JP2514087B2 - 総コレステロ―ル分析要素 - Google Patents

総コレステロ―ル分析要素

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JP2514087B2
JP2514087B2 JP64001070A JP107089A JP2514087B2 JP 2514087 B2 JP2514087 B2 JP 2514087B2 JP 64001070 A JP64001070 A JP 64001070A JP 107089 A JP107089 A JP 107089A JP 2514087 B2 JP2514087 B2 JP 2514087B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、血液中に含まれる総コレステロールを定量
分析するための乾式の一体型多層分析要素に関するもの
である。
［従来技術とその欠点］ 血液中の総コレステロールは、エステル型コレステロ
ール（結合型コレステロール）と遊離コレステロールか
ら成る。遊離コレステロールは総コレステロールの僅か
25％程度を占めるに過ぎず、結合型コレステロールが総
コレステロールの約75％を占める。結合型コレステロー
ルはコレステロールエステルと蛋白質との錯体（リポプ
ロテイン）の形で存在する。遊離コレステロールは、コ
レステロールオキシダーゼ等を用いて酸化し、生成する
過酸化水素またはコレステノンを定量することにより定
量できるが、結合型コレステロールは分解して遊離コテ
ステロールにしなければ分析することができない。
コレステロールエステルと蛋白質の錯体（リポプロテ
イン）は、コレステロールエステルに対するコレステロ
ールエステラーゼの作用を阻害するので、エステラーゼ
を作用させる前にこの錯体を分解させる必要がある。特
開昭53−96378号（米国特許4,275,151号、同4,275,152
号に対応）には、エチレングリコール単位が20未満のア
ルキルフェノキシポリエトキシエタノール（ポリエチレ
ンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテルの別名）
を作用させることが提案されている。また米国特許3,92
5,164号でコレステロールエステラーゼとともにポリエ
チレングリコールアルキルエーテルのような界面活性剤
を用いることが知られている。
一方、血液を試料とする臨床化学検査では、微量の液
体試料で精度の高い検査を行うことができることが望ま
しい。従来溶液試薬を用いる湿式法が広く用いられてい
るが、迅速性に欠ける。乾式化学分析、すなわち実質的
に乾燥状態の分析要素、例えば試験片や多層分析要素中
に分析試薬系を導入した臨床分析法が、1970年代から知
られている。乾式化学分析は湿式法による化学分析（即
ち溶液中の試薬を用いる方法）より、例えば使用上の簡
易性、経済上の節約及び分析の迅速さなどの点で優れて
いる。乾式多層分析要素は、微量の液体試料で精度の高
い検査を迅速に行うことができる分析手段として開発さ
れ、例えば特公昭53−21677号、特開昭55−164356号、
特開昭60−222769号等で知られている。乾式多層分析要
素の一例を挙げれば、透明支持体、試薬層、反射層、展
開層から構成されている。透明支持体（例えば下塗り処
理を施した薄いプラスチックフィルム）の上に塗布され
た試薬層には、液体試料中に含まれる被検成分と反応
し、その成分量に応じた光学濃度に発色する試薬が含ま
れる。反射層は、試薬層に入射した光が展開層に達する
のを防ぎ、試薬層の光学測定の際展開層に点着した液体
試料の影響を受けないようにする役割を持つ。展開層
は、点着された液体試料を均一に、液の量にほぼ比例す
る面積に広げる。このような乾式分析要素を用いて定量
分析するには、液体試料、例えば全血を展開層の表面に
一定量滴下する。展開層で展開された血液は反射層を通
って試薬層に達し、ここで試薬と反応し、発色する。点
着後、化学分析スライドを適当な時間、一定温度に保っ
て発色反応を充分に進行させた後、透明支持体側から照
明光を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定し
て反射濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて
定量分析を行う。
従来、湿式法、乾式化学分析いずれにおいても、赤血
球を除去した血清または血漿を試料として分析が行なわ
