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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen, die eine Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisen, bei welchem die von Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit von einem Eiweissträger durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass als Eiweissträger Blutserum oder Blutplasma benutzt wird.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutserum und das Blutplasma in einem durch Zerstäubung getrockneten, lyophilisierten oder eingefrorenen Zustand benutzt werden.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis zwischen der Gewichtsmenge der Mikrobenzellen und die Volumenmenge Blutse- rum oder Blutplasma von 1:1 bis 1:10 beträgt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikrobenzellen Bakterienzellen verwendet.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Blutserum oder Blutplasma in eingefrorenem oder getrocknetem Zustand verwendet und dieses in Wasser bis zu einer Konzentration von 10 bis 12% Trockensubstanz auflöst.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Blutserum oder Blutplasma verwendet, welches von gesunden Schlachttieren, insbesondere Rindern, Kleinvieh und Schweinen, entnommen wurde.
7. VerFahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt bei einer Temperatur im Bereich von -5 bis - l00C einfriert, anschliessend presst und granuliert und schliesslich bei einer Temperatur, die nicht höher liegt als 50"C, unter Vakuum oder im Luftstrom trocknet.
8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man das granulierte trockene Präparat anschliessend mahlt und siebt und diejenige Fraktion der Körner auswählt, die einer lichten Maschenweite im Bereich von 0,59 mm bis 2,00 mm entsprechen.
9. Immobilisierte Mikrobenzellen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1, in Form eines Enzympräparates.
10. Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aktivatoren enthaltende Glucoselösung durch eine Reaktionssäule leitet, welche ein Enzympräparat gemäss Patentanspruch 9 enthält.
II. Verfahren nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzympräparat in einer Reaktionssäule verwendet, durch die eine Aktivatoren enthaltende, 2 bis 3 Mol Glucose enthaltende Lösung, bei einer Temperatur von 45 bis 75"C geleitet wird, wobei die Strömungsgeschwindigkeit so eingestellt wird, dass eine 40-50%ige Umwandlung der Glucose in Fructose nach dem Durchtritt durch die Säule gewährleistet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen, die eine Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisen. Bei diesem Verfahren erfolgt die Immobilisierung durch eine von Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit von Eiweissträgern.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Mikrobenzellen in Form eines Enzympräparates.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose, bei dem dieses Enzympräparat eingesetzt wird.
Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität sind bekannt.
Gemäss dem USA-Patent Nr. 1 401 946 vom Baxter Laboratory wird die Polymerisation der Zellen auf der Basis der Querverbindung in Anwesenheit von einer diazotierten von einem bis zu drei Hetero(atom)-ringen enthaltenden Diamino-Verbindung, wie 2,6-Diaminopyridin, 3,6-Diaminoakridin und andere, vollzogen.
Gemäss der USA-Patentschrift Nr. 3 694 319 von Lloyd et al. werden thermisch behandelte ganze Arthrobacter-Zellen für die Isomeration der Glucose in Fructose in einem kontinuierlichen Verfahren verwendet.
Gemäss dem in der dänischen Patentschrift Nr. 390 521 von Amotz et al beschriebenen Verfahren werden ganze Zellen von Bacillus sp. NRLL 5656 mit Glutaraldehyd behandelt, wonach das so hergestellte Präparat für Isomerisierung der Glucose in Fructose benutzt wird. Dabei erfolgt die Isomerisierung in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktionsgefäss.
In den USA-Patentschriften Nr. 3 788 945 von Thompson C.M. et al. und 3 708 397 von Sipos T. et al. werden Verfahren beschrieben, gemäss denen ganze Actinomycetes (Streptomycetes)-Zellen mit DEAE-Zellulose oder ECTEOLA-Zellulose durch lonenaustauscher mittels Ionenbindungen immobilisiert werden.
In dem Artikel mit dem Titel Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes von Kolarik, M.J., et al. wird eine Immobilisierung auf Collagen-Gel beschrieben, wobei durch eine anschliessende Oberflächenbehandlung des Gemisches mit Glutaraldehyd dieses in einen unlöslichen Zustand übergeführt wird.
Die bisher beschriebenen Verfahren zur Immobilisierung weisen jedoch einige Nachteile auf.
