CN112485454A - 一种脂蛋白(a)检测试剂盒 - Google Patents

一种脂蛋白(a)检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112485454A
CN112485454A CN202011315826.9A CN202011315826A CN112485454A CN 112485454 A CN112485454 A CN 112485454A CN 202011315826 A CN202011315826 A CN 202011315826A CN 112485454 A CN112485454 A CN 112485454A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipoprotein
solution
detection kit
human apolipoprotein
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202011315826.9A
Other languages
English (en)
Inventor
黄秀珍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Aoyu Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Aoyu Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Aoyu Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Aoyu Technology Co ltd
Priority to CN202011315826.9A priority Critical patent/CN112485454A/zh
Publication of CN112485454A publication Critical patent/CN112485454A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白(a)检测试剂盒。本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒主要由抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶‑链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液组成。本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒具有操作简单，灵敏度高和抗干扰能力强的优点，可以有效降低血清中其他物质的干扰，尤其是抗RF因子对检测结果的干扰作用，大大的提高检测结果准确性和稳定性。同时，该试剂盒还可以降低因脂蛋白(a)中载脂蛋白(a)分子KringleIV‑2拷贝数的差异性而导致的检测结果不准确的现象，更有利于动脉硬化和心脏疾病患者的早期诊断和预后处理。

Description

一种脂蛋白(a)检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白(a)检测试剂盒。
背景技术
脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]是人体内一种独特的脂蛋白，有低密度脂蛋白(LDL)样微粒和载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a),apo(a)]组成。目前，大量的流行病学和临床研究已经证明Lp(a)水平与心脏疾病和缺血性脑卒中存在连续的独立的中等程度的相关，虽然Lp(a)在不同人群的血液中存在较大的差异性，但其在同一个体血清中浓度相对稳定，除遗传因素外，几乎不受年龄、性别、吸烟、饮食、脂代谢、药物、环境等因素的影响。因此，高Lp(a)可以作为心脑血管动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素。
目前，Lp(a)的检测方法有：放射免疫法、ELISA法、免疫比浊法和脂蛋白(a)-胆固醇法等，各个检测方法均存在各自的优缺点。其中放射免疫法存在放射性污染，酶联免疫法受人为因素影响较大；脂蛋白(a)-胆固醇法操作复杂，需要用超速离心或其它方法从血浆中分离出脂蛋白(a)，然后再用胆固醇酶法检测脂蛋白(a)；免疫比浊法对不同大小的apo(a)分子检测偏差较大，与纤溶酶原有交叉反应，易受类风湿因子干扰。因此，研究和开发一种操作检测，检测结果准确度高和稳定性好的脂蛋白(a)检测试剂盒仍是当前亟需攻克的难题。
ELISA法具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，其用于脂蛋白(a)的检测中具有特度的优势。专利文献CN107037217A公开了一种脂蛋白a的酶联免疫试剂盒及其制备方法，所述脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒主要由(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液组成。所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0，制备得到的试剂盒具有检测灵敏度高和稳定性好的优点。
然而，本发明人在研究中发现，但是该检测试剂盒在检测过程中易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)引起的干扰。类风湿因子是在类风湿性关节炎(RA)病人血清中发现，是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性IgG的抗体，属IgM型，可与IgGFc段结合。因此，可能会导致检测结果差异性较大，准确性较低，不适合广泛推广和应用。
发明内容
为了解决现有技术中脂蛋白(a)的酶联免疫试剂盒的不足，本发明目的在于提供一种脂蛋白(a)检测试剂盒，该检测试剂盒具有灵敏度高、抗干扰能力强，检测准确度和稳定性好的优点。
本发明提供了一种脂蛋白(a)检测试剂盒，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液；所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；所述生物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。
进一步地，所述抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
进一步地，所述生物素抗体包被板的制备方法为：
将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
进一步地，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。