れることが多かった。しかし血液の他の成分から赤血球
を分離する操作には多くの労力と装置のコストを伴うの
で、未希釈の全血で分析できることが望ましい。
全血を試料として乾式化学分析を行うには、分析要素
中で血清または血漿と血球成分とを分離しなければなら
ない。このような要求を満足する、全血試料中の特定成
分の分析に有用な乾式分析要素が、特開昭62−138757号
で提案された。この分析要素は、第１の非繊維質多孔性
層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質多孔性層がこの順
に一体に積層されており、前記３層の多孔性層がそれぞ
れ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に妨げら
れないような微少貫通部を形成するように部分的に配置
された接着剤により実質的に密着して接着されて一体化
されている、多層分析要素であり、発色等の光学的変化
を生ずる試薬組成物は前記３層の多孔性層のいずれかに
含まれ、被検出成分の存在下での発色等の光学的変化は
主として第１の非繊維質多孔性層で検出される。この多
層分析要素では、第２の非繊維質多孔性層と繊維質多孔
性層が協同的に働いて、血液から血球成分を分離する。
この様に上部に血液から血球成分を分離するための血
球分離層を備えた多層分析要素では、しかし血球分離層
内での溶血が重大な問題となる。即ち、溶血により赤血
球内部から放出されるヘモグロビン等のために、特定波
長域での反射光量の測定が妨害される。また溶血は血清
または血漿中の総コレステロールの濃度を変化させる。
酸素反応や試薬組成物の発色反応が阻害されることもあ
る。このように分析要素中の（特に血球分離層）で溶血
が起こることは、総コレステロール分析の測定精度を下
げる原因になる。
前述のポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニ
ルエーテル（アルキルフェノキシポリエトキシエタノー
ル）はコレステロールの加水分解を行うには有用である
が、それ自身溶血性（溶血させる性質）が大きい。しか
も比較的低分子であるために、組み込んだ層以外への拡
散性が大きい。それ故、血球分離層を備えた乾式分析要
素中にこの物質を組み込むと、分析要素中で溶血が起こ
ってしまい、その結果正確な総コレステロールの濃度分
析が行えないという欠点がある。
この問題を解決するためにポリエチレンオキシド−モ
ノ−アルキルフェニルエーテルのオキシエチレン単位を
大きくする（例えば40以上に）ことを試みた。しかしこ
のようなポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニ
ルエーテルを用いた場合、溶血性は低下するが、一方で
本来の役目である結合コレステロールの分解への効果が
減少してしまい、やはり正確な総コレステロールの濃度
分析は行えなかった。
分析要素中で溶血が起こらず、かつ結合コレステロー
ルが遊離コレステロールに充分分解されるような、優れ
た総コレステロール定量分析用の乾式一体型多層分析要
素が望まれていた。
［本発明が解決しようとする技術的課題］ 本発明において解決すべき技術的課題は、上述の技術
的要求を満たす分析要素を提供することである。即ち、
分析要素中で溶血が起こらず、かつ結合コレステロール
が遊離コレステロールに充分分解されるような、優れた
総コテステロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素
を提供することである。
［技術的課題を解決するための手段］ 前述の技術的課題は、多孔性液体展開層を包含する少
なくとも一つの水透過性層を有し、前記水透過性層のう
ち少なくとも１層にコレステロールエステル加水分解活
性を有する酵素を含む乾式分析要素であって、前記酵素
を含む層またはそれ以外の水透過性層の少なくとも１層
にポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエー
テルとホルムアルデヒドの縮合物を含む分析要素によっ
て解決された。
コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素を
含む層と上記化合物を含む層とは、異なってもよいが、
同一の層であることが好ましい。
ポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエー
テルとホルムアルデヒドの縮合物は、ポリオキシエチレ
