CN112014574A - 双脂质体纳米颗粒包被的血清淀粉样蛋白a检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双脂质体纳米颗粒包被的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,包含双脂质体纳米颗粒抗体,其包括质量比为1:2‑1:4的脂质体纳米颗粒抗体A和脂质体纳米颗粒抗体B;所述脂质体纳米颗粒抗体A采用的脂质体颗粒直径为210‑320nm,脂质体纳米颗粒抗体B采用的脂质体颗粒直径为50‑80nm;脂质体纳米颗粒抗体A和B中包被的抗体为兔抗人SAA多克隆抗体。本发明的试剂盒为增强免疫比浊法的试剂盒,是将抗体通过化学键结合于脂质体表面。其采用新型脂质体纳米颗粒作为免疫比浊信号放大载体,与传统采用乳胶纳米微球作为信号放大载体的试剂盒相比,显著提高了试剂检测灵敏度,试剂线性范围达到了0.5‑500mg/l。
Description
技术领域
本发明涉及免疫比浊发生化检测技术领域,具体涉及一种双脂质体纳米颗粒包被的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,尤其涉及一种信号放大的脂质体纳米颗粒及其制备和在免疫比浊检测中的应用。
背景技术
血清淀粉样蛋白A是一种急性时相反应蛋白,相对分子量为12000,主要由肝细胞产生,心脏、骨骼肌等肝外也有生成。SAA有4种亚型,其中SAA1和SAA2蛋白是急性蛋白,在炎症的急性反应期迅速上升;SAA3基因在人类中不能表达;SAA4蛋白能够持续表达,但不参与急性炎症反应。SAA根据在体内表达情况,分为急性期SAA(acute SAA,A-SAA)和组成型SAA(constitutive SAA,C-SAA)。正常情况下,SAA以痕量水平存在,C-SAA占体内SAA总量的90%,SAA的参考范围≤10mg/L。当机体受到感染、炎症、损伤等刺激后产生一系列细胞因子,经IL-1、IL-6和TNF刺激,SAA在肝脏中合成,可升高至最初浓度的100-1000倍,由单核细胞弹力蛋白酶降解清除。
在临床诊断中,SAA水平是反应感染性疾病的灵敏指标,有助于感染的诊断、病情评估及转归预测。
在炎症、感染性和非感染性疾病期间,它在血液中的浓度能在数小时内急剧升高,可升高到最初浓度的1000倍;SAA与HDL有关,它能在炎症期间调节HDL的代谢,SAA一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症;血清淀粉样蛋白A升高还见于动脉粥样硬化、糖尿病肾病、急性心肌梗死、冠心病、慢性肾脏疾病。在评价炎症、监控其活动及治疗中,SAA与WBC或CRP联合检测,起到优势互补的作用。
SAA是诊断病毒、细菌感染的敏感指标,在细菌感染性疾病中,SAA与CRP相比优势是:上升早、幅度大、灵敏度高,尤其是在急性细菌感染早期,检测SAA的优势更加显著;SAA在病毒感染性疾病中,SAA显著升高,CRP不升高,因此SAA可以作为诊断病毒感染的敏感指标;SAA联合CRP检测,可鉴别诊断细菌、病毒感染,又能提供新依据,可靠性更强,动态观察疗效并可指导临床用药;SAA联合CRP、PCT检测,有利于小儿感染性疾病(新生儿败血症、脓毒症)的早期诊断。
由于人体中血清淀粉样蛋白A的含量差异很大,正常人体内含量小于10mg/l,感染人体含量达到500mg/l以上。因此要求检查试剂即需要有良好的灵敏度,同时需要有很宽的线性。目前,市场上的检测方法有乳胶凝集法(LATEX)、酶免疫(ELISA)、放免法的定量检测,发展到胶体金渗透法、乳胶增强免疫比浊法的自动化检测,发展十分迅速。但是酶免具有较高的灵敏度,但是线性很差,且需要手工操作。胶体金法检测简便,但是检测重复性较差,检测范围有限。乳胶增强免疫比浊法是近年来迅速发展的检测方法,具有高度自动化,操作简便,定量检测等优点。目前国内外免疫比浊法采用乳胶微球包被,检测范围为5-200mg/l,对于SAA检测无论是灵敏度和线性范围都不能满足要求。
专利文献CN110244063A中记载了一种血清淀粉样蛋白A检测用试剂盒、其制备方法以及血清淀粉样蛋白A的检测方法,其包括校准品、磁微粒试剂、标记抗体试剂、清洗液、激发物和样本稀释液。采用的标记抗体试剂为吖啶酯类化合物标记的血清淀粉样蛋白A检测抗体。但该方法检测血清淀粉样蛋白A存在线性范围小,精确度低等问题。
发明内容
针对现有技术采用纳米乳胶颗粒作为包被载体检测SAA含量的试剂都存在检测灵敏度低、试剂线性低、重复性差的问题,本发明提供了一种双脂质体纳米颗粒包被的血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试剂盒,具有完全自主知识产权,填补国内空白。本项目研究的试剂盒性能优异,检测过程简便,快速,灵敏度高,特异性强。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,包括质量比为1:2-1:4的脂质体纳米颗粒抗体A和脂质体纳米颗粒抗体B;
