CN105548571A - 检测血清淀粉样蛋白a含量的试剂盒、方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品;所述试剂R1包括:第一缓冲液、第一电解质、表面活性剂、第一稳定剂、高分子促进剂和第一防腐剂;所述试剂R2包括:第二缓冲液、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒、第二电解质、第二稳定剂和第二防腐剂;所述血清淀粉样蛋白A校准品包括:第三缓冲液、第三稳定剂、第三防腐剂、抗氧化剂和抗人免疫球蛋白A抗原。一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒的在检测血清淀粉样蛋白A含量中的用途及采用检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法。本发明的试剂盒及方法,可简洁快速地检测其含量。
Description
技术领域
本发明属于检测血清淀粉样蛋白A含量的技术领域,具体涉及一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒、方法及用途。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是一个高度异质性蛋白,代表一个相对分子量为12000的家族。SAA基因位于第11号染色体,已经获得人类SAA完整的氨基酸序列,其mRNAs和蛋白在脊椎动物中的表达均高度保守,表明它有重要的生物学机能。SAA主要由肝细胞产生,但肝外细胞有SAA的体质性表达。SAA家族包含有不同表达形式的载脂蛋白、急性相蛋白A(A-SAAs)和结构型SAA(C-SAAs)。A-SAAs是主要的急性反应蛋白,在炎症反应中其浓度可以增加1000倍之多。相比之下,C-SAAs仅在人和鼠类中被发现,很少被诱导增多。A-SAAs由104个氨基酸构成,其前端76个氨基酸被酶切后为淀粉样蛋白A。
SAA是一个非常敏感的急性相反应物,在炎症反应中SAA这种急性反应物的浓度会比正常时增加1000倍。另一方面,SAA不仅能结合HDL,也能与低密度脂蛋白(LDL)片段结合一项通过检测血中SAA/LDL复合体的前瞻性研究发现,与传统冠心病危险因素(载脂蛋白、炎症因子CRP、SAA)相比,SAA/LDL复合体水平的高低与稳定性冠心病病人的预后独立正相关。作为炎性标志物的CRP和SAA在急性冠脉综合征(ACS)的诊断和危险分层中的作用亦为许多研究所证实。有研究表明:ACS患者血浆CRP和SAA水平均明显增高,且在起病后数日内呈显著升高趋势。
SAA目前常用检测方法有:酶联免疫法、透射比浊法和散射比浊法。在上述方法中,酶联免疫法具有酶催化的扩大效应,但定量不够准确,灵敏度较低;免疫散射比浊法须用特制的特种蛋白仪、试剂成本高、测试速度慢。胶乳增强透射比浊法的仪器投资成本低、不需要另配专用的特种蛋白仪、试剂开启后稳定成本低、校准周期较长、患者的费用低,可与生化样本合并,可降低采血成本、测试速度快、结果稳定、线性范围广、重复性好,适合进行临床推广应用。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,可以简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量,具有较高的准确度和很好的特异性。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种上述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒的在检测血清淀粉样蛋白A含量中的用途,可用于简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量,具有较高的准确度和很好的特异性。
本发明实施例的再一目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种采用上述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法,可以简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量,具有较高的准确度和很好的特异性。
为了实现上述发明目的,本发明实施例的技术方案如下:
一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品;所述试剂R1包括:第一缓冲液10~500mmol/L、第一电解质5~50g/L、表面活性剂0.5~50g/L、第一稳定剂0.5~10g/L、高分子促进剂1~100g/L和第一防腐剂1~10g/L;所述试剂R2包括:第二缓冲液10~500mmol/L、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒5~50%w/v、第二电解质5~50g/L、第二稳定剂0.5~10g/L和第二防腐剂1~10g/L;所述血清淀粉样蛋白A校准品包括:第三缓冲液10~500mmol/L、第三稳定剂5~50g/L、第三防腐剂1~10g/L、抗氧化剂0.01~10g/L和血清淀粉样蛋白A抗原。
进一步,所述抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒的制备过程如下:在交联缓冲液中,通过化学交联剂将抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体包被到胶乳颗粒的表面。