进一步地，所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L PBS缓冲液。
进一步地，所述稀释液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇10～15g/L、月桂醇聚氧乙烯醚5～8g/L、精氨酸12～15g/L、丙酮酸钠2～4g/L、氯化钠6～8g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
进一步地，所述稀释液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
进一步地，所述洗涤液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇8～12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚3～6g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。
进一步地，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液。
进一步地，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸。
目前，ELISA法虽具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，但是其灵敏度会随着标记的酶的活性而存在差异，且会随着酶活性的降低而降低，而且对于脂蛋白(a)检测会存在嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰，同时还会存在胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质的影响，导致试剂盒的检测结果准确度低，严重影响病程的判断。
为了解决上述问题，本发明人提供了一种专用的抗干扰稀释液和洗涤液，可以避免或减轻血清尤其是血清中除了脂蛋白(a)之外的其他物质对脂蛋白(a)检测结果干扰的现象，尤其是可以消除RF因子对测定结果的干扰，还可以消除一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的干扰，从而提高检测结果的准确性。
本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒是本发明人经过大量的摸索试验验证得到的。乙基苯基聚乙二醇是一种非离子性非变性去垢剂和表面活性剂，发明人在试验中意外发现，乙基苯基聚乙二醇可以降低样品中RF因子与抗人IgG结合的能力，而标记抗体与待测抗原的结合能力不受影响，同时，其还可以降低一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的影响，从而达到抗干扰的效果。其抗干扰原理发明人推测可能是：乙基苯基聚乙二醇可以打开抗变性IgG抗体中存在的二硫键，破坏抗变性IgG抗体的结构，从而消除抗变性IgG抗体的干扰作用。而且该乙基苯基聚乙二醇还可以降低一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的影响，并且乙基苯基聚乙二醇的加入不影响标记抗体与待测抗原的结合能力，即对检测结果不会造成任何影响。
进一步地，月桂醇聚氧乙烯醚是一种能与各种表面活性剂复配，降低它们的刺激性，改善产品的性能带的非离子表面活性剂。发明人加入月桂醇聚氧乙烯醚原本欲用以提高乙基苯基聚乙二醇消除RF因子的干扰性的性能，然而经试验发现，加入月桂醇聚氧乙烯醚对乙基苯基聚乙二醇的抗RF因子能力基本无影响，但是月桂醇聚氧乙烯醚的加入可以协同增加乙基苯基聚乙二醇对胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质的抗干扰能力，从而可以进一步提高试剂盒的抗干扰效果。
进一步地，试剂盒中的洗涤液是用于分离游离的和结合的酶标记物的目的。本发明采用乙基苯基聚乙二醇和月桂醇聚氧乙烯醚组成的洗涤液可以很好清除残留在板孔中游离的物质和非特异性地吸附的干扰物质，从而可以提高试剂盒的抗干扰能力，保证检测结果的准确性。封闭就是让大量不相关的蛋白质填充微孔板的空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物的再吸附。而本发明添加有乙基苯基聚乙二醇的封闭液可以很好地稳定不相关蛋白质的结构，从而可以很好的达到填充效果，减少后续干扰物的再吸附，从而提高试剂盒的抗干扰能力。
其次，本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒是本发明人是在常规酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶之间的作用，建立了一种高灵敏度的生物素-酶联免疫检测试剂盒。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成，其与生物素具有很强的特异性结合能力，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。本发明有生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体中的生物素可以迅速与辣根过氧化物酶产生反应，即提高了抗原与抗体的结合速度和增强了结合能力，从而可以进一步降低抗RF因子对检测结果的干扰作用，同时该生物素-酶联免疫检测还可以起到多级放大的作用，进一步提高检测结果的灵敏度和准确度。
另外，鉴于脂蛋白(a)中载脂蛋白(a)分子KringleIV-2拷贝数的差异性，用针对该位点的抗体作为原料制备的试剂盒会受到抗原多态性的影响，造成检测结果准确度低的缺陷。本发明采用抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体作为包被酶标板，该抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体可以识别多个抗原表位，可以避免KringleIV-2拷贝数的差异性而导致的检测结果不准确的问题，可以提高检测的灵敏度和准确性。
总之，与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：
(1)本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒具有操作简单，灵敏度高和抗干扰能力强优点，可以有效降低血清的其他物质的干扰，尤其是抗RF因子对检测结果的干扰作用，大大的提高检测结果准确性和稳定性。
(2)本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒还可以降低因脂蛋白(a)中载脂蛋白(a)分子KringleIV-2拷贝数的差异性而导致的检测结果不准确的现象，有利于动脉硬化和心脏疾病患者的早期诊断和预后处理。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体试验条件的试验方法，通常按照常规条件，分子克隆试验指南(Sambrook J,et al.2008.Molecular Cloning:A LaboratoryManual,3rd Ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备
