CN112014576A - 检测人血清淀粉样蛋白a的试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测人血清淀粉样蛋白A的试剂及其制备方法。本发明提供的检测试剂中包括试剂R1、试剂R2和标准品，其中试剂R1采用的稳定剂和缓冲液组分合理，试剂R2采用两种粒径的乳胶颗粒，粒径选择合理，且制备方案提高了抗体偶联的效率。该试剂在保证低值精密度和准确度的前提下，提高了试剂的线性，相对于现有技术，将线性范围扩大至500mg/L的被测物，且检测10mg/L附近病人样本精密度CV为1.26％，整个检测过程仅需10min。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测人血清淀粉样蛋白A的试剂及其制备方法。
背景技术
感染性疾病是临床常见的疾病类型，严重影响人类健康，是目前主要的公共卫生问题。世界卫生组织(WHO)调查表明，全球每年约有1500万人死于感染，约占全球总死亡的26％。多数感染者若被及时正确的诊断及用药，可在短时期内治愈。其中细菌和病毒感染是最常见的感染性疾病，感染后机体症状、体征多不特异仅靠临床症状体征鉴别细菌和病毒比较困难，同时两者在临床上用药也存在很大差异，因此早期区分细菌和病毒感染可为临床医生用药提供有意义的参考。
血清淀粉样蛋白A(SAA)是由肝脏分泌一种非特异性急性相时反应蛋白，正常情况下SAA含量极低，但在炎症和细菌、病毒感染等病原体刺激下，初期迅速升高可至原来的1000倍，并在疾病恢复期迅速下降，近年来受到人们广泛的关注。正常与临床上常用的炎症标志物C-反应蛋白(CRP)相比最大不同是，在受到病毒感染时，SAA会迅速升高，而CRP在受到无细菌感染的病毒感染时不升高或者升高幅度较低；而受到细菌及其他疾病感染时SAA与CRP敏感性相似。因此SAA与CRP联合检测可在早期迅速诊断出感染是否由病毒引起。除此之外，根据SAA特点，SAA水平变化对于治疗效果及预后评价均有非常重要的临床价值。
临床对血清淀粉样蛋白A的检测方法主要有放射性免疫检测法、免疫散射比浊法、酶联免疫吸附法、免疫层洗法和胶乳增强免疫比浊发等。其中放射性免疫检测法具有灵敏度高特异性强等优点，但反射性元素的效期较短，后期废弃物难以处理，逐渐被市场淘汰；酶联免疫吸附法操作繁琐，自动化水平低也逐渐被取代。胶乳增强免疫比浊发是一种较稳定的均相免疫比浊法，将抗体连接在胶乳微球上，抗原与交联微球的抗体结合后，会产生聚集从而影响吸光度的变化，吸光度变化与被测物的相关性在一定范围内可反应被测物的浓度。且生化试剂能够在全自动生化仪上快速高通量检测的优点，可满足临床使用的要求。
由于SAA正常范围低于10mg/L，病毒感染时可到正常范围的10～1000倍，而现有的胶乳免疫比浊法检测血清淀粉样蛋白A技术中，SAA线性较难达到临床检测的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人血清淀粉样蛋白A的试剂及其制备方法，使检测的线性和精密度得到提高。
本发明提供的检测人血清淀粉样蛋白A的检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和标准品：
所述试剂R1的pH值为6.5～8.0，包括缓冲溶液、稳定剂和防腐剂；
所述的缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中至少一种；所述稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、表面活性剂、助悬剂中至少一种；所述防腐剂选自Proclin-200、Proclin-300和NaN3；
所述试剂R2由如下原料制得：85nm胶乳颗粒、280nm胶乳颗粒、EDC、抗人血清淀粉样蛋白A、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、BSA和保存液；
所述保存液包括：HEPES缓冲液、BSA、蔗糖和Proclin-300。