进一步:所述交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸MOPSO缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液或者磷酸缓冲液,所述交联缓冲液的pH值为6.0~8.0;所述化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼和异氰酸酯中的一种或几种;所述抗人血清淀粉样蛋白A抗体选自鼠抗人、鸡抗人、兔抗人、羊抗人或牛抗人血清淀粉样蛋白A抗体;所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。
进一步:所述胶乳颗粒的浓度为0.5~5mg/mL,所述胶乳颗粒的直径为100~300nm。
进一步:所述胶乳颗粒的表面连有功能团,所述功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基。
进一步:所述试剂R1的pH为6~9,所述试剂R2的pH为6~9。
进一步:所述第一缓冲液、所述第二缓冲液和所述第三缓冲液均选自醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种;和/或,所述第一稳定剂、所述第二稳定剂和所述第三稳定剂均选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种;和/或,所述第一防腐剂、所述第二防腐剂和所述第三防腐剂均选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种;和/或,所述第一电解质和所述第二电解质均选自氯化钠、硫酸镁、氯化镁和氯化钾中的一种或几种;和/或,所述表面活性剂选自Triton系列表面活性剂、Tween系列表面活性剂、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种;和/或,所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种;和/或,所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚和维生素系列中的一种或几种。
进一步:所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的成分相同。
一种如上所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒的在检测血清淀粉样蛋白A含量中的用途。
以及,一种采用如上所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法,其特征在于,包括:按待测样品和所述试剂R1的体积比为1~10:250,向所述待测样品中加入所述试剂R1,得到第一混合液,并得到所述第一混合液的吸光度OD1;按所述试剂R2与所述试剂R1体积比为1:1~7,向所述第一混合液中加入所述试剂R2,得到第二混合液,并得到所述第二混合液的吸光度OD2;使用所述血清淀粉样蛋白A校准品得到标准曲线,根据所述吸光度OD1和所述吸光度OD2在所述标准曲线上得到所述待测样品中血清淀粉样蛋白A的含量。
本发明实施例的有益效果如下:
1、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,使用简便快速,可简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量。
2、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,与进口对比试剂实验表明,本发明的试剂盒中的试剂具有较高的准确度和很好的特异性,能够满足临床快速高通量检测样本的要求,检测效率明显提高。
3、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,使用了经过筛选后的最优化的试剂组合,使得试剂的稳定性大大提高,在2~8℃的环境下,可以稳定存放一年以上,因此在临床应用上具有广阔的前景。
4、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒中的抗体原料可以自制,降低了试剂成本,易于产业化。
5、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,还具有灵敏度高,可自动化检测等特点。
6、本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒使其具有检测免疫球蛋白E的用途。
7、本发明实施例的采样检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法,简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量,检测效率较高,在临床应用上具有广阔的前景。
附图说明
图1是本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的方法的流程图;
图2是本发明的实施例1的血清淀粉样蛋白A含量的检测方法的流程示意图;
图3是本发明的实施例1的检测血清淀粉样蛋白A含量的标准曲线;
图4是本发明的实施例5的检测血清淀粉样蛋白A试剂盒与国外对比试剂盒的比较结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图和实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明提供了一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒。该试剂盒包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品。试剂R1提供适当的反应环境,使抗原保持天然构象,并控制反应达到终点的时间和速率。试剂R2是一种含有抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体包被胶乳颗粒、均一的乳白色液体。血清淀粉样蛋白A校准品用来与样本比较进行结果计算。