所述脂质体纳米颗粒抗体A采用的脂质体颗粒直径为210-320nm,脂质体纳米颗粒抗体B采用的脂质体颗粒直径为50-80nm;所述脂质体纳米颗粒抗体A和脂质体纳米颗粒抗体B中包被的抗体为兔抗人SAA多克隆抗体。
本发明通过采用两种不同直径的脂质体颗粒包被抗体,其作用是可以提高试剂的线性范围以及精确度。
优选地,所述脂质体颗粒为合成磷脂,由DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、DPPE(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)中的一种或多种通过冷冻干燥法合成;所述合成磷脂表面的化学基团选自羧基、羟基、氨基、磺酸基中的一种。
优选地,所述脂质体颗粒的密度为1.01-1.03g/cm^3。
优选地,所述兔抗人SAA多克隆抗体为经过蛋白酶切处理后的抗体,其去除了抗体Fab片段,仅保留了抗体可变区Fc片段,用于包被,增加了试剂的灵敏度。所述抗体为原核表达的SAA抗原免疫制备而来,抗体免疫所用的肽段为78-320的肽段进行免疫,具有高特异性。
优选地,所述兔抗人SAA多克隆抗体进行蛋白酶切处理的步骤为:取合适的SAA多克隆抗体溶液加入5%的蛋白酶放置于摇床上半小时。
优选地,所述脂质体纳米颗粒抗体A或脂质体纳米颗粒抗体B采用以下方法制备:
S1、取脂质体颗粒离心,取上清液后,用甘氨酸缓冲液复悬,超声分散,得复悬液;
S2、将复悬液中加入NHS溶液混匀,再加入EDC溶液混匀后,室温搅拌,然后离心;
S3、将经步骤S2离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后加入兔抗人SAA多克隆抗体,室温搅拌后离心;
S4、将经步骤S3离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后离心;
S5、将经步骤S3离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后离心;
S6、将经步骤S3离心后的沉淀悬浮于稀释液中,超声,即得所述脂质体纳米颗粒抗体A或脂质体纳米颗粒抗体B悬浮液。
优选地,步骤S3中,所述兔抗人SAA多克隆抗体的加入量与脂质体悬浮液颗粒的比为5-20mg/10ml。
所述的脂质体颗粒表面用EDC分子修饰,使得纳米脂质球体能够与抗原抗体等蛋白化学结合。
优选地,步骤S6中,所述稀释液为水杨酸,所述超声时间为10分钟。所述的脂质体颗粒表面用水杨酸处理增加脂质球体表面的电荷,使得纳米微球能够同性相斥分散于液体中。
本发明还提供了一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,包括前述的双脂质体纳米颗粒抗体。
优选地,所述试剂盒包括试剂R1试剂、R2试剂及校准品;
所述R1试剂为甘氨酸缓冲液,其组成包括:10-50mM甘氨酸pH 7.0-7.5,NaCl 10-400mM,Tween20 0.5-1.5ml/L,EDTA 0.1-200mM,葡聚糖8000 10-500mM,阻断剂和防腐剂;
所述R2试剂为抗体脂质体颗粒悬浮液,其组成包括:双脂质体纳米颗粒抗体、甘氨酸缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、BSA 0.1-4.00%;
所述校准品为牛血清基质,包括:叠氮钠0.2-2.2%、吐温-20 1-10%、BSA 1-3%。
优选地,所述阻断剂为热变性人IgG片段,浓度范围为1-20mg/l。阻断剂能有效阻止异嗜性抗体结合,有效减少假阳性。
优选地,所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300或苯酚中的一种或多种,浓度范围为10-500mM。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1)本发明继续发展乳胶增强免疫比浊法,采用透明的脂质体颗粒替代了白色的乳胶微球颗粒。由于脂质体颗粒的透光性,使得试剂检测信号范围得到了极大的提高,解决了乳胶增强免疫比浊法的高本底问题。
2)本发明通过改变抗体的结构(即结合特定的脂质体),修饰后的抗体与抗原结合在免疫比浊发检测的试剂中稳定性显著提高,灵敏度也大大增强。
3)本发明的SAA检测试剂盒重复性好,试剂稳定,操作简便、灵敏度高、特异性好,测定快速、测定结果准确可靠。本发明通过采用了双粒径脂质体包被,检测灵敏度达到了0.5mg/l,检测范围达到了500mg/l。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为验证实施例1中检测试剂的相关性检验结果;
