DE2713861A1 - Verfahren zur immobilisierung von glukoseisomerase - Google Patents
Verfahren zur immobilisierung von glukoseisomeraseInfo
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Description
MÜLLER-BORE · DETJFFI. · J=CHON · 'lE'iTEL
PATE NTANWALTE
OR. WOLFGANG MÜLLER-BORS (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL OEUFEL. DIPL.-CHEM.
OR. ALFREO SCHÖN. OIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-PHYS.
S/be - C 2996
CPC International Inc.,
International Plaza, Englewood Cliffs,
New Jersey O7632 / USA
New Jersey O7632 / USA
Verfahren zur Immobilisierung von
Glukoseisomerase
Glukoseisomerase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung
von Glukoseisomerase sowie ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose. Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Gewinnung einer immobilisierten Glukoseisomerase, die sich für einen Einsatz zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose oder zu einer Produktion in industriellem Maßstabe eignet. Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose unter Einsatz der erwähnten immobilisierten Glukoseisomerase, die leicht zu
handhaben ist, geschaffen.
von Glukoseisomerase sowie ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose. Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Gewinnung einer immobilisierten Glukoseisomerase, die sich für einen Einsatz zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose oder zu einer Produktion in industriellem Maßstabe eignet. Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose unter Einsatz der erwähnten immobilisierten Glukoseisomerase, die leicht zu
handhaben ist, geschaffen.
Glukose j ί.·.ο!η·-;Γό.5Γ? vnirü-:· :\1.c F ve'.Vi'!. t von T-iiki ooeganisman entdeckt.
Die industrielle Erzeugung von Glukoseisomerase ist
709841/0813
MÜXCnlN 8« · SIEBEllTSTH. * · POSTFAOH 860720 · KABEL: IfUEBOPAT · TEL·. (089) 47 4003 · TELEX 0-24
• ν.
insbesondere in den vergangenen Jahren sprunghaft angestiegen. Glukoseisomerase ist die allgemeine Bezeichnung für die Enzymklasse,
welche Glukose (Dextrose) in Fruktose (Lävulose) umwandelt. Glukoseisomerase wird hauptsächlich für die Herstellung
von Lävulose-enthaltendem Sirup (LB-Sirup) aus Glukose in industriellem Maßstabe verwendet.
Derzeit wird die industrielle Erzeugung von LB-Sirup in der Weise durchgeführt, daß Glukose in Kontakt mit Mikrobenzellen,
welche Glukoseisomerase enthalten, bei einer Temperatur zwischen ungefähr 60° und 70° C während einer Zeitspanne von
ungefähr 2 bis 3 Tagen gehalten wird. Setzt man jedoch ein Chargensystem ein, dann hat diese herkömmliche Methode den
Nachteil, daß der Wirkungsgrad beim Einsatz des Enzyms niedrig ist. Ein anderer Nachteil besteht darin, daß die Produktreinigungskosten
sehr hoch sind, da es sich während der Reaktion, die bei hohen Temperaturen während einer langen
Zeitspanne durchgeführt wird, verfärbt. Ferner erfordert diesa Methode eine aufwändige Anlage, beispielsweise einen
großen Tank zur Durchführung der Reaktion. Um diese Probleme, die bei der Durchführung der herkömmlichen Methode auftreten,
zu lösen, wurde viel Forschungsaufwand betrieben, wobei sich die Bemühungen meistens auf die Herstellung einer immobilisierten
Glukoseisomerase richteten.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Methoden zur Immobilisierung von Glukoseisomerase entwickelt. Diese Methoden
lassen sich grob in die folgenden Gruppen einteilen:
1. Glukoseisomerase wird mit wasserunlöslichen Trägern vereinigt oder, an einem Träger adsorbiert. Beispielsweise
sei die Methode erwähnt, gemäß welcher Glukoseisomerase an einem organischen Polymeren adsorbiert wird, das aus
einem Polyphenol besteht (JA-PS 49-80160). Es gibt ferner eine Methode, bei deren Durchführung Glukoseisomerase
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an porösem Aluminiumoxyd adsorbiert wird (JA-PS 49-110889), eine Methode, bei deren Durchführung Glukoseisomerase an
einem Anionen-Austauschharz adsorbiert wird (US-PS 3 788 945)
oder die Methode, gemäß welcher Glukoseisomerase an DEAE-Zellulose adsorbiert wird (US-PS 3 708 397).
2. Glukoseisomerase wird mit Verbindungen mit mehr als zwei
funktioneilen Gruppen überbrückt. Beispielsweise sei die Methode erwähnt, gemäß welcher eine Glutaraldehyd-Behandlung
von Mikrobenzellen durchgeführt wird, welche Glukoseisomerase enthalten (JA-PS 48-1181), ferner eine Methode,
bei deren Durchführung Glukoseisomerase an kolloidalen Teilchen adsorbiert wird, worauf sich eine Behandlung mit
Glutaraldehyd anschließt (US-PS 3 796 634).