其中,试剂R1包括:第一缓冲液10~500mmol/L、第一电解质5~50g/L、表面活性剂0.5~50g/L、第一稳定剂0.5~10g/L、高分子促进剂1~100g/L和第一防腐剂1~10g/L。
试剂R2包括:第二缓冲液10~500mmol/L、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒5~50%w/v(相当于抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒的浓度为50~500g/L)、第二电解质5~50g/L、第二稳定剂0.5~10g/L和第二防腐剂1~10g/L。本发明中,w/v表示的意思是单位体积的溶液中所含的溶质质量。
血清淀粉样蛋白A校准品包括:第三缓冲液10~500mmol/L、第三稳定剂5~50g/L、第三防腐剂1~10g/L、抗氧化剂0.01~10g/L和血清淀粉样蛋白A抗原。
优选的,试剂R1包括:第一缓冲液25~150mmol/L、第一电解质5~50g/L、表面活性剂0.5~50g/L、第一稳定剂0.5~10g/L、高分子促进剂1~80g/L和第一防腐剂1~10g/L。
优选的,试剂R2包括:第二缓冲液100~500mmol/L、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒5~50%w/v(相当于抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒的浓度为50~500g/L)、第二电解质5~50g/L、第二稳定剂0.5~10g/L和第二防腐剂1~10g/L。本发明中,w/v表示的意思是单位体积的溶液中所含的溶质质量。其中,抗人血清淀粉样蛋白A抗体通过人血清淀粉样蛋白A抗原亲和纯化而来。
优选的,血清淀粉样蛋白A校准品包括:第三缓冲液30~500mmol/L、第三稳定剂5~50g/L、第三防腐剂1~10g/L、抗氧化剂0.01~10g/L和血清淀粉样蛋白A抗原。
优选的,试剂R1中,第一缓冲液选自醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。第一电解质选自氯化钠、硫酸镁、氯化镁和氯化钾中的一种或几种。表面活性剂选自Triton系列表面活性剂、Tween系列表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚、月桂醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种。第一稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种。高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种。第一防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种。
优选的,试剂R2中,第二缓冲液选自醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。第二电解质选自氯化钠、硫酸镁、氯化镁和氯化钾中的一种或几种。第二稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种。第二防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种。
优选的,试剂R2中,抗体包被胶乳颗粒的制备过程如下:在交联缓冲液中,通过化学交联剂将抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体包被到胶乳颗粒的表面。
其中,交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸MOPSO缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液或者磷酸缓冲液。交联缓冲液的pH值为6.0~8.0。
化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼和异氰酸酯中的一种或几种。
抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体选自鼠抗人、鸡抗人、兔抗人、羊抗人或牛抗人血清淀粉样蛋白A抗体。本发明所用的抗体,优选哺乳动物所产生的抗体,产量大,特异性高,能降低试剂成本。优选的,抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体为牛抗人血清淀粉样蛋白A抗体。上述的抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体可自制或购买。
胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。优选的,胶乳颗粒的浓度为0.5~5mg/mL。胶乳颗粒的直径为100~300nm。更优选的,胶乳颗粒的直径为150~250nm。更优选的,胶乳颗粒的直径为200nm。
优选的,胶乳颗粒的表面连有功能团。该功能团起修饰的作用。优选的,该功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基。更优选的,该功能团为羧基。
