CN111537315B - 红细胞膜分离液和红细胞膜分离方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种红细胞膜分离液，其包括腺嘌呤0.2‑0.4g/L、海藻糖6‑9g/L、氯化钠0.5‑1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L‑0.03g/L。本文还提供了利用该分离液来制备红细胞膜的方法。通过该方法制备的红细胞膜基本上无血红蛋白残留。

Description

红细胞膜分离液和红细胞膜分离方法

技术领域

本文涉及用于制备红细胞膜的红细胞膜分离液，还涉及利用所述红细胞膜分离液来制备红细胞膜的方法。

背景技术

在生物学实验以及临床检验中，经常需要检测或使用红细胞膜抗原。这些膜抗原通常难以从红细胞膜上纯化出来，或者纯化后影响了其本身的生物学活性，例如抗原性。但是，在很多情况下，可以直接使用带有膜抗原的红细胞膜(或膜碎片)来进行这些试验。

现有技术中红细胞膜的制备主要是通过低渗法制备。例如，CN101109755A公开了采用低渗法制备红细胞膜蛋白的过程，包括加预冷的0 .01mol/L Tric-HCl与红细胞混合(V：V= 40：1)，4℃放置2h，再以9000r/min离心20min，重复多次，至无肉眼可见的红细胞为止。其他低渗方法还包括以蒸馏水或低渗PBS处理红细胞后再进行离心。另外，CN106754692公开了一种通过反复冻融来制备红细胞膜的方法。

这些方法在红细胞膜制备过程中，受红细胞的洗涤、红细胞膜破碎和分离的影响，经常有不同程度的血红蛋白残留进入所制备的膜样品中。血红蛋白是红细胞的主要组成部分，膜样品中残留血红蛋白，为后续膜样品作为原料运用，例如在硝酸纤维素膜(NC膜)上的固定以及在样品的纯度上产生干扰。产生干扰的原因主要有三点：1) 血红蛋白本身有颜色，膜样品固定NC膜上，呈现肉眼可见的颜色干扰；2) 血红蛋白的卟啉环具有明显的氧化反应活性，可催化辣根过氧化物酶(HRP)的底物发生颜色反应，从而造成ELISA及部分HRP参与的层析检测干扰；3) 血红蛋白的卟啉环本身具有自发荧光，且荧光反应比较强烈，对荧光层析反应存在干扰。

现有红细胞膜制备方法并未考虑血红蛋白残留对后续实验的影响，也未能有效除去残留的血红蛋白。

发明内容

一方面，本文提供了一种红细胞膜分离液，其包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。

在一些实施方案中，所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。

另一方面，本文提供了一种制备红细胞膜的方法，包括：

1) 提供压积红细胞；

2) 以红细胞膜分离液悬浮所述压积红细胞，让所述红细胞破碎产生膜碎片；以及

3) 在所述红细胞分离液中通过离心沉淀所述膜碎片，

其中所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。

在一些实施方案中，所述红细胞分离液包括腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。

在一些实施方案中，在步骤1)和步骤2)之间还包括以所述红细胞分离液对所述压积红细胞进行洗涤。

在一些实施方案中，步骤2)所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于10：1。

在一些实施方案中，步骤2)所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于40：1。

在一些实施方案中，步骤2)包括在4℃下悬浮不少于2 h。

在一些实施方案中，在步骤3)中，在离心半径为 10cm时，离心转速不低于9000 r/min。

在一些实施方案中，所述红细胞为人红细胞。

本文提供的红细胞分离液可以使制备的红细胞膜中血红蛋白基本上全部去除，增强了红细胞膜抗原的纯度，避免了进行后续试验时的血红蛋白干扰。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

“红细胞膜”指来自红细胞的细胞膜。在本文中，由于需要红细胞破碎以释放出其中的血红蛋白，因此所制备的红细胞膜不必是完整的红细胞膜(即红细胞血影)，而可以是红细胞破碎后产生的膜碎片。这些红细胞血影和膜碎片可通过离心作为沉淀物与其他成分(如血红蛋白)分开。这种沉淀物在本文中也称为“膜样品”或“红细胞膜样品”。另外，为了叙述方便，本文并不对溶液或沉淀物中的红细胞血影和膜碎片进行区分，而是将它们统称为“膜碎片”。

“压积红细胞”指通过离心除去全血中白细胞、血小板和大部分血浆后剩余的主要含红细胞的部分。可视情况进行多次离心以获得洁净的压积红细胞。制备压积红细胞的方法在本领域内是公知的。