所述保存液的pH值为7.8，由如下组分组成：50mmol/L的HEPES缓冲液，50g/L蔗糖，4g/L牛血清白蛋白和0.1g/LProclin-300。
本发明所述试剂中的标准品包括：30mmol/L的HEPES缓冲溶液、500mg/L血清淀粉样蛋白A抗原、40g/L牛血清白蛋白、20g/L甘露醇、0.9g/L氯化钠、0.1g/LProclin-300。
其制备方法包括：将血清淀粉样蛋白A抗原溶于30mmol/L的HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，其中血清淀粉样蛋白A抗原的浓度为500mg/L，加入牛血清白蛋白至浓度为40g/L，甘露醇20g/L，氯化钠0.9g/L及Proclin-300 0.1g/L的后混合，分装后进行冷冻干燥，得到标准品。使用时，标准品以冻干前等体积离子水复溶。
本发明试剂R1中，采用的稳定剂和缓冲液合理，从而在检测中起到了良好的抗干扰的作用，使检测能够具有良好的准确性和线性。试剂R2中，采用两种粒径的胶乳颗粒，分别为85nm胶乳颗粒、280nm胶乳颗粒，两种颗粒粒径选择合理，且与缓冲液配合得当，提高了测定结果的低值精密度、线性和抗干扰性能。
本发明实施例中，所述的血清淀粉样蛋白A试剂盒中R1试剂中：所述缓冲液的pH值为6.5～8.0，优选为6.5、7.0、7.5或8.0。一些实施例中，所述R1试剂中的缓冲液为HEPES缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，作为优选的，所述R1试剂中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液的浓度为30～100mmol/L，一些实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5～8.0，优选为6.5、7.0、7.5或8.0，其浓度为30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L或100mmol/L。
本发明实施例中，试剂R1的稳定剂选自氯化钠、牛血清白蛋白或Tween20。一些具体实施例中，所述R1试剂中的稳定剂包括5g/L～30g/L氯化钠、1g/L～10g/L牛血清白蛋白和0.1g/L～2g/LTween20。
本发明实施例中，所述试剂R1中的防腐剂为Proclin-300，浓度为0.1g/L。
一些实施例中，所述试剂R1由水和如下组分组成：30～100mmol/L磷酸盐缓冲液、1g/L～10g/LBSA、0.1g/L～2g/LTween20和0.1g/LProclin-300。
一些具体实施例中，所述试剂R1由水和如下组分组成：50mmol/L磷酸盐缓冲液、3g/LBSA、0.1g/L～2g/LTween20和0.1g/LProclin-300。
本发明中，检测试剂中试剂R2的制备方法，其特征在于，包括：
将抗人血清淀粉样蛋白A以磷酸盐缓冲液溶解，获得抗人血清淀粉样蛋白A溶液；将牛血清白蛋白以MOPS缓冲液溶解，获得牛血清白蛋白溶液；
将85nm羧基化聚苯乙烯微球以MES缓冲液稀释，加入EDC活化后，与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合反应，再次以EDC活化后加入牛血清白蛋白溶液封闭，离心收集沉淀以保存液悬浮，获得A液；
将280nm羧基化聚苯乙烯微球以MES缓冲液稀释，加入EDC活化后，与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合反应，再次以EDC活化后加入牛血清白蛋白溶液封闭，离心收集沉淀以保存液悬浮，获得B液；
将所述A液与所述B液混合，42℃老化15～20h，分散制得试剂R2。
本发明采用了两种粒径的羧基化胶乳微球分别与抗体进行偶联，其中85nm的小球可以保证试剂的线性，280nm的大球的添加可以确保试剂分析灵敏度的检测，同时在试剂R2的偶联工艺中，先是采用了物理偶联，使得抗体与微球以物理吸附的方式与微球结合，使得抗体在微球上有一定的定向作用，随后进行化学偶联，使得抗体与微球的结合更加稳定，增大了抗体的偶联效率，可以有效降低成本，提高试剂性能。