图2为实施例1制备的试剂盒的线性范围;
图3为对比例1的试剂盒的线性范围;
图4为检测试剂的SAA钩状效应测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种双脂质体纳米颗粒抗体,其制备方法如下:
分别取10ml 62nm脂质体颗粒和202nm脂质体颗粒,按以下步骤(1)-(5)分别包被经过处理的SAA抗体:
(1)取10ml脂质体颗粒,4℃20000rpm离心30min;去上清液,用50mM甘氨酸缓冲液,按5倍于脂质体颗粒用量复悬,超声2min分散,待用;
(2)取复悬好的脂质体颗粒,加入0.690ml 100mg/ml的NHS溶液混匀,再加入1.435ml 10mg/ml的EDC溶液混匀,室温搅拌30min,之后4℃、20000rpm离心30min。
(3)取步骤(2)离心后获得的沉淀用10ml 25mM甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声1分钟,加入10mg兔抗人SAA多克隆抗体(已进行蛋白酶切处理,具体为将SAA多克隆抗体(外购)溶液加入5%的蛋白酶,放置于摇床上半小时),室温搅拌90min,4℃、20000rpm离心15分钟。再取沉淀用10ml 25mM甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声1分钟,再4℃、20000rpm离心20分钟。
(4)取步骤(3)离心后获得的沉淀用10ml 0.5%甘氨酸缓冲液悬浮,超声1分钟,之后4℃、20000rpm离心25分钟。
(5)将步骤(4)获得的沉淀悬浮于40ml稀释液中,超声10分钟,即制得脂质体颗粒母液A(由62nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(由202nm脂质体颗粒制备)。
包被后形成的脂质体颗粒母液A(62nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(202nm脂质体颗粒制备)按照1:2的比例混合,即得双脂质体纳米颗粒抗体。
本实施例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成如下:
R1试剂:
所述R1试剂为甘氨酸缓冲液,其组成包括:10-50mM甘氨酸pH 7.0-7.5,NaCl 10-400mM,Tween20 0.5-1.5ml/L,EDTA 0.1-200mM,葡聚糖8000 10-500mM,阻断剂和防腐剂;
R2试剂:
所述R2试剂为抗体脂质体颗粒悬浮液,其组成包括:前述方法所制备的双脂质体纳米颗粒抗体、甘氨酸缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、BSA 0.1-4.00%;
校准品为牛血清基质,包括:叠氮钠0.2-2.2%、吐温-20 1-10%、BSA 1-3%;
上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。
上述各种成分可以室温下依次添加,或者同时添加,或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。
本实施例描述的SAA检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表1。分析方法:两点终点法,即R1试剂、R2试剂的用量分别为224ul和56ul,样本量2.4ul;224ul R1试剂加入2.4ul样本于37℃、3min后孵育3-5min,然后加入56ul R2试剂混匀30s开始读取A1,再置于37℃孵育4.5分钟后,读取吸光度A2;检测主波长为570nm,无副波长。(机器运行步骤)
表1.测试参数表
实施例2
本实施例提供了一种双脂质体纳米颗粒抗体,其制备方法与实施例1基本相同,不同之处仅在于:步骤(3)中加入的是未经过蛋白酶切处理的兔抗人SAA多克隆抗体。
本实施例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本实施例制备的抗体双脂质体颗粒。
本实施例描述的SAA检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表2。分析方法:两点终点法,即试剂R1、R2的用量分别为224ul和56ul,样本量2.4ul;224ul试剂R1加入2.4ul样本于37℃3min后孵育3-5min后加入56ulR2混匀30s开始读取A1,再置37℃孵育4.5分钟后,读取吸光度A2;检测主波长为570nm,无副波长。
