DE1908833B2 - Verfahren zur Anreicherung und Reim gung von L Asparaginase aus einem Filtrat einer Mangansalzfällung eines Extraktes von Zellen von Eschenchia coh - Google Patents

Description

35 3. Zentrifugieren bei 30000 g (die großtechnisch

allein in Betracht kommenden selbstaustragenden Separatoren erreichen nur 5000 bis 6000 g) und

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreiche- 4. Hydroxylapatitchromatographie.
rung und Reinigung von L-Asparaginase aus einem 40

Filtrat einer Mangansalzfällung eines Extraktes von Allein an der 3. Stufe würde eine großtechnische

Zellen von Escherichia coli. Durchführung des Verfahrens schon scheitern, aber

Es ist bekannt, daß L-Asparaginase ausgeprägte auch die 4. Stufe ist nur im Labormaßstab durchantineoplastische Eigenschaften aufweist und sowohl führbar. Eine Übertragung in technischem Maßstab im Tierversuch als auch beim Menschen erfolgver- 45 ist wegen der durch die Feinheit des Materials besprechende Ergebnisse in der Behandlung von Leu- dingten Verstopfungen nicht möglich. Die an Stelle kämie und anderen Tumoren geliefert hat. Es wird der Hydroxylapatitchromatographie vorgeschlagene angenommen, daß die bereits erzielten Behandlungs- Säuleneleklrophorese ist bisher überhaupt nur für erfolge noch wesentlich verbessert werden können, Substanzmengen unter 50 mg realisierbar,
wenn ausreichende Mengen L-Asparaginase zur Ver- 5° Ein weitgehend ähnliches Verfahren ist aus »Arch, fügung stehen, da zumindest ein Teil der negativen Biochem. Biophys.«, Vol. 105, 1964, S. 450 bis 454, Behandlungsergebnisse auf Unterdosierung infolge bekannt. Hierbei wurde lediglich der Ultraschallauf-Schwierigkeiten bei der Beschaffung des Enzyms zu- schluß des oben beschriebenen Verfahrens durch rückgeführt werden. Zerreiben ersetzt. Dieses Verfahren weist die glei-

Es besteht daher ein großes Interesse an der 55 chen Nachteile auf wie das Verfahren aus »Nature« Schaffung von Methoden, welche es ermöglichen, loc. cit. Auch ein Zerreiben im Mörser ist kein techden Bedarf an L-Asparaginase zu befriedigen. nisch durchführbares Aufschlußverfahren.

H. A. Campbell et al. beschreiben in »Bio- Auch bei dem Verfahren in »Biochemistry« loc.

chemistry«, Vol. 6, 1967, S. 721 ff., ein Reinigungs- cit. wird von lyophilisierten E.-coli-B-Zellen ausgeverfahren für L-Asparaginase, wobei Escherichia- 60 gangen. Lediglich die zweite Hydroxylapatitchromacoli-Zellen aufgeschlossen, die zellfreien Extrakte tographie wird durch eine DEAE-Zellulosechromaeiner Manganfällung unterworfen, der Überstand mit tographie ersetzt. Dieses Verfahren führt nach fünf Ammoniumsulfat fraktioniert und die erhaltene ak- Anreicherungsstufen nur zu einer spezifischen Endtive Eiweißfraktion über eine Hydroxylapatitsäule reinheit von 15 Einheiten. Hiervon abgesehen weist chromatographiert wird. Das Eluat der Säule wird 65 das Verfahren auch die für die oben beschriebenen dann über DEAE-Zellulose chromatographiert. Methoden typischen Nachteile auf.

J. M. Hill et al. beschreiben im »Journal of Das Verfahren gemäß »Journal of Bacteriology«

Bacteriology«, Vol. 95 (1968), S. 2117 bis 2123, loc. cit., bei welchem nach Aufschluß eine Äthanol-

fraktionierung, dann eine DEAE-Zellulosechromato- vorzugt wird die Hochdruckdispersion. Ebenfalls in graphie, erneute Äthanolfällung und Chromatogra- bekannter Weise wird die Mangansalzfällung durchphie über carboxyäthyliertem vernetzten! Dextran geführt. Beispielsweise wird hierzu auf die oben andurchgeführt wird, konnte mit dem angegebenen Er- gegebene Literaturstelle s-Biochemistry« loc. cit. hinfolg nicht nachgearbeitet werden, da allein bei der 5 gewiesen.