Die direkte thermische Behandlung der Zellen, die durchgeführt wird, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen zu verhindern, führt gewöhnlich zu Präparaten, die eine niedrige Aktivität und eine kurze Lebensdauer während ihrer Verwendung im Isomerisationsverfahren besitzen.
Die Immobilisierung von ganzen Zellen, wie beispielsweise DEAE-Zellulose mittels lonenaustauschern, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität bei der Verwendung der Präparate allmählich durch die Substratlösung abgewaschen wird. Die gleichen Nachteile wurden auch bei der Immobilisierung der Zellen in einer Gelstruktur, beispielsweise aus Polyacrylamid oder Collagen, beobachtet.
Die dauerhaftesten Präparate von immobilisierten Enzymen werden im allgemeinen erhalten, indem man eine kovalente Bindung der an der Oberfläche der Zellmembranen befindlichen Reaktivgruppen durchführt. Entsprechende Verfahren sind ebenso für die Immobilisierung von Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität bereits angewandt worden.
Das in der weiter vorne genannten USA-Patentschrift Nr.
1 401 946 beschriebene Verfahren, bei dem eine Immobilisierung durch Polymerisation mit diazotierten Diaminen durchgeführt wird, führt zu einer guten Aktivität der Zellen. Die bei diesem Verfahren angewandten Reagenzien, beispielsweise 2,6-Diaminopyridin und 3,6-Diaminoakridin, besitzen jedoch stark toxische und kanzerogene Eigenschaften und deshalb ist die Anwendung dieses Verfahrens auf bestimmte Einsatzgebiete beschränkt und mit Gefahren verbunden.
An der Zelloberfläche sind nur eine ungenügende Anzahl an freien reaktiven Gruppen vorhanden, und deshalb führt die Zellenpolymerisation durch direkte Behandlung mit Glutaraldehyd nur zu einem niedrigen Polymerisationsgrad.
Dementsprechend ist es nicht möglich, die Netzstruktur in einem solchen Ausmass zu erreichen, dass ein guter Kontakt zwischen dem benutzten Substrat und dem immobilisierten Enzym sichergestellt ist. Das in dem weiter vorne beschriebe
nen dänischen Patent 390 521 beschriebenen Verfahren bietet ferner keine Möglichkeit zur Standardisierung des Endproduktes.
Es wurden auch bereits Versuche unternommen, Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität durch Bindung auf Blutfraktionen zu immobilisieren, beispielsweise durch Immobilisierung auf der Fraktion V nach Cohn, auf Fibrin und andere Fraktionen. Dabei konnten jedoch nur Präparate erhalten werden, die keine gute Aktivität besitzen.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen, die eine Glucose-lsomerase-Aktivität aufweisen, zu entwickeln, bei dem unter Verwendung eines leicht erhältlichen Eiweissträgers ein hochaktives beständiges Enzympräparat erhalten werden kann.
Überraschendcrwcise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele dadurch erreicht werden können, dass man als Beweis sträger Blutserum oder Blutplasma benutzt und die Polymerisation der Mikrobenzellen mit Glutaraldehyd in Anwesenheit dieses Eiweissträgers durchführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen, die eine Glucose-lsomerase-Aktivität aufweisen, bei welchem die von Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit von einem Eiweissträger durchgeführt wird, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass als Eiweissträger Blutserum oder Blutplasma benutzt wird.
Gemiiss einer bevorzugten Ausführungsart des erfin dt gsgelluissell Verfahrens wii-d das 131ulserulll und das 131ut- plaSUla in einen durch Zclsiicbang getroekneten, lyophil- sierten oder eingefrorenen Zustand verwendet. Wenn das Blutserum oder Blutplasma in eingefrorenem oder getrocknetem Zustand verwendet wird, dann ist es vorteilhaft, dieses in Wasser bis zu einer Konzentration von 10 bis 12% Trockensubstanz aufzulösen.
Bevorzugte beim erfilldungsgemässen Verfahren eingesetzte Mikrobenzellen sind Bakterienzellen.
Vorzugsweise liegt bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens das Verhältnis zwischen der Gewichtsmenge der Mikrobenzellen und der Volumenmenge an Blutserum oder Blutplasma im Bereich von 1:1 bis 1:10.
