DE1908833A1

DE1908833A1 - Verfahren zur Reinigung von Asparaginase

Info

Publication number: DE1908833A1
Application number: DE19691908833
Authority: DE
Inventors: Karlfried Gawehn; Dr Phil Nat Wolfgang Gruber; Hans Moellering; Waldemar Thum; Bergmeyer Dr Rer Nat Ha Ulrich
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1969-02-21
Filing date: 1969-02-21
Publication date: 1970-09-24
Also published as: GB1231982A; DE1908833B2; DE1908833C3; US3684659A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. R Weickmann,

Dipl.-Ing. H.Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 27, DEN HZW ' MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., Mannheim

Verfahren zur Reinigung von Asparaginase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung von Asparaginase aus Escherichia coli.

Es ist bekannt, daß L-Asparaginase ausgeprägte antineoplastische Eigenschaften aufweist und sowohl im Tierversuch als auch beim Menschen erfolgversprechende Ergebnisse in der Behandlung von Leukämie und anderen Tumoren geliefert hat. Es wird angenommen, daß die bereits erzielten Behandlungserfolge noch wesentlich verbessert werden können, wenn ausreichende Mengen L-Asparaginase zur Verfügung stehen, da zumindest dn Teil der negativen Behandlungsergebnisse auf Unterdosierung infolge Schwierigkeiten bei der Beschaffung des Enzyms zurückgeführt werden.

Es besteht daher ein großes Interesse an der Schaffung von Methoden, welche es ermöglichen, den Bedarf an L-Asparaginase zu befriedigen.

H.A.Campbell et al. beschreiben in "Biochemis-try" £, 721 ff. ,(1967) ein Reinigungsverfahren für L-Asparaginase, wobei Escherichia coli-Zellen aufgeschlossen, die zellfreien Extrakte einer Manganfällung unterworfen, der Überstand mit Ammoniumsulfat fraktioniert und die erhaltene aktive Eiweißfraktion über eine Hydroxylapatitsäule chromatographiert wird. Das Eluat der

009839/1743

Säule wird dann über DEAE-Zellulose chromatographiert. J.M.Hill et al. beschreibt im "Journal of Bacteriology" _9j5, Seite 2117 bis 2123 (1968) ebenfalls ein Reinigungsverfahren, bei dem E. coli-Zellen aufgeschlossen, der Aufschluß einer Äthanolfraktionierung unterworfen, die aktive Fraktion über eine DEAE-Zellulose säule chromatographiert, das aktive Eluat mit Äthanol gefällt, dann über Carboxymethyl-Sephadex chromatographiert, wieder mit Äthanol gefällt und gegebenenfalls durch Polyacrylamidelektrophorese hochgereinigt wird.

Diese bekannten Verfahren haben den Fachteil, daß sie einerseits bei vielen E. coli-Stämmen nicht zu befriedigenden Anreicherungen führen und andererseits durch die Notwendigkeit wiederholter Säulenchromatographie sehr aufwendig hinsichtlich Arbeit und Raumbedarf sind. Sie sind daher nur mit Einschränkung für ein großtechnisches Herstellungsverfahren brauchbar* Außerdem erwies sich die Nacharbeitung als undurchführbar und die erhalte liehen Handelspräparate weisen auch nicht/ die Reinheitsgrade auf, welche nach den obigen Veröffentlichungen erzielt wurden,

Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines besonders für die großtechnische Durchführung geeigneten Verfahrens zur Rei-r nigung und Anreicherung von Asparaginase aus E. cöli, welches die oben erwähnten Nachteile nicht aufweist*

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Anreicherung und Eeinigung von Ii-Asparaginase aus; E, eqli durch Aufschluß und anschließende Manganfällung besteht darin, daß der Überstand der Manganfällung mit Gel behandelt, das Gel abgetrennt und bei pH^Wfrten zwischen 8,5 und 10 eluiert wird. · _: . ^!

Durch den erfindungsgemäßen Reinigungsschritt-wird neben einer Reinigung auch eine erhebliche Konzentrierung erzielt, so daß die Weiterreini'gung nach irgendeinem geeigneten Verfahren mit erheblich verringerten Mengen durchgeführt werden kann. Besonders überraschendv/igjigfdaß ,mit nur einer sehr geringen Gelmenge (10 bis 20 $, bezogen auf das Volumen desL ManganfallungsfII-

009839/1743

"träte·)' eine praktisch vollständige Adsorption und Elution des aktiven Proteins erfolgt obwohl ein verhältnismäßig hoher Salzgehalt in dem Filtrat der Manganfällung vorliegt, welcheβ für den Gelschritt eingesetzt wird.

Der Aufschluß der Bakterienzellen erfolgt in bekannter Weise. Geeignete Methoden sind z.B. Hochdruckdispersion, Einwirkung von Essigsäureäthylester, grenzflächenaktiven Stoffen, wie Triton X 100 oder Lysozym. Bevorzugt wird die Hochdruckdispersion. Ebenfalls in bekannter Weise wird die Manganfällung durchgeführt. Beispielsweise wird hierzu auf die oben angegebene Mteraturstel-Ie "Biochemistry" loc. cit. hingewiesen.