1、抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
2、生物素抗体包被板的制备方法为：
将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
3、脂蛋白(a)系列标准品：
所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L PBS缓冲液。
4、稀释液的配置：
乙基苯基聚乙二醇10g/L、月桂醇聚氧乙烯醚5g/L、精氨酸12g/L、丙酮酸钠2g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
5、洗涤液的配置：
乙基苯基聚乙二醇8g/L、月桂醇聚氧乙烯醚3g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。
6、将抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液组装，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸，即得。
实施例2、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备
1、抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和4g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
2、生物素抗体包被板的制备方法为：
将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和4g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
3、脂蛋白(a)系列标准品：
所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L PBS缓冲液。
4、稀释液的配置：
乙基苯基聚乙二醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
5、洗涤液的配置：
乙基苯基聚乙二醇10g/L、月桂醇聚氧乙烯醚5g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。
6、将抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液组装，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸，即得。
实施例3、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备
1、抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和5g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
2、生物素抗体包被板的制备方法为：
将羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和5g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
3、脂蛋白(a)系列标准品：
所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L PBS缓冲液。
4、稀释液的配置：
乙基苯基聚乙二醇15g/L、月桂醇聚氧乙烯醚8g/L、精氨酸15g/L、丙酮酸钠4g/L、氯化钠8g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
5、洗涤液的配置：
乙基苯基聚乙二醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。
6、将抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液组装，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸，即得。
对比例1、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述抗体酶标板的制备过程和生物素抗体包被板的制备过程的封闭液为0.2％BSA，其余步骤与实施例2类似。
对比例2、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述稀释液为2-巯基乙醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液，其余步骤与实施例2类似。
对比例3、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述稀释液为：0.05％(V/V)吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液，其余步骤与实施例2类似。
对比例4、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述稀释液为：乙基苯基聚乙二醇12g/L、0.05％(V/V)曲拉通X-100、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液，其余步骤与实施例2类似。
对比例5、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述洗涤液为：0.1％(V/V)吐温20、月桂醇聚氧乙烯醚5g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液，其余步骤与实施例2类似。
对比例6、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒的制备方法不同在于，所述洗涤液为：乙基苯基聚乙二醇10g/L、0.1％(V/V)曲拉通X-100、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液，其余步骤与实施例2类似。
对比例7、一种脂蛋白(a)检测试剂盒
所述脂蛋白(a)检测试剂盒为公开号为CN107037217A申请文本中实施例1制得的脂蛋白(a)的酶联免疫检测试剂盒。
试验例一、脂蛋白(a)检测试剂盒的抗类风湿因子干扰试验
1、试验材料：
实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6和对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒。
