JPH0522520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血液等の各種生物体液、飲食物その
他の水性液体試料に含まれている総コレステロー
ルを定量分析するための、乾式の一体型多層分析
要素の改良に関するものである。 〔従来の技術および本発明が解決しようとする問
題点〕 リポプロテインの型で存在する血液等の体液中
のコレステロールとコレステロールエステルの定
量分析を乾式の一体型多層分析要素を用いて行う
場合、水性液体試料である血液を水、生理的塩類
水溶液、PHバツフアー等で稀釈することなしに用
いるために、分析要素中で呈色反応が迅速に進ま
なかつたり、体液中の共存物質（例、血液中の中
性脂肪）の干渉を受けて、正確な定量分析が困難
であつた。この問題を解決するために、特開昭53
−96378、特開昭61−85200、「CLINICAL
CHEMISTRY」28、1159−1162（1982）等にア
ルキルフエノキシポリエトキシエタノールを併用
することが提案されている。 しかし、これらの提案の技術においてもなお、
以下のような問題点があることが判明した。 コレステロールエステラーゼ活性が阻害され
る。 乾式多層分析要素の便用前の保存時に、多層
要素が水を吸収する傾向が強く、そのために要
素中の酵素活性が減少又は失活するので、要素
の性能が劣化しやすい。 「CLINICAL CHEMISTRY」20、470−475
（1974）及び特開昭50−125796にはコレステロー
ルエステラーゼと胆汁酸又はその塩を併用して、
水溶液中で効率的にコレステロールエステルを加
水分解することが記載されている。そこで、乾式
の一体型多層分析要素にこの技術を応用してみた
ところ、水性液体試料、特に血液（全血、血漿、
血清）の多孔性展開層での展開が悪く、分析精度
が著しく低下することが判明した。 上述の諸問題点（コレステロールエステラーゼ
活性の阻害、保存経時での性能劣化、低い分析精
度等）が解決された優れた総コレステロール定量
分析用の乾式の一体型多層分析要素が望まれてい
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはこのような問題を解決するべく鋭
意検討を行い胆汁酸又はその塩とオキシエチレン
単位16以上（平均20以上）のポリオキシエチレン
鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシコタノ
ールの組合せを含むコレステロール分析用試薬組
成物を用いることにより、コレステロールエステ
ラーゼ活性を有する酵素の活性阻害が少く保存安
定性が向上した乾式の一体型多層分析要素が得ら
れることが明らかになつた。 また、血液（全血、血漿、血清）のように呈色
試薬組成物の発色に干渉を与える諸種の物質が共
存するような液体試料を用いる場合に、胆汁酸又
はその塩とオキシエチレン単位16以上（平均20以
上）ポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフエノ
キシポリエトキシエタノールを試薬組成物に共存
させると、呈色反応が円滑に進行し、大きな発色
光学濃度が得られて正確な総コレステロール含有
量の比色分析が可能なことが明らかになつた。 すなわち、本発明は、少なくとも、光透過性水
不透過性支持体、１層以上の親水性ポリマーを含
む層（以下、親水性層ということがある）、及び
展開層がこの順に積層されるとともにコレステロ
ールエステラーゼ活性を有する少なくとも１種の
酵素、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキ
シダーゼの各酵素、並びに発色試薬組成物を展開
層、親水性層、又は要素内の他の親水性層中に含
有する総コレステロール分析用乾式一体型多層分
析要素において、胆汁酸化合物（胆汁酸類、胆汁
酸誘導体及びそれらの塩のうちの少なくとも１
種）とオキシエチレン単位16以上（平均20以上）
のポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフエノキ
シポリエトキシエタノールとの組合せを展開層又
はいずれかの親水性層に含有させた改良された、
一体型多層分析要素に関するものである。 〔発明の構成の詳細な説明〕 光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要
素に使用されている公知のものを利用すればよ
い。その具体例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、
ポリスチレン、セルロースエステル（セルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート、セル
ロースアセテートプロピオネート等）などのポリ
マーからなる厚さ約50μmから約１mm、好ましく
は約80μmから約300μmの範囲の透明支持体を用
いることができる。支持体の表面には必要により
前記の諸特許明細書等より公知の不塗層または接
着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等