优选的,血清淀粉样蛋白A校准品中,第三缓冲液选自醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种。第三稳定剂选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种。第三防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种。抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚和维生素系列中的一种或几种。
优选的,试剂R1的pH为6~9。
优选的,试剂R2的pH为6~9。
更优选的,试剂R1中的第一缓冲液和试剂R2中的第二缓冲液的成分相同。
更优选的,第三缓冲液为甘氨酸缓冲液。
更优选的,该试剂盒包括如下的成分:
试剂R1包括:三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液10~500mmol/L、氯化钠5~50g/L、TritonX1000.5~50g/L、牛血清蛋白0.5~10g/L、乙二醇聚氧乙烯醚1~100g/L和叠氮钠1~10g/L。试剂R1的pH为6~9。试剂R2包括:磷酸盐缓冲液10~500mmol/L、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒5~50%w/v(该胶乳颗粒的直径为100~300nm)、氯化钠5~50g/L、牛血清蛋白0.5~10g/L和叠氮钠1~10g/L。试剂R2的pH为6~9。血清淀粉样蛋白A校准品包括:甘氨酸缓冲液10~500mmol/L、牛血清蛋白5~50g/L、叠氮钠1~10g/L、二丁基羟基甲苯0.01~10g/L和血清淀粉样蛋白A抗原。
本发明实施例的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒使用简便快速,可简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量;具有较高的准确度和很好的特异性,能够满足临床快速高通量检测样本的要求,检测效率明显提高;试剂的稳定性大大提高,在2~8℃的环境下,可以稳定存放一年以上,因此在临床应用上具有广阔的前景;抗体原料可以自制,降低了试剂成本,易于产业化;还具有灵敏度高,可自动化检测等特点。
本发明实施例还提供了一种上述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒的在检测血清淀粉样蛋白A含量中的用途,可以用于简洁快速地检测样本中血清淀粉样蛋白A的含量,具有较高的准确度和很好的特异性。
本发明实施例还提供了一种采用上述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法。采用本发明的试剂盒检测的方法为胶乳增强免疫比浊法定量检测血清淀粉样蛋白A含量。其原理是:利用化学交联法将特异的抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体包被到胶乳颗粒表面,当被测样本中含有血清淀粉样蛋白A抗原时,发生抗原抗体免疫反应形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物,形成的复合物能与邻近的胶乳颗粒连接,最终交织成网状,引起反应体系浊度显著变化。保持反应体系里抗体过量时,其体系浊度的变化与血清淀粉样蛋白A含量成正比关系,根据血清淀粉样蛋白A标准曲线可以定量分析。
如图1所示,为本发明实施例的检测免疫球蛋白A含量的方法的流程图。该方法具体包括如下的步骤:
步骤S10:按待测样品和试剂R1的体积比为1~10:250,向待测样品中加入试剂R1,得到第一混合液,并得到第一混合液的吸光度OD1。该步骤可解除待测样品中抗原周围电子层和水化层,使抗原位点充分暴露。
步骤S20:按试剂R2与试剂R1体积比为1:1~7,向第一混合液中加入试剂R2,得到第二混合液,并得到第二混合液的吸光度OD2。
优选的,试剂R2与试剂R1体积比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6或1:7。
步骤S30:使用血清淀粉样蛋白A校准品得到标准曲线,根据吸光度OD1和吸光度OD2在所述标准曲线上得到待测样品中血清淀粉样蛋白A的含量。
标准曲线可在全自动生化分析仪上通过内置曲线拟合模式得到。其中,标准曲线的拟合模式包括:Spline、二次方程、logit-log3p、logit-log4p、logit-log5p或Polygonal。
下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
该检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品。
其中,试剂R1包括如下的成分:
试剂R2包括如下的成分:
血清淀粉样蛋白A校准品包括如下的成分:
按照需要的校准品浓度将相应量的血清淀粉样蛋白A抗原添加到上述其他试剂混合液中,混合得到血清淀粉样蛋白A校准品。本实施例配制5个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品,其血清淀粉样蛋白A抗原的浓度分别为:10mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L和180mg/L。将血清淀粉样蛋白A校准品用0.22μm的滤膜过滤除菌,在2~8℃下保存。
采用上述试剂盒,通过日立7080全自动生化分析仪对待测样品进行检测分析。如图2所示,为本发明的实施例1的血清淀粉样蛋白A含量的检测方法的流程示意图。首先,使用血清淀粉样蛋白A校准品在全自动生化分析仪上通过内置logit-log(4p)曲线拟合模式拟合标准曲线。如图3所示,为本发明的实施例1的检测血清淀粉样蛋白A含量的标准曲线。然后,向待测样品中加入试剂R1,待测样品的体积为3μL,试剂R1的体积为250μL,混合得到第一混合液,并在37℃保温5分钟,然后读取该第一混合液的吸光度OD1。再向第一混合液中进一步加入试剂R2,试剂R2体积为50μL,得到第二混合液,并在37℃保温5分钟,读取第二混合液的吸光度OD2。根据第一混合液的吸光度OD1和第二混合液的吸光度OD2,在标准曲线上得到待测样品的血清淀粉样蛋白A的含量。检测的主波长为546nm,副波长为800nm。
