留去接水
を加えて５ｍｌとした反応混合液をセファデックスＧ−
１０カラム（２，５ｘ１００ｃｍ）に通し、１ＭＩＩ酸
−ビソービリジン緩衝液Ｈ＝５．０）で溶出した。溶出
液を５１づつ分画して、各画分につきフェノール硫酸反
応による中性糖の測定及びＯＤ２８５ｎｍでの吸光度測
定を行ない、それぞれのピークが一致する画分を集めて
凍結乾燥した。

凍結試料を２＋ｎＭ酢酸−ビリジン緩衝液（ｐＨ５，０
）に溶解し、フッ８フ２０ （０．５Ｘ２０ｃｎ＋）に通じ、同緩衝液で未反応原料
（３−一αーＬーフコピラノシルーαーラクトース）を
溶出後、０．１Ｎアンモニア水で溶出した。溶出液を２
０滴（約０．　６＋ｎｌ）づつ分画し、各両分につき上
記と同様にして中性糖測定、及び０Ｄ２ｅｓｎｌｌｌで
の吸光度測定を行ない、ピークが一致する両分を採取し
凍結乾燥した。

かくして３−一αーＬーフコピラノシルーαーラクトー
ス−フェネチルアミン誘導体を得た。このものの糖組成
は、ガスクロマトグラフィー（　３　ｉｏｃｈｅｍ．　
３　１ｏｐｈｙｓ，　　へｃｔａ．、２２２，３３９−
３４７）及び高速液体クロマトグラフィー（　Ｑ　ｅＶ
ｅｌＯｐｍｅｎｔａ＋Ｂ　１ｏｌｏｏｙ，　９０，　４
４１−４４４　　（　１９８２）　）により確認できた
。

（２＞３＝−α−１−フコピラノシル−αーラク１ーー
スーｐーイソチオシアネート−フェネチルアミン誘導体
く３″−α−り一フコビラノシルーαーラクトース−Ｐ
ＩＰ）の製造 上記（１）で得た３′−α−「−フコピラノシル−α−
ラクトース−フェネチルアミン誘導体の２５μモルを、
０．１μ炭Ｍボ素ナトリウム水溶液（ＬＨ＝８．０）２
ｍｌに溶解して、チオホスケン６５μモルを含むクロロ
ホルム２．５ｍｌ上に重層し、１時間激しく撹拌した。

反応混合物を遠沈管に移し、クロロホルム２１で２回抽
出し、過剰のチオホスゲンを除去し、水層を集め、窒素
カスを通して残存するクロロホルムを除去した。

かくして３′−α−しーフコピラノシル−α−ラクトー
ス−ｐ−イソチオシアネート−フェネチルアミン誘導体
を水性液として収得した。

（３）３−一αー１ー７コビラノシルーαーラクトース
−ｐ−イソチオシアネート−フェネチルアミン誘導体と
牛血清アルブミンとのカップリング反応による糖抗原（
３−−α−［−フコピラノシル−α−ラクトース−Ｐ　
Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ）の製造 上記（２）で得た水性液を、生血清アルブミン（ＢＳＡ
）０．２μモルを含む０．５Ｍ塩化ナトリウム−０．１
Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐ　Ｈ＝９．５＞に加え
、室温で１８時間撹拌して反応させた。反応混合液をダ
ルベツコ−処理のＰＢＳ　（−）＜生理食塩水−リン酸
塩緩衝液）２；に対して透析して、未反応の３−一αー
Ｌーフコビランシル−α−ラクトース−ｐ−イソチオシ
アネート−フェネチルアミン誘導体を除去した。

透．析液を１２時間毎に３回交換後、透析された液につ
き、ローリ−法及びフェノール硫酸反応を行ない、それ
ぞれの蛋白量及び中性糖の定量を行なつた。その結果得
られた馳折原は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１モルに
対して３−一α−し一フコピラノシル糖鎖が約２０モル
結合していた。

かくして目的とする馳折原液を得た。これを凍結保存し
た（これを「抗原−Ｉ　ｊとする）。

抗原の製造例２ 前記抗原の製造例１において、３′−α−Ｌ−フコピラ
ノシルーα−ラクトースに変えて４″−α−Ｌ−フコピ
ラノシルーα−ラクトースを用いて同様にして目的とす
る馳折原液を得た。これを凍結保存した（これを「抗原
−■」とする）。

この馳折原は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１モルに対
して４′−α−Ｌ−フコピラノシル糖鎖が約２５モル結
合していた。