本发明实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8；所述抗人血清淀粉样蛋白A溶液中，抗人血清淀粉样蛋白A的浓度为0.43mg/ml；所述MOPS缓冲液的pH值为7.0；所述牛血清白蛋白溶液中，牛血清白蛋白的浓度为0.14～0.43mg/ml。一些实施例中，所述牛血清白蛋白溶液中，牛血清白蛋白的浓度为0.14mg/ml、0.21mg/ml、0.43mg/ml。
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L；所述MES缓冲液的pH值为5.0。
制备所述A液的步骤中，所述85nm胶乳颗粒以MES缓冲液稀释至浓度为10g/L；
制备所述B液的步骤中，所述280nm胶乳颗粒以MES缓冲液稀释至浓度为10g/L。
所述加入EDC为加入含有EDC的MES缓冲液，其中，EDC浓度为4mg/mL或2.3mg/mL，MES的浓度为10mmol/L；所述制备A液的步骤中加入EDC至浓度为4mg/ml；所述制备B液的步骤中加入EDC至浓度为2.3mg/ml；所述活化的条件为室温活化30min。本发明中，所述A液的制备或B液的制备步骤中，两次活化的条件相同。
本发明中，所述制备A液的步骤中与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合至抗人血清淀粉样蛋白A的浓度为4mg/ml；所述制备B液的步骤中与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合至抗人血清淀粉样蛋白A的浓度为2.3mg/ml；所述与抗原稀释液混合反应的条件为室温反应4～6h。优选的反应条件为室温反应5小时。
一些实施例中，所述制备A液的步骤中加入BSA至其浓度为30μg/ml；所述制备B液的步骤中加入BSA至其浓度为30μg/ml，所述封闭的反应条件为室温反应20～40min。
一些实施例中，所述A液与所述B液混合至胶乳颗粒的密度为0.5mg/mL。
一些实施例中，所述试剂R2中，中85nm微球与280nm微球的质量比为1.4:1。
本发明所述的R2试剂制备方法中，对抗体与微球的偶联方式进行了改进，结果表明，相对于两个对照(1是先物理偶联再化学偶联与常规的直接化学偶联的对照；2是抗体与微球直接偶联及抗体与蛋白一起与微球偶联。)先物理再化学偶联或者将抗体与蛋白一起都有助于抗体表面特异性基团的暴露，实验结果也表明了这样的方法中，抗体偶联效率有所提高，表现为检测线性得到保证，且精密度和准确度也提到提高。
本发明所述试剂适用于胶乳颗粒增强免疫比浊法检测，检测使用全自动生化分析仪。检测方法为终点法，检测波长570nm，测定温度为37℃。在检测中，所述的R1:R2:样本比例为50:10:1；所述的血清样本为无溶血、脂浊和黄疸样本。
本发明提供的检测试剂中包括试剂R1、试剂R2和标准品，其中试剂R1采用的稳定剂和缓冲液组分合理，试剂R2采用两种粒径的乳胶颗粒，粒径选择合理，且制备方案提高了抗体偶联的效率。该试剂在保证低值精密度和准确度的前提下，提高了试剂的线性，相对于现有技术，将线性范围扩大至500mg/L的被测物，且检测10mg/L附近病人样本精密度CV为1.26％，整个检测过程仅需10min。
附图说明
图1本发明实施例4与对比例的校准曲线；
图2本发明实施例4与对比例的线性；
图3本发明实施例4与对比例的相关性。
具体实施方式
本发明提供了人血清淀粉样蛋白A的试剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、血清淀粉样蛋白A试剂R1的制备:50mmol/L磷酸盐缓冲溶液，3g/L的BSA，0.12g/L Tween20及0.1g/L的PC300，溶液PH为7.5。
2、血清淀粉样蛋白A试剂R2的制备：
