DE2224131A1 - Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxydase - Google Patents
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Description
Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,
Dipl.-Ing. H.Wetckmann, D1PL.-P11YS. Dr.K. Fincke
Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
222A1 "31
8 MÜNCHEN 86, DEN '
POSTFACH 860 820 HZW MOHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., 68 Mannheim, San&hofer Straße 112-132
Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinoxydase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des neuen
Enzyms Cholesterinoxydase.
Es ist bekannt» daß eine Anzahl von Mikroorganismen Cholesterin
umzusetzen vermögen. So beschreibt beispielsweise Turfitt in
J.Bacteriol. 47» 487 bis 493 (1944) 188 Bakterien-Stämme, die
Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle ausnutzen konnten»
Über den Mechanismus der Cholesterinverwertung und die daran
beteiligten Enzyme war jedoch nichts bekannt» Es besteht jedoch
Interesse an der Auffindung eines Cholesterin --amsetseaden
Enzyms, da su erwarten ist, daß ein derartiges Enzym für. eine
spezifische Cholesterinbestimmuiägsmethode tob Interesse ist.
Eine derartige spezifische ChoIesterinbestiiEmimgsmethoäe fehlt
■bisher, wäre jedoch in der medizinischen Diagnostik τοη großer
Bedeutung.
Nunmehr wurde gefunden, daß aus Cholesterin; laasetsezulexL. lifero«·
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Organismen ein Enzym, isoliert werden kann, welches die Umsetzung
von Cholesterin gemäß nachstehender Gleichung katalysiert:
Cholesterin(HH) + O2 *· Cholestenon + H2O2
Entsprechend der obigen Reaktion wird das neue Enzym als Cholesterinoxydase
bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinoxydase
bestoht darin, daß ein Cholesterin umsetzender Mikroorganismus, gegebenenfalls nach Waschung mit Butanol-Wasser-Mischung,
durch Zerstörung der Zellwand mit einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung
aufgeschlossen und extrahiert, der Extrakt über einen Anionenaustauscher
gegeben und das Enzym mit einer das oberflächenaktive Mittel enthaltenden Pufferlösung eluiert wird.
Bei der Oholesterinoxydase handelt es sich um ein Enzym, welches
einerseits in der Zellmembran des Mikroorganismus gebunden ist und andererseits eine extrem hydrophobe Substanz, nämlich das
Cholesterin, umzusetzen hat. Enzyme dieser Art zeigen bei den klassischen Gewinnungsverfahren eine besonders unangenehme·
Eigenschaft. Sie lassen sich nämlich äußerst schwer aus der Membran freisetzen und neigen, selbst wenn die Freisetzung gelungen
ist, stets dazu, sich zusammenzuklumpen und an Gefäßwänden, Phasengrenzschichten oder auch Adsorptionsmitteln und
Austauschermaterialien zu binden. Es ist daher nicht möglich, die üblichen Methoden der Enzymgewinnung und Isolierung anzuwenden.
Eine besondere Schwierigkeit liegt dabei darin, daß Aktivität und Spezifität des Enzyms nicht verändert werden
dürfen.
Als Mikroorganismus eignet sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens wie erwähnt im Prinzip jeder Cholesterin umsetzende Mikroorganismus. Besonders gute Ergebnisse wurden
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mit Bakterien der Gattung Proactinomyces erzielt und bevorzugt
werden die zu dieser Gattung gehörenden Bakterien Proactino- .
myces erythropolis NBC 9158, ATCC 17895, ATCC 4277 und Uocardia
formica ATCC 14811- Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch
in gleicher Weise auch auf andere Mikroorganismen, Bakterien wie "Pilze, anwendbar, welche Cholesterin umzusetzen vermögen.
Dor Aufschluß von Mikroorganismen durch Zerstörung der Zellwand
mittels Detergentien ist an sich bekannt und grundsätzlich lassen sich alle der hierzu beschriebenen und in die Praxis eingegangenen
Methoden anwenden.
Der Mikroorganismus wird mit einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives
Mittel enthaltenden Pufferlösung aufgeschlossen und extrahiert. Bevorzugte nicht ionogene oberflächenaktive Mittel
sind die Alkylaryläthylenglycole und Polyäthylenoxyd-Polypropylenoxyd-Addukte,
insbesondere deren Ester. Die anzuwendende Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der zum Aufschluß
und zur Extraktion verwendeten Pufferlösung hängt in gewissem Ausmaß von dem jeweils verwendeten oberflächenaktiven Mittel ab
und kann durch Vorversuche bestimmt werden. Im allgemeinen eignen sich Konzentrationen zwischen etwa 0,01 und 3 $>' vorzugsweise
zwischen 0,1 und 1 #. Die Pufferlösung kann pH-Werte zv/ischen
etwa 5 und 9 aufweisen, bevorzugt wird ein pH zwischen 6 und 8.