Es zeigte sich, dass dadurch, dass beim erfindungsgemässen Verfahren die Polymerisation der Mikrobenzellen, die eine Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisen, mit dem Glutaraldehyd in Anwesenheit von Blutserum oder Blutplasma durchgeführt wird, ein Produkt erhalten wird, in dem die Glucose-Isomerase-Aktivität über lange Zeiträume erhalten bleibt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Mikrobenzellen in Form eines Enzympräparates.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Aktivatoren enthaltende Glucoselösung durch eine Reaktionssäule leitet, welche ein oben definiertes erfindungsgemässes Enzympräparat enthält.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsirt dieses Verfahrens wird das Enzympräparat in einer Reaktionssäule verwendet, durch die eine Aktivatoren enthaltende, 2 bis 3 Mol Glucose enthaltende Lösung, bei einer Temperatur von 45 bis 75"C geleitet wird. Dabei wird die Strömungsgeschwindigkeit so eingestellt, dass eine 40-50%ige Umwandlung der Glucose in Fructose nach dem Durchtritt durch die Säule gewährleistet ist.
Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens das Blutserum oder Blutplasma von gesunden Schlachttieren entnommen, beispielsweise Rindvieh, Kleinvieh, Schweinen und ähnlichen Tieren. In der Regel soll ferner das entnommene Blutserum und Blutplasma den Veterinär-Sanitätserfordernissen entsprechen.
Wenn man das Blutserum oder Blutplasma in eingefrorenem oder getrocknetem Zustand einsetzt, dann soll es zweckmässigerweise in Wasser bis zu einer Erreichung von 10 bis 12% Trockensubstanz aufgelöst werden.
Das nach der Umsetzung erhaltene Produkt kann als solches oder nach dem Einfrieren auf -5 bis - 10"C, beispielsweise während 12 Stunden, gepresst werden. Nach dem Pressen kann das Produkt granuliert und bei einer Temperatur, die nicht höher liegt als 50"C, unter Vakuum oder im Luftstrom einer Trockenluft getrocknet werden.
Das granulierte trockene Präparat kann anschliessend gemahlen und gesiebt werden, und dabei wird vorzugsweise diejenige Fraktion an Körnern ausgewählt, die einer lichten Maschenweite im Bereich von 0,59 mm bis 2,0 mm, also 30 mesh bis 10 mesh, entsprechend der USA-Siebserie, entsprechen.
Bei der Verwendung der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Enzympräparate in einer Reaktionskolonne oder in einer Kolonnenbatterie zeigte es sich, dass die Glueose-lsomerase-Aktivität und die Lebensdauer des enzymatisehen Präparates eine Funktion der Berührungsdauer des Enzympräparates mit dem Substrat, die durch die Strömungsgeschwindigkeit in der Kolonne bestimmt wird, ist.
Weitere Faktoren, die die Glucose-Isomerase-Aktivität und die Lebensdauer des Präparates beeinflussen, sind die angewandlern Temperaturen, die Aktivität des l'ripa:.:tes am Beginn der \crwendu:lg, die Menge, in der das l > räparat cin- gesetzt wird, und ferner das Vorhandensein von Aktivatoren für die enzymatisehe Umwandlung von Glucose in Fructose.
Als Aktivatoren dienen beispielsweise Magnesiumionen und Kobaltionen. ln dem weiter vorne erwähnten USA-Patent Nr.
3 788 945 wird ein Verfahren und eine Reaktionsapparatur beschrieben, die zur Bestimmung der Glucose-lsomerase Aktivität der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparate eingeselzt werden kann.
Die Menge an Glucose, die in Fructose umgewandelt wurde, kann kolorimetrisch nach dem Verfahren von Dische et al. oder mit Hilfe der Polarimetrie bestimmt werden. Diesc Bestimmung wird in bestimmten sich wiederholenden Zeitintervallen während der Arbeit der Kolonne vorgenommen. Der Aktivitätsindex der Kolonne wird nach der nachstehend angeführten Formel I bestimmt.
h = RIE x log [0,504(0,505-1)] 1 in der A - die Effektivität der Kolonne ist, l - das in Fructose umgewandelte Glucosequantum (in g), R - die Strömungsgeschwindigkeit (in cm3 pro Minute), E - die Anzahl der internationalen Einheiten Glucose-lsomerase-Aktivität, welche sich in der Kolonne oder Kolonnenbatterie befinden.