3. Glukoseisomerase wird in einem Gelgitter oder in einer semipermeablen Membran fixiert. Dabei sei beispielsweise
die Methode erwähnt, gemäß welcher Glukoseisomerase durch GeIatinisierung durch Bestrahlung mit radioaktiven Ionenstrahlen
einer Mischung aus Glukoseisomerase und einem Akrylamidmonomeren fixiert wird (JA-PS 49-81585). Die gemäß
der Gruppe 1 eingesetzte DEAE-Zellulose ist jedoch als
Träger zu teuer, um zur Durchführung einer kontinuierlichen Isomerisierung von Glukose in industriellem Maßstabe eingesetzt
werden zu können. Andererseits besitzt die nach den Methoden der Gruppen 2 und 3 hergestellte immobilisierte
Glukoseisomerase schlechte Fließeigenschaften, wenn sie in eine Säule eingefüllt wird. Auch eine immobilisierte
Glukoseisomerase, die nach den in der JA-PS S 48(1973) -1181 sowie unter (3) beschriebenen Methoden hergestellt
worden ist, zeigt schlechte Fließeigenschaften, wenn sie in eine
Säule eingefüllt ist. Die Anwendung der Methode gemäß der US-PS 3 796 634 gemäß (2) liefert einen Träger, der schwierig
in eine Säule einzufüllen ist. Ist das Einfüllen in eine Säule gelungen, dann sind die Fließeigenschaften
ebenfalls sehr schlecht. Daher ist es schwierig, einen kon-
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-4-
stanten Fluß während einer langen Zeitspanne aufrecht zu erhalten.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, eine immobilisierte Glukoseisomerase zu entwickeln, die gute
Fließeigenschaften in einer Säule besitzt und billig hergestellt werden kann. Eine Koagulierung, Gelierung
sowie Verfestigung von kolloidaler Kieselerde durch Einfrieren, Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, Zugabe eines Salzes
oder Oxydation sind bekannt (vergleiche beispielsweise den Lucox-Katalog von Du Pont). Es wurde gefunden, daß die
gestellte Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß kolloidale Kieselerde als Träger für die Glukoseisomerase eingesetzt
wird. Auf dieser Erkenntnis basiert die Erfindung.
Die Erfindung besteht daher aus folgenden Merkmalen:
1. Einem Verfahren zur Immobilisierung von Glukoseisomerase, welches darin besteht, eine Glukoseisomerase an einer kolloidalen
Kieselerde durch Kontaktieren dieses Enzyms mit dieser kolloidalen Kieselerde zu adsorbieren und anschließend
eine Verfestigung der Kieselerde, an welcher Glukoseisomerase adsorbiert ist, durch Einfrieren entweder in der
vorliegenden Form oder nach einer Geiatinisierung durchzuführen.
2. Einem Verfahren zur Immobilisierung von Glukose, welches darin besteht, kontinuierlich eine Glukose enthaltende Lösung
mit der immobilisierten Glukoseisomerase gemäß (1) zur Isomerisierung der Lösung zu kontaktieren.
Die erfindungsgemäß einzusetzende kolloidale Kieselerde kann aus allen kolloidalen Kieselerden bestehen. Erwähnt
seien beispielsweise (1) das Kolloid einer Kieselerde, das durch Suspendieren von super-feinen Teilchen von wasserfreier Kieselerde in Wasser erhalten worden ist, oder (2)
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•V
das Kolloid, bei welchem die H+-Ionen der OH-Ionen auf der
Oberfläche der Teilchen durch ein Kation, wie Na+, K+ oder
NHt, ersetzt worden sind. Beispielsweise kommen die Materialien LUDOX HS-30, LUDOX HS-40, LUDOX AM sowie LUDOX TM
(jeweils Warenzeichen für von Du Pont, USA, erzeugte Produkte) sowie SNOWTEX 20, SNOWTEX 30 und SNOWTEX N (jeweils
Warenzeichen der Nissan Chemical Co., Japan) infrage. Die sich auf dem Markt befindlichen kolloidalen Kieselerden
besitzen eine Teilchengröße zwischen ungefähr 10 und 30 mη
im Durchmesser. Erfindungsgemäß kann jedoch eine kolloidale Kieselerde in jeder Form eingesetzt werden, und zwar unabhängig
von der Teilchengröße. Ferner kann jede verfügbare Glukoseisomerase-Enzymzubereitung erfindungsgemäß eingesetzt
werden.
Beispiele für derartige Glukoseisomerasen, die sich erfindungsgemäß
eignen, sind mikrobielle Glukoseisomerasen, die auf die Zellen von Strahlenpilzen (wie Streptomyces olivochromogenes)
oder Bakterien (wie Lactobacillus brevis),die als Glukoseisomerase—erzeugende Mikroorganismen bekannt
sind, zurückgehen. DiesesEnzym kann in drei verschiedenen Formen eingesetzt werden, und zwar (1) in Form einer hohen
Glukoseisomerase, die aus den Zellen von Glukoseisomeraseerzeugenden
Mikroorganismen entweder durch Autolyse oder Ultraschall-Behandlung extrahiert und von den Zelltrümmern
abgetrennt wird, (2) in Form einer teilweise gereinigten Glukoseisomerase, die mit Protamin zum Ausfällen der Nucleinsäuren
behandelt worden ist, und (3) in Form einer kristallinen Glukoseisomerase, die durch Kristallisation aus einer
teilweise gereinigten Glukoseisomerase nach einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat erhalten worden ist. Eine Einheit
der Enzymaktivität wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 mM Fruktose in einer Minute erzeugt, wenn eine Bebrütung
mit einer 0,1 m-Glukoselösung in Gegenwart von 0,01m
MgCl2 und 0,001 m CoCl2 durchgeführt wird (CPC-Einheit).