抗原の製造例３ 前記抗原の製造例１において、３′−α−し一フコピラ
ノシルーα−ラクトースに変えて６″−α−Ｌ−ノコピ
ラノシルーα−ラクトースを用いて同様にして目的とす
る馳折原液を得た。これを凍結保存した（これを「抗原
〜■」とする）。

この馳折原は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１モルに対
して６′−α−Ｌ−フコピラノシル糖鎖が約２３モル結
合していた。

抗体の製造例１ ニューシーラント白兎のフットパッド（ｆｏｏｔｐａｄ
ｓ）に、上記抗原の製造例１で得た抗原−■の０．４ｍ
ｇを含むフロイント完全補助液１ｍｌを注射した。３週
間後同量の抗原−■含有フロイント完全補助液を注射し
、この操作を２週間毎に３回繰り返した。第３回目（最
終）の注射から１０日後に、試験動物から採面し、遠心
分離して抗血清を採取して目的の抗体を得た。これを「
抗体−■」とする。抗体−丁は一７０℃に保存される。

また上記で得られた抗血清を凍結乾燥して抗体−■の乾
燥品を得た。

抗体の製造例２ 前記抗原の製造例２で得た抗原−■を用い、抗体の製造
例１と同様にして目的の杭体く抗血清）を得た。これを
「抗体−■」とする。

抗体の製造例３ 前記抗原の製造例３で得た抗原−■を用い、抗体の製造
例１と同様にして目的の抗体く抗血清）を得た。これを
「抗体−■」とする。

以下、抗体の特異性試験例につき詳述する。

〈抗体の特異性試験　■〉 （１）　各種細胞を遠心分離＜５００ｘｇ　）Ｌ、リン
酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオン及びマグネシウ
ムイオン含有、ＤＨ＝７．２）の５０倍量で２回洗浄す
る。得られる細胞を上記リン酸塩緩衝生理食塩水に１％
（Ｖ／Ｖ）１１度となるように懸濁さぜ、この懸濁液５
０μＩに、抗体の製造例１〜３で得た抗体（抗体−１〜
−■）のそれぞれを予めリン酸塩緩衝生理食塩水（カル
シウムイオン及びマグネシウムイオン含有）で２０容積
倍に希釈したもの、又は対照として同様に希釈された正
常兎血清を混合し、各混合液を４℃下１時間インキュベ
ートする。その後置細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（カ
ルシウムイオン及びマグネジ。

ラムイオン含有、１）Ｈ＝７．２）の１００＠量で洗浄
し、次にＦＩＴＣが共有した羊抗兎Ｔ（ＩＧｃマイルス
ーイエーダ（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ　）社製〕の１７′
１０８１Ｒ液を用いて４℃下１時間インキュベートする
。引き続き、上記リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐ　Ｈ＝７
．２＞の１００倍量で２回洗浄後、各細胞を落射螢光顕
微鏡（オリンパスモデルＢＨ−ＲＦＩ−ＬＢ、オリンパ
ス光学社製）で観祭し、富士カラーフィルムＡＳＡ１０
０（富士フィルム社製）で撮影する。

（２）　癌又は正常組織を迅速に凍結し、クリオスタッ
ト（Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｑ　ｐｔｉｃａ１社製）に
より、超薄切片を得る。これをガラススライド上にアセ
トンで１分間固定して検体とし、更にＦＩＴＣ−羊抗兎
Ｉ（ＪＧの代りにＦＩＴＣ−羊抗兎Ｉ（］　Ｇ−Ｆ　（
ａｂ）　−２（Ｃａｐｐｅ１社製）を使用して、上記と
同様にして試験゛する。

上記（１）及び（２）において、用いた各細胞又は組織
片と抗体−Ｔ〜−■どの反応性を調べた結果を各抗体毎
に下記第１表に示す。第１表にお一′ける各反応性につ
いての評価記号は、それぞれ次のことを示す。