(1)将抗人血清淀粉样蛋白A溶于PH＝7.8磷酸盐缓冲溶液和PH＝7.0的MOPS缓冲溶中，制得抗体溶液浓度为0.43mg/ml
(2)将粒径为85nm和280nm的羧基化聚苯乙烯微球分别分散在PH＝5.0的10mmolMES缓冲溶液中，微球在溶液中浓度为1％(w/V)，分别加入100ul浓度为4mg/ml和2.3mg/ml的EDC溶液，活化半个小时后，将溶液(1)加入到溶液中，进行化学交联，室温下搅拌反应5小时后，分别加入30ul/ml的牛血清白蛋白混匀，封闭半小时。
(3)将步骤(2)中反应后的溶液在10000rpm离心10min去上清，保留沉淀
(5)配制50mmol/L的HEPES缓冲溶液，PH＝7.8，蔗糖为50g/L，牛血清白蛋白4g/L及0.1g/L的防腐剂Proclin-300
(6)将步骤(3)所得沉淀分别溶解在步骤(5)的缓冲溶液中，分散15-20min成乳白色的混悬液，42℃水浴老化17小时，重新分散5min，即得到浓度为0.5mg/ml的抗体胶乳微粒。
(7)将制得的胶乳试剂以小球与大球的比例为1.4:1的比例混合均匀。
3、血清淀粉样蛋白A试剂中标准品的制备：
校准品是将血清淀粉样蛋白A抗原溶于30mmol/L的HEPES缓冲溶液，PH＝7.5，使溶液浓度达到500mg/L，同时加入牛血清白蛋白为40g/L，甘露醇为20g/L，氯化钠为0.9g/L及0.1g/L的Proclin-300后混合均匀，以1ml/瓶分装后进行冷冻干燥，即得到血清淀粉样蛋白A的淡黄色疏松冻干校准品。取10瓶冻干，1ml去离子水复溶，作为样本用市售血清淀粉样蛋白A试剂瓶重复检测三次，计算均值即为冻干品的值，浓度为488mg/L。
实施例2
1、血清淀粉样蛋白A试剂R1的制备同实施例1
2、血清淀粉样蛋白A试剂R2的制备：
与实施例1相比，仅步骤(2)发生改变。步骤(2)中需要先将步骤(1)中的抗体缓冲溶液加入到微球，进行物理偶联1小时后，再分别加入100ul浓度为4mg/ml和2.3mg/ml的EDC溶液进行羧基的活化，反应5小时后，加入30ul/ml的牛血清白蛋白混匀，封闭半小时。
3、标准品的制备与实施例1相同。
实施例3
1、血清淀粉样蛋白A试剂R1的制备同实施例1
2、血清淀粉样蛋白A试剂R2的制备：
与实施例2相比，仅步骤(1)发生改变。步骤1中将抗人血清淀粉样蛋白A和牛血清白蛋白分别溶于PH＝7.8磷酸盐缓冲溶液和PH＝7.0的MOPS缓冲溶中，制得抗体溶液浓度为0.43mg/ml，牛血清白蛋白浓度为0.14mg/ml。
3、标准品的制备与实施例1相同。
实施例4
1、血清淀粉样蛋白A试剂R1的制备同实施例1
2、血清淀粉样蛋白A试剂R2的制备：
与实施例3相比，仅步骤(1)发生改变。步骤1中将抗人血清淀粉样蛋白A和牛血清白蛋白分别溶于PH＝7.8磷酸盐缓冲溶液和PH＝7.0的MOPS缓冲溶中，制得抗体溶液浓度为0.43mg/ml，牛血清白蛋白浓度为0.21mg/ml。
3、标准品的制备与实施例1相同。
实施例5
1、血清淀粉样蛋白A试剂R1的制备同实施例1
2、血清淀粉样蛋白A试剂R2的制备：
与实施例4相比，仅步骤(1)发生改变。步骤1中将抗人血清淀粉样蛋白A和牛血清白蛋白分别溶于PH＝7.8磷酸盐缓冲溶液和PH＝7.0的MOPS缓冲溶中，制得抗体溶液浓度为0.43mg/ml，牛血清白蛋白浓度为0.43mg/ml。
3、标准品的制备与实施例1相同。
对比例1
R1组分为50mmolTRIS缓冲溶液、无机盐以及表面活性剂；
R2组分为包被有抗人血清淀粉样蛋白A抗体的胶乳微粒；
校准品和质控品均为牛血清基质的冻干品。
效果验证
对实施例4-7中所制备的试剂盒进行血清淀粉样蛋白A的检测，检测仪器为贝克曼AU480全自动生化仪，参数表1如下，对比例按照说明书要求进行参数设置：
表1
将本发明制备的校准品用去离子水将发明的校准品以水为零点建立工作用曲线,稀释方法如表2所示：
表2
| 稀释后校准品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 校准品(μl) | -- | 10 | 40 | 80 | 160 | 320 |