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Das Verfahren zur Durchführung der Adsorption von Glucoseisomerase
an der kolloidalen Kieselerde wird wie folgt durchgeführt.
Die Glukoseisomerase wird in Lösungsform nach einer entsprechenden
Verdünnung mit Wasser oder einer entsprechenden Salzlösung (wie 0,001 m MgCl2 oder MgSO4), vorzugsweise
mit bis zu ungefähr 10 bis 30 Gew.-%, verwendet.
ί Wird Glukoseisomerase an kolloidaler Kieselerde adsorbiert,
dann wird eine entsprechende Menge Glukoseisomerase der kolloidalen Kieselerde zugesetzt, worauf die Mischung während
einer entsprechenden Zeitspanne mit einer entsprechenden Geschwindigkeit gerührt wird. Beispielsweise wird Glukoseisomerase
(auf Trockenbasis) in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 1/3 bis 1 zu der kolloidalen Kieselerde
eingesetzt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von ungefähr 10 bis 20 Minuten bei 10 bis 100 Upm gerührt.
Während des Rührens wird der pH-Wert der Mischung aus kolloidaler Kieselerde und Enzym auf einen Bereich von ungefähr
5 bis 9 (vorzugsweise 6 bis 8) mit einer entsprechenden Säure oder einem Alkali eingestellt. Vorzugsweise wird
jedoch In HCl oder 1 η NaOH verwendet. Mehr als 90% der eingesetzten Glukoseisomerase werden an der Oberfläche der
Teilchen aus der kolloidalen Kieselerde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren adsorbiert.
Es ist darüber hinaus zweckmäßiger, ein bifunktionelles Reagens, wie Glutaraldehyd, der Mischung aus kolloidaler
Kieselerde und Glukoseisomerase nach Beendigung der Adsorptionsreaktion zuzusetzen. Beispielsweise wird Glutaraldehyd
(als trockener Feststoff) der Mischung in einer Menge von ungefähr 1/10 - 1/5 des Gewichts der Glukoseisomerase (als
trockener Feststoff) in der Mischung zugesetzt, worauf sich ein Rühren während einer ausreichenden Zeitspanne (ungefähr
30 bis 60 Minuten bei Zimmertemperatur) anschließt. Das
Adsorptionsverhältnis von Glukoseisomerase an der kolloida-
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len Kieselerde wird bei Durchführung dieser Stufe höher
im Vergleich zu dem Fall·, daß kein bifunktionelles Reagens zugesetzt wird. Die Zugabe eines bifunktionellen Reagenses
zu der Mischung ist jedoch keine wesentliche Stufe.
Anschließend wird die kolloidale Kieselerde mit daran adsorbierter
Glukoseisomerase eingefroren, um sie zu verfestigen. Die kolloidale Kieselerde kann als solche oder
nach einer geeigneten Gelatinisierung eingefroren werden.
Um die kolloidale Kieselerde mit daran adsorbierter Glukoseisomerase
zu gelatinisieren, wird eine geeignete Menge eines geeigneten Salzes, beispielsweise MgC^, MgSO4,
NaCl oder KCl (vorzugsweise MgCIg) der kolloidalen Kieselerde
zugesetzt, beispielsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 2 m (vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 0,3 m). Die
Mischung wird langsam während einer bestimmten Zeitspanne, beispielsweise ungefähr 10 bis 30 Minuten, bei Zimmertemperatur
gerührt. Die kolloidale Kieselerde mit daran adsorbierter Glukoseisomerase oder das gemäß der vorstehend beschriebenen
Methode gelatinisierte Produkt wird in einer Gefrierkammer bei ungefähr -10° bis -300C während einer
bestimmten Zeitspanne, beispielsweise ungefähr 20 bis 40 Stunden, eingefroren, wobei man auch so verfahren kann,
daß man ein Einfrieren und Auftauen während einer Zeitspanne von ungefähr 20 bis 30 Stunden in entsprechenden Intervallen
von beispielsweise ungefähr jeweils 5 Stunden wiederholt. Man kann auch während einer bestimmten Zeitspanne,
beispielsweise 20 bis 40 Stunden, unter Rühren einfrieren.
Das gefrorene Produkt läßt sich leicht durch einfaches Stehenlassen bei Zimmertemperatur auftauen.