采用本实施例的试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的SAA标准品
表2.测试参数表
实施例3
本实施例提供了一种双脂质体纳米颗粒抗体,其制备方法如下:
分别取10ml 80nm脂质体颗粒和300nm脂质体颗粒,按以下步骤(1)-(5)分别包被经过处理的SAA抗体:
(1)取10ml脂质体颗粒,4℃20000rpm离心30min;去上清液,用50mM甘氨酸缓冲液,按5倍于脂质体颗粒用量复悬,超声2min分散,待用;
(2)取复悬好的脂质体颗粒,加入0.690ml 100mg/ml的NHS溶液混匀,再加入1.435ml 10mg/ml的EDC溶液混匀,室温搅拌30min,之后4℃、20000rpm离心30min。
(3)取步骤(2)离心后获得的沉淀用10ml 25mM甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声1分钟,加入5mg兔抗人SAA多克隆抗体(已进行蛋白酶切处理,具体为将SAA多克隆抗体溶液加入5%的蛋白酶,放置于摇床上半小时),室温搅拌90min,4℃、20000rpm离心15分钟。再取沉淀用10ml 25mM甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声1分钟,再4℃、20000rpm离心20分钟。
(4)取步骤(3)离心后获得的沉淀用10ml 0.5%甘氨酸缓冲液悬浮,超声1分钟,之后4℃、20000rpm离心25分钟。
(5)将步骤(4)获得的沉淀悬浮于40ml稀释液中,超声10分钟,即制得脂质体颗粒母液A(由80nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(由320nm脂质体颗粒制备)。
包被后形成的脂质体颗粒母液A(80nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(320nm脂质体颗粒制备)按照1:4的比例混合,即得双脂质体纳米颗粒抗体。
本实施例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本实施例制备的抗体双脂质体颗粒。
对比例1
将国外某公司提供的血清淀粉样蛋白A(SAA)检测试剂盒(乳胶增强免疫比浊法)作为对比试剂与本专利实施案例进行性能比对。
对比例2
本对比例提供了一种双脂质体纳米颗粒抗体,其制备方法与实施例1基本相同,不同之处仅在于:本对比例采用1:1的脂质体颗粒母液A(62nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(202nm脂质体颗粒制备)混合制备双脂质体纳米颗粒抗体。
本对比例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本对比例制备的抗体双脂质体颗粒。
对比例3
本对比例提供了一种双脂质体纳米颗粒抗体,其制备方法与实施例1基本相同,不同之处仅在于:本对比例采用1:6的脂质体颗粒母液A(62nm脂质体颗粒制备)和脂质体颗粒母液B(202nm脂质体颗粒制备)混合制备双脂质体纳米颗粒抗体。
本对比例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本对比例制备的抗体双脂质体颗粒。
对比例4
本对比例提供了一种单脂质体纳米颗粒抗体,即实施例1中制备的脂质体颗粒母液A(62nm脂质体颗粒制备)。
本对比例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本对比例制备的脂质体颗粒母液A。
对比例5
本对比例提供了一种单脂质体纳米颗粒抗体,即实施例1中制备的脂质体颗粒母液B(202nm脂质体颗粒制备)。
本对比例还提供了一种SAA检测试剂盒,其各组分的组成与实施例1基本相同,不同之处仅在于:R2试剂中,采用本对比例制备的脂质体颗粒母液B。
效果验证
验证实验例1:检测试剂的相关性比较
使用本发明试剂(实施例1)和国外某知名公司的SAA试剂(对比例1),按各自参数同时进行测定对50份人血清(包括正常和异常标本)进行检测,同时对测定值进行相关性分析。
由图1的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.9998,回归方程为y=1.0017x-0.0049。结果表明本试剂与进口试剂测定人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。结果准确度达到98.1%。
验证实验例2:试剂检测灵敏度比较
本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