| 生理盐水(μl) | 320 | 310 | 280 | 240 | 160 | -- |
| 稀释因数 | 0 | 1/32 | 1/8 | 1/4 | 1/2 | 1 |
A、定标结果：
使用稀释后校准定标，根据实施例1～5定标反应度，对偶联过程及偶联效率进行考察，对比例按照市售校准浓度进行定标，结果如表3所示：
表3
根据实例1与实例2的对比，我们发现偶联工艺改进后，试剂的反应度有所提升，说明先经过物理偶联后，在一定程度上可以利于抗体的定向，提高了偶联效率；实施例3和实施例4与实施例2对比可以发现低值区域的分析灵敏度有一定的提升，这主要是因为抗体与蛋白以一定的比例混合加入到微球时，抗体与微球的连接方式为多种，蛋白的存在使得抗体在与微球进行物理偶联时具有一定的定向作用，有效提高了微球的与抗体的偶联效率，而实施例5与实施2对照发现，并不是蛋白添加越多，偶联效率越高，当蛋白含量与抗体含量一致时，由于牛血清白蛋白含量与微球偶联，导致抗体偶联效率反而降低。
B、精密度检测：
选取参考值10mg/L附近的血清样本，重复检测20次，计算测值的均值、标准差(SD)和变异系数(CV)，结果如表4所示：
表4
从精密度实验中明显可以看到，实施例1和实施例2可以发现，相对于实施例1而言，实施例2的偶联工艺改进后，检测精密度有了很大的提升，通过比较实施例3和4可以发现使用蛋白与抗体混和偶联时，由于偶联效率的提高，分析灵敏度较大精密度较好，实施例4的CV最小，低值精密度表现最好，实施例5中由于低值灵敏度较低，从而导致试剂精密度较差。
C、准确度检测：对具有溯源性的高值质控品和低值质控品靶值分别为48.5mg/L和18.2mg/L的质控品进行测定，每个质控品检测5次，计算每次结果与靶值的相对偏差，临床化学检验，准确度小于15％均认为是合格。实验结果如表5所示：
表5
从准确度的实验来看，实施例1-5的准确度均在合格范围内。
D、线性检测：对实施例3-5以及对比例进行线性检测，选取高值病人样本，按照倍比稀释为6个梯度，每个梯度的样品检测3次取均值，对检测的测值与理论浓度做线性回归分析，X轴理论浓度，Y轴表示测定值，一般R2要求不小于0.990。线性结果如表6所示：
表6
从线性的结果来看，实施例2和实例3对比可以发现实施例3的线性有了明显的提升，说明微球与抗体最开始的定向偶联，有效的提高了偶联效率，连接在微球上的抗体与样本反应的效率得到有效的提升，因此线性增加，实施例3和实施例4对比，实时例4的线性更好，说明蛋白的添加对定向起了积极的效果，使得偶联效率在物理偶联过程中有了进一步的提升，而实施例4和5的对比发现，线性有所降低，这说明微球连接的大部分是蛋白而非抗体，因此高值区域由于抗体量的原因测值无法进行，所以线性有了很大的降低，而对比例中高值样本最高点只能测到317，R2为0.9619。
E、相关性能检测
根据定标试剂中的分析灵敏度、低值精密度和线性三个指标综合来考虑，实施例4兼顾了低值的精密度以及线性的性能为最优，与市售试剂进行相关性检测，结果如表7所示：
表7
取市售试剂线性以内的样本21例进行相关性验证，从实验结果来看实施例7与市售的血清淀粉样蛋白A试剂具有非常好的相关性。相关系数可达0.999，实验结果说明本发明检测数据准确可靠，可有效降低成本。
以上结果表明，本发明中实施例4低值精密度高、线性与对比例相比线性更加优良，与对照试剂相关性良好，测值准确，检测结果最佳。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测人血清淀粉样蛋白A的检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和标准品：
所述试剂R1的pH值为6.5～8.0，包括缓冲溶液、稳定剂和防腐剂；
所述的缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中至少一种；所述稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、表面活性剂、助悬剂中至少一种；所述防腐剂选自Proclin-200、Proclin-300和NaN3；