Durch dieses Auftauverfahrcn erhalt man eine Mischung aus
fester Kieselerde mit daran fixierter Glukoseisomerase sowie eine flüssige Fraktion. Die adsorbierte Glukose-
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isomerase läßt sich leicht aus der Mischung nach einer geeigneten Methode, beispielsweise durch Filtration,
isolieren. Die auf diese Weise hergestellte fixierte GIukoseisomerase
liegt in Form von halb transparenten Kügelchen oder Flocken mit einer Größe von 20 bis 100 mesh vor
und enthält ungefähr 30 bis 50% Feuchtigkeit. Sie ist nicht mehr in Wasser oder einer Salzlösung löslich, ihre enzymatischen
Eigenschaften sind jedoch praktisch die gleichen wie diejenigen der nicht behandelten Glukoseisomerase. Es
wird keine merkliche Abnahme der Enzymaktivität sogar nach einer 6 Monate dauernden Lagerung in einem Kühlschrank bei
einer Temperatur von 5 C festgestellt.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Fixierungsmethode von Glukoseisomerase sind die folgenden:
Es erfolgt keine Abnahme der Enzymaktivitäf während des
Fixierungsverfahrens, es liegt eine sehr starke Bindung
des Enzyms vor, das Verfahren ist einfach und billig. Daher bedeutet das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr wirksame
Methode zur Glukoseisomerase-Fixierung.
Die Isomerisierung von Glukose unter Einsatz der auf diese Weise hergestellten immobilisierten Isomerase wird wie folgt
durchgeführt:
Die Glukose enthaltende Lösung, die zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird, kann entweder aus einem Stärkesaccharisat mit einem DA von 90 bis 99
(DA: Dextrose Äquivalent, Prozentsatz an reduzierenden Zuckern, angegeben als Dextrose, gegenüber der Gesamtmenge
an Frischstoff), einem raffinierten Stärkesaccharisat, das durch Reinigen, beispielsweise an einem Ionenaustauschharz,
einer Dextroselösung, die durch Auflösen eines Gesamtzuckers oder von kristalliner Dextrose hergestellt worden ist, er-
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zeugt worden ist, oder einem Hydrol, das während der Dextroseerzeugung
gewonnen wird, bestehen. Diese Glukose enthaltenden Lösungen werden entweder konzentriert oder verdünnt,
um sie auf einen Gehalt von 20 bis 60% (trockene Feststoffe),
vorzugsweise etwa 50%, einzustellen. Der pH-Wert wird ebenfalls auf ungefähr 7 bis 9 und vorzugsweise ungefähr 7,5 bis
8,5 mit einem Alkali, beispielsweise NaOH oder KOH, eingestellt· Vor der Isomerisierung können ungefähr 1 bis 10 mM
eines geeigneten Glukoseisomerase-Aktivators, vorzugsweise
MgCIp, zugesetzt werden. Ein Chelierungsmittel, beispielsweise
EDTA, kann der Lösung zur Entfernung von Isoraerisierungsinhibitoren,
wie Zn++ etc., zugesetzt werden.
Die fixierte Glukoseisomerase, die nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren hergestellt worden ist, wird gegebenenfalls nach einem Sieben in eine Säule eingegossen. Dann wird
die Säule entweder mit Wasser, einer verdünnten Salzlösung, beispielsweise MgClg-Lösung, oder einer Glukose enthaltenden
Lösung gefüllt und bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise ungefähr 60 bis 70° C, gehalten. Eine kontinuierliche
Isomerisierung wird in der VJeise durchgeführt, daß durch die Säule eine Glukose enthaltende Lösung geschickt wird, die
nach der vorstehend beschriebenen Methode hergestellt worden ist. Die Fließgeschwindigkeit sollte einem SV-Wert von
ungefähr 1 bis 10 entsprechen (SV: Raumgeschwindigkeit, welche die stündliche Menge der Lösung angibt, die durch
die Säule unter Berücksichtigung des Ausmaßes des Bettvolumens der Säule fließt). Vorzugsweise sollte der SV-Wert
ungefähr 2 bis 5 betragen. Entweder ein aufsteigendes oder
absteigendes Fließen ist möglich.
Da die Glukoseisomerase an Körnern fixiert ist, kann die Glukose enthaltende Lösung gleichmäßig durch die Säule
fließen. Dies bedeutet, daß sich die Fließgeschwindigkeit leicht zur Erzielung jeder gegebenen Xsomerisationsge-
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schwindigkeit einstellen läßt. Infolge der kontinuierlichen Isomerisierungsreaktion ist die Reaktionsperiode sehr kurz.
Folglich lassen sich der pH-Wert der Lösung sowie die Reaktionstemperatur leicht auf optimale Werte bezüglich der
Glukoseisomerase einstellen.
Eine Einstellung des pH-Wertes der Glukose enthaltenden Lösung auf ungefähr 7,5 bis 8,5 ist im Hinblick auf eine Erhöhung
der Enzymstabilität während der Isomerisierung unter Einsatz der fixierten Isomerase zweckmäßig.