2、试验方法：
采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6和对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒分别对分别加入不同浓度的类风湿因子的同一份血清样品进行检测，加入类风湿因子后的样本测定值除以加入类风湿因子前的样本测定值即为回收率，按照回收率在100％的基础上，上下偏差不得超过10％来判断试剂盒是否受干扰物的影响。
3、试验结果：
试验结果如表1所示。
表1脂蛋白(a)检测试剂盒的抗干扰试验数据
Figure BDA0002791381350000091
Figure BDA0002791381350000101
由表1可知，本发明实施例1～3制得的脂蛋白(a)检测试剂盒对一定浓度的类风湿因子具有较好的抗干扰能力，而对比例1～7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒均受到一定浓度的类风湿因子的干扰，对检测结果具有较大的影响。
试验例二、脂蛋白(a)检测试剂盒的抗干扰试验
1、试验材料：
实施例2和对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒。
2、试验方法：
采用实施例2和对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒分别对分别加入不同含量的干扰物物质的同一份血清样品进行检测，加入干扰物质后的样本测定值除以加入干扰物质前的样本测定值即为回收率，按照回收率在100％的基础上，上下偏差不得超过10％来判断试剂盒是否受干扰物的影响。
3、试验结果：
试验结果如表2～表3所示。
表2实施例2制得的脂蛋白(a)检测试剂盒的抗干扰试验数据
Figure BDA0002791381350000102
Figure BDA0002791381350000111
表3对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒的抗干扰试验数据
Figure BDA0002791381350000112
由表2和表3可知，本发明制得的脂蛋白(a)检测试剂盒对一定浓度的游离胆红素、结合胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质具有较好的抗干扰能力，而对比例7制得的脂蛋白(a)检测试剂盒均受到一定浓度的游离胆红素、结合胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质的干扰，对检测结果具有较大的影响。
试验例三、脂蛋白(a)检测试剂盒的精确度和灵敏度试验
1、试验材料：
实施例2制得的脂蛋白(a)检测试剂盒。
2、试验方法：
参考专利文献CN107037217A中实施例2的灵敏度的检测方法和实施例4的精密度的检测方法进行检测。
3、试验结果：
3.1、灵敏度检测：本发明实施例2制得的脂蛋白(a)检测试剂盒的灵敏度可以达到0.1mg/L。
3.2、精密度检测：本发明实施例2制得的脂蛋白(a)检测试剂盒对于正常血清的检测平均值为209.5mg/L，SD为1.2，批间CV为0.57％，对于高脂血清的检测平均值为478.7mg/L，SD为4.9，批间CV为1.02％。
经试验证明，本发明实施例2制得的脂蛋白(a)检测试剂盒具有较高的灵敏度和精密度。
试验例四、脂蛋白(a)检测试剂盒的稳定性试验
1、试验材料：
实施例2制备得到的脂蛋白(a)检测试剂盒。
2、试验方法：
将实施例2制备的脂蛋白(a)检测试剂盒在室温下放置12个月后，参考试验例一和试验例二的方法测定脂蛋白(a)检测试剂盒的抗干扰能力。
3、试验结果
试验结果如表4所示：
表4脂蛋白(a)检测试剂盒存放12个月后的抗干扰结果
Figure BDA0002791381350000121
Figure BDA0002791381350000131
由表4可知，本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒存放12个月后，其检测结果不受一定浓度的游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白，三酰甘油和类风湿因子等干扰物质的干扰，说明本发明提供的脂蛋白(a)检测试剂盒具有较高的稳定性，可以有效保证检测结果的准确性，更有利疾病的诊断与治疗。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (10)

1.一种脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液；所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；所述生物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
3.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述生物素抗体包被板的制备方法为：
将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。
4.如权利要求1～3任一所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。
5.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/L碳酸钠缓冲液。
6.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇10～15g/L、月桂醇聚氧乙烯醚5～8g/L、精氨酸12～15g/L、丙酮酸钠2～4g/L、氯化钠6～8g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
7.如权利要求6所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。
8.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液由以下组分组成：
乙基苯基聚乙二醇8～12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚3～6g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。
9.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液。
10.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸。