Durch die beschriebene mit dem Aufschluß kombinierte Extraktion
in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels läßt sich die spezifische
Aktivität des gesuchten Enzyms auf das 100-fache erhöhen im Vergleich zu einer mit dem gleichen Puffer in Abwesenheit des
oberflächenaktiven Mittels, aber mit Ultraschall durchgeführten Extraktion.
Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der Mikroorganismus
vor dem Aufschluß und vor der Extraktion in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels einer Wäschung mit einem Butanol-,
Wasser-Gemisch unterzogen wird. Überraschenderweise führt diese Waschung mit einer Butanol-Wasser-Emulsion nicht zur erwarteten
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Zusammenballung oder Denaturierung des Enzyms an Grenzflächen, obwohl eine solche Maßnahme bei üblichen nicht zur Zusainmenballung
neigenden Enzymen bereits zu Grenzflächenanreicherungen und zu einer starken Beeinträchtigung der Aktivität führen kann.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich jedoch durch diese Waschung vorab eine weitere erhebliche Anreicherung
erzielen. Die Butanol-Wasser-Waschung kann dabei in einem oder mehreren Schritten durchgeführt werden.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte läßt sich zahlenmäßig durch Vergleich mit einem gewöhnlichen Ultraschallaufschluß
demonstrieren. So lassen sich durch Ultraschallaufschluß einer bestimmten Menge des Mikroorganismus mit 0,05 M
Phosphatpuffer pH 7,0 30 Einheiten Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 0,01 erhalten. Wird hingegen der Aufschluß
des Organismus mit dem gleichen Puffer, dem etwa 0,5 f° oberflächenaktives Mittel zugesetzt wurden, durchgeführt, so
erhält man eine Gesamtaktivität von 60 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 1,0. Dies entspricht einer Verdoppelung
der Ausbeute und einer 100-fachen Anreicherung. Wird das letztgenannte Verfahren wiederholt, vor dem Aufschluß aber eine Waschung
mit Butanol-Wasser-Gemisch durchgeführt, so erhält man 60 Einheiten Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 3,0,
also insgesamt 300-fache Anreicherung.
Der erfindungsgemäß erhaltene Extrakt, welcher die Cholesterinoxydase
gelöst enthält, wird anschließend über Ionenaustauscher gereinigt. Es hat sich herausgestellt, daß es dabei jedoch nicht
möglich ist, die üblichen Methoden einer derartigen Reinigung anzuwenden. Es stellte sich nämlich heraus, daß das Enzym vom
Austauscher nicht mehr eluiert werden konnte. Selbst unter Anwendung hoher Ionenkonzentrationen konnte das Enzym nicht mehr
wiedergewonnen werden. Desgleichen gelang es auch mit Lösungen oberflächenaktiver Mittel nicht mehr, das Enzym zurückzugewinnen.
Überraschenderweise konnte jedoch mit einer Kombination
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von Puffer und oberflächenaktivem Mittel von relativ geringer
Konzentration das Enzym praktisch vollständig wieder vom Austauscher
heruntergewaschen v/erden.
Als Austauscher eignen sich die Anionenaustausch^, insbesondere
die "schwachbasischen Sorten. Bevorzugt v/erden Austauscher, die
eine Diäthylamirioathanolgruppe tragen- Andere Austauscher mit
vergleichbarer Basizität eignen sich jedoch ebenfalls gut.
Die Elution vom Austauscher w.ird vorzugsweise mit einer 0,01
bis 0,2 molaren Pufferlösung des oben angegebenen pH-Wertbereichs durchgeführt. Die Konzentration des oberflächenaktiven
Mittels liegt dann, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 2 #.
Besonders bevorzugt wird die Verwendung von O5 03 bis 091 molarem
Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 0^2 bis 0,7 $>
oberflächenaktivem nicht ionogenem Mittel.
Aus dem so erhaltenen Eluat läßt sich das Enzym in üblicher
Weise isolieren, beispielsweise durch Ausfällung mit Salzen . oder -organischen Sölventien wie Ammonsulfat, Methanol und dgl.
Es kann auch zweckmäßig sein, vor der Austauscherchromatographie das Enzym aus der Lösung auszufällen, um die Lösungsmittel«
menge zu erniedrigen. Für die 'Wie derauf lösung einer ausgefällt
ten Cholesterinoxydase wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, welcher eine geringe Menge eines oberflächenaktiven Mittels
enthält. Es wurde nämlich beobachtet, daß gelegentlich die
Wiederauflösung des gefällten Enysms große Schwierigkeiten bereitet,
die jedoch bei Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels nicht auftreten.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine etwa 3000-fache
Anreicherung des Enzyms durchführen,, Eine weitere Reinigung
nach üblichen biochemischen Peinreinigungs^tlroden ist
möglich. Soweit das Enzym dabei gefällt oder an Oberflächen adsorbiert oder gebunden wird, sollen derartige Methoden in
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Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt werden.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren nach der Austauscherelution erhaltene Enzympräparat läßt sich direkt für die quantitative
Cholesterinbestiminung gemäß der oben angegebenen Reaktionsgleichung
einsetzen.