Die erforderliche Menge an Glukoseisomerase beträgt ungefähr 0,2 bis 0,4 Einheiten für die Isomerisierung von Ig Glukose
(auf Trockenbasis) zu einem zu 45% isomerisierten Zucker unter Anwendung des kontinuierlichen Verfahrens, bis die
Halbwertszeit der Enzymaktivität erreicht ist (vergleiche die nachfolgenden Ausführungen). Das herkömmliche Chargenverfahren
erfordert ungefähr 2 Einheiten Glukoseisomerase zur Erzielung des gleichen Isomerisationsgrades. Bei der
Durchführung des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahrens
bedeutet die Halbwertszeit der Enzymaktivität die Länge der Zeit (Tage) von Beginn bis zu dem
Punkt, an welchem der Fruktosegehalt des Ablaufes die Hälfte des Gehaltes in dem anfänglichen Ablauf beträgt.
Wie vorstehend erwähnt, erfordert dieses kontinuierliche Isomerisierungsverfahren nur 1/5 bis 1/10 der Glukoseisomerase,
die bei der Durchführung des chargeweise betriebenen Verfahrens zur Erzielung des gleichen Isomerisationsgrades
erforderlich ist. Infolge der schnellen Isomerisierungsreaktion sowie infolge der Tatsache, daß praktisch
keine Salzbildung während der Isomerisierung erfolgt, besitzt das erfindungsgemäße Produkt nur eine schwache Färbung,
wodurch sich die Reinigung des Produktes sehr vereinfachen läßt. Es ist nur eine Entsalzung des erfindungsgemäß
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hergestellten Produktes an einem Ionenaustauscherharz erforderlich,
während die bei der Durchführung der herkömmlichen Chargenverfahren erhaltenen Produkte einer Reinigung unter
Einsatz mehrerer IER Säulen sowie einer zusätzlichen Entfärbung mit Aktivkohle bedürfen. Darüber hinaus erfordert das
Chargenverfahren einen großen Reaktionstank sowie komplizierte Reinigungsanlagen, während zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens nur einige Säulen erforderlich sind· '
Wie vorstehend erwähnt wurde, spart man bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Isomerase sowie Investitionskosten
für die zu seiner Durchführung eingesetzten Anlagen ein, so daß sich die Herstellungskosten wesentlich
senken lassen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
100 ml einer im Handel erhältlichen kolloidalen Kieselerde, und zwar LUDOX HS-30 (erzeugt von Du Pont Co., USA) werden
in einen Becher mit einem Fassungsvermögen von 300 ml eingefüllt und mit 160 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Der pH-Wert
dieser Lösung wird dann auf 7,0 unter Einsatz von In HCl eingestellt. Danach v/erden 35 ml einer Enzymlösung,
die 41500 Einheiten Glukoseisomerase enthält, der Lösung zugesetzt. Die Enzymlösung wird aus Zellen von Streptomyces
olivochromogenes, die in einer Flüssigkeit während einer Zeitspanne von 50 Stunden gezüchtet worden sind, durch Digerierung
mit Lysozym und teilweise Reinigung unter Einsatz von Isopropylalkohol hergestellt. Anschließend wird die
Mischung langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 15 Minuten gerührt. Danach werden 2 ml einer
25%igon im Handel f»rb'ilM.ic'icii GlutaraÜdehydlösung (erzeugt
von der Tokyo Kasei Kogyo Co.)der erhaltenden Lösung zuge-
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setzt. Die Lösung wird anschließend bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne Von 60 Minuten langsam gerührt.
Dann werden 15 g MgCIp · 6HpO der Lösung zugesetzt. Die
Lösung wird langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung in
einen Gefrierschrank gestellt, der auf einer Temperatur von -20° C gehalten wird. Nach 12 Stunden wird die gefrorene
Mischung aus dem Gefrierschrank entnommen und bei Zimmertemperatur gerührt. Die Mischung trennt sich in dem Becher
in zwei Teile, und zwar in eine feste Phase und eine flüssige Phase. Die Mischung wird dann wiederum während einer Zeitspanne
von 12 Stunden in den Gefrierschrank gestellt. Dann wird die Mischung wiederum bei Zimmertemperatur gerührt,
wobei sich wiederum die Mischung in zwei Teile trennt, und zwar in die feste Phase und die flüssige Phase. Die flüssige
Phase wird von der Mischung durch Dekantieren entfernt. Man erhält 50 g eines festen Materials. Das feste Material, das
immobilisierte Glukoseisomerase enthält, weist 790 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität pro Gramm des festen Materials
in der vorliegenden Form auf.
100 ml einer im Handel erhältlichen kolloidalen Kieselerde, und zwar LUDOX HS-30 (erzeugt von der Du Pont Co., USA)
werden in einen Becher mit einem Fassungsvermögen von 300 ml eingefüllt und mit 160 ml entionisiertem Wasser verdünnt.