DEAE-Zellulosechromatographie nach Alkohol- Als Gele eignen sich für das erfindungsgemäße fraktionierung Enzymverluste zwischen 20 und 8O°/o Verfahren Calciumphosphatgel, Alumiiiiumhydroauftreten. xydgel, Kieselsäuregel und Zinnsäuregel. Vorzugs-Ferner wird in »Biochemical Research Commu- weise wird ein Calciumphosphatgel verwendet. Die nications«, Vol. 28, Nr. 2, 1967, S. 160 bis 165, ein io Caiciumphosphatkonzentration im Gel liegt üblicher-Verfahrej beschrieben, bei dem zwar die Ammonsul- weise zwischen 10 und 30 mg/ml, vorzugsweise zwifatfraktionierung weggelassen wird, jedoch eine sehen etwa 15 und 25 mg/ml. Das Gel wird dem Chromatographie über DEAE-Zellulose, eine Filtra- Überstand der Manganfällung zweckmäßig nach tion über Polyacrylamidgel und eine Chromatogra- einer Vorprobe zugesetzt und durch Rühren verteilt phie über Hydroxylapatit und Zellulose vorgenom- 15 und danach absitzen gelassen. Die vorhergehenden men wird. Dieses Verfahren erfordert allein dreimal Schritte, Aufschluß der Bakterienzellpaste und Ver-45minütiges Zentrifugieren bei 27 000 g. Schon die- setzen der erhaltenen Zellsuspension mit einer verser Verfahrensschritt ist in technischem Maßstab, wie dünnten Mangansalzlösung sind bekannt. Der nach oben erläutert, nicht durchführbar. Abtrennen des Manganniederschlages erhaltene Demgegenüber führt das Verfahren der Erfindung 20 Überstand wird mit dem Gel behandelt und danach unter Anwendung von in großtechnischem Maßstab abgetrennt. Nach dem Waschen und Trocknen des unschwierig durchzuführenden Verfahrensschritten Niederschlages wird dieser bei einem pH-Wert zwizu einer spezifischen Reinheit von 20 Einheiten bei sehen 3,5 und 10, vorzugsweise bei etwa 9,3 bis 9,7, 58°/o Ausbeute. Das bekannte Verfahren dagegen eluiert. Zweckmäßig wird hierbei der gewaschene erreicht durch Manganfällung und aufwendige 25 und getrocknete Niederschlag einfach mit einer Lö-DEAE-Zellulosechromatographie nur eine spezifi- sung des angegebenen pH-Wertes, vorzugsweise sehe Reinheit von 9 Einheiten bei 30 °/o Ausbeute. einer verdünnten Pufferlösung, verrührt. Die L-Aspa-Auch das Ausgangsmaterial dieses Verfahrens ist raginase geht hierbei in den Überstand und läßt sich äußerst schwer zu beschaffen, da es nur als Ober- vom Calciumphosphatniederschlag einfach trennen, flächenkultur gezüchtet werden kann. Trotzdem ist 30 Die Elution erfolgt mit einer Pufferlösung. Als der spezifische Asparaginasegehalt niedrig und be- sehr geeignet erwies sich beispielsweise die 0,02 M trägt höchstens 0,3 E/mg Zelltrockengewicht, wobei Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung von pH = 9,5. das Zelltrockengewicht/ml Kulturflüssigkeit nur Eine Elution bei einem pH-Wert unter 8,5 ist zwar 1,68 mg beträgt. Demgegenüber wird mit E. coli eine im Prinzip möglich, hierbei sind jedoch so hohe Aktivität von mehr als 0,9 E/mg Zelltrockengewicht 35 Puffer- bzw. Salzkonzentrationen für die Elution erbei mehr als 3 mg Zelltrockengewicht pro ml Kultur- forderlich, daß anschließend eine Dialyse erforderflüssigkeit erwähnt. lieh wäre, was in großtechnischem Maßstab schwie-Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines rig ist. Bei pH-Werten über 10 erfolgt eine zunehbesonders für die großtechnische Durchführung ge- mende Inaktivierung des Enzyms. Im angegebenen eigneten Verfahrens zur Reinigung und Anreiche- 40 bevorzugten pH-Wertbereich werden mehr als 80⁰O rung von L-Asparaginase aus E. coli, welches die der ursprünglichen Aktivität eluiert.
obenerwähnten Nachteile nicht aufweist. Vorzugsweise wird das Gelelulat einer Alkohol-Das erfindungsgemäße Verfahren zur Anreiche- fraktionierung unterworfen. Da das Eluat eine sehr rung und Reinigung von L-Asparaginase aus einem niedrige Salzkonzentration aufweist, ist es möglich, Filtrat einer Mangansalzfällung eines Extraktes von 45 vor der Fraktionierung die Lösung erheblich einzu-Zellen von Escherichia coli ist dadurch gekennzeich- engen, vorzugsweise auf etwa Vs bis ¹H des ursprüngnet, daß man dem Filtrat der Mangansalzfällung liehen Volumens. Die Alkoholfraktionierung wird er-Calciumphosphatgel, Aluminiumhydroxylgel, Kiesel- findungsgemäß in der Weise durchgeführt, daß man säuregel oder Zinnsäuregel zusetzt, das Gel mit der dem Geleluat Isopropanol zusetzt, den gebildeten adsorbierten L-Asparaginase abtrennt und aus die- 50 Niederschlag abtrennt, diesen in Lösung bringt, der sem die L-Asparaginase bei einem pH-Wert zwi- erhaltenen Lösung Methanol zusetzt und den gebilschen 8,5 und 10 eluiert. deten Niederschlag abtrennt.