本文提供的红细胞膜制备方法部分地基于发明人意外地发现，采用特定成分的分离液有利于大大减少制备的膜样品中的血红蛋白残留量。结合适当的离心转速，可以使红细胞膜样品中血红蛋白的残存量小于0.01mg/L，甚至小于1μg/L。

所用的红细胞分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。这里所用的“包括”旨在表明该红细胞分离液中还可以含有其他成分，例如水和少量的其他成分或杂质，只要这种少量其他成分或杂质的存在并不影响使用该红细胞分离液来制备膜样品。例如，在非限定性实例中，该红细胞分离液还可以含有少量抑菌剂。

以下通过具体实施例来进一步阐述本发明的技术方案。

主要实验材料和设备

人血红蛋白(HB)酶联免疫吸附检测试剂盒：上海扶生实业有限公司 货号，A097153

酶标仪：德铁酶标仪，型号HBS-1096A

离心机：北京白洋高速冷冻离心机，型号BY-R20，转子型号15mLx8，离心半径约10cm

实施例1 血红蛋白浓度测定方法

本实施例阐述血红蛋白浓度的测定方法，其用于在下文实施例中测定制备的红细胞膜样品中的血红蛋白浓度。采用人血红蛋白(HB)酶联免疫吸附检测试剂盒进行血红蛋白浓度检测。

检测原理：用抗人HB抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人HB会与包被抗体结合，游离成分被洗去。依次加入生物素化的抗人HB抗体和辣根过氧化酶标记亲和素。抗人HB抗体与结合在包被抗体上的人HB结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加入终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，HB浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中HB的浓度。

样品检测准备过程：

1. 取500μL离心后的沉淀物(即红细胞膜样品)悬浮于1mL 0.01mol/L PBS(pH7.2)中，5000r/min离心10min， 取上清液进行检测。

2. 提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

检测过程(参考试剂盒说明书)：

1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后加待测样品10μL (样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板空底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。

4. 温育：用封板膜封板后置37摄氏度温育60min。

5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30S后弃去，如此重复5次，拍干。

7. 显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37摄氏度避光显色15min。

8. 终止：每孔加终止液50μL，终止反应。

9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min内进行。

结果判断：

1. 计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘制出四参数逻辑函数的标准曲线。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。

3. 最低检测浓度为1.0μg/L。

通过上文对测定方法的描述可知，将所测得的上清液中游离血红蛋白浓度乘以3，则得到制备的红细胞膜样品中的实际血红蛋白浓度。以下各实施例中的血红蛋白浓度结果均为计算出的实际血红蛋白浓度。

实施例2 传统红细胞膜提取方法(对比实施例)

本实施例采用目前常用的红细胞膜提取方法来制备红细胞膜。制备过程如下：

1) 取3mL A型(或其他血型)抗凝混合全血，加入装有10mL0.01mol/L PBS(pH7.2)的15mL离心管中，3000r/min离心5min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层，获得约1.5mL压积红细胞；

2) 用相当于压积红细胞3倍的4℃预冷0.01mol/L PBS (pH7.2)洗涤3次，每次在4℃下以5000r/min离心15min；

3) 以V: V = 40: 1的比例加4℃预冷的0.01mol/L PBS (pH7.2)与沉淀物混合，4℃放置2 h，再以9000r/min离心20min，弃上清；

4) 再重复步骤3) 4次，直至无肉眼可见的红细胞，所获得的约800μL沉淀物既为携带膜抗原的红细胞膜样品。

我们采用实施例1的方法对步骤3)和4)中多次离心分别得到的沉淀物进行血红蛋白测定。测定结果显示在表1中。

表1 膜样品中血红蛋白浓度

多次离心之后，所制备的红细胞膜抗原中残留血红蛋白量约为0.03mg/L。肉眼观察也可见制备的膜样品为粉红色。血红蛋白的存在其降低了红细胞膜抗原的纯度，如果将其用于下游实验，经常会产生干扰。

实施例3 采用本文提供的红细胞膜分离液提取红细胞膜

本实施例以本文提供的分离液替换实施例2红细胞膜提取过程中使用的PBS缓冲液。为了与实施例2的结果进行对比，对操作步骤本身基本上不进行改动。

本实施例所使用的分离液包括：腺嘌呤0.3g/L，海藻糖7g/L，氯化钠0.7g/L，以及磷酸二氢钠0.02g/L。

本实施例红细胞膜具体制备过程如下：

1) 取3mL A型(或其他血型)抗凝混合全血，加入装有10mL 分离液的15mL离心管中，3000r/min离心5min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层，获得约1.5mL压积红细胞；