采用实施例1的试剂、对比例1的试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水或是去离子水溶解样本,然后50%稀释成5个点,和零点一起每一个样本测试5次,计算平均值,求得SD数值。
结果解析:如表3所示,根据检测数据,计算SD数值和CV数值,分别计算1SD,2SD,从最小的开始,其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
表3.灵敏度测试结果
实验结果表明,本发明提供的SAA试剂(实施例1)灵敏度可以到达0.5mg/L,而对照试剂(对比例1)只能达到4mg/L,说明本发明试剂在灵敏度方面大有提升。
验证实验例3:试剂检测精密度比较
采用本发明提供的SAA试剂检测低值样本和高值样本个10次,计算Mean、SD、CV。对该试剂的精密度进行评估,结果如表4所示。
表4.实施例1精密度测试结果
表5.对比例1精密度测试结果
实验数据表明,实施例1和对比例1的SAA试剂精密度优良,且本发明提供的试剂(实施例1)在具体的数值上更加优于对比例1的试剂。
验证实验例4:实施例3的验证
实施例3是将采用与实施例1不同粒径的脂质体构成的双脂质体,按照实施例1的检测方法在日立7170生化仪上进行测试,定标失败,说明在选取双脂质体的组成颗粒在粒径的方面需要注意。
验证实验例5:对比例2-5的验证
对比例2和对比例3是采用不同比例的脂质体母液A和B制备脂质体的,采用同实施例1相同的验证方法在7170生化仪上进行检测,定标实验结果表明对比例2在低浓度时曲线结果混乱,而对比例3则与对比例2的结果相反,高浓度时结果上不去。
对比例4和对比例5采用同上方法进行检测,定标结果良好,但在开封稳定性的表现上偏差较大,并且R2试剂在后期产生了沉淀。
验证实验例6:试剂检测范围比较
本实验目的是检测本发明提供的试剂所能测得的最大值。
取浓度约为300.00mg/L的高值样本,用0.9%NaCl作为稀释液。按0.025、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8的比例稀释成6个点,加上高值样本,共7个样本按标准实验操作步骤用实验例1和实验例2的方法各测定3次,分别求测定均值(yi)。以7个样本的稀释浓度(xi)为自变量,以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按公式(1)计算相关系数(r)。
用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程,计算yi的估算值及yi与yi估算值的相对偏差或绝对偏差,应符合相关的规定。
实验结果:
实施例1的线性结果如表6和图2所示。
表6.实施例1的线性范围
对比例1的线性结果如表7和图3所示。
表7.对比例1线性范围
实验结果表明,本发明提供的SAA试剂的线性高值是可以达到500mg/L浓度的,而对比例1的SAA试剂检测的线性达不到300mg/L,说明在本发明提供的SAA检测试剂在线性值较其他试剂有所提高。
验证实验例7:试剂钩状效应比较
本实验目的为验证本发明提供试剂盒(实施例1)和国外知名公司试剂盒(对比例1)的钩状效应比较。将大于500mg/l的SAA高值稀释成系列梯度,进行检测稀释后标本的浓度。
实验结果如表8、表9和图4所示:
表8.实验例1测试结果
表9.对比例1测试结果
实验结果表明,本发明提供的试剂(实施例1)在样本达到600mg/L时测量值继续上升;达到800mg/L时,测量值开始下降。因此本试剂测量浓度为600mg/L以下样本时不会出现钩状效应。而国外某知名公司提供的试剂(对比例1)在样本量达到400mg/L时便出现了下降,因此本发明提供的试剂出现钩状效应的范围要优于别的试剂。
验证实验例8:试剂特异性评估比较
验证本发明提供的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒(实施例1和实施例2)以及国外知名品牌SAA检测试剂(对比例1)分析特异性实验效应。
选取与血清淀粉样蛋白A感染部位相同,感染症状相似的CRP和PCT纯化提取物样本,在本试剂盒上的测定结果(物质的量)与该类似物的量的比值的百分率。
实验结果如表10所示:
表10