Das Gleichgewicht der lsomerisationsreaktion kann beim Vorhandensein von Minimum 2000 internationalen Glucose Isomerase-Einheiten erlangt werden.
Die Nebenprodukte der Reaktion und die Kobalt- und Magncsiumioncn können mittels Behandlung mit aktiver Kohle und Kationenaustauschharz, wie zum Beispiel Vofatit, Duolit, Amberlight, Dowex und andere, beseitigt werden. Der Farbindex des Hoch-Fructose-Sirups kann spektrophotometrisch in einer spektralphotometrischen Küvette von 1 cm3 bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm bestimmt werden. Die Farbeinheiten des Hoch-Fructose-Sirups werden mit Hilfe folgender Formel berechnet:
109 (A45o-A6oo) c in der B - den Farbindex bedeutet, A43o und A60o - die Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm, C die Konzentration der Lösung (in g/100 cm3).
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren immobilisierten enzymatische Aktivität besitzenden Mikrobenzellen weisen im Vergleich zu bisher bekannten Präparaten folgende Vorteile auf: hohe Aktivität pro Gramm immobilisiertes Präparat (150-200 GIU/g), günstiges pH-Optimum (7,0), hohes Temperaturoptimum (70-75"C) und eine wesentliche Wärmestandfestigkeit (Thermostabilität) bei Temperaturen von 45"C bis 65"C. Die Produktivität (der Umwandlungseffekt) des hergestellten Präparates ist im allgemeinen 1,5 GTU für 1 g Glucose bei einer Konvertierungsstufe von 45-50%.
Anhand der nachstehend angeführten Beispiele wird die Erfindung näher erläutert: Beispiel I
Die nach einer Fermentation von Mikrobenzellen erhaltene Kulturflüssigkeit wird zentrifugiert oder filtriert. Die abfiltrierte Biomasse wird nur einmal mit Wasser gespült. Die nach dem Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen feuchten Zellen müssen 10-12% trockene Substanz enthalten. Bei einer Abweichung von diesen Werten wird eine entsprechende Korrektion der Menge des benutzten Blutserums oder Blutplasmas vorgenommen. Die frische Biomasse wird mit frisch erhaltenem Blutserum oder Blutplasma in einem Verhältnis 1:1 bis 1:10 Gewicht/Volumen vermischt, so dass das Präparat nach der Polymerisation von 150 bis 200 GIU/g Trockensubstanz Glucose-Isomerase-Aktivität enthält.
Es werden 380400 cm3 25%ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung pro Kilogramm Trockensubstanz im Reaktionsgemisch zugegeben, wonach es etwa eine Stunde mit einem mechanischen Rührer bei Zimmertemperatur gerührt wird. Das erhaltene polymerisierte Produkt wird filtriert und mehrfach mit Wasser gespült, bis das Spülwasser keine gelbe Färbung mehr aufweist. Das überschüssige Wasser wird mittels Pressen ausgeschieden, wonach das Präparat während 12 Stunden und bei einer Temperatur von - 50 bis - C eingefroren wird.
Nach diesem Arbeitsgang wird das Präparat aufgetaut, das ausgeschiedene Wasser mittels Pressen abgesondert und die entstandene poröse Masse einer Granulation unterzogen, wonach sie bei einer Temperatur nicht höher als 50"C unter Vakuum oder in Trockenluftstrom getrocknet wird. Ausser in granulierter Form kann das Präparat auch, nachdem es bis zu einer Körnergrösse von 10 bis 30 Maschenweite (mesh) gemahlen und gesiebt wird, gebraucht werden.
Beispiel II
Bei einer Polymerisation von ganzen Zellen mit Glucose Isomerase-Aktivität mit Blutserum oder Blutplasma wird wie im Beispiel I verfahren. Nach dem Pressen wird das hergestellte Produkt nicht eingefroreri, sondern direkt einer Granulation unterzogen, wonach es, wie im Beispiel I angegeben, getrocknet wird.
Beispiel III
Die Polymerisation von Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisenden Zellen wird mit Benutzung von mittels Zerstäubung getrocknetem oder lyophilisiertem Blutserum oder Blutplasma durchgeführt. Das Blutserum oder Blutplasma wird vorher in Wasser gelöst, bis der Trockensubstanzgehalt auf 8-12% eingestellt ist. Die nachfolgenden Arbeitsgänge werden wie in den Beispielen I und II vollzogen.
Beispiel IV
Bei der Polymerisierung von Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisenden ganzen Mikrobenzellen wird wie in den Beispielen I, II und III verfahren mit dieser Ausnahme, dass man eingefrorenes Blutplasma oder Blutserum benutzt. In diesem Fall werden die eingefrorenen Blutserum- oder Blutplasma-Blöcke bei einer Temperatur nicht höher als 55"C aufgetaut. Danach wird die Trockensubstanz bestimmt, die entsprechende Korrektion vorgenommen und wie in den Beispielen I und II verfahren.
Beispiel V
Die nach den vorangegangenen Beispielen hergestellten getrockneten Produkte werden während 12 Stunden in einem eine Konzentration von 2 bis 3M aufweisenden Glucose Sirup eingeweicht, welcher die für das gegebene Enzym optimale Konzentration an Kobalt- und Magnesiumionen enthält, oder in Wasser in einem Verhältnis von 1:10 Gewichtsteilen/Volumen. Mit dem gequollenen Präparat wird eine Kolonne oder eine Kolonnenbatterie gefüllt, wobei zu beachten ist, dass die letzteren richtig und gleichmässig gefüllt werden, ohne dass Luft mit eingeschlossen wird. Die Menge des enzymatischen Präparates, die für die Durchführung der Reaktion erforderlich ist, wird nach der Formel I bestimmt
Durch die Kolonne passiert ununterbrochen ein Glucose Sirup mit einer Konzentration von 2 bis 3M. Die Fructose Konzentration am Ausgang der Kolonne wird kolorimetrisch oder polarimetrisch bestimmt.
Die Umwandlung des Glucose-Sirups wird auf dem Niveau von 40 bis 50% mittels einer Kolonnenbatterie aufrechterhalten, wobei eine Kolonne, deren Aktivität unter 20% fällt, ausgewechselt wird. Um eine Mikrobenverschmutzung zu vermeiden, ist es empfehlenswert, die Temperatur des Isomerisationsprozesses von 60"C bis 65"C aufrechtzuerhalten, und ebenso soll der Sirup bis auf die Arbeitstemperatur vorgewärmt sein. Die Strömungsgeschwindigkeit durch die Kolonne oder durch die Kolonnenbatterie wird mittels einer geeigneten Pumpe gesteuert und hängt von der Menge und der Aktivität des benutzten Präparates, gemäss Formel I, ab.
Die Arbeitszeit einer einzelnen Kolonne (d.h. einer Kolonne, die nicht in einer Batterie eingeschlossen ist) hängt von der Anfangsaktivität des immobilisierten Präparates und der Wärmestandfestigkeit des benutzten Enzyms sowie auch von der Strömungsgeschwindigkeit des Substrates ab.
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PATENT CLAIMS
1. A method for immobilizing microbial cells which have a glucose isomerase activity, in which the polymerization induced by glutaraldehyde is carried out in the presence of a protein carrier, characterized in that blood serum or blood plasma is used as the protein carrier.
2. The method according to claim 1, characterized in that the blood serum and the blood plasma are used in a dried, lyophilized or frozen state by atomization.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the ratio between the weight of the microbial cells and the volume of blood serum or blood plasma is from 1: 1 to 1:10.
4. The method according to claim 1, characterized in that bacterial cells are used as microbial cells.
5. The method according to claim 1, characterized in that one uses the blood serum or blood plasma in the frozen or dried state and this dissolves in water up to a concentration of 10 to 12% dry matter.
6. The method according to claim 1, characterized in that one uses a blood serum or blood plasma, which was taken from healthy slaughter animals, especially cattle, small cattle and pigs.
7. The method according to claim 1, characterized in that the product is frozen at a temperature in the range of -5 to - 100C, then pressed and granulated and finally at a temperature which is not higher than 50 "C, under vacuum or in Airflow dries.
8. The method according to claim 7, characterized in that the granulated dry preparation is then ground and sieved and that fraction of the grains is selected which correspond to a clear mesh size in the range from 0.59 mm to 2.00 mm.
9. Immobilized microbial cells, produced by the method according to claim 1, in the form of an enzyme preparation.
10. A process for converting glucose into fructose, characterized in that a glucose solution containing activators is passed through a reaction column which contains an enzyme preparation according to claim 9.
II. Process according to claim 10, characterized in that the enzyme preparation is used in a reaction column through which a solution containing activators and containing 2 to 3 mol of glucose is passed at a temperature of 45 to 75 ° C., the flow rate being adjusted in this way ensures that a 40-50% conversion of glucose to fructose is guaranteed after passing through the column.
The present invention relates to a method for immobilizing microbial cells which have glucose isomerase activity. In this method, the immobilization is carried out by polymerization induced by glutaraldehyde in the presence of protein carriers.
Furthermore, the present invention relates to microbial cells produced by the method according to the invention in the form of an enzyme preparation.
Another object of the present invention is a method for converting glucose into fructose, in which this enzyme preparation is used.
Methods for immobilizing microbial cells with glucose isomerase activity are known.
According to U.S. Patent No. 1,401,946 to the Baxter Laboratory, the cross-link cell polymerization is carried out in the presence of a diazotized diamino compound containing from one to three hetero (atom) rings, such as 2,6-diaminopyridine , 3,6-diaminoacridine and others.
According to U.S. Patent No. 3,694,319 to Lloyd et al. thermally treated whole Arthrobacter cells are used for the isomeration of glucose in fructose in a continuous process.
According to the method described in Danish Patent No. 390,521 by Amotz et al. Whole cells from Bacillus sp. NRLL 5656 treated with glutaraldehyde, after which the preparation thus produced is used for isomerization of glucose in fructose. The isomerization takes place in a continuously operating reaction vessel.
U.S. Patent No. 3,788,945 to Thompson C.M. et al. and 3 708 397 by Sipos T. et al. methods are described according to which whole Actinomycetes (Streptomycetes) cells with DEAE cellulose or ECTEOLA cellulose are immobilized by ion exchangers by means of ionic bonds.
In the article entitled Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes by Kolarik, M.J., et al. An immobilization on collagen gel is described, whereby the mixture is subsequently surface-treated with glutaraldehyde and converted into an insoluble state.
However, the immobilization methods described so far have some disadvantages.
The direct thermal treatment of the cells which is carried out to prevent the permeability of the cell membranes usually leads to preparations which have a low activity and a short lifespan during their use in the isomerization process.
The immobilization of whole cells, such as DEAE cellulose by means of ion exchangers, has the result that the enzymatic activity is gradually washed away by the substrate solution when the preparations are used. The same disadvantages were also observed when the cells were immobilized in a gel structure, for example made of polyacrylamide or collagen.
The most durable preparations of immobilized enzymes are generally obtained by covalently binding the reactive groups located on the surface of the cell membranes. Corresponding methods have also already been used for the immobilization of cells with glucose isomerase activity.
The US patent no.
The method described in 1,401,946, in which immobilization is carried out by polymerization with diazotized diamines, leads to good cell activity. However, the reagents used in this process, for example 2,6-diaminopyridine and 3,6-diaminoacridine, have highly toxic and carcinogenic properties and the use of this process is therefore restricted to certain fields of application and is associated with dangers.
There is an insufficient number of free reactive groups on the cell surface, and therefore cell polymerization leads to a low degree of polymerization through direct treatment with glutaraldehyde.
Accordingly, it is not possible to achieve the network structure to such an extent that good contact between the substrate used and the immobilized enzyme is ensured. That described in the above
The process described in Danish patent 390 521 also offers no possibility of standardizing the end product.
Attempts have also already been made to immobilize cells with glucose isomerase activity by binding to blood fractions, for example by immobilization on fraction V according to Cohn, on fibrin and other fractions. However, only preparations that did not have good activity could be obtained.
The aim of the present invention was to develop a method for immobilizing microbial cells which have glucose isomerase activity, in which a highly active, stable enzyme preparation can be obtained using an easily available protein carrier.
Surprisingly, it was found that the desired goals can be achieved by using blood serum or blood plasma as evidence and carrying out the polymerization of the microbial cells with glutaraldehyde in the presence of this protein.
The present invention therefore relates to a method for immobilizing microbial cells which have glucose isomerase activity, in which the polymerization induced by glutaraldehyde is carried out in the presence of a protein carrier, this method being characterized in that blood serum or blood plasma is used as the protein carrier is used.
According to a preferred embodiment of the invented method, the 131ulserulll and the 131ut-plaSUla are used in a state dried, lyophilized or frozen by zclsiicbang. If the blood serum or blood plasma is used in the frozen or dried state, then it is advantageous to dissolve it in water up to a concentration of 10 to 12% dry matter.
Preferred microbial cells used in the method according to the invention are bacterial cells.
When carrying out the method according to the invention, the ratio between the amount by weight of the microbial cells and the amount by volume of blood serum or blood plasma is preferably in the range from 1: 1 to 1:10.
It was found that in the process according to the invention, the polymerization of the microbial cells which have a glucose isomerase activity with the glutaraldehyde in the presence of blood serum or blood plasma results in a product in which the glucose isomerase activity is preserved over long periods.
The present invention further provides microbial cells in the form of an enzyme preparation produced by the process according to the invention.
The present invention further provides a process for converting glucose into fructose, which is characterized in that a glucose solution containing activators is passed through a reaction column which contains an enzyme preparation according to the invention as defined above.
According to a preferred embodiment of this method, the enzyme preparation is used in a reaction column through which a solution containing activators and containing 2 to 3 mol of glucose is passed at a temperature of 45 to 75 ° C. The flow rate is adjusted so that a 40 -50% conversion of glucose to fructose is guaranteed after passing through the column.
When carrying out the method according to the invention, the blood serum or blood plasma is preferably taken from healthy slaughter animals, for example cattle, small cattle, pigs and similar animals. As a rule, the blood serum and blood plasma drawn should also meet the veterinary medical requirements.
If the blood serum or blood plasma is used in the frozen or dried state, then it should expediently be dissolved in water to a level of 10 to 12% dry matter.
The product obtained after the reaction can be pressed as such or after freezing to -5 to -10 ° C., for example for 12 hours. After pressing, the product can be granulated and at a temperature which is not higher than 50 ° C. , can be dried under vacuum or in the air flow of dry air.
The granulated dry preparation can then be ground and sieved, and that fraction of grains is preferably selected that has a clear mesh size in the range from 0.59 mm to 2.0 mm, ie 30 mesh to 10 mesh, according to the USA sieve series , correspond.
When the enzyme preparations produced by the process according to the invention were used in a reaction column or in a column battery, it was found that the glueose isomerase activity and the life span of the enzyme preparation were a function of the contact time of the enzyme preparation with the substrate, which was determined by the flow rate in the Column is determined is.
Other factors influencing the glucose isomerase activity and the life span of the preparation are the temperatures used, the activity of the l'ripa:.: Tes at the beginning of the \ crwendu: lg, the amount in which the l> preparation cin - Is set, and also the presence of activators for the enzymatic conversion of glucose to fructose.
Magnesium ions and cobalt ions, for example, serve as activators. In U.S. Patent No. mentioned earlier.
3,788,945 describes a method and a reaction apparatus which can be used to determine the glucose isomerase activity of the preparations produced by the method according to the invention.
The amount of glucose converted to fructose can be colorimetrically determined by the method of Dische et al. or determined using polarimetry. This determination is made at certain repeating time intervals during the work of the column. The activity index of the column is determined according to formula I below.
h = RIE x log [0.504 (0.505-1)] 1 in the A - the effectiveness of the column is, l - the glucose quantum converted to fructose (in g), R - the flow rate (in cm3 per minute), E - the Number of international units of glucose isomerase activity that are in the column or column battery.
The equilibrium of the isomerization reaction can be achieved in the presence of a minimum of 2000 international glucose isomerase units.