实施例2
该检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品。
其中,试剂R1包括如下的成分:
试剂R2包括如下的成分:
血清淀粉样蛋白A校准品包括如下的成分:
本实施例选用高浓度单点校准品,因此血清淀粉样蛋白A抗原浓度为180mg/L。然后将血清淀粉样蛋白A校准品用0.22μm的滤膜过滤除菌,在2~8℃下保存。在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品,其血清淀粉样蛋白A抗原的浓度分别为:10mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L和180mg/L。
采用上述试剂盒,通过日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。检测方法同实施例1。
实施例3
该检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品。
其中,试剂R1包括如下的成分:
试剂R2包括如下的成分:
血清淀粉样蛋白A校准品包括如下的成分:
按照需要的校准品浓度将相应量的血清淀粉样蛋白A抗原添加到上述其他试剂混合液中,混合得到血清淀粉样蛋白A校准品。本实施例配制5个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品,其血清淀粉样蛋白A抗原的浓度分别为:10mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L和180mg/L。将免疫球蛋白E用0.22μm的滤膜过滤除菌,在2~8℃下保存。
采用上述试剂盒,通过日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。检测方法同实施例1。
实施例4
该检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品。
其中,试剂R1包括如下的成分:
试剂R2包括如下的成分:
血清淀粉样蛋白A校准品包括如下的成分:
本实施例选用高浓度单点校准品,因此血清淀粉样蛋白A抗原浓度为180mg/L。将血清淀粉样蛋白A校准品用0.22μm的滤膜过滤除菌,在2~8℃下保存。在使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的血清淀粉样蛋白A校准品,其血清淀粉样蛋白A抗原的浓度分别为:10mg/L、45mg/L、90mg/L、120mg/L和180mg/L。
采用上述试剂盒,通过日立7080全自动生化分析仪进行检测分析。检测方法同实施例1。
实施例5
本发明的试剂盒与血清淀粉样蛋白A对比试剂(散射比浊法,购自SIEMENS公司)对照检测60例临床标本血清,测定结果如表1所示。本实施例的试剂盒检测方法同实施例1,血清淀粉样蛋白A对比试剂按照说明书设定相关参数,使用日立7080全自动生化分析仪对样本进行分析。
表1本发明的试剂盒与对照试剂检测值比较结果
线性回归得到的回归方程为y=0.9813x+0.1556,相关系数R2=0.9942。如图4所示,为本发明的实施例5的检测血清淀粉样蛋白A试剂盒与国外对比试剂盒的比较结果示意。图4示出相关性。数据表明,本发明的试剂盒与对比试剂相关性很好,说明本发明试剂盒对检测血清淀粉样蛋白A具有很好的特异性和准确度。
实施例6
采用实施例1的试剂盒及检测方法,随机取一临床血清样本,使用日立7080全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,检测结果如表2所示。
表2检测样本中的血清淀粉样蛋白A浓度(10次)及变异系数
结果显示,变异系数为2.35%,小于5%,表明本发明的试剂盒具有较高的精密度。
实施例7
本发明的试剂盒(采用实施例1的试剂盒)与对比试剂盒同时进行了抗干扰性试验,试验结果如表3所示,加入干扰物后,对各种干扰物的相对误差均在10%以内。对照试剂对各种干扰物的相对误差都超过10%。即使检测样品中存在一定浓度的干扰物包括血红蛋白、胆红素、Vc、甘油三酯等,对本发明试剂盒的检测结果影响很小。
表3本发明的试剂盒抗干扰性试验结果
干扰物 | 本试剂 | 相对误差 | 某公司试剂 | 相对误差 |
样本+水 | 62 | 60 | ||
样本+1600mg/dl甘油三酯 | 64 | 3.23% | 67 | 11.67% |
样本+460mg/dl血红蛋白 | 60 | 3.23% | 54 | 10.00% |
样本+50mg/dlVc | 63 | 1.61% | 69 | 15.00% |
样本+18.2mg/dl胆红素 | 65 | 4.84% | 67 | 11.67% |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于,包括:试剂R1、试剂R2和血清淀粉样蛋白A校准品;所述试剂R1包括:第一缓冲液10~500mmol/L、第一电解质5~50g/L、表面活性剂0.5~50g/L、第一稳定剂0.5~10g/L、高分子促进剂1~100g/L和第一防腐剂1~10g/L;所述试剂R2包括:第二缓冲液10~500mmol/L、抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒5~50%w/v、第二电解质5~50g/L、第二稳定剂0.5~10g/L和第二防腐剂1~10g/L;所述血清淀粉样蛋白A校准品包括:第三缓冲液10~500mmol/L、第三稳定剂5~50g/L、第三防腐剂1~10g/L、抗氧化剂0.01~10g/L和血清淀粉样蛋白A抗原。
