DD294729A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF IMMOBILISATES WITH BIOLOGICALLY ACTIVE, MACROMOLECULAR COMPOUNDS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immobilisaten mit biologisch aktiven, makromolekularen Verbindungen. Erfindungsgemaesz werden Biomakromolekuele in einem waeszrigen, gegebenenfalls gepufferten, Polymerengemisch, das gegebenenfalls zusaetzlich Alkali-, Erdalkali- oder Eisensalze geloest oder suspendiert enthaelt, gleichmaeszig verteilt und anschlieszend durch Verdampfen der waeszrigen Loesungsmittel und Behandlung mit einem Vernetzungsmittel zur Gelbildung zu Membranen oder sphaerischen Partikeln geformt, wonach gegebenenfalls nachbehandelt wird. Anwendungsgebiete der hergestellten Immobilisate sind die Biotechnologie, die Biochemie und die analytische Chemie.{Verfahren; Herstellung; Immobilisat; biologisch aktive Verbindungen; Biomakromolekuele; Polymerengemisch; Alkalisalze; Erdalkalisalze; Eisensalze; Vernetzungsmittel; Biotechnologie; Biochemie; analytische Chemie}The invention relates to a process for the preparation of Immobilisaten with biologically active, macromolecular compounds. According to the invention, biomacromolecules are uniformly distributed in a washable, optionally buffered, polymer mixture which may optionally have dissolved or suspended alkali, alkaline earth or iron salts and subsequently formed into membranes or spherical particles by evaporation of the aqueous solvents and treatment with a cross-linking agent. after which it is optionally post-treated. Areas of application of the immobilisates produced are biotechnology, biochemistry and analytical chemistry. {Process; manufacture; immobilized; biologically active compounds; biological macromolecules; Polymer mixture; Alkali metal salts; alkaline earth metal salts; Iron salts; Crosslinking agent; Biotechnology; Biochemistry; analytical chemistry}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immobilisaten mit biologisch aktiven, makromolekularen Verbindungen. Diese Produkte werden in der Biotechnologie, Biochemie und analytischen Chemie eingepetzt.The invention relates to a process for the preparation of Immobilisaten with biologically active, macromolecular compounds. These products are used in biotechnology, biochemistry and analytical chemistry.
Um biologisch aktive Verbindungen - insbesondere biokatalytisch aktive Verbindungen wie Enzyme oder mikrobielle Zellen -kontinuierlichen, biotechnologischen Prozessen in einfacherer Weise zugänglich zu machen, werden sie mit Vorteil in eine unlösliche, d. h. immobilisierte Form gebracht. Als Verfahren zur Herstellung immobilisierter Biokatalysatoren sind Absorptionsverfahren an unlöslicher. Trägermaterialien, kovalente Bindungen an ebenfalls unlösliche Trägermaterialien, Quorvernetzungsverfahren mit bifunktionellen Re&gentien und Einschlußverfahren in makromolekulare Matrizes bekannt geworden. Besonders letzteres Verfahren bietet den Vorteil der schonenden Immobilisierung der Biokatalysatoren, weil hierbei in vielen Fällen eine negative Beeinflussung der Struktur und der Funktionalität der Biokatalysatoren vermieden wird. Bei den Geleinschlußverfahren wird der Biokatalysator selbst nicht am Trägermaterial fixiert, sondern im Gelgitter eingeschlossen. Bei Vet wendung geeigneter Trägermaterialien bleibt deshalb auch die biokatalytische'Aktivität der Biokatalysatoren im wesentlichen erhalten.In order to make biologically active compounds-in particular biocatalytically active compounds such as enzymes or microbial cells -continuous biotechnological processes accessible in a simpler manner, they are advantageously converted into an insoluble, ie. H. brought immobilized form. As a method for producing immobilized biocatalysts, absorption methods are more insoluble. Support materials, covalent bonds to also insoluble support materials, quor networking with bifunctional Re & gentien and inclusion process in macromolecular matrices has become known. Especially the latter method offers the advantage of gentle immobilization of the biocatalysts because in many cases a negative influence on the structure and functionality of the biocatalysts is avoided. In the gel inclusion process, the biocatalyst itself is not fixed to the support material but enclosed in the gel lattice. When using suitable carrier materials, therefore, the biocatalytic activity of the biocatalysts is essentially retained.