ン鎖のオキシエチレン単位の数が20未満である、ポリエ
チレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル分子
２ないし４個の、ホルムアルデヒド縮合物であることが
好ましい。好ましい縮合物は、下記一般式［Ｉ］で表さ
れる。
式中ｍは２から４までの整数、ｎは20未満の整数、Ｒ
は炭素原子数４ないし12のアルキル基を表す。Ｒは炭素
原子数８または９の直鎖または分岐アルキル基であるこ
とが好ましい。
本発明の上記課題はまた、光透過性支持体の上に少な
くとも１層の親水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、
血液から血球成分を分離するための層（血球分離層と称
する）および血球分離層の一部を構成する多孔性血液展
開層が、この順に一体に積層されており、コレステロー
ルエステラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素、コ
レステロールオキシダーゼ、及び過酸化水素の存在下に
検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む総コレ
ステロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素であっ
て、前記多孔性試薬層にコレステロールエステラーゼ活
性を有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキ
シダーゼ、および過酸化水素の存在下に検出し得る光学
的変化を生ずる試薬組成物の少なくとも一部のうちいず
れか少なくとも１つを含み、前記親水性ポリマーを含む
層、多孔性試薬層、血液から血球成分を分離するための
層のうち少なくとも１つに、前記一般式で表される界面
活性化合物を含む分析要素によって、好ましく解決され
た。
［発明の具体的構成の詳細］ 本発明の分析要素は少なくとも一つの水透過性層を有
し、そのうち少なくとも１層は多孔性血液展開層であ
る。
本発明の分析要素は、前記水透過性層のうち少なくと
も１層にコレステロールエステル加水分解活性を有する
酵素を含む。本発明の分析要素は、コレステロールエス
テル加水分解活性を有する酵素を含む層またはそれ以外
の水浸透性層に、ポリエチレンオキシド−モノ−アルキ
ルフェニルエーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含む
ことを、特徴とする。
本発明の分析要素は光透過性支持体を有してもよい。
光透過性支持体は水浸透性であってもよいが、水不浸透
性であることが実用上好ましい。
本発明の分析要素は光透過性支持体の上に、それぞれ
少なくとも１層の、多孔性試薬層および血液から血球成
分を分離するための層（以下、血球分離層を称す）を有
することが好ましい。この構成において光透過性水不浸
透性支持体と多孔性試薬層の間には、少なくとも１層の
親水性ポリマーを含む層を有することが好ましい。
血球分離層のうち支持体と反対の表面に近い部分が、
血液展開層として作用する層であるが、血液展開作用を
してもよく、それが好ましい。
本発明において、光透過性水不浸透性支持体の上に、
親水性ポリマーから成る層、多孔性試薬層、血球分離層
がこの順に一体に積層されており、血球分離層の支持体
と反対の表面に近い部分が血液展開層としての作用をす
る層である多層分析要素が、特に好ましい。
多孔性試薬層は血漿または血清の展開層としての作用
をしてもよい。この場合の展開とは、血液展開層および
／または血球分離層での血液の展開領域よりも広い領域
に、血漿または血清をほぼ一様に展開することを言う。
本発明の分析要素は水浸透性層に、コレステロールエ
ステラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素（以下CH
Eと略記する）、コレステロールオキシダーゼ、ペルオ
キシターゼ、及び過酸化水素の存在下に発色等の検出し
得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む。これら全て
を多孔性試薬層に含んでもよいし、その一部を多孔性試
薬層以外の水浸透性層に含んでもよい。例えば、CHEと
コレステロールオキシダーゼを多孔性試薬層に含み、ペ
ルオキシダーゼと過酸化水素検出試薬組成物を親水性ポ
リマーから成る層に含んでもよい。上記諸成分の一部、
例えばCHEを、血球分離層に含んでもよい。
コレステロールエステルから遊離コレステロールを得
るために用いるコレステロールエステラーゼ活性を有す
る酵素としては、例えば米国特許3,925,164号、同4,27
5,151号等に製法が記載されたコレステロールエステラ
ーゼをはじめ、市販のコレステロールエステラーゼを選
択して用いることができる。コレステロールエステラー
ゼは動物臓器起源のものでも、微生物起源のものでもよ
い。特公昭56−19240号に記載されたように、コレステ
ロールエステラーゼとともにリポプロテインリンパーゼ
を併用してもよい。
遊離コレステロールの定量には、コレステロールオキ
シダーゼを用いて酸化し、生成する過酸化水素を定量す
る方法を用いることができる。コレステロールオキシダ
ーゼとしては、例えば特開昭49−47582号、特公昭57−2
8552号、同57−44318号等に製法が記載されたものを用
いることができる。
過酸化水素を定量する方法は種々のものが良く知られ
ており、当業者はそれらの中から選択して採用すること
ができる。例えば ｉ）ペルオキシダーゼと米国特許3,983,005号に記載さ
れた４−アミノアンチピリンとナフトール類の組み合わ
せ、 ii）特開昭57−142,562号に記載された、ペルオキシダ
ーゼ、水素供与体、N,N−ジ置換アニリンの組み合わ
せ、 iii）ロイコ色素の酸化により染料を生成する系、例え
ば、ペルオキシダーゼと米国特許4,089,747号、に記載
されたトリアリールイミダゾールロイコ色素、又は特開
昭59−193352号等に記載されたジアリールイミダゾール
ロイコ色素との組み合わせ、 等が有用である。
コレステノンを検出するには、ヒドラジン類、例えば
ヒドラジン、2,4−ジニトロヒドラジン等を試薬として
用いることができる。
遊離コレステロールの定量にはまた、NAD（またはNAD
P）依存コレステロールデヒドロゲナーゼを用いて、生
成するコレステノン又はNADH（またはNADPH）を定量す
る方法を用いることもできる。
多孔性試薬層としては、濾紙、不織布のような繊維質
多孔性層を用いてもよいが、非繊維多孔性層を用いるこ
ともできる。特公昭53−21677号、米国特許1,421,341号
等に記載されたセルロースエステル類、例えば、セルロ
ースアセテート、セルロースアセテート／ブチレート、
硝酸セルロースからなるブラッシュ・ポリマーの層が好
ましい。６−ナイロン、6,6−ナイロン等のポリアミ
ド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多孔性膜でも
よい。特開昭62−27006号に記載されたポリスルホンか
ら成る微孔性膜でもよい。その他、特公昭53−21677
号、特開昭55−90859号等に記載された、ポリマー小粒
子、ガラス粒子、けい藻土等が親水性または非吸水性ポ
リマーで結合された連続空隙をもつ多孔性層、特開昭57
−101,760号、同57−101,761号に記載されたポリマー粒
子構造物も利用できる。
相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマ
ーから成るメンブランフィルターでは、厚さ方向の液体
通過経路は膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で
最も狭くなっており、本発明の分析要素の試薬層にこの
種の膜を用いる場合には、層の支持体に近い側にメンブ
ランフィルターの光沢面を向けることが好ましい。
親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一層
を塗布した後、試薬組成物を含まない非繊維多孔性層を
特開昭55−164356号のような方法で接着させることによ
って、試薬組成物を第１の非繊維多孔性層に実質的に含
有させることができる。
試薬組成物には必要に応じ、活性化剤、緩衝剤、硬膜
剤、界面活性剤等を含有させることができる。本発明の
分析要素の試薬層に含有させることができる緩衝剤の例
としては、日本化学会編『化学便覧 基礎編』（東京、
丸善（株）、1966年発行）1312−1320頁、R.M.C.Dawson
et al編『Data for Biochemical Research』第２版（O
xford at the Clarendon Press,1969年発行）476−508
頁、『Biochemistry』５,467−477頁（1966年）（Good
のpH緩衝剤）、『Analytical Biochemistry』104,300−
310頁（1980年）等に記載のpH緩衝剤がある。好ましい
緩衝剤の具体例として、燐酸塩、硼酸塩、炭酸塩、Tri
s、Bicine、HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）
各々を含むpH緩衝剤がある。これらの緩衝剤は『蛋白質
・酵素の基礎実験法』（堀尾武一ほか著、南江堂、1981
年）、前記Biochemistry誌第５巻等を参考にして選択す
ることができる。
遊離コレステロールとの反応により中間体を生成する
組成物を試薬層に、中間体と反応して染料等を生成し得
る組成物（指示薬）を試薬層と支持体との間にある第２
の試薬層に含んでもよい。この場合第２の試薬層は、多
孔質であってもよいが、親水性ポリマーを結合剤とする
実質的に均一な層であることが好ましい。親水性ポリマ
ーとして例えばゼラチンおよびその誘導体（例えばフタ
ル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシ
プロピルセルロース）、アガロース、アクリルアミド重
合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミドまた
はメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重
合体等が利用できる。第１の試薬層と第２の試薬層の間
に妨害物除去層（例えばResearch Disclosure,No.12626
（1974）,p.51to56に記載されたような）を設けてもよ
い。
血液展開層は、試料血液に対して液体計量作用を有す
る層であることが好ましい。液体計量作用とは、その表
面に点着供給された液体試料を、その中に含有している
成分を実質的に偏在させることなく、面方向に単位面積
当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。
血液展開層をかねる血球濾過層を構成する繊維質多孔
性材料としては、紙、不織布、織物生地（例えば平織
生地）、編物生地（例えばトリコット編）、ガラス繊維
紙等を用いることができる。また、特開昭62−91543
に記載の多層塗布法又は多層流延法により形成された２
層の高分子微多孔性層がその界面で密着一体化してなる
連続微空隙を有する構造の複合メンブランフィルタ（複
合ブラッシュポリマー層）を用いることができる。これ
らのうち織物、編物が好ましい。織物等は特開昭57−66
359号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよ
い。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するた
め、特開昭60−222770号、特願昭61−122875号、同61−
122876号、同61−143754号に記載したような親水性高分
子あるいは界面活性剤を含有してもよい。
血球分離層としては、繊維質多孔性層と非繊維質多孔
性層が部分接着された多孔性層を用いることができる。
２層の多孔性層は繊維質多孔性層を支持体から遠い側に
配置する。非繊維多孔性層として、特公昭53−21677、
米国特許3 992 158、米国特許1 421 341等に記載のセル
ロースエステル類、例えば、セルロースアセテート、セ
ルロースブチレート、セルロースアセテートブチレート
（混合エステル）、セルロースニトレート；セルロース
エーテル類、例えば、エチルセルロース；炭酸エステル
ポリマー類、例えばビスフェノールＡのポリカルボネー
ト；ポリアミド、例えばポリカプラミド（６−ナイロ
ン）、ポリヘキサメチレンアジポアミド（6,6−ナイロ
ン）等からなるメンブランフィルタ（ブラッシュポリマ
ー層）；第９回プラスチックフィルム研究会講座講演要
旨集（高分子学会、1984年２月22日発行）、Membrana I
nc.カタログ（1982年７月発行）等に記載のポリエチレ
ン微多孔性膜、ポリプロピレン微多孔性膜等のポリオレ
フィン微多孔性膜；特開昭62−27006に記載のポリスル
ホンからなる微多孔性膜；特公昭53−21677、特開昭55
−90859等に記載のポリマー小粒子、ガラス粒子、珪藻
土等が親水性又は非吸収性ポリマーで結合された連続空
隙をもつ微多孔性層等の非繊維質等方的多孔性層等を用
いることができる。
非繊維質多孔性層の空隙サイズ（平均最小孔径）は約
0.8μｍから約30μｍ、好ましくは約1.0μｍから約10μ
ｍの範囲、空隙率は約20％から約90％、好ましくは約40
％から約85％の範囲、厚さは約20μｍから約500μｍ、
好ましくは約80μｍから約350μｍの範囲である。
繊維質多孔性層としては、前記の繊維質多孔性層を用
いることができる。２層の多孔性層を部分接着する方法
及び用いる接着剤は特開昭62−138757等に記載の方法に
よることができる。好ましい接着剤はホットメルト型接
着剤である。２層の多孔性層を部分接着してなる血球濾
過層は、２層が一体となって全血から血球を濾過すると
ともに全血を展開する。
本発明で用いるポリエチレンオキシド−モノ−アルキ
ルフェニルエーテルのホルムアルデヒド縮合物は、公知
の方法で合成することができる。例えば米国特許2,541,
991号に記載された方法で合成できる。即ち、アルキル
フェノールとホルムアルデヒドとの縮合物を、アルキレ
ンオキシドと反応させてオキシアルキル化することによ
り、合成できる。また特公昭38−23,347号に記載された
方法を利用することもできる。
［実施例１］ １−1.ロイコ色素分散液の調製 ロイコ色素溶液 下記組成Ａのロイコ色素溶液を調製した。
A: ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
４−〔４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−フェネ
チルイミダゾール酢酸塩 5.7g ２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
４−〔４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−フェネ
チルイミダゾール塩酸塩 0.8g N,N−ジエチルラウリルアミド 104 ｇ ゼラチン溶液 下記組成Ｂのゼラチン溶液を作成した。
B: アルカリ処理ゼラチン 300 ｇ 水 1900 ｇ ビス〔（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ〕
メタン 3.0g 乳化物の調製 Ｂ液をTKオートホモミキサー（特殊機械工業社製 乳
化器）で約5700回転／分で撹拌しながらＡ液を添加し、
約30分間分散して、乳化物を調製した。
１−2.発色試薬層の塗布 上記乳化物を、ゼラチン下塗りされている厚さ180μ
ｍの透明ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルム
（支持体）の上に1m2当たり150gの割合で塗布し、乾燥
させ、発色試薬層とした。
１−3.第１多孔質層の積層と処理 上記発色試薬層の表面を約25℃の水で一様に湿らせ
（約30g/m2の割合）、有効孔径1.2μｍ、厚さ140μｍ、
空隙率約80％のセルロースアセテート メンブレンフィ
ルター（富士写真フイルム（株）製ミクロフィルターFM
300）を重ね合わせ、乾燥させて、発色試薬層にメンブ
レンフィルターを接着させた。
次にこのメンブレンフィルターの上から、別に調製し
ておいた下記組成物［１］を1m2当たり110mLの割合で塗
布し、乾燥させて、第１多孔質層とした。
［１］ 水 1223 g コレステロールエステラーゼ 1.7 g コレステロールオキシダーゼ 10.18g リポプロテインリパーゼ 1.94g ペルオキシダーゼ 8.86g フェロシアン化カリウム 5.6 g 一般式［Ｉ］の化合物（ただしＲ＝ｐ−ノニル,n−10,m
＝２およびｍ＝３の混合物） 4.6 g １−4.第２多孔質層および展開層の含浸処理 第２多孔質層とするための有効孔径３μｍ、厚さ140
μｍ、空隙率約80％のセルロースアセテートメンブレン
フィルター（富士写真フイルム（株）製ミクロフィルタ
ーFM300）と、試料展開層とするための、50デニール相
当のPET紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編物布地
（厚さ約250μｍ）を、それぞれ一般式［Ｉ］の化合物
（ただしＲで示される置換基がｐ−ノニル基、ｎ＝10、
ｍ＝２およびｍ＝３の混合物）の２重量％水溶液に浸漬
し、空隙に液を満たした後取り出して、乾燥させた。
１−5.第２多孔質層および展開層の積層 次に含浸処理済みのトリコット編物生地の温度80℃に
予熱した表面に、温度130℃に加熱熔融したホットメル
ト型接着剤を、グラビア印刷法を利用して、グラビアロ
ーラーからの転写により点状に付着させた。グラビアロ
ーラーのドット中心間隔0.9mm、ドット面積率は約20
％、付着した固形成分量（単位面積当たり）は約3g/m2
であった。
高温の接着剤が付着した布地（展開層となる）の表面
に、直ちに含浸処理済みの前記メンブレンフィルター
（第２多孔質層となる）の非光沢面を向かい合わせ、両
者をラミネートローラーの間を通してラミネート（接着
一体化）した。
この重層物（展開層および第２多孔質層）を上記と同
じ点状接着法により前記第１多孔質層の面上に接着し、
一体化させた。すなわち上記重層物のメンブレンフィル
ター面に、加熱したホットメルト型接着剤を、グラビア
印刷法を利用してグラビアローラーからの転写により点
状に付着させた後、直ちに前記第１多孔質層（支持体お
よび発色試薬層の上にある）の面と向かい合わせ、両者
をラミネートローラーの間を通し、ラミネート（接着一
体化）した。
こうして完成した総コレステロール測定用分析フィル
ムは、支持体、発色試薬層、第１多孔質層、第２多孔質
層、布展開層の順に一体に積層されている。布展開層と
第２多孔質層とは協同して、血球ろ過層として作用す
る。第１多孔質層は、コレステロールの存在下に第２鉄
イオンを生成する反応層として作用する。発色試薬層
は、コレステロールの存在下に第１多孔質層で生成した
第２鉄イオンにより色素を形成し、色素は透明支持体を
通して光学的に検出される。
１−6.分析スライドの製作 得られた総コレステロール定量分析用分析フィルムを
一辺15mmの正方形チップに裁断し、特開昭58−32350号
に記載のスライド枠に収めて総コレステロール定量用生
化学分析スライドを完成した。
［比較例１］ 実施例１の一般式［Ｉ］の化合物の代わりに、ポリエ
チレンオキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエーテル
（ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）
（オキシエチレン単位縮合数10）を用いた他は、実施例
１と同様の手順で、総コレステロール定量用生化学分析
スライドを完成した。
［測定例１］ 分析スライドの全血中総コレステロールによる発色
を、下記のようにして評価した。
総コレステロール160mg/dLを含むヒト血漿と、同じ総
コレステロール含有量でヘマトクリット値40％のヒト全
血試料を用意し、各10μＬを実施例１および比較例１で
作成した分析スライドの展開層上にそれぞれ点着し、37
℃で３分および６分間インクベーション後、中心波長64
0nmの可視光でPET支持体側から反射測光により、分析ス
ライドの発色光学濃度を測定した。結果を第１表に示
す。表中の数値は、血漿で得られた反射光学濃度に帯す
る全血で得られた反射光学濃度の百分率である。
第１表から明らかなように、実施例１では血漿でも全
血でも同様の反射光学濃度が得られたが、比較例１では
全血での発色が、血漿でのそれに比し著しく低下した。
［参考例１］（溶血に関する試験） ヒト全血に第２表に示す種類の界面活性剤を添加し十
分に攪拌した後に、遠心分離（5000rpm、10分）を行
い、得られた上澄み液（血漿）の中心波長575nmの可視
光に対する透過率を測定し、吸光度を求めた。同じ全値
を凍結により完全に溶血させた後同じ操作で得た血漿
の、同じ方法で測定した吸光度を100とした前記吸光度
の相対値を溶血度として、第２表に示した。
［参考例２］（総コレステロールの分解） 下記組成の総コレステロール定量用試薬溶液を調製し
た。
水 1000 mL コレステロールエステラーゼ 4.0u コレステロールオキシダーゼ 4.0u ペルオキシダーゼ 10.0u ４−アミノアンチピリン 2.0mM 1.7−ジヒドロキシナフタレン 4.0mM ポリエチレンオキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエ
ーテル（オキシエチレン単位数10） 20 g リン酸ナトリウム緩衝液（pH＝6.8） 67 mM この試薬溶液3mLに、総コレステロール濃度の異なる
コレステロール標準液20μＬを加え、37℃、10分間の反
応検量線を作成した。
上記組成のうちポリエチレンオキシド−モノ−ｐ−オ
クチルフェニルエーテル（オキシエチレン単位数10）の
代わりに、参考例１と同じ他の界面活性剤を用い、160m
g/dLの総コレステロールを含むヒト血漿を試料として同
様の反応を行い、先に得られた検量線により総コレステ
ロール濃度を算出した。第３表に示す結果が得られた。
第３表から明らかなように、オキシエチレン単位の多
いポリエチレンオキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニル
エーテル（オキシエチレン単位数40）では結合コレステ
ロールの充分な分解が行なわれないが、本発明のポリエ
チレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテルホル
マリン縮合物はオキシエチレン単位10のポリエチレンオ
キシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエーテルと同等の
結合コレステロール分解能力を示している。即ち、リポ
プロテインとの結合破壊に十分な効果を有すると推定さ
れる。
なお、参考例１および２の結果を総合すると、オキシ
エチレン単位10のポリエチレンオキシド−モノ−アルキ
ルフェニルエーテルは十分な結合コレステロール分解能
力を有するが全血試料の溶血を起こし、他方オキシエチ
レン単位数の大きいポリエチレンオキシド−モノ−アル
キルフェニルエーテルは溶血を起こさないが結合コレス
テロール分解能力が低い。これに対し、本発明によるポ
リエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル
ホルマリン縮合物は、十分な結合コレステロール分解能
力を示し、しかも溶血を起こさない。

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】多孔性液体展開層を包含する少なくとも１
    つの水透過性層を有し、前記水透過性層のうち少なくと
    も１層にコレステロールエステル加水分解活性を有する
    酵素を含む乾式分析要素であって、前記酵素を含む層又
    はそれ以外の水透過性層の少なくとも１層に、下記一般
    式で表されるポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフ
    ェニルエーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含む総コ
    レステロール分析要素。 式中ｍは２から４までの整数、ｎは20未満の整数、Ｒは
    炭素原子数４ないし12のアルキル基を表す。
  2. 【請求項２】前記一般式で表わされる縮合物において、
    Ｒが炭素原子数８又は９の直鎖又は分岐アルキル基であ
    る特許請求の範囲１に記載の総コレステロール分析要
    素。
  3. 【請求項３】光透過性支持体の上に少なくとも１層の親
    水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、血液から血球成
    分を分離するための層（血球分離層と称する）がこの順
    に一体に積層されており、血球分離層の一部は多孔性血
    液展開層であり、コレステロールエステラーゼ活性を有
    する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダー
    ゼ及び過酸化水素の存在下に検出し得る光学的変化を生
    ずる試薬組成物を含む総コレステロール定量分析用の乾
    式一体型多層分析要素であって、前記多孔性試薬層にコ
    レステロールエステラーゼ活性を有する少なくとも１種
    の酵素、コレステロールオキシダーゼ及び過酸化水素の
    存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物の少
    なくとも一部のうちいずれか少なくとも１つを含み、前
    記親水性ポリマーを含む層、前記多孔性試薬層、前記血
    球分離層のうち少なくとも１つに、下記一般式で表され
    る界面活性化合物を含む総コレステロール分析要素。 式中ｍは２から４までの整数、ｎは20未満の整数、Ｒは
    炭素原子数４ないし12のアルキル基を表す。
  4. 【請求項４】前記一般式で表わされる界面活性化合物に
    おいて、Ｒが炭素原子数８又は９の直鎖又は分岐アルキ
    ル基である特許請求の範囲３に記載の総コレステロール
    分析要素。
  5. 【請求項５】前記血球分離層の支持体から遠い部分が多
    孔性血液展開層である特許請求の範囲３又は４に記載の
    総コレステロール分析要素。
  6. 【請求項６】前記多孔性試薬層と前記血球分離層のうち
    少なくとも１つに、前記一般式で表される界面活性化合
    物を含む特許請求の範囲３又は４に記載の総コレステロ
    ール分析要素。
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