Als Gele eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren die anorganischen Gele mit Adsorptionseigenschaften. Beispiele hierfür sind Calciumphosphatgel, Aluminiumhydroxydgel» Kieselsäuregel und Zinnsäuregel· Vorzugsweise wird ein Calciumphosphatgel verwendet. BIe Calciumphosphatkonzentration im Gel liegt üblicherweise zwischen 10 und 30 mg/ml, vorzugsweise zwischen etwa 15 und 25 mg/ml. Das Gel wird dem Überstand der Manganfällung, zweckmäßig nach einer Vorprobe, einfach zugesetzt und durch Rühren verteilt und danach absitzen gelassen. Die vorhergehenden Schritte, Aufschluß der Bakterienzellpaste und Versetzen der erhaltenen Zellsuspension mit einer verdünnten Mangansalzlösung sind bekannt. Der nach Abtrennen des Manganniederschlage erhaltene Oberstand wird mit dem Gel behandelt und danach abgetrennt.. Nach dem Waschen und Trocknen des Niederschlags wird dieser bei einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10, vorzugsweise bei etwa 9,3 bis 9,7, elüiert. Zweckmäßig wird hierbei der gewaschene und getrocknete Niederschlag einfach mit einer Lösung des angegebenen pH-Wertes, vorzugsweise einer verdünnten Pufferlösung, verrührt. Die L-Asparaginase geht hierbei in den Überstand und läßt sich vom Calciumphosphatniederschlag einfach trennen.

Vorzugsweise erfolgt die Elution mit einer Pufferlösung. Als sehr geeignet erwies sich beispielsweise 0,Ö2 M Dikaliumhydrogenphosphat pH 9,5. Eine Elution bei einem°pH-Wert unter 8,5

009839/1743

ist zwar im Prinzip möglich, hierbei sind jedoch so hohe Pufferbzw. Salzkonzentrationen für die Elution erforderlich, daß anschließend eine Dialyse erforderlich wäre, was in großtechnischem Maßstabe schwierig ist. Bei pH-Werten über 10 erfolgt eine zunehmende Inaktivierung des Enzyms. Im angegebenen bevorzugten pH-Wertbereich werden mehr als 80 % der ursprünglichen Aktivität eluiert. "

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt kann gegebenenfalls nach bekannten Verfahren weiter gereinigt werden. Beispielsweise kann eine Äthanolfällung und anschließend eine Chromatographie über Carboxymethyl-Sephadex angeschlossen werden. Es ist auch möglich, in bekannter Weise direkt nach dem Aufschluß eine Athanolfraktionierung durchzuführen, an die sich dann die Manganfällung anschließt. Vorzugsweise wird jedoch das Geleluat einer Alkoholfraktionierung unterworfen. Da das Eluat eine sehr niedrige Salzkonzentration aufweist, ist es möglich, vor der Fraktionierung die Lösung erheblich einzuengen, vorzugsweise auf etwa 1/5 bis 1/7 des ursprünglichen Volumens. Die Alkoholfraktionierung wird erfindungsgemäß durch Fällung mit Isopropanol, Lösen des Niederschlags und Fällung mit Methanol durchgeführt. Diese Fraktionierung mit Isopropanol und Methanol kann auch anstelle der bekannten Athanolfraktionierung direkt nach dem Aufschluß durchgeführt werden. Bevorzugt ist die Isopropanol-Methanolfraktionierung jedoch nach dem G-elschritt. ■

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausbildung des Verfahrens der Erfindung wird nach dem Gelschritt, gegebenenfalls nach Zwischen·^- schaltung des Isopropanol-Methanolschrittes, eine Protaminsulfatfällung durchgeführt. Nach*dem Abtrennen des Protaminsulfatniederschhgs wird der Überstand über eine. DEAE-Sephadexeäuie chromatographiert. Die Kombination der Protaminsulf atf ällung mit der DEAE-Sephadexehromatographie ergibt eine sehr gute Eeinigungs- und Anreicherungswirkung und führt zu einem Produkt, dessen spezifische Aktivität etwa der der handelsüblichen Präparate entspricht.

009839/ 17.43

. Die oben aufgeführten zusätzlichen Reinigungsschritte nach der Elution des Calciumphosphatgels werden günstig bei pH-Werten zwischen etwa 6,5 und 8,5, vorzugsweise zwischen 7 und 8, durchgeführt. Bei der Chromatographie über I)EAE-Sephadex wird zweckmäßig mit 0,02 bis 0,03 M Phosphatpuffer gewaschen und mit-0,05 bis 0,06 M Phosphatpuffer eluiert. Aus dem Eluat wird das aktive Protein zweckmäßig in bekannter Weise durch Alkohol gefällt und entweder als solches verwendet oder noch einer an sich bekannten Feinreinigung, beispielsweise Chromatographie an Carboxymethyl-Sephadex, zugeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine rasche und wirksame Reinigung und Anreicherung von L-Asparaginase aus E. coli in großtechnischem Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet raum-, zeit- und arbeitsaufwendige Verfahrensschritte, wie Chromatographie größerer Substanzmengen. Soweit eine Chromatographie durchgeführt wird, erfolgt diese erst in einem späteren Verfahrensstand, wo die Reinigung bereits soweit fortgeschritten ist, daß in wesentlich kleinerem Ausmaß gearbeitet werden kann, bzw. bei gleichem apparativem Aufwand, wie bei den bekannten Verfahren ein wesentlich höherer Drehsatz, bezogen auf aktives Protein, erzielt werden kann.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1 .