Polymere Netzwerke mit eingeschlossenen Biokatalysatoren werden unter besonders milden Reaktionsbedingungen durch ionotrope Gelbildung erzeugt (Angew. Makromol. Chem. 166/167 [1989], 293-309). Bei diesem Immobilisierungsverfaliren werden hydrophile Trägermaterialien wie Alginate, Pectinate, Carrageenane, Chitosan oder Zellulosederivate in Gegenwart der Biokatalysatoren mit quervernetzend wirkenden ionischen Verbindungen behandelt. Dabei werden die Biokatalysatoren im sich bildenden Netzwerk eingeschlossen. Dieses Immobilisierungsverfahren zeichnet sich durch seine Einfachheit aus und führt zu leicht handhabbaren Immobilisaten mit hoher Funktionsstabilität. Besonders in Ca-Alginaten und K-Carrageenanen, den am häufigsten angewendeten ionotropen Netzwerken, eingeschlossene Biokatalysatoren zeichnen sich dabei durch eine hohe biokatalytische Aktivität aus. Nachteilig bei diesen genannten Immobilisierungsverfahren ist allerdings, daß die ionotrope Gelbildung und der damit verbundene Geleinschluß unter bestimmten Bedingungen ein reversibler Prozeß sind, z. B. beim Arbeiten in Gegenwart von Phosphationen oder Natriumionen. Dadurch können dieses schonende und die biokatalytische Aktivität der Biokatalysatoren weitestgehend erhaltene Immobilisierungsverfahren und die danach hergestellten Immobilisate nicht umfassend in biotechnologischen Prozessen angewendet werden.Polymer networks with entrapped biocatalysts are produced under particularly mild reaction conditions by ionotropic gelation (Angew. Makromol. Chem. 166/167 [1989], 293-309). In this Immobilisierungsverfaliren hydrophilic support materials such as alginates, pectinates, carrageenans, chitosan or cellulose derivatives are treated in the presence of biocatalysts with crosslinking ionic compounds. The biocatalysts are enclosed in the forming network. This immobilization process is characterized by its simplicity and leads to easy-to-handle Immobilisaten with high functional stability. Especially in Ca-alginates and K-carrageenans, the most commonly used ionotropic networks, enclosed biocatalysts are characterized by a high biocatalytic activity. A disadvantage of these mentioned immobilization, however, is that the ionotropic gelation and the associated gel inclusion under certain conditions are a reversible process, for. When working in the presence of phosphate ions or sodium ions. As a result, this gentle and the biocatalytic activity of the biocatalysts largely obtained immobilization and the Immobilisate then produced can not be used extensively in biotechnological processes.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, biologisch aktive Verbindungen durch Geleinschluß nach einem Irreversiblen Verfahren zu immobilisieren. Es sollen Immobilisate in Membranform oder in Form sphärischer Partikel mit verbesserter Stabilität und Aktivität für den Einsatz in biotechnologischen Prozessen und der Analytik bereitgestellt werden.The object of the invention is to immobilize biologically active compounds by gel entrapment by an irreversible method. It is intended to provide immobilizates in membrane form or in the form of spherical particles with improved stability and activity for use in biotechnological processes and analytics.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen zu entwickeln, bei dem die biologisch aktiven Verbindungen in ein stabiles Gel eingeschlossen werden, so daß sie bei biotechnologischen Prozessen oder in analytischen Systemen nicht in das sie umgebende lösliche Medium eintreten, d. h. das Gelnetzwerk nicht verlassen können. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß Biomakromoleküle in einem wäßrigen Polymerengemisch, das gegebenenfalls zusätzlich noch Alkali- und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze gelöst oder suspendiert enthält, gleichmäßig verteilt werden. Danach werden aus diesen Gemischen Immobilisate in Form von Membranen oder sphärischenThe object of the invention is to develop a method for immobilizing biologically active compounds in which the biologically active compounds are enclosed in a stable gel, so that they do not enter the surrounding soluble medium in biotechnological processes or in analytical systems, i , H. can not leave the gel network. According to the invention, this is achieved by uniformly distributing biomacromolecules in an aqueous polymer mixture which optionally additionally contains dissolved or suspended alkali metal and / or alkaline earth metal salts and / or iron salts. Thereafter, from these mixtures Immobilisate in the form of membranes or spherical