との接着を強固にすることができる。 親水性層は呈色反応して発色した色素が蓄積さ
れる層であり、また呈色反応時のPHを安定させる
PH緩衝剤組成物を含有させることができる層であ
つて、親水性ポリマーバインダーにより形成さ
れ、親水性ポリマーバインダー、のみ又はこれと
他の成分から形成されるものである。親水性層は
試薬成分を含まず吸水して膨潤し、検出種を受容
して蓄積する吸水層、検出種を媒染固定できる陰
電荷又は陽電荷を有する媒染剤を含みかつ吸水し
て膨潤する検出層として機能させることができ
る。親水性ポリマーバインダーは水吸収時の膨潤
率が30℃で約150％から約2000％、好ましくは約
250％から約1500％の範囲の天然または合成親水
性ポリマーである。 その例として、特開昭59−171864、特開昭60−
108753等に開示のゼラチン（酸処理ゼラチン、脱
イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化
ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラ
チン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン等をあげることができ
る。親水性層の乾燥時の厚さは約1μmから約
100μm、好ましくは約3μmから約50μm、特に好
ましくは約5μmから約30μmの範囲であり、また
実質的に透明であることが好ましい。 親水性層にはPH緩衝剤、酵素、発色試薬組成
物、その他の必要により組合せられる試薬（例、
フエロシアン化物）の一部又は全部、さらには公
知の媒染剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー等を
含有させることもできる。この場合には親水性層
は試薬層又は呈色試薬層として機能する。 展開層としては特公昭53−21677号公報等に開
示のメンブランフイルタ（ブラツシユポリマー
層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビー
ズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持さ
れてなる連続微空隙含有多孔性層、特開昭55−
90859号公報に開示のポリマーミクロビーズ、ガ
ラスミクロビーズ等が水で膨潤しないポリマー接
着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有
多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊
維質等方的多孔性展開層、特開昭55−164356号公
報、特開昭57−66359号公報等に開示の織物展開
層、特開昭60−222769号明細書に開示の編物展開
層、特開昭57−148250号公報に開示の有機ポリマ
ー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層等の繊
維質多孔性展開層等があげられる。 展開層は直接あるいは必要により接着層を介し
て前記の親水性層の上に積層される。展開層に酵
素、発色試薬組成物、必要により組合せ含有され
るフエロシアン化物その他の試薬の一部又は全部
を含有させることもできる。特に酵素のうち、コ
レステロールエステラーゼ活性を有する酵素は多
孔性展開層に含有させることが好ましい。 本発明の一体型多層分析要素には、前述の諸特
許明細書に開示の試薬層、光遮蔽層、光反射層、
濾過層、半透膜層、バリヤ層、拡散防止層（マイ
グレーシヨン防止層）等やこれら単独の層を有す
る機能を二つ以上併せもつ層を組みこむことがで
きる。 試薬層は酵素、発色試薬組成物、必要により組
合せられるフエロシアン化物、その他の試薬の一
部又は全部を含有する層であり、非孔性で吸水性
の層又は微多孔性で水浸透性の層である。 実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる
親水性ポリマーバインダーは、試薬を実質的に均
一に溶解または分散させる媒体として作用し、ま
た液体試料中の水を吸収して水とともに被検成分
を試薬層に到達させる作用を少なくとも有するも
のである。親水性ポリマーバインダーとしては前
記の親水性層に用いられる吸水性の親水性ポリマ
ーバインダーと同じポリマーから適宜に選択して
用いることができる。実質的に非孔性の試薬層の
乾燥厚さは約3μmから約50μm、好ましくは約
5μmから約30μmの範囲であり、また試薬層は実
質的に透明であることが好ましい。 微多孔性で水浸透性の試薬層は固体微粒子とそ
のバインダーである親水性ポリマーバインダーか
ら構成される微多孔性構造体層に試薬または試薬
組成物が含有保持されている層である。ここでい
う微多孔性構造体層とは微多孔性微粒子または非
多孔性微粒子と微粒子間を接着して微多孔性連続
空隙構造を保持する親水性ポリマーバインダーか
らなる構造物の層である。 微多孔性試薬層に用いられる微多孔性微粒子ま
たは非多孔性微粒子の例として微結晶性セルロー
ス、セルロース微粉末または微粒子等のセルロー
ス微粒子、シリカ、珪藻土等の二酸化珪素化合物
の微粒子、沸石等の珪酸塩の微粒子、ポリマーミ
クロビーズ、ガラスミクロビーズ、諸種のセラミ
ツクスビーズ等があげられる。親水性ポリマーイ
ンバーターとしては、前記の親水性層に用いられ
る吸水性の親水性ポリマーと同じポリマーから適
宜に選択して用いることができるほか、特開昭59
−145965等に開示の親水性構成繰返し単位を約２
％以上含有するコポリマーの水性ラテツクス等を
用いることもできる。微多孔性試薬層の乾燥層厚
は約7μmから約50μm、好ましくは約10μmから約
30μmの範囲である。 試薬層には公知のPH緩衝剤組成物、高分子PH緩
衝剤、塩基性ポリマー、酸性ポリマー、高分子媒
染剤等を含有させることができる。 試薬層と支持体の間に吸水層を配置する態様は
好ましい１実施態様例である。また、親水性層に
発色試薬組成物を、多孔性展開層に酵素、胆汁酸
化合物及びアルキルフエノキシポリエトキシエタ
ノールを、それぞれ含有させる態様は特に好まし
い１実施態様例である。 試薬層または親水性層の上に光遮蔽層を設ける
ことができる。光遮蔽層は光遮蔽性または光遮蔽
性と光反射性を兼ね備えた微粒子または微粉末
（以下、単に微粒子という）が少量の皮膜形成能
を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持さ
れている水透過性または水浸透性の層である。光
遮蔽層試薬層又は親水性層における発色を光透過
性支持体側から反射測光する際に展開層に点着供
給された水性液体試料の色、特に全血試料に含ま
れるヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光
反射層または背景層としても機能する。 光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例
として二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナター
ゼ型またはブルカイト型の粒子径約0.1μmから約
1.2μmの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、
アルミニウム微粒子または微小フレーク等があ
り、光遮蔽性微粒子の例としてカーボンブラツ
ク、ガスブラツク、カーボンミクロビーズ等があ
る。これらのうちでは二酸化チタン微粒子及び硫
酸バリウム微粒子が好ましい。皮膜形成能を有す
る親水性ポリマーボインダーとしては親水性層に
用いられるのと同じ親水性ポリマーのほかに弱親
水性の再生セルロース、セルロースアセテート等
がある。これらのうちでは、ゼラチン、ゼラチン
誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。ゼラ
チン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）
を混合して用いることができる。 光遮蔽層は光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーと
の水性分散液を公知の方法により試薬層または親
水性層の上に塗布し乾燥することにより設けるこ
とができる。光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーバ
インダーとの乾燥時の体積比は光遮蔽性微粒子10
に対しポリマーバインダーが約2.5から約7.5、好
ましくは約3.0から約6.5の範囲であり、光遮蔽性
微粒子が二酸化チタン微粒子の場合には重量比で
二酸化チタン微粒子10に対しポリマーバインダー
が約0.6から約1.8、好ましくは約0.8から約1.5の
範囲である。光遮蔽層の乾燥層厚は約3μmから約
30μm、好ましくは約5μmから約20μmの範囲であ
る。 展開層、光遮蔽層等を接着し積層するために接
着層を設けることができる。光遮蔽層の上に多孔
性展開層を設ける場合には接着層は必須である。
接着層は水で湿潤しているとき、または水を含ん
で膨潤しているときに展開層を接着して一体化で
きる親水性ポリマーから主としてなる。接着層に
用いうる親水性ポリマーとしては親水性層に用い
るのと同じ親水性ポリマーがあげられ、これらの
うちでゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリル
アミド等が好ましい。接着層の乾燥層厚は約
0.5μmから約20μm、好ましくは約1μmから約
10μmの範囲である。接着層には界面活性剤を含
有させることができる。界面活性剤としてはノニ
オン性界面活性剤、例えばオキシエチレン基また
はオキシプロピレン基が８〜15個連なつた鎖状構
造を含むノニオン性界面活性剤が好ましい。 接着層は親水性ポリマーと所望により加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で試薬
層、親水性層、又は光遮蔽層の上に塗布して設け
ることができる。 次に本発明の総コレステロール定量用一体型多
層分析要素に含有されるコレステロール分析用呈
色試薬組成物について説明する。本発明の要素に
含まれるコレステロール分析用呈色試薬組成物は
コレステロールエステラーゼ活性を有する少なく
とも１種の酵素、コレステロールオキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ、発色試薬組成物、胆汁酸類、
胆汁酸誘導体及びそれらの塩からなる群から選ら
ばれた少なくとも１種の化合物、及び16以上（平
均20以上）のオキシエチレン単位からなるポリオ
キシエチレン鎖を含むアルキルフエノキシポリエ
トキシエタノールを含む。さらに組成物中にはフ
エロシアン化物を含ませることができる。 コレステロールエステラーゼ（E.C.3.1.1.13）
は試料中に含まれているコレステロールエステル
をコレステロールに変える酵素であり、コレステ
ロールオキシダーゼ（E.C.1.1.3.6）はコレステロ
ールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素であ
る。ペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7）はこの過
酸化水素を利用して発色試薬組成物を酸化発色さ
せる反応に関与する酵素である。コレステロール
エステラーゼとしてはEC3.1.1.13に分類される酵
素を用いることができるだけでなく、コレステロ
ールエステラーゼ活性を有する他の単独の酵素
（例、特公昭56−45599に記載のコレステロールエ
ステラーゼ活性を有するリパーゼＭ、リパーゼ
3000）、および２種以上の酵素の組合せ（例、
特公昭56−45599に記載のコレステロールエステ
ラーゼ活性を有するリパーゼ（例、リパーゼＭ
、リパーゼ3000）、とプロテアーゼ（例、キ
モトリプシン（EC3.4.21.1）、パパイン
（EC3.4.21.2）、プロメライン（EC3.4.22.4）、プロ
ナーゼ）との組合せを用いることができる。 コレステロールオキシダーゼ（EC1.1.3.6）は
コレステロールを酸化して過酸化水素を発生させ
る酵素である。コレステロールオキシダーゼとし
ては、市販の酵素から適宜に選択して用いること
ができる。必要に応じて補酵素FDA（フラビン
アデニン ジヌクレオチド）とともに用いること
ができる。 ペルオキシダーゼとしては特公昭56−45599号、
特公昭57−5520号等に記載の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（EC1.11.1.7）、特公昭
58−5035号等に記載の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（EC1.11.1.7）を用いることができる。これ
らのうちでは植物起源または微生物起源の非特異
性ペルオキシダーゼが好ましい。好ましいペルオ
キシダーゼの例として西洋わさび、大根から抽出
したペルオキシダーゼ、Cochliobolus属、
Curvularia属の微生物から抽出したペルオキシダ
ーゼ等がある。 胆汁酸類としては、コール酸、デオキシコール
酸、リトコール酸、ケノデオキシコール酸があげ
られる。胆汁酸誘導体としては、タウロコール
酸、グリコール酸、タウロデオキシコール酸、グ
リコデオキシコール酸があげられる。胆汁酸類お
よび胆汁酸誘導体の塩としては、上記の酸のナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩等があげられ
る。本発明の多層分析要素においては、上記の胆
汁酸類、胆汁酸誘導体およびそれらの塩（本明細
書ではこれらを総称して胆汁酸化合物という）の
うちの少なくとも１種の化合物をいずれかの層に
含有する。胆汁酸化合物は展開層又は展開層に隣
接する層に含有させることが好ましい。胆汁酸化
合物はアルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ル、コレステロールエステラーゼ活性を有する単
独の酵素又は２種以上の酵素の組合せとともに同
じ層に含有させることが特に好ましい。 16以上（平均20以上）のオキシエチレン単位か
らなるポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフエ
ノキシポリエトキシエタノール（以下、単にアル
キルフエノキシポリエトキシエタノールというこ
とがある。またこの化合物の別名はポリオキシエ
チレン アルキルフエニル エーテル）のアルキ
ル基としては、各種のアルキル基が用いうるが、
好ましくはオクチル基、１，１，３，３−テトラ
メチルブチル基、ノニル基等の炭素原子数８又は
９の直鎖状又は分岐枝状のアルキル基である。ポ
リオキシエチレン鎖中のオキシエチレン単位数と
しては16から約60までの範囲、好ましくは平均20
から50までの範囲である。アルキルフエノキシポ
リエトキシエタノールの例として、オクチルフエ
ノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン
単位９〜11含有物の混合物、平均20〜40含有物
等）、ノニルフエノキシポリエトキシエタノール
（オキシエチレン単位平均20〜40含有物等）、１，
１，３，３−テトラメチルブチルフエノキシポリ
エトキシエタノール（オキシエチレン単位平均20
〜40含有物等）がある。アルキルフエノキシポリ
エトキシエタノールはコレステロールエステラー
ゼ活性を有する単独の酵素又は２種以上の酵素の
組合せ、胆汁酸化合物とともに同じ層に含有させ
るか、相互に隣接する層に含有させることが好ま
しい。アルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ルは２種以上の化合物を組合せて用いることがで
きるほか、他の種類の界面活性剤、とくに他のノ
ニオン性界面活性剤を併用することもできる。 発色試薬組成物は色原体とカプラーを含み、
ペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素により色
原体とカプラーが酸化カプリングしてキノンイミ
ン染料を形成して発色する組成物、またはロイ
コ色素でペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素
により酸化されて色素になり発色する化合物であ
る。 色原体としては、Ann.Clin.Biochem.，６，24
−27（1969）に記載の４−アミノアンチピリン
（別名４−アミノフエナゾン、すなわち１−フエ
ニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラ
ゾリン−５−オン）、特開昭59−54962等に記載の
１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３
−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン、１−（３，５−ジクロロフエニル）−２，３
−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン等のトリ置換−４−アミノ−３−ピラゾリン
−５−オン、特公昭55−25840等に記載の１−フ
エニル−２，３−ジメチル−４−ジメチルアミノ
−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミノアン
チピリン類似体を用いることができる。これらの
化合物のうちでは、４−アミノアンチピリン、１
−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２，３−
ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オ
ン、１−（３，５−ジクロロフエニル）−２，３−
ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オ
ン等が好ましい。 カプラーとしては、Ann.Clin.Biochem.，６，
24−27（1969）、特公昭55−25840、特公昭58−
45599、特公昭58−18628、特開昭55−164356、特
開昭56−124398、特開昭56−155852等に記載のフ
エノール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホ
ン酸、４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン
酸、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベ
ンゼンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−メトキ
シ−１−ベンゼンスルホン酸等のフエノールスル
ホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を
含む）；１−ナフトール、２−ナフトール；１，
７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキシナ
フタレン；１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスル
ホン酸、１−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホ
ン酸等のナフトールスルホン酸（アルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩を含む）；その他のフエ
ノールまたはナフトール誘導体がある。これらの
化合物のうちでは、１，７−ジヒドロキシナフタ
レン、１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホン
酸（Na塩、Ｋ塩、Li塩を含む）、３，５−ジクロ
ロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸
（Na塩、Ｋ塩、Li塩を含む）が好ましい。 ロイコ色素として、特公昭57−5519に記載の２
−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエニ
ル）−４，５−ビス〔４−（ジメチルアミノ）フエ
ニル〕イミダゾール等のトリアリールイミダゾー
ルロイコ色素；特開昭59−193352に記載の２−
（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフエニル）
−４−〔４−（ジメチルアミノ）フエニル〕−５−
フエネチルイミダゾール等のジアリールイミダゾ
ールロイコ色素；特開昭61−4960に記載の２−
（２−フエニル−３−インドリル）−４，５−ジ
「４−（ジメチルアミノ）フエニルイミダゾール等
のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色
素；特開昭61−229868に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフエニル）−３−アセ
チル−４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フ
エニル〕イミダゾール等のトリアリールモノアシ
ルイミダゾールロイコ色素；２−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジメトキシフエニル）−３−メチル
−４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フエニ
ル〕イミダゾール等のトリアリールモノアルキル
イミダゾールロイコ色素等がある。 コレステロール分析用呈色試薬組成物には、オ
プシヨナル成分として、フエロシアン化物を加え
ることができる。 フエロシエン化物としては、フエロシアンイオ
ン（ヘキサシアノ鉄（）酸イオン；すなわち
〔Fe（CN）₆〕⁴ ）を含有するか、または放出しう
る化合物を用いることができる。フエロシアン化
物としてはヘキサシアノ鉄（）酸のアルカリ金
属塩、アルカリ土類金属塩、これらの混合金属塩
を用いることができる。 フエロシアン化物の具体例としては、フエロシ
アン化ナトリウムNa₄〔Fe（CN）₆〕；フエロシアン
化カリウムK₄〔Fe（CN）₆〕；ヘキサシアノ鉄（）
酸リチウム；ヘキサシアノ鉄（）酸マグネシウ
ム；ヘキサシアノ鉄（）酸カルシウムがある。
これらのうちではフエロシアン化カリウム、フエ
ロシアン化ナトリウムが好ましい。 上述のコレステロール分析用呈色試薬組成物の
成分のうち、各酵素、胆汁酸化合物、及びアルキ
ルフエノキシポリエトキシエタノールは多孔性展
開層に含有させることが好ましい。発色試薬組成
物、さらにオプシヨナル成分であるフエロシアン
化物は多孔性展開層、多孔性展開層に隣接する
層、独立試薬層、親水性層、及び吸水層のいずれ
か１層又は複数の層に含有させることができる。 本発明の要素に用いられるコレステロール分析
用呈色試薬組成物の各成分の要素中の含有量（被
覆量）は次のとおりである（被覆量は要素１m²当
り）。 コレステロールエステラーゼ活性を有する少なく
とも１種の酵素； 約500〜約５万IU、好ましくは約１千〜約３万
IU（コレステロールエステラーゼ活性値とし
て） コレステロールオキシダーゼ； 約１千〜約３万IU、好ましくは約1500〜約２
万IU ペルオキシダーゼ； 約１千〜約10万、好ましくは約２千〜約６万
IU 色原体又はロイコ色素； 約0.5〜約10ミリモル、好ましくは約１〜５ミ
リモル カプラー； 約2.5〜約50ミリモル、好ましくは約５〜25ミ
リモル フエロシアン化物； 約0.1〜約10ミリモル、好ましくは約0.5〜５ミ
リモル 胆汁酸化合物； 約0.2ｇ〜約10.0ｇ、好ましくは約0.5ｇ〜約5.0
ｇ 16以上（平均20以上）のオキシエチレン単位から
なるポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフエノ
キシポリエトキシエタノール； 約0.5ｇ〜約12.0ｇ、好ましくは約0.8ｇ〜約8.0
ｇ 本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適
用しての分析操作実施時のPH値を約5.5から約
9.0、好ましくは約7.7から約8.5の範囲の所望の値
に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して含有
させることができる。 用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学
便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、1966年発行）
1312−1320頁、R.M.C.Dawson et al編「Date
for Biochemical Research」第２版（Oxford
at the Clarendon Press，1969年発行）476−
508頁、「Biochemistry」５，467頁以降（1966
年）、「Analytical Biochemistry」104，300−
310頁（1980年）等に記載のPH緩衝剤系がある。 PH5.5〜9.0の範囲のPH緩衝剤の具体例として、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（Tris）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼
酸塩を含む緩衝剤；枸櫞酸または枸櫞酸塩を含む
緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）；Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸
（HEPPS）Na塩またはＫ塩等；Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−N′−３−スルホン酸
（EPPS）Na塩またはＫ塩等；Ｎ−〔トリス〔ヒ
ドロキシメチル）メチル〕−３−アミノプロパン
スルホン酸（TAPS）Na塩またはＫ塩等；Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−エ
タンスルホン酸（HEPES）Na塩またはＫ塩等；
およびこれらのいずれかと必要により組合せられ
る酸、アルカリまたは塩がある。好ましい緩衝剤
の具体例として、燐酸二水素カリウム−燐酸水素
二ナトリウム；Tris−硼酸ナトリウム；Tris−
硼酸ナトリウム−EDTA・2Na塩；Tris枸櫞
酸；枸櫞酸−燐酸二水素ナトリウム；Bicine；
HEPPS；HEPPSナトリウム塩；EPPS；EPPS
ナトリウム塩；TAPS；TAPSナトリウム塩等が
ある。 PH緩衝剤は酵素が含有されている層に存在する
のが好ましいので、一般的には酵素含有する多孔
性展開層または試薬層にPH緩衝剤を含有させるの
が好ましい。一方で低分子量のPH緩衝剤は点着さ
れた水性液体試料の媒体である水の浸透に従つて
層間を移動しうるので、酵素と発色試薬組成物が
含まれる全ての層にPH緩衝剤が含有される必要は
なく、例えば親水性層又は吸水層だけにPH緩衝剤
を含有させてもよい。 本発明の一体型多層分析要素は、一辺約15mmか
ら約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の
小片に裁断し、特開昭57−63452号公報、特開昭
54−156079号公報、実開昭56−142454号公報、実
開昭58−32350号公報、特表昭58−501144号公表
等に開示のスライド枠等に収めて分析スライドと
して用いるのが、製造、包装、輸送、保存、測定
操作等の全ての観点が好ましい。 測定試料はコレステロールを含有する水性試料
であれば特に限定されるものではなく、例えば全
血、血漿、血清等の血液のほか、その他各種体
液、食品、さらにはコレステロールを製造しある
いは利用している工場の工程管理用試料などを含
む。 本発明の一体型多層分析要素は前述の諸特許明
細書に開示の方法に従い、約5μから約30μ、
好ましくは8μから約15μの水性液体試料を展
開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45
℃、好ましくは約35℃から約40℃の範囲の実質的
に一定の温度でインキユベーシヨンする。そして
その後に、例えば光透過性支持体側から多層分析
要素内の発色を反射測光し、比色法の原理により
液体試料中の総コレステロール含有量を定量する
ことができる。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ180μmのポ
リエチレンテレフタレート（PET）フイルム上
に、ゼラチン26ｇ／m²、ノニルフエノキシポリエ
トキシエタノール（オキシエチレン単位（以下、
ｎと略記する）平均９〜10含有）0.03ｇ／m²、ビ
ス（ビニルスルホニルメチル）エーテル30mg／m²
になるように塗布乾燥してゼラチン層（吸水層）
を形成した。 次に、この吸水層に30ｇ／m²の割合で水を湿し
水として供給湿潤させたのちグロー放電で親水化
したポリエチレンテレフタレート（PET）紡績
糸（50デニール）からなるトリコツト編物生地
（平均厚さ250μm）を圧着ラミネートして展開層
を設けた。 ついで展開層中で下記の成分被覆量になるよう
にして、編物展開層の上からコレステロール分析
用呈色試薬組成物水溶液を塗布含浸し乾燥して総
コレステロール定量用一体型多層分析要素を完成
した。 コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分被
覆量（１m²当り） メチルセルロース（メトキシ基含有率29％、
2w％水溶液20℃で粘度112cps） 3.0ｇ 二酸化チタン微粒子（ルチル型；粒子サイズ
0.25〜0.40μm） 24ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（ｎ：平均40） 1.1ｇ デオキシコール酸ナトリウム 1.5ｇ コレステロールオキシダーゼ （EC1.1.3.6） 3500IU コレステロールエステラーゼ （EC3.1.1.13） 2000IU ペルオキシダーゼ （EC1.11.1.7） 2900IU ２−ヒドロキシ３，５−ビクロロベンゼンスル
ホン酸ナトリウム 1.8ｇ ４−アミノアンチピリン 0.3ｇ 燐酸二水素ナトリウム 7.3ｇ 比較例 １ コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分の
うち、オクチルフエノキシポリエトキシエタノー
ル（ｎ：平均40）、ノニルフエノキシポリエトキ
シエタノール（ｎ：平均９〜10）、デキオシコー
ル酸ナトリウムの配合の有無について、第１表に
記載の９のとおりに変更したほかは、実施例１と
同様にして比較用総コレステロール定量用一体型
多層分析要素を完成した。 ついで実施例１及び比較例１で作成した総コレ
ステロール定量用一体型多層分析要素を15mm×15
mmの正方形チツプに裁断し、特開昭57−63452に
開示のプラスチツクマウントに収めて総コレステ
ロール定量用化学分析スライドを完成した。 性能評価 実験−１ 上述の化学分析スライドを４℃相対湿度５％以
下と45℃相対湿度約45％状態に３日間保存した時
の発色光学濃度値を比較した。各スライドにヘパ
リン採血したコレステロール濃度約450mg／dLの
ヒト血漿を10μ点着し37℃６分間インキユベー
シヨンしたのち540nmの測定光でPET支持体側
から反射光学濃度を測定した。 実験−２ 総コレステロール含有量の異なるヒト血漿につ
いて、標準法としてC.C.Allain et alの溶液法
（「CLINICAL CHEMISTRY」20，470−475
（1974））で総コレステロール値を求めた。この値
をもとにして、本発明および比較例の総コレステ
ロール定量用一体型多層分析要素のヒト血漿用検
量線を作成した。 ついで中性脂肪濃度約620mg／dLのヒト血漿を
用い、実験−１と同様に操作して発色させ、前記
検量線から総コレステロール含有量を求めた。 実験−３ 総蛋白量約11ｇ／dLのヒト血漿を用いて実験
−１と同様に操作して発色させ、前記検量線から
総コレステロール含有量を求めた。 Allain et alの方法と上記の化学分析スライド
を用いて得られた実験−２及び−３のヒト血漿中
の総コレステロール含有量の比（化学分析スライ
ドの値／Allain et alの値）は第１表のとおりで
あつた。 第１表の値から、本発明の総コレステロール定
量用一体型多層分析要素は、45℃45％RH3日の
加速劣化促進試験後においても、発色光学濃度値
の減少が1.3％（以下）ときわめて少ないこと、
標準測定法であるC.C.Allain et alの溶液法と同
様に血液中の中性脂肪の干渉（約マイナス１％）、
総蛋白の干渉（約マイナス３％）がきわめて少な
く、総合性能として標準法ときわめてよい相関を
有することが明らかである。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光透過性水不透過性支持体の上に少なくとも
   １層の親水性ポリマーを含む層及び多孔性展開層
   がこの順に一体に積層されており、コレステロー
   ルエステラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵
   素、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダ
   ーゼ、及び発色試薬組成物を含むコレステロール
   分析用呈色試薬組成物を含有する総コレステロー
   ル定量用一体型多層分析要素において、多層分析
   要素内にさらに胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれ
   らの塩からなる群から選らばれた少なくとも１種
   の化合物、及び16以上のオキシエチレン単位から
   なるポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフエノ
   キシポリエトキシエタノールを含有することを特
   徴とする総コレステロール定量用一体型多層分析
   要素。 ２ 前記コレステロールエステラーゼ活性を有す
   る酵素がコレステロールエステラーゼである特許
   請求の範囲第１項に記載の多層分析要素。 ３ 前記胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩
   からなる群がコール酸、デオキシコール酸、リト
   コール酸、ケノデオキシコール酸、タウロコール
   酸、グリコール酸、タウロデオキシコール酸、グ
   リコデオキシコール酸、及びこれらのナトリウム
   塩、カリウム塩及びリチウム塩からなる群であ
   り、前記アルキルフエノキシポリエトキシエタノ
   ールのアルキル基が炭素原子数８又は９の直鎖状
   又は分岐アルキル基、ポリオキシエチレン鎖のオ
   キシエチレン単位の数が16から60の範囲である特
   許請求の範囲第１項に記載の多層分析要素。 ４ 前記アルキルフエノキシポリエトキシエタノ
   ールのポリオキシエチレン鎖のオキシエチレン単
   位の数が平均20から50の範囲である特許請求の範
   囲第３項に記載の多層分析要素。 ５ 前記コレステロールエステラーゼ活性を有す
   る少なくとも１種の酵素、コレステロールオキシ
   ダーゼ、胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩
   からなる群から選ばれた少なくとも１種の化合
   物、及びアルキルフエノキシポリエトキシエタノ
   ールが前記展開層に含有されている特許請求の範
   囲第１項に記載の多層分析要素。