CN202011315826.9A 2020-11-22 2020-11-22 一种脂蛋白(a)检测试剂盒 Withdrawn CN112485454A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011315826.9A CN112485454A (zh) 2020-11-22 2020-11-22 一种脂蛋白(a)检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011315826.9A CN112485454A (zh) 2020-11-22 2020-11-22 一种脂蛋白(a)检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112485454A true CN112485454A (zh) 2021-03-12

Family

ID=74933132

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011315826.9A Withdrawn CN112485454A (zh) 2020-11-22 2020-11-22 一种脂蛋白(a)检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112485454A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114994306A (zh) * 2022-05-31 2022-09-02 哈尔滨医科大学 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒
CN115078739A (zh) * 2022-08-22 2022-09-20 上海执诚生物科技有限公司 一种检测载脂蛋白a1的试剂盒及其应用
CN115078737A (zh) * 2022-06-30 2022-09-20 山东帝俊生物技术有限公司 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用
CN117405890A (zh) * 2023-12-15 2024-01-16 北京美联泰科生物技术有限公司 胃蛋白酶原ii的化学发光检测试剂盒及方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114994306A (zh) * 2022-05-31 2022-09-02 哈尔滨医科大学 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒
CN114994306B (zh) * 2022-05-31 2022-12-09 哈尔滨医科大学 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒
CN115078737A (zh) * 2022-06-30 2022-09-20 山东帝俊生物技术有限公司 一种检测狂犬免疫血浆效价的试剂盒及其制备方法、应用
CN115078739A (zh) * 2022-08-22 2022-09-20 上海执诚生物科技有限公司 一种检测载脂蛋白a1的试剂盒及其应用
CN115078739B (zh) * 2022-08-22 2022-11-22 上海执诚生物科技有限公司 一种检测载脂蛋白a1的试剂盒及其应用
CN117405890A (zh) * 2023-12-15 2024-01-16 北京美联泰科生物技术有限公司 胃蛋白酶原ii的化学发光检测试剂盒及方法
CN117405890B (zh) * 2023-12-15 2024-03-29 北京美联泰科生物技术有限公司 胃蛋白酶原ii的化学发光检测试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112485454A (zh) 一种脂蛋白(a)检测试剂盒
JP6750066B2 (ja) ビタミンｄ結合タンパク質からビタミンｄを解離するための溶液、その関連検出法及び使用
WO2013097607A1 (zh) 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN105548571A (zh) 检测血清淀粉样蛋白a含量的试剂盒、方法及用途
JP2021119355A (ja) ビタミンｄをアッセイするための方法および組成物
WO2019075769A1 (zh) 一种超敏c反应蛋白的检测方法
EP4279922A1 (en) Latex enhanced competitive turbidimetric immunoassay detection method and kit
JP2002539458A (ja) 唾液中のａｐｏａおよびａｐｏｂ、ならびにそれらの比を検出するための方法およびデバイス
CN110297093B (zh) 一种检测人免疫球蛋白g4的方法和试剂盒
JP6388861B2 (ja) 検体総濃度の特定
WO2024120133A1 (zh) 疏水性干扰物及其制备方法和应用
JPH06300761A (ja) 免疫比濁測定試薬及び測定方法
CN113917142A (zh) 一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒及制备方法和检测方法
Ćulafić et al. Plasma and platelet serotonin levels in patients with liver cirrhosis
US10191069B2 (en) Accurate assay measurement of hydrophobic haptenic analytes
CN102368068B (zh) 检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒
JPH06104064B2 (ja) 安定化酵素結合体組成物
WO2006027990A1 (ja) 免疫比濁法及びそのための試薬
US20150212099A1 (en) Methods and compositions for assaying vitamin d
Alcantara et al. Heparin in plasma samples causes nonspecific binding to histones on Western blots
JP3998245B2 (ja) 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット
CN110687285B (zh) 诊断试剂盒及mak16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用
CN112763731A (zh) 一种脂蛋白（a）测定试剂盒及其检测方法
CN111077321B (zh) 抗mcv抗体定量检测试剂盒及其制备方法
US9541550B2 (en) Method for immunologically measuring soluble LR11

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210312