Aus zwei E. coli-Kulturansätzen zu je 500 1 werden die Zellen abgetrennt und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Die Zellsuspension wird mit Wasser auf 150 1 aufgefüllt und mit verdünnter Essigsäure auf pH 5»8 eingestellt. Nach Erwärmen auf 40⁰C wird mit verdünnter Manganacetatlösung auf 0,05 M gebracht. Der pH-Wert wird nachgestellt und der Niederschlag absitzen.gelassen und abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und Überstand und Waschwasser vereinigt.

009839/1743

Die vereinigten Überstände werden mit etwa15 % Calciumphosphatgel (C~20 mg/ml) versetzt und abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen. Überstand und Waschwasser werden verworfen.

Der Gelniederschlag wird mit der dreifachen Menge,, bezogen auf das ursprüngliche Gelvolumen, an 0,02 MKpHPO.-Iösung pH 9,5 verrührt. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert nachgestellt. Nach Beendigung der Elution wird das Gel vom Überstand abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen. Waschwasser und Gelüberstand werden vereinigt und enthalten etwa 80 % der ursprünglichen Aktivität.

Die so erhaltene Lösung wird bei pH-Wert 7,0 unter Erwärmen auf einen Proteingehalt von etwa 20 mg/ml konzentriert.

Aus dem so erhaltenen Konzentrat wird das Protein durch Zusatz von 1,2 Vol. Äthanol gefällt.

Aktivität: 15 bis 20 Tl/mg, Ausbeute: 58 $, bezogen auf Zeil— Suspensionsüberstand.

Beispiel 2

_ Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren, jedoch wird ^ das Calciumphosphatgeleluat nach dem Einengen bei pH 7,0 stufenweise mit soviel 90$igem Isopropanol versetzt, bis im Überstand weniger als 5 % AsparaginaseaJEtivität verbleiben (etwa 1VoI.). Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 0,02 M Puffer pH 7,0 aufgenommen und mit insgesamt etwa 1,15 Vol. Methanol bei pH 7,0 und 10⁰O stufenweise gefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 0,02 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,6 aufgenommen und mit 10$iger Protaminsulfatlösung versetzt, bis keine Trübung mehr eintritt. Der Niederschlag wird abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird auf eine mit 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,6 äquilibrierte DEAE-Sephadexsäule gegeben, mit zwei Säulenvolumen 0,025 M Puffer gewaschen und mit 0,055 H Phosphatpuffer eluiert.

009a39/17 43

Die Fraktionen, welche die L-Asparäginase enthalten, werden vereinigt und das Eiweiß mit Alkohol gefällt* Der Niederschlag besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 180 bis 200 U/mg. Die Gesamtausbeute beträgt etwa 36 #.

Beispiel 3

Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben vorgegangen, jedoch wird der Niederschlag der Alkoholfällung in 0,05 M Natriumacetat-.puffer pH 5,0 aufgenommen und auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Carboxymethyl-Sephadexsäule gebracht. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer unter Zusatz von 0,05 M Kaliumchlorid gewaschen und mit gleichem Puffer unter Zusatz von 0,1 M Kaliumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, auf pH 7fO eingestellt und mit Alkohol gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser aufgenommen, wieder auf pH 7,0 eingestellt und vom Unlöslichen getrennt. Durch Zusatz von Ammoniumsulfat auf 3,5 M kristallisiert das Enzym. Spezifische Aktivität: 230 U/mg. Das kristallisierte Präparat ist in der Elektrophorese bei pH 5 und 8,6 einheitlich. Gesamtausbeute, bezogen auf die im Aufschluß gemessene Aktivität: 29 #.

0 09839/17

Claims

P a te η t a η s ρ r ü c h e

1. Verfahren zur Anreicherung und Reinigung von L-Asparaginase aus Escherichia coil durch Aufschluß der Zellsuspension und anschließende Manganfällung, dadurch gekennzeichnet, daß das S¹U-trat der Manganfällung mit Gel behandelt, das Gel abgetrennt und bei einem pH-Wert zwischen 8,5 "und 10 elulert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor oder vorzugsweise nach dem Phosphatgelschritt eine Alkoholfraktionierung durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst eine Isopropanolfällung und dann eine Methanolfällung durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3i dadurch gekennzeichnet, daß bei Alkoholfraktioniening nach dem Gelschritt anschließend eine Protaminsulfatfällmig äur-chgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Piltrat der Protaminsulfatfällung einer DEAE-Sephadexchromatographie unterworfen wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Calciumphosphatgel oder Aluminiumhydroxidgel verwendet wird.

009839/1743