所述试剂R2由如下原料制得：85nm胶乳颗粒、280nm胶乳颗粒、EDC、抗人血清淀粉样蛋白A、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、BSA和保存液；
所述保存液包括：HEPES缓冲液、BSA、蔗糖和Proclin-300。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂R1包括：30～100mmol/L磷酸盐缓冲液、1g/L～10g/L BSA、0.1g/L～2g/L Tween20和0.1g/L Proclin-300。
3.权利要求1所述的检测试剂中试剂R2的制备方法，其特征在于，包括：
将抗人血清淀粉样蛋白A以磷酸盐缓冲液溶解，获得抗人血清淀粉样蛋白A溶液；将牛血清白蛋白以MOPS缓冲液溶解，获得牛血清白蛋白溶液；
将85nm羧基化聚苯乙烯微球以MES缓冲液稀释，加入EDC活化后，与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合反应，再次以EDC活化后加入牛血清白蛋白溶液封闭，离心收集沉淀以保存液悬浮，获得A液；
将280nm羧基化聚苯乙烯微球以MES缓冲液稀释，加入EDC活化后，与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合反应，再次以EDC活化后加入牛血清白蛋白溶液封闭，离心收集沉淀以保存液悬浮，获得B液；
将所述A液与所述B液混合，42℃老化15～20h，分散制得试剂R2。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8；所述抗人血清淀粉样蛋白A溶液中，抗人血清淀粉样蛋白A的浓度为0.43mg/ml；所述MOPS缓冲液的pH值为7.0；所述牛血清白蛋白溶液中，牛血清白蛋白的浓度为0.14～0.43mg/ml。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述MES缓冲液的浓度为10mmol/L；
制备所述A液的步骤中，所述85nm胶乳颗粒以MES缓冲液稀释至浓度为1g/L；
制备所述B液的步骤中，所述280nm胶乳颗粒以MES缓冲液稀释至浓度为1g/L。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述加入EDC为加入含有EDC的MES缓冲液，其中，EDC浓度为4mg/mL或2.3mg/mL，MES的浓度为10mmol/L；所述制备A液的步骤中加入EDC至浓度为4mg/ml；所述制备B液的步骤中加入EDC至浓度为2.3mg/ml；所述活化的条件为室温活化30min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备A液的步骤中与抗人血清淀粉样蛋白A溶液混合至抗人血清淀粉样蛋白A溶液的浓度为4mg/ml；所述制备B液的步骤中与抗原稀释液混合至抗原稀释液的浓度为2.3mg/ml；所述与抗原稀释液混合反应的条件为室温反应4～6h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备A液的步骤中加入BSA至其浓度为30μg/ml；所述制备B液的步骤中加入BSA至其浓度为30μg/ml，所述封闭的反应条件为室温反应20～40min。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述A液与所述B液混合至胶乳颗粒的密度为0.5mg/mL。
10.根据权利要求3～9任一项所示的制备方法，其特征在于，所述试剂R2中，中85nm微球与280nm微球的质量比为1.4:1。
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