Partikeln entweder durch Verdampfen der wäßrigen Lösungsmittel und/oder durch Behandlung der feuchten bzw. getrockneten Gemische mit einem Vernetzungsmittel zur Golbildung hergestellt. Gegebenenfalls werden die Immobilisate mit wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 1,0 bis 12,0 im Verlaufe von 15 Sekunden bis 12 Stunden bei O0C bis 70°C nachbehandelt. Nach der Erfindung werden zur Immobilisierung durch Geleinschluß als Biomakromoleküle bevorzugt Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, Zellen tierischer, pflanzlicher oder humaner Herkunft, Zellorganellen, Gewebe- und Organschnitte, synthetische Enzyme und makromolekulare Koenzyme eingesetzt. Es können mit Vorteil aber auch biokatalytisch inaktive Proteine, z. B. Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine oder in vitro hergestellte Konjugate aus den Biokatalysatoren und den biokatalytisch inaktiven Proteinen oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Peptide oder Pharmaka n?.ch dieser Methode immobilisiert werden. Die genannten Biomakromoleküle werden nach der Erfindung mit wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten, Lösungen von Polyvinylalkohol (PVA) und/oder Karboxymethylzellulose (CMZ) vermischt. Anstelle der zu den PVA/Biomakromolekül- bzw. CMZ/Biomakromolekül-Gemischen alternativ zumischbaren Makromoleküle CMZ bzw. PVA können aber auch andere, zur Gelbildung befähigte, hydrophile Makromoleküle zur Immobilisatbildung herangezogen werden, wie z. B. Dextrane, Agarose, Polyethylenglykole, Gelatine, Chitosan und seine Derivate, Carrageenan, weitere Cellulosen, Pektine oder Alginsäure. Für bestimmte Anwendungsfälle der erfindungsgemäßen Immobilisate in biotechnologischen Prozessen oder analytischen Systemen ist es darüber hinaus von Voiteil bzw. mitunter unumgänglich, daß den gelbildungsfähigen Makromolekül/ Biomakromolekül-Gemischen auch noch Alkali- und/oder Erdalkali- und/oder Eisensalze zugemischt werden. Als solche Salze kommen besonders Ammoniumsalze bzw. Alkali- oder Erdalkalikarbonate oder Chloride bzw. Sulfate des zwei- oder dreiwertigen Eisens bzw. Gemische von Alkali- und Erdalkalikarbonaten mit und ohne Eisensalze in Betracht, die auf Grund ihrer Löslichkeitseigenschaften in den Gemischen golöst oder suspendiert vorliegen können.Particles either by evaporation of the aqueous solvent and / or by treatment of the wet or dried mixtures with a crosslinking agent for Golbildung prepared. Optionally, the immobilizates with aqueous solutions of pH 1.0 to 12.0 in the course of 15 seconds to 12 hours at 0 0 C to 70 ° C post-treated. According to the invention, biocatalysts such as enzymes, microorganisms, cells of animal, plant or human origin, cell organelles, tissue and organ sections, synthetic enzymes and macromolecular coenzymes are preferably used for immobilization by gel inclusion as biomacromolecules. It may be advantageous but also biocatalytically inactive proteins, eg. As antigens, antibodies, growth factors, blood clotting factors, interferons, hemoproteins, albumins, sugar binding proteins or in vitro produced conjugates of biocatalysts and biocatalytically inactive proteins or high molecular weight effectors such as nucleic acids, peptides or drugs n. .Ch immobilized by this method. The said biomacromolecules are mixed according to the invention with aqueous, optionally buffered, solutions of polyvinyl alcohol (PVA) and / or carboxymethyl cellulose (CMZ). Instead of to the PVA / Biomakromolekül- or CMZ / Biomakromolekül mixtures alternatively immiscible macromolecules CMZ or PVA but also other capable of gelation, hydrophilic macromolecules can be used to Immobilisatbildung, such. As dextrans, agarose, polyethylene glycols, gelatin, chitosan and its derivatives, carrageenan, other celluloses, pectins or alginic acid. For certain applications of the immobilizates according to the invention in biotechnological processes or analytical systems, it is moreover inevitable from Voiteil or sometimes necessary that the gel-formable macromolecule / biomacromolecule mixtures also alkali and / or alkaline earth and / or iron salts are mixed. Particularly suitable salts of this type are ammonium salts or alkali metal or alkaline earth metal carbonates or chlorides or sulfates of dibasic or trivalent iron or mixtures of alkali metal and alkaline earth metal carbonates with and without iron salts, which are present in the mixtures as goleasts or suspended due to their solubility properties can.
Zur Herstellung der Immobilisate durch Gelbildung werden nach der Erfindung verschiedene Methoden angewandt. Die einfachste besteht darin, daß Immobilisate z. B. in Membranform durch Auftragen der vorgenannten Gemische auf ebene Flächen wie Glasplatten oder wasserunlösliche, polymere Stützmembranen in definierten, durch den Anwendungsfall vorbestimmten Mengen und anschließendem Verdampfen der Lösungsmittel bei O0C bis 70°C hergestellt werden. Diese neuartig zusammengesetzten, gelartigen Immobilisate in Membranform zeichnen sich durch verbesserte Eigenschaften aus. Überraschend wurde gefunden, daß die Immobilie. <)te aus den PVA/Biomakromolekül/CMZ-Gemischen wesentlich höhere biokatalytische Aktivitäten besitzen als Immobilisate aus PVA/Biomakromolekül- odor CMZ/Biomakromolekül-Gemischen allein. Daraus ergeben sich besonders verbesserte und günstige Einsatzmöglichkeiten als biokatalytisch aktive Membranen in analytischen Systemen wie den Biosensoren. Eine weitere Verbesserung der Eigenschaften der neuartigen Membranen, besonders der chemischen Stabilität, wird dadurch erreicht, daß die feuchten oder auch getrockneten Membranen aus den Gemischen noch nachträglich mit Vernetzungsmitteln behandelt werden. Als solche kommen bifunktionelle Reagentien wie Dialdehyde, diazotierte, aromatische Diamine, Diisocyanate, Diisothiocyanate, gleichzeitig Diisocyanat- und Diisothiocyanatgruppen enthaltende Verbindungen, bisaktivierte Derivate von Dikarbonsäuren wie Säurechloride, Säureazide und aktivierte Ester, Diepoxide, Chinone, Epihalogenhydrine, !Carbodiimide, 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine oder 2-substituierte, 4,6-Dihalogen-1,3,5-triazine in Frage, die besonders in organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden oder multivalente Kationen wie Ca2+, Zn2+, Mg2+, Al3+, Fe2+/3+ oder Karbon- bzw. Mineralsäuren, von letzteren besonders Borsäure und ihre Salze, die überwiegend in wäßrigen Lösungen eingesetzt werden.For the preparation of the immobilizate by gelation various methods are used according to the invention. The simplest is that Immobilisate z. B. in membrane form by applying the aforementioned mixtures on flat surfaces such as glass plates or water-insoluble, polymeric support membranes in defined, predetermined by the application of amounts and subsequent evaporation of the solvent at 0 0 C to 70 ° C are prepared. These novel composite, gel-like immobilizates in membrane form are characterized by improved properties. Surprisingly, it was found that the property. <) have from the PVA / Biomakromolekül / CMZ mixtures significantly higher biocatalytic activities than immobilizates of PVA / Biomakromolekül- odor CMZ / Biomakromolekül mixtures alone. This results in particularly improved and favorable application possibilities as biocatalytically active membranes in analytical systems such as biosensors. A further improvement of the properties of the novel membranes, especially the chemical stability, is achieved by the fact that the wet or dried membranes from the mixtures are treated later with crosslinking agents. As such, bifunctional reagents such as dialdehydes, diazotized, aromatic diamines, diisocyanates, diisothiocyanates, compounds containing diisocyanate and diisothiocyanate groups, bisactivated derivatives of dicarboxylic acids such as acid chlorides, acid azides and activated esters, diepoxides, quinones, epihalohydrins, carbodiimides, 2,4, 6-trihalo-1,3,5-triazines or 2-substituted, 4,6-dihalo-1,3,5-triazines in question, which are used especially in organic solvents or multivalent cations such as Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Al 3+ , Fe 2 + / 3 + or carbonic or mineral acids, of the latter especially boric acid and its salts, which are predominantly used in aqueous solutions.
Neben Immobilisaten in Membranform können nach der Erfindung aber auch sphärische Immobilisate hergestellt werden, indem die Makromolekül/Biomakromolekül-Gemische in wäßrige Lösungen oder organische Lösungsmittel oder Gemische beider Lösungsmittelarten, dis die Gelbildungsmittel in der Regel gelöst enthalten, eingetropft werden. Nach dem Abtrennen der Immobilisate von den Lösungsmitteln und dem Waschen zum Entfernen überschüssiger Gelbildungsmittel können die stabilen Immobilisate in biotechnologischen Prozessen, z. ß. zur Stoffwandlung, eingesetzt werden. Dazu empfiehlt es sich, für diesen speziellen Anwendungsfall in den meisten Fällen die Immobilisate, die gegebenenfalls Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze enthalten, mit wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 1,0 bis 12,0 15 Sekunden bis 12 Stunden bei 0°C bis 70°C nachzubehandeln. Im Falle des Einsatzes von Ammoniumsalzen und Eisensalzen arbeitet man dabei vorteilhafterweise bei pH-Werten größer 7,0 und im Falle der Verwendung von Alkali- und/oder Erdalkalikarbonaten bevorzugt bei pH-Werten kleiner als 7,0. Werden jedoch Eisensalze bei der Gemischherstellung verwendet, so wird die Nachbehandlung der Immobilisate bei pH-Werten vorzugsweise größer 9,0 vorgenommen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Immobilisate finden ein breites Arwendungsfeld, bevorzugt aber in stoffwandelnden Prozessen und in Membranform in analytischen Systemen wie den Biosensoren.In addition to immobilizates in membrane form but according to the invention also spherical immobilizates can be prepared by the macromolecule / Biomakromolekül mixtures in aqueous solutions or organic solvents or mixtures of both types of solvents, dis dissolved the gelling agent usually dissolved, are added dropwise. After separating the immobilizates from the solvents and washing to remove excess gelling agent, the stable immobilizates can be used in biotechnological processes, e.g. ß. for the transformation of materials. For this purpose, it is recommended for this particular application in most cases the immobilizates, optionally containing alkali metal salts and / or alkaline earth salts and / or iron salts, with aqueous solutions of pH 1.0 to 12.0 15 seconds to 12 hours at 0 ° C to be treated up to 70 ° C. In the case of the use of ammonium salts and iron salts, it is advantageous to work at pH values greater than 7.0, and in the case of the use of alkali metal and / or alkaline earth metal carbonates, preferably at pH values of less than 7.0. However, if iron salts are used in the preparation of the mixture, the aftertreatment of the immobilizates is preferably carried out at pH values greater than 9.0. The immobilizates prepared by the process according to the invention find a wide field of application, but preferably in material-converting processes and in membrane form in analytical systems such as the biosensors.
Im letzteren Fall werden die flächigen Immobilisate zwischen zwei wasserunlösliche, polymere Membranen plaziert und in dieser Sandwich-Form in Biosensorsystemen eingesetzt.In the latter case, the flat immobilizates are placed between two water-insoluble, polymeric membranes and used in this sandwich form in biosensor systems.
Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens beruhen darauf, daß hinreichend große Biomakromoleküle schonend und ohne großen Aktivitätsverlust immobilisiert werden können und daß die Immobilisate mechanisch stabil sind auch beim Arbeiten in Gegenwart von Phosphat- oder Natriumionen.The advantages of the method described are based on the fact that sufficiently large biomacromolecules can be immobilized gently and without much loss of activity and that the immobilizates are mechanically stable even when working in the presence of phosphate or sodium ions.