Der pH-Wert dieser Lösung wird dann auf 7,0 unter Verwendung von 1 η HCl eingestellt. Danach werden 35 ml einer Enzymlösung,
die 41500 Einheiten Glukoseisomerase enthält, der Lösung zugesetzt. Die Enzymlösung wird nach der in Beispiel I
beschriebenen Methode hergestellt. Anschließend wird die Mischung langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne
von 30 Minuten gerührt. Danach werden 15 g MgCl_ . 6HpO der erhaltene;! Losung zugesetzt. Die Lösung wird dann
2 urmier temperatur während rlner Ze Lt spanne von
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ORIGINAL INSPECTED
30 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung in einen Gefrierschrank
mit einer Temperatur von -20° C gestellt. Nach 12 Stunden wird die gefrorene Mischung aus dem Gefrierschrank
entnommen und bei Zimmertemperatur gerührt. Die Mischung trennt sich in dem Becher in zwei Teile, und zwar eine feste
Phase und eine flüssige Phase. Die Mischung wird dann erneut in den Gefrierschrank während einer Zeitspanne von 12
Stunden gestellt. Dann wird die Mischung erneut bei Zimmer-
temperatur gerührt, worauf sie sich wiederum in zwei Teile trennt, und zwar die feste und die flüssige Phase. Die
flüssige Phase wird von der Mischung durch Dekantieren entfernt. Man erhält 38 g eines festen Materials. Das feste
Material, das immobilisierte Glukoseisomerase enthält, enthält 550 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität pro Gramm des
festen Materials in der vorliegenden Form.
100 ml einer im Handel erhältlichen kolloidalen Kieselerde, und zwar LUDOX HS-30 (erzeugt von der Du Pont Co., USA), werden
in einen Becher mit einem Fassungsvermögen von 200 ml eingefüllt und mit 160 ml entionisiertem Wasser verdünnt. Der
pH-Wert dieser Lösung wird auf 7,0 unter Verwendung von 1 η HCl eingestellt. Danach werden 35 ml einer Enzymlösung,
die 41500 Einheiten Glukoseisomerase enthält, der Lösung
zugesetzt. Die Enzymlösung wird nach der in Beispiel I beschriebenen Methode hergestellt. Anschließend wird die Mischung
langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 15 Minuten gerührt. Dann werden 2 ml einer 25%igen
im Handel erhältlichen Glutaraldehydlosung (Produkt der Tokyo Kasei Kogyo Co.) der erhaltenen Lösung zugesetzt.
Die Lösung wird langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 60 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung
in einen bei einer Temperatur von -20° C gehaltenen Gefrierschrank gestellt. Nach 12 Stunden wird die gefrorene Mi-
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schung aus dem Gefrierschrank entnommen und bei Zimmertemperatur gerührt. Die Mischung in dem Becher trennt sich in
zwei Teile, und zwar in eine fesbe und eine flüssige Phase.
Die Mischung wird dann erneut in den Gefrierschrank während einer Zeitspanne von 12 Stunden gestellt. Dann wird die
Mischung erneut bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich wiederum in zwei Teile trennt, und zwar die feste und die
flüssige Phase. Die flüssige Phase wird von der Mischung durch Dekantieren entfernt. Man erhält 40 g1 des festen Materials.
Das feste Material, das immobilisierte Glukoseisomerase enthält, weist 420 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität
pro Gramm des festen Materials in der vorliegenden Form auf.
100 ml einer im Handel erhältlichen kolloidalen Kieselerde, und zwar LUDOX AM (erzeugt von der Du Pont Co., USA), wer<fcn in
einen Becher mit einem Fassungsvermögen von 300 ml eingeführt und mit 160 ml entionisiertem V7asser verdünnt. Der
pH dieser Lösung wird dann auf 7,0 unter Verwendung von 1 η HCl eingestellt. Danach werden 35 ml einer Enzyr^lörung, die
41500 Einheiten Glukoseisomerase enthält, der Lösung zugegeben. Die Enzymlösung wird nach der in Beispiel I beschriebenen
Methode hergestellt. Anschließend wird die Mischung langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von
15 Minuten gerührt. Danach werden 2 ml einer 25%igen, im Handel erhältlichen Glutaraldehydlosung (erzeugt von der
Tokyo Kasei Kogyo Co.) der erhaltenen Lösung zugesetzt. Die Lösung wird langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne
von 60 Minuten gerührt. Dann werden 15 g MgCl3.6H3O
der Lösung zugesetzt. Die Lösung wird anschließend langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 Minuten
gerührt. Dann wird die Mischung in einen auf einer Temperatur von - 20° C gehaltenen Gefrierschrank gestellt.
Nach 12 Stundc-η viiird cH.e gefrorene- Mi pchunq aus dem Gefrierschrank
entnommen und bei Zimmertemperatur gerührt. Die
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ORIGINAL INSPECTED
Mischung in dem Becher scheidet sich in zwei Teile, und zwar in eine feste und eine flüssige Phase. Die Mischung wird
dann erneut während einer Zeitspanne von 12 Stunden in den Gefrierschrank gestellt. Anschließend wird die Mischung erneut
bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich wiederum in zwei Teile trennt, und zwar in die feste und die flüssige
Phase. Die flüssige Phase wird von der Mischung durch Dekantieren abgetrennt. Man erhält 35 g eines festen Materials.
Das feste Material, das immobilisierte Glukoseisomerase
enthält, weist 423 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivitat
pro Gramm des festen Materials in der vorliegenden Form auf.
100 ml einer im Handel erhältlichen kolloidalen Kieselerde, und zwar SNOWTEX-30 (erzeugt von der Nissan Kagaku Co.),
werden in einen Becher mit einem Fassungsvermögen von 300 ml eingefüllt und mit 160 ml entionisiertem Wasser verdünnt.