2.如权利要求1所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于,所述抗人血清淀粉样蛋白A抗体包被胶乳颗粒的制备过程如下:在交联缓冲液中,通过化学交联剂将抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体包被到胶乳颗粒的表面。
3.如权利要求2所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:
所述交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸MOPSO缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液或者磷酸缓冲液,所述交联缓冲液的pH值为6.0~8.0;
所述化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼和异氰酸酯中的一种或几种;
所述抗人血清淀粉样蛋白A多克隆抗体选自鼠抗人、鸡抗人、兔抗人、羊抗人或牛抗人血清淀粉样蛋白A抗体;
所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳颗粒。
4.如权利要求2所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:所述胶乳颗粒的浓度为0.5~5mg/mL,所述胶乳颗粒的直径为100~300nm。
5.如权利要求2所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:所述胶乳颗粒的表面连有功能团,所述功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基。
6.如权利要求1所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:所述试剂R1的pH为6~9,所述试剂R2的pH为6~9。
7.如权利要求1所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:
所述第一缓冲液、所述第二缓冲液和所述第三缓冲液均选自醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷TRIS缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸CAPSO缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液中的一种或几种;和/或,
所述第一稳定剂、所述第二稳定剂和所述第三稳定剂均选自亚氨基二乙酸、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸钠、1,2-环己二醇缩水甘油、甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇和牛血清蛋白中的一种或几种;和/或,
所述第一防腐剂、所述第二防腐剂和所述第三防腐剂均选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或几种;和/或,
所述第一电解质和所述第二电解质均选自氯化钠、硫酸镁、氯化镁和氯化钾中的一种或几种;和/或,
所述表面活性剂选自Triton系列表面活性剂、Tween系列表面活性剂、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的一种或几种;和/或,
所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸钠、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素和羟甲基纤维素钠中的一种或几种;和/或,
所述抗氧化剂选自丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、磷脂、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、特丁基对苯二酚和维生素系列中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒,其特征在于:所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的成分相同。
9.一种如权利要求1~8任一项所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒的在检测血清淀粉样蛋白A含量中的用途。
10.一种采用如权利要求1~8任一项所述的检测血清淀粉样蛋白A含量的试剂盒检测血清淀粉样蛋白A含量的方法,其特征在于,包括:
按待测样品和所述试剂R1的体积比为1~10:250,向所述待测样品中加入所述试剂R1,得到第一混合液,并得到所述第一混合液的吸光度OD1;
按所述试剂R2与所述试剂R1体积比为1:1~7,向所述第一混合液中加入所述试剂R2,得到第二混合液,并得到所述第二混合液的吸光度OD2;
使用所述血清淀粉样蛋白A校准品得到标准曲线,根据所述吸光度OD1和所述吸光度OD2在所述标准曲线上得到所述待测样品中血清淀粉样蛋白A的含量。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160504 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |