AT373278B

AT373278B - Verfahren zur immobilisierung von mikrobenzellen mit einer glucose-isomerase-aktivitaet

Info

Publication number: AT373278B
Application number: AT113682A
Authority: AT
Inventors: Mitko Stojtschev Popov; Fidanko Stilijanov Sretenov; Rossen Haralanov Ratschev; Galina Michajlovna Djejeva; Sebastijana Valtschano Bojkova
Original assignee: Inst Po Mikrobiologia
Priority date: 1982-03-23
Filing date: 1982-03-23
Publication date: 1984-01-10
Also published as: ATA113682A

Description

EMI1.1

oder nach Einfrieren bei -5 bis -10. C während 12 h wird das Produkt einem Pressvorgang unterzogen, danach granuliert und bei Temperaturen von höchstens 50 C unter Vakuum oder im Trockenluftstrom getrocknet. Ausser in granulierter Form, kann das trockene Präparat auch gemahlen und dann gesiebt benutzt werden, indem man die Fraktion mit einer Korngrösse von 2, 00 bis 0. 59 mm Maschenweite wählt.

Das hergestellte immobilisierte Präparat wird zum Füllen einer Reaktionskolonne oder Kolonnenbatterie benutzt, durch welche eine Aktivatoren enthaltende 2-3M Glukose-Lösung (Magnesium- und Kobaltionen in für das gegebene Enzym optimalen Konzentrationen) bei Temperaturen von 45 bis 75 C durchgelassen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit des Substrats ist so eingestellt, dass eine 40 bis 50% Umwandlung der Glukose in Fruktose gewährleistet wird (z. B. beim Gleichgewicht der Isomerisierungsreaktion).

Die Glukose-Isomerase-Aktivität in der Reaktionskolonne oder in der Kolonnenbatterie und die Lebensdauer des enzymatischen Präparats sind eine Funktion der Berührungsdauer des Enzyms mit dem Substrat (Strömungsgeschwindigkeit der Kolonne), der angewendeten Temperatur, der Aktivität und der Menge des angelegten Präparats und des Vorhandenseins von Aktivatoren (Magnesium und Kobaltionen). Die Glukose-Isomerase-Aktivität wird in einem Reaktionsapparat nach dem von Thompson et al (US-PS Nr. 3. 788, 945) beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die in Fruktose umgewandelte Glukosemenge wird kolorimetrisch oder polarimetrisch bestimmt. Diese Bestimmung wird in bestimmten sich wiederholenden Zeitintervallen während des Betriebes der Kolonne vorgenommen. Der Aktivitätsindex A der Kolonne wird nach der nachstehend angeführten Formel bestimmt : A=RIExlog[0.504(0.505-1)] in der bedeuten : I - die in Fruktose umgewandelte Glukosemenge (in g), R - die Strömungsgeschwindigkeit (in cm3/min) und E - die in der Kolonne (oder Kolonnenbatterie) ermittelte Anzahl der internationalen Einheiten Glukose-Isomerase-Aktivität (GIU).

Das Gleichgewicht der Isomerisierungsreaktion kann beim Vorhandensein von mindestens 2000 internationalen Glukose-Isomerase-Einheiten erlangt werden.

Die Nebenprodukte der Reaktion und die Kobalt- und Magnesiumionen können mittels Behandlung mit Aktivkohle und Kationenaustauschharzen beseitigt werden. Der Farbindex des hochfruktosehältigen Sirups wird spektrophotometrisch in einer spektralphotometrischen Küvette von 1 cm3 bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm bestimmt. Die Farbeinheiten des hochfruktosehältigen Sirups werden mit Hilfe folgender Formel berechnet :
EMI2.1
in der B - den Farbindex bedeutet, A,. s und A , -die Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm und C - die Konzentration der Lösung (in g/100 cm3).

Die hergestellten immobilisierten enzymatischen Präparate weisen im Vergleich mit den bisher bekannten Präparaten folgende Vorteile auf : hohe Aktivität/g immobilisiertes Präparat (150 bis 200 GIU/g). günstiges pu-optimum (7, 0), hohes Temperaturoptimum (70 bis 75 C) und eine wesentliche Thermostabilität bei Temperaturen von 45 bis 65 C. Die Produktivität (der Umwandlungseffekt) des hergestellten Präparats ist 1, 5 GIU für 1 g Glukose bei einer Konvertierungsstufe von 45 bis 50%.

An Hand der nachstehend angeführten Beispiele wird die Erfindung näher erläutert :
Beispiel I : Die nach einer Fermentation von Mikrobenzellen erhaltene Kulturflüssigkeit wird zentrifugiert oder filtriert. Die abfiltrierte Biomasse wird nur einmal mit Wasser gespült. Die nach dem Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen feuchten Zellen müssen 10 bis 12% Trockensubstanz enthalten. Bei einer Abweichung von diesen Werten wird eine entsprechende Korrektur der Menge des benutzten Blutserums oder Blutplasmas vorgenommen. Die frische Biomasse wird mit frisch erhaltenem Blutserum oder Blutplasma in einem Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 10 Gewicht/Volumen vermischt, so dass das Präparat nach der Polymerisation 150 bis 200 GIU Glukose-Isomerase-Aktivität/g Trockensubstanz enthält.

Es werden 380 bis 400 cm3 25%ige wässerige Glutaraldehyd-Lösung/kg

Trockensubstanz dem Reaktionsgemisch zugegeben, wonach es zirka 1 h mit einem mechanischen Rührer bei Zimmertemperatur gerührt wird. Das erhaltene polymerisierte Produkt wird filtriert und mehrfach mit Wasser gespült bis das Spülwasser keine gelbe Färbung mehr aufweist. Das überschüssige Wasser wird mittels Pressen ausgeschieden, wonach das Präparat während 12 h und bei einer Temperatur von-5 bis-10 C eingefroren wird. Nach diesem Arbeitsgang wird das Präparat ent-
EMI3.1
oder im Trockenluftstrom getrocknet wird. Ausser in granulierter Form kann das Präparat auch, nachdem es bis zu einer Körnergrösse von 2, 00 bis 0, 59 mm Maschenweite (mesh) gemahlen und gesiebt wird. verwendet werden.

Beispiel II : Bei der Polymerisation von ganzen Zellen mit Glukose-Isomerase-Aktivität mit Blutserum oder Blutplasma wird wie im Beispiel I verfahren. Nach dem Pressen wird das hergestellte Produkt nicht eingefroren, sondern direkt einer Granulation unterzogen. wonach es, wie im Beispiel I angegeben. getrocknet wird.

Beispiel III : Die Polymerisation von Glukose-Isomerase-Aktivität aufweisenden Zellen wird mit Benutzung von mittels Zerstäubung getrocknetem oder lyophilisiertem Blutserum oder Blutplasma durchgeführt. Das Blutserum oder Blutplasma wird vorher in Wasser gelöst, bis der Trockensubstanzgehalt auf 8 bis 12% eingestellt ist. Die nachfolgenden Arbeitsgänge werden wie in den Beispielen I und II vollzogen.

Beispiel IV : Bei der Polymerisierung von Glukose-Isomerase-Aktivität aufweisenden ganzen Mikrobenzellen wird wie in den Beispielen I, II, III verfahren, mit der Ausnahme, dass man eingefrorenes Blutplasma oder Blutserum benutzt. In diesem Fall werden die eingefrorenen Blutserumoder Blutplasma-Blöcke bei einer Temperatur von höchstens 550C entfrostet. Danach wird die Trockensubstanz bestimmt, die entsprechende Korrektur vorgenommen und wie in den Beispielen I und II verfahren.

Beispiel V : Das hergestellte Trockenpräparat wird während 12 h in einem eine Konzentration von 2-3M aufweisenden Glukose-Sirup eingeweicht, welcher die für das gegebene Enzym optimale Konzentration an Kobalt- und Magnesiumionen enthält, oder in Wasser in einem Verhältnis von 1 : 10 Gewicht/Volumen. Mit dem gequollenen Präparat wird eine Kolonne oder eine Kolonnenbatterie gefüllt, wobei zu beachten ist. dass die letzteren richtig und gleichmässig gefüllt werden, ohne dass Luft mit eingeschlossen wird. Die Menge an enzymatischem Präparat, das für die Durchführung der Reaktion erforderlich ist, wird nach der Formel (I) bestimmt.

Durch die Kolonne läuft ununterbrochen ein Glukose-Sirup mit einer Konzentration von 2-3M. Die Fruktose-Konzentration am Ausgang der Kolonne wird kolorimetrisch oder polarimetrisch bestimmt. Die Umwandlung des Glukose-Sirups wird in der Kolonnenbatterie auf 40 bis 50% gehalten, wobei die Kolonne, deren Aktivität unter 20% fällt, ausgewechselt wird. Um eine Mikrobenverschmutzung der Kolonne zu vermeiden, ist es empfehlenswert, die Temperatur des Isomerisationprozesses auf 60 bis 65GC zu halten und ebenso soll der Sirup bis auf die Arbeitstemperatur vorgewärmt sein. Die Strömungsgeschwindigkeit durch die Kolonne oder durch die Kolonnenbatterie wird mittels einer geeigneten Pumpe gesteuert und hängt von der Menge und der Aktivität des benutzten Präparats, gemäss Formel (1) für A, ab.

Die Arbeitszeit einer einzelnen Kolonne (d. h. einer Kolonne, die nicht in einer Batterie eingeschlossen ist) hängt von der Anfangs-Aktivität des immobilisierten Präparats und der Thermostabilität des benutzten Enzyms sowie von der Strömungsgeschwindigkeit des Substrats ab.

PATENTANSPRÜCHE : 1 : Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit einer Glukose-Isomerase-Aktivi- twat, bei welchem die von einem Glutaraldehyd bewirkte Polymerisation in Anwesenheit eines Eiweissträgers durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass als Eiweissträger Blutserum oder Blutplasma eingesetzt wird.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutserum oder das Blutplasma in einem durch Zerstäubung getrockneten, lyophilisierten oder eingefrorenen Zustand eingesetzt werden. <Desc/Clms Page number 4>

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verhältnis zwischen der Gewichtsmenge der Mikrobenzellen und der Volumenmenge des Blutserums oder Blutplasmas von 1 : 1 bis 1 : 10 eingehalten wird.