The reaction by-products and the cobalt and magnium ions can be removed by treatment with active carbon and cation exchange resin such as Vofatit, Duolit, Amberlight, Dowex and others. The color index of the high fructose syrup can be determined spectrophotometrically in a spectrophotometric cuvette of 1 cm3 at a wavelength of 450 and 600 nm. The color units of the high fructose syrup are calculated using the following formula:
109 (A45o-A6oo) c in the B - the color index means A43o and A60o - the light absorption at a wavelength of 450 and 600 nm, C the concentration of the solution (in g / 100 cm3).
The microbial cells which have immobilized enzymatic activity by the process according to the invention have the following advantages compared to previously known preparations: high activity per gram of immobilized preparation (150-200 GIU / g), favorable pH optimum (7.0), high temperature optimum (70 -75 "C) and a substantial heat resistance (thermostability) at temperatures from 45" C to 65 "C. The productivity (the conversion effect) of the preparation is generally 1.5 GTU for 1 g of glucose at a conversion level of 45-50 %.
The invention is explained in more detail with reference to the examples below: Example I
The culture fluid obtained after fermentation of microbial cells is centrifuged or filtered. The filtered biomass is rinsed only once with water. The moist cells obtained after centrifugation or filtration must contain 10-12% dry substance. If these values deviate, the amount of blood serum or blood plasma used is correspondingly corrected. The fresh biomass is mixed with freshly obtained blood serum or blood plasma in a ratio of 1: 1 to 1:10 weight / volume so that the preparation contains glucose isomerase activity after the polymerization of 150 to 200 GIU / g dry substance.
380400 cm3 of 25% aqueous glutaraldehyde solution per kilogram of dry substance are added to the reaction mixture, after which it is stirred for about an hour with a mechanical stirrer at room temperature. The polymerized product obtained is filtered and rinsed several times with water until the rinsing water no longer has a yellow color. The excess water is removed by pressing, after which the preparation is frozen for 12 hours and at a temperature of - 50 to - C.
After this operation, the preparation is thawed, the water which has separated out is separated by means of presses and the resulting porous mass is subjected to granulation, after which it is dried at a temperature not higher than 50 ° C. under vacuum or in a dry air stream after it is ground and sieved to a size of 10 to 30 mesh.
Example II
In the case of polymerization of whole cells with glucose isomerase activity with blood serum or blood plasma, the procedure is as in Example I. After pressing, the product produced is not frozen, but subjected directly to granulation, after which it is dried, as indicated in Example I.
Example III
The polymerization of cells having glucose isomerase activity is carried out using atomized dried or lyophilized blood serum or blood plasma. The blood serum or blood plasma is previously dissolved in water until the dry matter content is adjusted to 8-12%. The following operations are carried out as in Examples I and II.
Example IV
The whole microbial cells which have glucose isomerase activity are polymerized as in Examples I, II and III, with the exception that frozen blood plasma or blood serum is used. In this case, the frozen blood serum or blood plasma blocks are thawed at a temperature not higher than 55 ° C. The dry substance is then determined, the corresponding correction is carried out and the procedure is as in Examples I and II.
Example V
The dried products prepared according to the preceding examples are soaked for 12 hours in a 2 to 3M concentration glucose syrup which contains the optimal concentration of cobalt and magnesium ions for the given enzyme, or in water in a ratio of 1:10 Parts by weight / volume. A column or a battery of columns is filled with the swollen preparation, whereby it should be noted that the latter is filled correctly and evenly without trapping air. The amount of the enzymatic preparation which is necessary for the implementation of the reaction is determined according to formula I.
A glucose syrup with a concentration of 2 to 3M continuously passes through the column. The fructose concentration at the exit of the column is determined colorimetrically or polarimetrically.
The conversion of the glucose syrup is maintained at the level of 40 to 50% by means of a column battery, whereby a column whose activity falls below 20% is replaced. In order to avoid microbial contamination, it is advisable to maintain the temperature of the isomerization process from 60 "C to 65" C, and the syrup should also be preheated to the working temperature. The flow rate through the column or through the column battery is controlled by a suitable pump and depends on the amount and the activity of the preparation used, according to formula I.
The working time of a single column (i.e. a column that is not enclosed in a battery) depends on the initial activity of the immobilized preparation and the heat resistance of the enzyme used, as well as on the flow rate of the substrate.