Der pH dieser Lösung wird dann auf 7,0 unter Verwendung von
1 η HCl eingestellt. Danach werden 35 ml einer Enzymlösung, die 41500 Einheiten Glukoseisomerase enthält, der Lösung
zugesetzt. Die Enzymlösung wird nach der in Beispiel I beschriebenen Methode hergestellt. Anschließend wird die Mischung
langsam bei Zimmertempertür während einer Zeitspanne
von 15 Minuten gerührt. Dann werden 2 ml einer 25%igen im
Handel erhältlichen Glutaraldehydlosung (erzeugt von der Tokyo Kasei Kogyo Co.) der erhaltenen Lösung zugesetzt. Die
Lösung wird dann langsam bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 60 Minuten gerührt. Dann werden 15 g MgCl_·
6H2O der Lösung zugesetzt. Die Lösung wird anschließend
langsam bei Zimmertempertür während einer Zeitspanne von
30 Minuten gerührt. Dann wird die Mischung in einen auf eine Temperatur von - 20° C gehaltenen Gefrierschrank bestellt.
Nach 12 Stunden wird die gefrorene Mischung aus doüi Gefrierschrank ontnorvritM; uml bei Kinii.iortui.iperatur ge-
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rührt. Die Mischung trennt sich in dem Becher in zwei Teile, und zwar in eine feste und eine flüssige Phase. Die Mischung
wird dann erneut während einer Zeitspanne von 12 Stunden in den Gefrierschrank gestellt. Anschließend wird die Mischung
erneut bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich wiederum in zwei Teile trennt, und zwar die feste und die flüssige
Phase. Die flüssige Phase wird von der Mischung durch Dekantieren getrennt. Man erhält 36 g eines festen Materials. Das
feste Material, das immobilisierte Glukoseisomerase enthält, weist 455 Einheiten Glukoseisomerase-Aktivität pro Gramm das
festen Materials in der vorliegenden Form auf.
50 g einer immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bettvolumen:
60 ml), die in der Weise hergestellt worden ist, daß Glukoseisomerase an LUDOX HS-30 nach der in Beispiel I
beschriebenen Methode adsorbiert worden ist, v/erden in einer mit einem Mantel versehenen Glassäule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt.
Während die Säule auf einerTemperatur von 60° C gehalten
wird, wird eine 50%ige Glukoselösung, die 5 mM MgCl2
enthält und auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit
mit einem SV-Wert von 2 geschickt. Der Fruktosegehalt des Ablaufes beträgt am Anfang 51,2 % des festen Substrats. Dieser
Wert wird während einer Zeitspanne von 10 Tagen gehalten und nimmt dann langsam auf 25,6 %, der Hälfte des anfänglichen
Wertes, nach 75 Tagen ab.
38 g einer immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bettvolumen:
45 ml), die in der Weise hergestellt worden ist, daß Glukoseisomerase an LUDOX HS-30 nach der in Beispiel II beschriebenen
Methode adsorbiert worden ist, werden in eine mit einem Mantel versehene Säul:·:- (2, S χ ?0 cm) eingefüllt.
Während die Säule bfM einr>r Temperatur von 60° C gehalten
wird, wird eine bO%ige ülukoselösung, die 5 mM MgCl2 ent-
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ORIGINAL INSPECTED
hält und auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist, durch
die Säule mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit mit einem SV-Wert von 2 geschickt. Der Fruktosegehalt des Ablaufs
beträgt am Anfang 51,2 % des festen Substrats. Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 5 Tagengehalten und nimmt
dann auf 25,6 %, die Hälfte des Anfangwertes, nach 38 Tagen
ab.
Beispiel VIII
;
40 g einer immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bettvolumen:
48 ml), die in der Weise hergestellt worden ist, daß eine Glukoseisomerase an LIJDOX HS-30 nach der in Beispiel
III beschriebenen Methode adsorbiert worden ist, werden in eine mit einem Mantel versehene Glassäule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt.
Während die Säule auf einerTemperatur von 60° C
gehalten wird, wird eine 50%ige Glukoselösung, die 5 mM
MgCIp enthält und auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit
mit einem SV-Wert von 2 geschickt. Dor Fruktosegehalt des Ablaufs beträgt zu Anfang 51,2 % des festen Substrats.
Dieser Wert wird während einer Zeitspanne von 2 Tagen gehalten
und fällt dann auf 25,6%, die Hälfte des anfänglichen Wertes, nach 30 Tagen ab.
35 g einer· immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bett—
volumen: 40 ml), die in der Weise hergestellt worden ist, daß Glukoseisomerase an LUDOX AM nach der in Beispiel IV
beschriebenen Weise adsorbiert worden ist, werden in eine mit einem Mantel versehene Säule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt.
Während die Säule auf einer Temperatur von 60° C gehalten wird, wird eine 50%ige Glukoselösung, die 5 mM MgCl- enthält
und auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer konstanten Fließgeschwinciigkeit mit einem
SV-Wert von 2 geschickt. Der Fru^tonegobolt des Ablaufs
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beträgt am Anfang 51,2 % des festen Substrats. Dieser Wert wird während einer Zeitspänne von 1 Tag erhalten und fällt
dann auf 25,6 %, die Hälfte des anfänglichen Wertes, nach 15 Tagen ab.