实验结果表明,采用处理抗体的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒试剂(实施例1)测定人提取CRP和PCT样本,交叉反应率分别为0.41%和1.23%,表明了本试剂具有良好的特异性;而采用未处理抗体的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒试剂(实验例2)测定人提取CRP和PCT样本,交叉反应率分别为9.02%和15.44%,表明未处理的抗体在试剂的特异性表现中要差许多。而外国知名品牌SAA试剂(对比例1)在特异性检测方面结果也不好。说明本发明提供的SAA试剂在特异性方面性能优良。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改,这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下,本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (10)
1.一种用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,包括质量比为1:2-1:4的脂质体纳米颗粒抗体A和脂质体纳米颗粒抗体B;
所述脂质体纳米颗粒抗体A采用的脂质体颗粒直径为210-320nm,脂质体纳米颗粒抗体B采用的脂质体颗粒直径为50-80nm;所述脂质体纳米颗粒抗体A和脂质体纳米颗粒抗体B中包被的抗体为兔抗人SAA多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,所述脂质体颗粒为合成磷脂,由DPPC、DPPE、DSPC中的一种或多种通过冷冻干燥法合成;所述合成双脂质体表面的化学基团选自羧基、羟基、氨基、磺酸基中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,所述兔抗人SAA多克隆抗体为经过蛋白酶切处理后的抗体,其去除了抗体Fab片段,仅保留了抗体可变区Fc片段。
4.根据权利要求3所述的用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,所述兔抗人SAA多克隆抗体进行蛋白酶切处理的步骤为:选取合适的SAA多克隆抗体溶液加入5%的蛋白酶放置于摇床上半小时。
5.根据权利要求1所述的用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,所述脂质体纳米颗粒抗体A或脂质体纳米颗粒抗体B采用以下方法制备:
S1、取脂质体颗粒离心,取上清液后,用甘氨酸缓冲液复悬,超声分散,得复悬液;
S2、将复悬液中加入NHS溶液混匀,再加入EDC溶液混匀后,室温搅拌,然后离心;
S3、将经步骤S2离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后加入兔抗人SAA多克隆抗体,室温搅拌后离心;
S4、将经步骤S3离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后离心;
S5、将经步骤S3离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液溶解悬浮,超声,然后离心;
S6、将经步骤S3离心后的沉淀悬浮于稀释液中,超声,即得所述脂质体纳米颗粒抗体A或脂质体纳米颗粒抗体B。
6.根据权利要求1所述的用于血清淀粉样蛋白A检测的双脂质体纳米颗粒抗体,其特征在于,步骤S3中,所述兔抗人SAA多克隆抗体的加入量与脂质体颗粒的比为5-20mg/10ml。
7.一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的双脂质体纳米颗粒抗体。
8.根据权利要求7所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1试剂、R2试剂及校准品;
所述R1试剂为甘氨酸缓冲液,其组成包括:10-50mM甘氨酸pH 7.0-7.5,NaCl 10-400mM,Tween20 0.5-1.5ml/L,EDTA 0.1-200mM,葡聚糖8000 10-500mM,阻断剂和防腐剂;
所述R2试剂为抗体脂质体颗粒悬浮液,其组成包括:双脂质体纳米颗粒抗体、甘氨酸缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、BSA 0.1-4.00%;
所述校准品为牛血清基质,包括:叠氮钠0.2-2.2%、吐温-20 1-10%、BSA 1-3%。
9.根据权利要求8所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述阻断剂为热变性人IgG片段,浓度范围为1-20mg/l。
10.根据权利要求8所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,其特征在于,所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300或苯酚中的一种或多种,浓度范围为10-500mM。
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