Durch den erfindungsgemäßen Reinigungsschritt Gemäß einer besonders bevorzugten Ausbildung

wird neben einer Reinigung auch eine erhebliche des Verfahrens der Erfindung bringt man den Nie-

Konzentrierung erzielt, so daß die Weiterreinigung 55 derschlag der nach dem Gelschritt durchgeführten

mit erheblich verringerten Volumina durchgeführt Alkoholfraktionierung des Geleluats in Lösung, setzt

werden kann. Besonders überraschend ist, daß mit der Lösung Protamisulfat zu, filtriert den erhaltenen

nur einer sehr geringen Gelmenge (10 bis 2O°/o, be- Niederschlag ab und gewinnt das Filtrat mit der

zogen auf das Volumen des Manganfällungsfiltrats) L-Asparaginase. Hierbei kann die Alkoholfraktionie-

eine praktisch vollständige Adsorption und Elution 60 rung in der vorstehend angegebenen Weise durch-

des aktiven Proteins erfolgt, obwohl ein verhältnis- geführt werden. Nach dem Abtrennen des Protamin-

mäßig hoher Salzgehalt in dem Filtrat der Mangan- Sulfatniederschlages wird der Überstand über eine

fällung vorliegt, welches für den Gelschritt eingesetzt Säule mit diäthylaminoäthyliertem vernetzten! Dex-

wird. trän chromatographiert. Diese abschließende Chro-

Der Aufschluß der Bakterienzellen erfolgt in be- 65 matographie führt zu einem Produkt, dessen spezi-

kannter Weise. Geeignete Methoden sind z. B. Hoch- fische Aktivität etwa der der handelsüblichen Präpa-

druckdispersion, Einwirkung von Essigsäureäthyl- rate entspricht,

ester, grenzflächenaktiven Stoffen oder Lysozym. Be- Die oben aufgeführten zusätzlichen Reinigungs-

schritte nach der Elution des Calciumphosphatgels vereinigt und enthalten etwa 8O°/o der ursprüngwerden günstig bei pH-Werten zwischen etwa 6,5 liehen Aktivität.

und 8,5, vorzugsweise zwischen 7 und 8, durchge- Die so erhaltene Lösung wird bei pH-Wert 7,0

führt Bei der Chromatographie über diäthylamino- unter Erwärmen auf einen Proteingehalt von etwa

äthyliertes vernetztes Dextran wird zweckmäßig mit s 20 mg/ml konzentriert.

0,02 bis 0,03 M Phosphatpuffer gewaschen und mit Aus dem so erhaltenen Konzentrat wird das Pro-

0,05 bis 0,06 M PhosphatpufTer eluiert. Aus dem tein durch Zusatz von 1,2 Vol. Äthanol gefällt.

Eluat wird das aktive Protein zweckmäßig in be- Aktivität: 15 bis 20 mg, Ausbeute: 58%, bezogen

kannter Weise durch Alkohol gefällt. Es kann als auf Zeilsuspensionsüberstand der Hochdruckdispersolches verwendet werden. Selbstverständlich kann io sion.

sich die zur Feinreinigung von vorgereinigten _R . - ι τ

L-Asparaginase-Präparaten bekannte Femreinigung ei spie *.

mit carboxymethyliertem vernetzten! Dextran an- Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben verfahren,

schließen. jedoch wird das Calciumphosphatgeleluat nach dem

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine 15 Einengen bei pH 7,0 stufenweise mit so viel 9O°/oigem rasche und wirksame Reinigung und Anreicherung Isopropanol versetzt, bis im Überstand weniger als von L-Asparaginase aus E. coli in großtechnischem 5 % Asparaginaseaktivität verbleiben (etwa 1 Vol.). Maßstab. Das erfindungsgemäße Verfahren vermei- Der Niederschlag wird abgetrennt, mit 0,02 M Puffer det raum-, zeit- und arbeitsaufwendige Verfahrens- pH 7,0 aufgenommen und mit insgesamt etwa schritte, wie Chromatographie größerer Substanz- ao 1,15 Vol. Methanol bei pH 7,0 und 10° C stufenmengen. Soweit eine Chromatographie durchgeführt weise gefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit wird, erfolgt diese erst in einem späteren Verfah- 0,02 M KaliumphosphatpuSer pH 7,6 aufgenommen rensstand, wo die Reinigung bereits so weit fortge- und mit lO°/oiger Protaminsulfatlösung versetzt, bis schritten ist, daß in wesentlich kleinerem Ausmaß keine Trübung mehr eintritt. Der Niederschlag wird geadbeitet werden kann bzw. bei gleichem apparati- 25 abgetrennt und verworfen. Der Überstand wird auf vem Aufwand wie bei den bekannten Verfahren ein eine mit 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,6 äquilibrierte wesentlich höherer Durchsatz, bezogen auf aktives Säule mit diäthylaminoäthyliertem vernetztem Dex-Protein, erzielt werden kann. trän gegeben, mit zwei Säulenvolumen 0,025 M

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung Puffer gewaschen und mit 0,055 M Phosphatpuffer

weiter. 30 eluiert. Die Fraktionen, welche die L-Asparaginase

. -I₁ enthalten, werden vereinigt und das Eiweiß mit

üeispiel l Alkohol gefällt. Der Niederschlag besitzt eine spezi-

Aus zwei E.-coli-Kulturansätzen zu je 5001 wer- fische Aktivität von etwa 180 bis 200 mg. Die Geden die Zellen abgetrennt und ohne Kühlung in der samtausbeute beträgt etwa 36 %.
Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Die Zeil- 35 η ■ · 1 ■*

suspension wird mit Wasser auf 150 1 aufgefüllt und Beispiel 3

mit verdünnter Essigsäure auf pH 5,8 eingestellt. Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben vorgegan-

Nach Erwärmen auf 40° C wird mit verdünnter gen, jedoch wird der Niederschlag der Alkoholfäl-Mcinganacetatlösung auf 0,05 M gebracht. Der lung in 0,05 M Natriumacetatpuffer pH 5,0 aufgepH-Wert wird nachgestellt und der Niederschlag ab- 4° nommen und auf eine mit dem gleichen Puffer äquisitzen gelassen und abgetrennt. Der Niederschlag librierte Säule mit carboxymethyliertem vernetztem wird mit Wasser gewaschen und Überstand und Dextran gebracht. Die Säule wird mit dem gleichen Waschwasser vereinigt. Die vereinigten Über- Puffer unter Zusatz von 0,05 M Kaliumchlorid gestände werden mit etwa 15 °/o Calciumphosphatgel waschen und mit gleichem Puffer unter Zusatz von (C~20 mg/ml) versetzt und abgetrennt. Der Nieder- 45 0,1 M Kaliumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen schlag wird mit Wasser gewaschen. Überstand und werden vereinigt, auf pH 7,0 eingestellt und mit Al-Waschwafser werden verworfen. kohGl gefällt. Der Niederschlag wird in Wasser auf-

Der Gelniederschlag wird mit der dreifachen genommen, wieder auf pH 7,0 eingestellt und vom Menge, bezogen auf das ursprüngliche Gelvolumen, Unlöslichen getrennt. Durch Zusatz von Ammoan 0,02 M K₂HPO₄-Lösung pH 9,5 verrührt. Erfor- 50 niumsulfat auf 3,5 M kristallisiert das Enzym. Spederlichenfalls wird der pH-Wert nachgestellt. Nach zifische Aktivität: 230 mg. Das kristallisierte Präpa-Beendigung der Elution wird das Ge' vom Überstand rat ist in der Elektrophorese bei pH 5 und 8,6 einabgetrennt. Der Niederschlag wird mit Wasser ge- heitlich. Gesamtausbeute, bezogen auf die im Aufwaschen. Waschwasser und Gelüberstand werden Schluß gemessene Aktivität: 29 °/o.

Claims (5)

ebenfalls ein Reinigungsverfahren, bei dem E.-coli- Patentansprüche: Zellen aufgeschlossen, der Aufschluß einer Äthanol- fraktionierung unterworfen, die aktive Fraktion über

1. Verfahren zur Anreicherung und Reinigung eine DEAE-Zellulosesäule chromatographiert, das von L-Asparaginase aus einem Filtrat einer Man- 5 aktive Eluat mit Äthanol gefällt, dann über carboxygansalzfällung eines Extraktes von Zellen von methyliertes vernetztes Dextran chromatographiert, Escherichia coü, dadurch gekennzeich- wieder mit Äthanol gefällt und gegebenenfalls durch net, daß man dem Filtrat der Mangansalzfäl- Polyacrylamidelektrophorese hochgereinigt wird,
lung Calciumphosphatgel, Alumüiiumhydroxyd- Diese bekannten Verfahren haben den Nachteil, gel, Kieselsäuregel oder Zinnsäuregel zusetzt, das io daß sie einerseits bei vielen E.-coli-Stämmen nicht zu Gel mit der adsorbierten L-Asparaginase ab- befriedigenden Anreicherungen führen und anderertrennt und aus diesem die L-Asparaginase bei seits durch die Notwendigkeit wiederholter Säuleneinem pH-Wert zwischen 8,5 und 10 eluiert. Chromatographie sehr aufwendig hinsichtlich Arbeit

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- und Raumbedarf sind. Sie sind daher nur mit Einkennzeichnet, daß man nach der Elution der Gele 15 schränkung für ein großtechnisches Herstellungsvereine Alkoholfraktionierung durchführt. fahren brauchbar. Außerdem erwies sich die Nach-

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge- arbeitung als undurchführbar, und die erhältlichen kennzeichnet, daß man dem Geleluat Iso- Handelspräparate weisen auch nicht die Reinheits-

' propanol zusetzt, den gebildeten Niederschlag grade auf, welche nach den obigen Veröffentlichunabtrennt, diesen in Lösung bringt, der erhaltenen 20 gen erzielt wurden.

Lösung Methanol zusetzt und den gebildeten Ferner ist aus »Nature«, Vol. 211, 1966, S. 1403,

Niederschlag abtrennt. ein Verfahren zur Reinigung von Asparaginase be-

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, da- kannt, bei dem lyophilisierte E.-coli-B-Zellen mit durch gekennzeichnet, daß man den Nieder- Ultraschall aufgeschlossen, der Extrakt mit Manganschlag der nach dem Gelschritt durchgeführten 25 chlorid behandelt, im Überstand der Manganchlorid-Alkoholfraktionierung des Geleluates in Lösung fällung eine Ammonsulfatfraktionierung durchgebringt, der Lösung Protaminsulfat zusetzt, den führt, anschließend dialysiert und danach eine zweierhaltenen Niederschlag abfiltriert und das FiI- fache Säulenchromatographie über Hydroxylapatit trat mit der L-Asparaginase gewinnt. durchgeführt wird. Dieses Verfahren weist vier groß-

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge- 30 technisch nicht durchführbare bzw. außerordentlich kennzeichnet, daß man das Filtrat der Protamin- aufwendige Verfahrensschritte auf, nämlich
sulfatfällung noch einer Chromatographie an di-

äthylaminoäthyliertem vernetztem Dextran unter- 1. Lyophilisation der Bakterien,

wirft. 2. Ultraschallaufschluß von 30 Minuten,