36 g einer immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bettvolumen:
42 ml), die in der Weise hergestellt worden ist, daß Glukoseisomerase an SNOWTEX 30 nach der in Beispiel V
beschriebenen Methode adsorbiert worden ist, werden in eine mit einem Mantel versehene Glassäule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt.
Während die Säule bei einer Temperatur von 60° C gehalten wird, wird eine 50%ige Glukoselösung, die 5 mM MgCIp enthält
und auf einen pH von 8,0 eingestellt worden ist, durch die Säule mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit mit einem
SV-Wert von 2 geschickt. Der Fruktosegehalt des Ablaufs beträgt
zu Beginn 51,2 % des festen Substrats.»Dieser Wert wird
während einer Zeitspanne von 4 Tagen gehalten und fällt dann auf 25,6 %, die Hälfte des anfänglichen Wertes, nach 30 Tagen
ab.
50 g einer immobilisierten Glukoseisomerase (feucht) (Bettvolumen:
60 ml), die nach der in Beispiel I beschriebenen Methode hergestellt worden ist, werden in eine mit einem
Mantel versehene Glassäule (2,5 χ 20 cm) eingefüllt. Während die Säule auf einer Temperatur von 60° C gehalten wird, wird
eine 50%ige Glukoselösung, die 5 mM MgCl2 enthält und auf
einen pH von 8,0 eingestellt worden ist, durch diese Säule mit einer variablen Fließgeschwindigkeit geschickt, um eine
kontinuierliche Isomerisierungsgeschwindigkeit aufrecht zu erhalten (Isomerisierung einer 45%igen Dextrose zu Fruktose).
Zur Erzielung dieser Isomerisierungsgeschwindigkeit entspricht die Anfangsfließgeschwindigkeit einem SV-Wert von
Die folgende Tabelle zeigt die Veränderungen der Fließgeschwindigkeit
zur Aufrechterhaltung der konstanten Isomeri-
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sierungsgeschwindigkeit.
Tage 2 5 10 20 30 40 5,7 5,0 4,3 3,0 2,1 1,5
Während dieser kontinuierlichen Isomerisierung zeigt die Säule sehr gute Fließexgenschaften.
Die Erfindung wurde vorstehend unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen erläutert. Es ist auch darauf hinzuweisen,
daß auch andere Ausführungsformen in den Rahmen der Erfindung fallen.
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Claims (9)
1. Verfahren zur Immobilisierung von Glukoseisomerase,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Glukoseisomerase an einer kolloidalen Kieselerde durch Kontaktieren dieses
Enzyms mit der kolloidalen Kieselerde adsorbiert wird, worauf die Kieselerde mit daran adsorbierter Glukoseisomerase
durch Gefrieren entweder in ihrem vorliegenden Zustand oder nach einer Gelatinisierung verfestigt wird.
2. Verfahren zur Isomerisierung von Glukose, dadurch gekennzeichnet,
daß ein kontinuierlicher Kontakt zwischen einer
Glukose enthaltenden Lösung und der immobilisierten Glukoseisomerase
aufrechterhalten wird, die durch Adsorbieren einer Glukoseisomerase an einer kolloidalen Kieselerde
durch Kontaktieren des Enzyms mit der kolloidalen Kieselerde und anschließender Verfestigung der Kieselerde mit
daran adsorbierter Glukoseisomerase durch Einfrieren hergestellt worden ist.
3. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Snzymmaterials,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Glukoseisomerase-Enzymzubereitung
mit einer kolloidalen Kieselerde zum Adsorbieren dieses Enzyms an dieser Kieselerde kontaktiert
wird, worauf die Mischung bei einer Temperatur von ungefähr -10° bis ungefähr -30° C zur Gewinnung des immobilisierten
Enzymmaterials eingefroren wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung vor dem Einfrieren gelatinisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung vor dem Einfrieren mit einem bifunktionellen
Reagenz behandelt wird.
6. Immobilisiertes Enzymmaterial, gekennzeichnet durch eine
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Glukoseisomerase, die an· kolloidaler Kieselerde adsorbiert
ist.
7. Immobilisiertes Enzymmaterial nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die kolloidale Kieselerde eine Teilchengröße von ungefähr 10 bis ungefähr 30 mil besitzt.
8. Verfahren zur partiellen Isomerisierung einer Glukoselösung zu einer Fruktoselösung, dadurch gekennzeichnet,
daß die Glukoselösung bei einem pH von ungefähr 7 bis 9 mit einem immobilisierten Enzymmaterial umgesetzt wird,
das aus Glukoseisotnerase besteht, die an kolloidaler Kieselerde adsorbiert ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Material in Form von Granulaten oder Flocken mit einer
Teilchengröße von 20 bis 100 mesh in einer Säule eingesetzt wird und die Glukoselösung durch die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit
von ungefähr 1 bis ungefähr 10 geschickt wird.
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