Die Aktivität des Enzyms und damit die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens wurde verfolgt, indem das gemäß obiger Gleichung gebildete H2O2 nach bekannten Methoden der HgC^-Be-1
Stimmung gemessen wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
40 ml einer Suspension von üFocardia erythropolis (ca. 10 g
Trockengewicht) v/erden mit 40 ml n-Butanol versetzt und einige
Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird zentrifugiert und sowohl das Butanol als auch die überständige wässrige
Phase abgegossen. Der Niederschlag wird erneut mit 40 ml Wasser versetzt und nach Herstellen einer homogenen Suspension
der Zellen wieder mit 40 ml n~Butanol versetzt, einige Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der Niederschlag
wird in 40 ml 0,01 molareia Phosphatpuffer, pH = 7,0, suspendiert,
dem 0,3 $ eines nicht ionogenen oberflächenaktiven Mittels (Alkylarylpolyäthylenglycol) zugesetzt sind,und bei
Raumtemperatur 30 Minuten gerührt« Anschließend wird zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Der Extrakt enthält ca.
120 Einheiten Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 3 Einheiten/ml Protein.
Dieser Extrakt wird mit festem Ammonsulfat bis zu einer Konzentration
von 1,3 M an Ammonsulfat bei O0C versetzt. Anschließend
wird die Suspension zentrifugiert, wobei der Niederschlag sich aufgrund eines offensichtlich lipophilen Anteils auf der Ober-
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fläche der Lösung sammelt. Der zusammengebackene Niederschlag wird filtriert, mit 0,01 molarem Phosphatpuffer, pH = Ί, gelöst
und anschließend gegen denselben Puffer bei O0C erschöpfend
dialysiert.
Die dialysierte Lösung wird auf eine mit 0,01 molar Phosphatpuffer,
pH = 7, äquilibrierte Säule eines handelsüblichen Anionenaustauschers
mit Diäthylaminoäthanolgruppen auf Dextranbasis gezogen. Dabei wird das Enzym adsorbiert. Nach Waschen
der Säule mit demselben Puffer wird nach-einander mit Lösungen von 0,5 f°, 2 % und 5 $ des obigen oberflächenaktiven Mittels
in V/asser gewaschen. Dabei werden große Mengen an Verunreinigungen eluiert. Anschließend wird nacheinander mit 0,01 M Phosphatpuffer,
pH = 7, 0,05 M Phosphatpuffer, pH = 7, 0,2 M Phosphatpuffer,
pH = 7, und 0,5 M Phosphatpuffer, pH = 7, gewaschen.
Anschließend wird erneut mit 0,05 molarem Phosphatpuffer, pH = 7, gewaschen und- anschließend das gewünschte Enzym mit 0,05 molarem
Phosphatpuffer, dem 0,5 % oberflächenaktives Mittel zugesetzt
sind, eluiert. Im Eluat finden sich ca. 80 <fo der an der Säule
adsorbierten enzymatischen Aktivität an Cholesterinoxydase mit einer spezifischen Aktivität von 25 bis 30 U/mg Protein.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde
die Waschung mit Butanol-Wasser weggelassen. Man erhielt so einen Extrakt für die Ammonsulfatfällung, welcher etwa 120 Einheiten
Cholesterinoxydase mit"einer spezifischen Aktivität von 1 Einheit/ml Protein enthielt. Die weitere Aufarbeitung in der
beschriebenen Weise führte zu einem Produkt mit einer spezifischen
Aktivität von 8 bis 10 U/mg Protein.
Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch erfolgte
die Elution des Austauschers mit einer wässrigen Losung, die
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5 io des gleichen oberflächenaktiven Mittels gelöst enthielt.
Es konnte keinerlei Enzymaktivität wieder eluiert v/erden. Das Enzym zog irreversibel am Austauscher auf.
1 U Protein ist diejenige Aktivität, bei der 1 Mikromol
.FLpO2' pro Minute imter folgenden Bedingungen gebildet wird:
2>31 ml PO4-Puffer, 0,05 M, pH 7,0 (+ ABTS 2 ml, c = 50 auf
100 ml Puffer)
0,05 ml Cholesterin-Lösung, c = 3,7 intertiären Butanol
0,6 ml tertiäres Butanol, 0,02 ml POl), c = 1, 0,02 ml Bakterienextrakt.
ORIGfNAL
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Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung von Gholesterinoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Cholesterin-uiasetzehder Mikroorganismus,
gegebenenfalls nach Waschen mit Butanol-Wasser-Mischung, mit
einer ein nicht ionogenes oberflächenaktives Mittel enthaltenden Pufferlösung durch Zerstörung der Zellwand aufgeschlossen
und extrahiert, der Extrakt über einen Anionenaustauscher gegeben und das Enzym, mit einer das oberflächenaktive Mittel enthaltenden
Pufferlösung eluiert wird«,
2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus dem Extrakt durch Zusatz von Ammonium sulfat gefällt
und danach wieder in Pufferlösung aufgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Puffer pH 5· bis 9 verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Elution des Austauschers eine 0,01 bis
0,2 molare Pufferlösung verwendet wird.
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