Durch das Verfahren bleiben die bekannten, stabilisierenden Effekte ionotroper Gele auf Biokatalysatoren z. B. erhalten - sie werden gemeinsam im Gelnetz bzw. zwischen den wasserunlöslichen, polymeren Membranen eingeschlossen -woraus sich erweiterte Einsatzmöglichkeiten ergeben, vor allem in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und analytischen Chemie. Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.By the method, the known stabilizing effects of ionotropic gels on biocatalysts remain z. B. are - they are included in the gel network or between the water-insoluble, polymeric membranes -woraus extended uses arise, especially in biotechnology, biochemistry, pharmacy and analytical chemistry. The invention will be further explained by examples.
Ausführung.'belsploleAusführung.'belsplole
Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 1%igen Lösung von Polyethylenglykol (MG 6000) werden miteinander vermischt, und zu diesem Polymerengemisch werden nach bekannten Methoden fermentierte und abzentrifugierte Zellen vom Mikroorganismus Trichosporon cutaneum mit einem Feuchtgewicht von 2 mg addiert.One milliliter of a 10% solution of polyvinyl alcohol and one milliliter of a 1% solution of polyethylene glycol (MW 6000) are mixed together, and to this polymer mixture fermented and centrifuged cells of the microorganism Trichosporon cutaneum are added to this polymer mixture with a wet weight of 2 mg ,
Polymeren-Mikroorganismen-Gemisches werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen und bei 20°C bis 25°C getrocknet. Zur Herstellung eines mikrowellen Biosensors zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs wird die Membran vor eine Sauerstoffelektrode gespannt, der Sensor in eine Meßlösung eingetaucht und der Sauerstoffverbrauch nach Substratzugabe zur Meßlösung gemessen.Polymer-microorganism mixtures are applied to a gas-permeable polymer membrane and dried at 20 ° C to 25 ° C. To produce a microwave biosensor for determining the biological oxygen demand, the membrane is stretched in front of an oxygen electrode, the sensor immersed in a measurement solution and the oxygen consumption after substrate addition to the measurement solution measured.
Entsprechend Beispiel 1, anstelle von Polyethylenglykol wird aber Monomethoxypolyethylenglykol (MG 5000) eingesetzt, wird eine mikrobielle Membran aus 4mg von einer Fermentationslösung abzentrifugierte Zellen vom Mikroorganismus Bacillus subtilüs hergestellt. Diese Membran kann ebenfalls in einem mikrowellen Biosensor zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs von Meßproben eingesetzt werden.Monomethoxypolyethylene glycol (MW 5000) is used instead of polyethylene glycol, but a microbial membrane of 4 mg of cells centrifuged off from a fermentation solution is prepared by the microorganism Bacillus subtilus. This membrane can also be used in a microwave biosensor to determine the biological oxygen demand of samples.
10mg Calciumkarbonat und danach 4mg feuchte Zellen vom MikroorganismusTrichosporoncutaneum addiert. Dieses Gemischwird gut durchmischt, und 10μΙ davon werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen. Das Polymeren-10 mg calcium carbonate and then 4 mg wet cells from the microorganism Trichosporoncutaneum added. This mixture is well mixed and 10μΙ of it is applied to a gas-permeable polymer membrane. The polymer
0,1 molaren Aluminiumchloridlösung vom pH-Wert 4,0 30 Sekunden eingetaucht. Membranen dieser Art werden in mikrobiellen0.1 molar aluminum chloride solution of pH 4.0 4.0 immersed for 30 seconds. Membranes of this type are found in microbial
Zu einem nach Beispiel 3 hergestellten Polymerengemisch aus Polyvinylalkohol und Karboxymethylzellulose werden zuerst 25mg Ammoniumchlorid addiert, und der pH-Wert des Gemisches wird auf 7,0 eingestellt. Dazu werden 4mg feuchte Zellen vom Mikroorganismus Bacillus subtillis addiert. Dieses Gemisch wird zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen gut durchmischt, und 10 μΙ davon werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen. Das Polymeren-Mikroorganismen-Gemisch wird bei Umgebungstemperatur getrocknet, und die Membran wird anschließend in einer 0,1 molaren Borsäurelösung vom pH-Wert7,5 1 Minute eingetaucht. Diese Membran ist als mikrobielle Membran in Biosensoren zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs geeignet.To a polymer mixture of polyvinyl alcohol and carboxymethyl cellulose prepared according to Example 3 are first added 25 mg of ammonium chloride, and the pH of the mixture is adjusted to 7.0. 4mg wet cells are added by the microorganism Bacillus subtillis. This mixture is well mixed for uniform distribution of the cells, and 10 μΙ of which are applied to a gas-permeable polymer membrane. The polymer-microorganism mixture is dried at ambient temperature, and the membrane is then immersed in 0.1 molar boric acid solution of pH 7.5 for 1 minute. This membrane is suitable as a microbial membrane in biosensors for determining the biological oxygen demand.
Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und 2ml einer 5%igen Lösung von Polyethylenglykol (MG6000) werden zusammen mit 25mg Glukoseoxidase (aus Penicillium notatum mit einer Aktivität von 43U/mg Einv/aage) und 20mg CaCO3 vermischt. Das Gemisch wird auf einer Glasplatte (2cm χ 10cm) gleichmäßig verteilt und bei Umgebungstemperatur getrocknet. Die Glasplatte mit der Glukoseoxidasemembran wird anschließend 2 Minuten In eine 0,1 molare Borsäurelösung vom pH-Wert 5,0 und danach 3 Stunden in einen Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 eingetaucht. Ein Teil dieser Membran, fixiert vor einer Sauerstoff elektrode, kann zur Bestimmung von Glukose in Meßproben mit einer Enzymelektrode verwendet werden.One milliliter of a 10% solution of polyvinyl alcohol and 2 ml of a 5% solution of polyethylene glycol (MG6000), together with 25mg glucose oxidase (from Penicillium notatum with an activity of 43U / mg E inv / Aage) and 20mg of CaCO 3 is mixed. The mixture is evenly distributed on a glass plate (2 cm × 10 cm) and dried at ambient temperature. The glass plate with the glucose oxidase membrane is then immersed for 2 minutes in a 0.1 molar boric acid solution of pH 5.0 and then in an acetate buffer of pH 5.0 for 3 hours. A part of this membrane, fixed in front of an oxygen electrode, can be used for the determination of glucose in test samples with an enzyme electrode.
Beispiel βExample β
Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Chitosan (in 1%iger Ameisensäurelösung) werden miteinander gemischt. Der pH-Wert der Polymerenlösung wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Zur Polymerenlösung werden 50mg Urease (Aktivität: 5U/mg Einwaage) und 25mg Ammoniumchlorid addiert und darin gleichmäßig verteilt. In die Polymeren-Urease-Lösung wird die pH-sensitive Fläche einer pH-Einstabelektrode eingetaucht. Unter Drehen der pH-Elektrode wird das Lösungsmittel verdampft bei Umgebungstemperatur. Die pH-Elektrode wird anschließend in eine 5%ige Glutaraldehydlösung vom pH-Wert8,0 2 Minuten und danach 5 Stunden in einen Boratpuffer vom pH-Wert8,0 eingetaucht. Die so modifizierte pH-Elektrode wird als Enzymelektrode zur Bestimmung von Harnstoff in Meßproben verwendet.One milliliter of a 10% solution of polyvinyl alcohol and one milliliter of a 2% solution of chitosan (in 1% formic acid solution) are mixed together. The pH of the polymer solution is adjusted to 7.0 with dilute sodium hydroxide solution. To the polymer solution, 50 mg urease (activity: 5 U / mg initial weight) and 25 mg ammonium chloride are added and evenly distributed therein. In the polymer urease solution, the pH-sensitive surface of a pH-adjusting electrode is immersed. By rotating the pH electrode, the solvent is evaporated at ambient temperature. The pH electrode is then immersed in a 5% glutaraldehyde solution of pH 8.0 for 2 minutes and then 5 hours in a borate buffer of pH 8.0. The thus modified pH electrode is used as an enzyme electrode for the determination of urea in test samples.
Ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Karboxymethylzellulose und 1 ml einer4%igen Lösung von Alginsäure mit einem pH-Wert von 6,0 werden zusammen miat 25mg Glukoseoxidase und 15mg Katalase vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25ml einer 0,1 molaren Lösung von essigsaurer Tonerde vom pH-Wert4,3 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt und mit 500 Milliliter destilliertem Wasser gewaschen. Dieses Immobilisat wird zur Herstellung von Glukonsäure aus Glukose eingesetzt.One milliliter of a 2% solution of carboxymethylcellulose and 1 ml of a 4% solution of 6.0 g of alginic acid are mixed together with 25 mg of glucose oxidase and 15 mg of catalase. This mixture is added dropwise with stirring in 25 ml of a 0.1 molar solution of pH 3.5 acid clay. After stirring for 5 minutes, the spherical particles are separated and washed with 500 milliliters of distilled water. This immobilizate is used to produce gluconic acid from glucose.
Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Carrageenan werden zusammen mit 25 Milligramm Penicillinacylase und 15mg Ammoniumchlorid vermischt. Dieses Gemisch v/ird unter Rühren in 25ml einerO,1 molaren Lösung von Borsäure mit einem pH-Wert9,0 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, in eine wäßrige Lösung vom pH-Wert9,0 bis 10,0 eingetragen, und diese Suspension wird 3 bis 4 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Spaltung von Penicillin G in 6-Aminopenicillin und Phenylessigsäure verwendet werden.One milliliter of a 10% solution of polyvinyl alcohol and one milliliter of a 2% solution of carrageenan are mixed together with 25 milligrams of penicillin acylase and 15 mg of ammonium chloride. This mixture is added dropwise with stirring to 25 ml of an O, 1 molar solution of pH9.0 boric acid. After stirring for 5 minutes, the spherical particles are separated, introduced into an aqueous solution of pH 9.0 to 10.0, and this suspension is stirred for 3 to 4 hours. The immobilizate is separated from the solution, washed with distilled water and can be used to cleave penicillin G in 6-aminopenicillin and phenylacetic acid.
Zwei Milliliter einer 3%igen Lösung von Karboxymethylzellulose und 1 ml einer 2%igen Lösung von Dextran in destilliertem Wasser werden zusammen mit 50mg Chymotrypsin und 15mg Calciumkarbonat vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25 ml einer 0,1 molaren Lösung von essigsaurer Tonerde vom pH-Wert 3,0 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen, in eine wäßrige Lösung vom pH-Wert 3,0 eingetragen, und die resultierende Suspension wird 4-5 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, wieder mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Esterspaltung bzw. Amidbildung in organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden.Two milliliters of a 3% solution of carboxymethylcellulose and 1 ml of a 2% solution of dextran in distilled water are mixed together with 50 mg of chymotrypsin and 15 mg of calcium carbonate. This mixture is added dropwise with stirring in 25 ml of a 0.1 molar solution of acetic acid clay of pH 3.0. After stirring for 5 minutes, the spherical particles are separated, washed with distilled water, introduced into an aqueous solution of pH 3.0, and the resulting suspension is stirred for 4-5 hours. The immobilizate is separated from the solution, washed again with distilled water and can be used for ester cleavage or amide formation in organic solvents.
Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und 1 ml einer 10%igen Lösung von Dextran in destilliertem Wasser werden zusammen mit 25mg Penlcilllnacylase, 1,0g EisendD-sulfat und 0,5g Ammoniumchlorid vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25ml einer 0,1 molaren Natriumboratlösung vorn pH-Wert9,0 eingetragen. Nach 3 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, in 50ml einer 3%igen Ammoniaklösung eingetragen, und die Suspension wird 5 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Spaltung von Penicillin G in 6-Aminepenicillin und Phenylessigsäure eingesetzt werden.One milliliter of a 10% solution of polyvinyl alcohol and 1 ml of a 10% solution of dextran in distilled water are mixed together with 25 mg of penicillin acylase, 1.0 g of iron end-sulfate and 0.5 g of ammonium chloride. This mixture is added with stirring in 25 ml of a 0.1 molar sodium borate solution of pH 9.0. After stirring for 3 minutes, the spherical particles are separated, introduced into 50 ml of a 3% ammonia solution, and the suspension is stirred for 5 hours. The immobilizate is separated from the solution, washed with distilled water and can be used for the cleavage of penicillin G in 6-aminespenicillin and phenylacetic acid.
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