2) 用相当于压积红细胞3倍的4℃预冷分离液洗涤3次，每次在4℃下以5000r/min离心15min；

3) 以V: V = 40: 1的比例加4℃预冷分离液与沉淀物(主要是红细胞)混合，4℃放置2h，再以9000r/min离心20min，弃上清。所获得约890μL沉淀物既为携带膜抗原的红细胞膜样品。

与实施例2不同，本实施例没有重复进行步骤3)，原因在于步骤3) 一次离心之后获得的红细胞膜样品为乳白色，经测定，其中的血红蛋白浓度已经低于检测限。

实施例4 分离液与沉淀物体积比对膜样品中血红蛋白浓度的影响

在实施例3基础上，我们对步骤3)中所加的分离液与沉淀物(主要为红细胞)的体积比进行了研究，希望能尽量降低分离液的用量，以降低生产成本。

实验操作同实施例3，以6个体积比进行了试验。结果见下表2。

表2 膜样品中血红蛋白浓度

由表2中结果可知，分离液与沉淀物体积比会影响到血红蛋白的残留。但是，如果与实施例2制备的红细胞膜样品中血红蛋白残留量相比较，可以预期的是，如果同样进行多次离心(实施例3中的步骤3))，则也可以实现残留血红蛋白低于检测限。

实施例5不同离心转速对细胞膜抗原制备的影响

在实施例3基础上，我们对步骤2)中洗涤红细胞所用的离心转速和步骤3)所用的离心转速进行了研究。

实验操作同实施例3，采用各个不同的离心转速进行试验。离心转速和制备的红细胞膜样品中血红蛋白残留量都列在下表3和4中。

表3不同离心转速情况下制备的膜样品中血红蛋白浓度

表4不同离心转速情况下制备的膜样品中血红蛋白浓度

由表3和4中结果可见，离心转速也会影响到血红蛋白的残留。但是，同样地，如果与实施例2制备的红细胞膜样品中血红蛋白残留量相比较，可以预期的是，如果同样进行多次离心(实施例3中的步骤3))，则采用较低离心转速也可以实现残留血红蛋白低于检测限。

实施例3-5中所使用的分离液的渗透压(或离子强度)是高于实施例2中的PBS渗透压的，但制得的膜样品中血红蛋白残留远低于实施例2。虽然从理论上还难以充分解释这种现象的原因，但我们分析，可能是在这种分离液存在下血红蛋白不易被吸附在红细胞膜上，或者这种分离液存在下让血红蛋白与红细胞膜之间沉降速度的差异进一步加大，导致红细胞膜能够快速沉降而血红蛋白基本上全部处于上清液中，或者是这两种因素(以及其他因素)共同作用的结果。

实施例6 分离液成分对细胞膜抗原制备的影响

本实施例研究分离液成分的浓度变化对红细胞膜制备的影响。采用不同的分离液成分，按实施例5中描述的方法制备红细胞膜。分离液成分和对应的检测结果显示在表5中。

表5 不同分离液和不同离心转速情况下制备的膜样品中血红蛋白浓度

从表5结果可知，当分离液成分在一定范围内变动时，仍可获得基本上不含有血红蛋白的红细胞膜样品。当对样品中血红蛋白残留要求严格时，可通过提高离心转速来进一步减小残留量。

采用本文提供的分离液制备的携带膜抗原的红细胞膜样品，残留血红蛋白量低，提高了红细胞膜抗原的纯度。同时，制备过程简单，可以省去反复离心操作程序，也节省了时间。

Claims (8)

1.红细胞膜分离液，包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L。

2.如权利要求1所述的红细胞膜分离液，包括：腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。

3.制备红细胞膜的方法，包括：

1) 提供压积红细胞；

2) 以红细胞膜分离液悬浮所述压积红细胞，让所述红细胞破碎产生膜碎片；以及

3) 在所述红细胞分离液中通过离心沉淀所述膜碎片，

其中所述红细胞膜分离液包括：腺嘌呤0.2-0.4g/L、海藻糖6-9g/L、氯化钠0.5-1.0g/L、以及磷酸二氢钠0.01g/L-0.03g/L；步骤2)中所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于10：1；步骤3)中，在离心半径为 10cm时，离心转速不低于9000 r/min。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述红细胞分离液包括腺嘌呤0.3g/L、海藻糖7g/L、氯化钠0.7g/L、以及磷酸二氢钠0.02g/L。

5.如权利要求3所述的方法，其中在步骤1)和步骤2)之间还包括以所述红细胞分离液对所述压积红细胞进行洗涤。

6.如权利要求3所述的方法，其中所用红细胞膜分离液与所述压积红细胞的体积比不低于40：1。

7.如权利要求3所述的方法，其中步骤2)包括在4℃下悬浮不少于2 h。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述红细胞为人红细胞。