−・・・・染色像か認められるっ −・・・・染色像が認められない。

尚上記において抗体−Ｔ〜−■の代りに対照として使用
した正常兎血清の場合は、すべて染色像は認められなか
った。

第　　１　　表 正常細胞 マウス赤血球　　　−− マウスリンパ球　　−−− マウス牌細胞　　　− マウス胸腺細胞　　−− ヒト赤血球 （タイプＨ）　　　− （タイプ１−ｅａ）−−− マウステラトカルシノーマ Ｆ−９＋　　　　　−− ３ＳＴ−Ｍ　　　　　＋　　　　　十　　　　よ試験例
（２）の結果 十二指腸　　　　　−−− 肝　　臓　　　　　　　　　　−−− 胆のう　　　　　　−　　　　−− 膵　　臓　　　　　　　　　　−−− 肺　　臓　　　　　　　　　　−−− 甲状線　　　　　　−−− 胸　　腺　　　　　　　　　　　−−−リンパ節　　　
　　−−− 筋　　肉　　　　　　　　　　　−−−結合組織　　　
　　−−− 血　　管　　　　　　　　　　　−−−癌　　細　　胞 ヒト大腸アゾン カルシノーマ　　　＋　　　　十　　　　＋（手術片） （３）　上記（２）の試験で染色像が認められたヒト入
眠アデノカルシノーマ（手術片）を検体として、抗体−
王を使用し、第−反応時に０．２Ｍ３−−α−Ｌ−Ｖコ
ピラノシル　α−ラクトース、０．２Ｍラクトース、０
．２Ｍフコース又は１０ｍｇ／ｍ１３３△を存在させ、
上記（２）と同様にして試験した。その結果、染色像は
３′″−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクトースによ
り減弱されるが、ラフ１−ス、フコース及びＢＳＡでは
染色像に変化は認められなかった。

〈抗体の特異性試験　■〉 オーチテロニイ（Ｑ　ｕｃｌｌｔｅｒ　１ｏｎｙ　）二
重拡散分析法により、抗体−１〜抗体−■の特異性を以
下の通り調べた。即ち、１％寒天ゲル＜０．０１モルト
リス塩酸緩衝液（１）Ｈ＝７．６）中に２％トリトンＸ
−１ｏｏ、”０．１５Ｍ−Ｎａ　Ｃ１、フェニルメチル
スルホニルフルオライド５０ｕ（］／’ｍ＋及び０．０
５％Ｎａ　Ｎ３を含む寒天ゲル）をスライドグラス上に
積騙し、その中央に抗体を置き、周辺にそれぞれ２０μ
Ｑの、３−一α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラクトース
−Ｐ　！　Ｐ−８８へ、４−一α−「−フ」ピラノシル
−α−ラクトース−ＰＩＰ−ＢＳ’Ａ、６′−α−Ｌ−
７コビラノシルーα−ラク１〜−スーＰ　Ｉ　Ｐ−ＢＳ
Ａ、α−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ及びＢＳＡを
含む水溶液を置き、拡散試験を行なった。

結果を第１図〜第３図に示す。第１図は抗体−■の拡散
状態を示す図であり、第２図は抗体−■の拡散状態を示
１図であり、また第３図は抗体−■の拡散状態を示づ図
である。各図において（ａ　）は３′−α−１−フコピ
ラノシル−α−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ、（ｂ
）は４′−α−し一フ］ピラノシルーα−ラクトース−
ＰＩＰ−ＢＳＡ、（０）は６′−α−Ｌ−フコピラノシ
ルーα−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ、（ｄ　）は
α−プラク１−−、１．−ＰＩ　Ｐ−ＢＳＡ及び（ｅ　
）はＢＳＡをそれぞれ示す。各図より次のことが判る。

即ち、抗体−■は、３−一α−し一７コビラノシルーα
−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡとは沈降線を形成す
るが、他の抗原とは沈降線を形成しない。抗体−ＩＩは
、４′−α−Ｌ−フコピラノシルーα−ラク１−〜スー
Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡとは沈降線を形成するが、他の抗原
とは沈降線を形成しない。抗体−■は、６−−α−Ｌ−
７コビラノシルーα−ラクトース−Ｐ　Ｉ　Ｐ−ＢＳＡ
とは沈降線を形成するが、他の抗原とは沈降線を形成し
ない。尚上記試験において、抗体−■は前記抗体の製造
例で得られたちの１ｍｌ当り０，４ｍａのＢＳＡを加え
て４℃、−晩放＠後遠心分離して上清を採取し、抗ＢＳ
Ａ抗体を除去した後に、上記試験に使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は、本発明の抗体＝１〜抗体−ｍの二
重拡散分析法による拡散状態を示す図である。 （ＪＸ　　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ■　α−フコピラノシル−（１→３）−１−（１→４）
   −又は−（１→６）−ガラクトピラノシル基を含有する
   オリゴ糖とキャリアー蛋白との複合体からなる糖抗原を
   哺乳動物に投与し、生成する抗体を採取することを特徴
   とするフコース抗原を識別する抗体の製造法。