EA017266B1

EA017266B1 - Биокатализатор, способ его приготовления и способ получения глюкозофруктозных сиропов

Info

Publication number: EA017266B1
Application number: EA200900703A
Authority: EA
Inventors: Галина Артемьевна Коваленко; Лариса Валентиновна Перминова; Вера Макеевна Ленская; Леонида Ивановна Сапунова; Ирина Олеговна Тамкович; Анатолий Георгиевич Лобанок
Original assignee: Институт Катализа Им. Г.К. Борескова Сибирского Отделения Российской Академии Наук; Государственное Научное Учреждение "Институт Микробиологии Национальной Академии Наук Беларуси"
Priority date: 2009-06-17
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2012-11-30
Also published as: EA200900703A1

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам приготовления биокатализаторов для производства из возобновляемого крахмалсодержащего сырья натуральных сахарозаменителей - глюкозофруктозных сиропов. Приведено описание биокатализатора, который содержит микробную биомассу, обладающую глюкозоизомеразной активностью, диоксид кремния и нерастворимые гидроксосоединения Со(II). Микробную биомассу используют в виде пасты с влажностью 75-80%. Диоксид кремния используют в виде гидрогеля с влажностью 60-95%. Гидроксосоединения Со(II) используют в виде влажного, отмытого водой осадка. Для увеличения стабильности биокатализатора проводят поперечную сшивку микробной биомассы бифункциональным реагентом, например глутаровым диальдегидом в концентрации, не превышающей 100 мг реагента на 1 г сухих клеток. Приведено описание способа приготовления биокатализатора и способа получения глюкозофруктозных сиропов. Технический результат - увеличение стабильности и глюкозоизомеразной активности биокатализатора.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способам приготовления биокатализаторов для производства из возобновляемого крахмалсодержащего сырья натуральных сахарозаменителей глюкозофруктозных сиропов.

Известно, что глюкозофруктозные сиропы широко применяются в пищевой промышленности при производстве безалкогольных напитков, кондитерских изделий и продуктов диетического питания, а также при консервировании плодов и овощей. Использование этих сиропов в рецептурах приготовления различных изделий существенно улучшает их потребительские свойства, замедляет процессы высыхания и затвердевания (черствления).

Гетерогенный (многофазный) режим проведения биокаталитической конверсии природных субстратов с участием твердых биокатализаторов, загруженных в проточный реактор, является наиболее экономически выгодным. Неорганические матрицы (оксиды металлов, силикаты, углерод-минеральные носители) как носители для иммобилизации ферментативно-активных субстанций (ферментов или содержащих их микробных клеток) отличаются инертностью, высокой устойчивостью в водных средах, стойкостью к химическому и микробному разрушению. Высокая механическая прочность неорганических носителей позволяет использовать их в реакторах различного типа, в том числе в высокопроизводительных вихревых реакторах.

Актуальной задачей в области приготовления высокостабильных и активных биокатализаторов является оптимизация их состава и разработка новых способов иммобилизации.

Известен способ иммобилизации клеток актинобактерий Аг(11гоЬас(ег шеоБапае, обладающих глюкозоизомеразной активностью и катализирующих ферментативную реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу, путем их физической адсорбции на неорганических носителях [Коваленко Г. А., Перминова Л.В., Терентьева Т.Г., Сапунова Л.И., Лобанок А.Г., Чуенко Т.В., Рудина Н.А., Черняк Е.И. Активность глюкозоизомеразы в суспензиях клеток Аг(НгоЬас1ег шеоБапае и адсорбционная иммобилизация микроорганизмов на неорганических носителях//Прикладн. Биохим. Микробиол. 2008. - Т. 44. - Вып. 2. С. 193-201]. Установлено, что актинобактерии А.шеоБапае обладают слабой способностью к адгезии на поверхности твердых носителей, которая не зависит ни от текстурных характеристик носителя, ни от химической природы, ни от морфологии поверхности носителя. Величина адгезии не превышает 1,6 мг сухих клеток на 1 г носителя. Максимальная глюкозоизомеразная активность (ЕА ^мкмоль/мин) биокатализаторов, приготовленных путём адсорбции бактериальных клеток на макропористом углеродминеральном носителе Сапропеле с последующим совместным высушиванием суспензии клеток и носителя, составляет 2ЕА/г. Максимальной стабильностью обладают биокатализаторы, полученные в процессе глубинного культивирования микроорганизмов в присутствии углеродсодержащей пенокерамики; данные биокатализаторы сохраняют первоначальную активность в реакции изомеризации моносахаридов в течение 10 ч работы при 70°С. Недостатками данного способа являются:

1) низкая величина адсорбции;

2) низкая биокаталитическая активность (<2 ЕА/г);

3) низкая стабильность в реакционных условиях (время полуинактивации 1_1/2< 18 ч).

Известен способ иммобилизации глюкозоизомеразы, выделенной из клеток 81гер1отусе5 тиЫдтокик, путем адсорбции на частицах 8ίΘ₂ с последующей сшивкой глутаровым диальдегидом [Вйо8а1е 8.Н., Као М.В., Ое^Ерапбе ν.ν. Мо1еси1аг апб ίηάιΐ5ΐιύι1 акреей οί д1иео8е щотета8е//М1сгоЬю1. Веу. 1996, уо1. 60, № 2, р. 280-300]. По данной технологии компания Мйек Ка11-Сйет1е (И8) производит коммерческий биокатализатор ОрЯ5\\'ее1 2®, активность которого составляет 22 ЕА/г при 60°С. Недостатком данного способа является низкая глюкозоизомеразная активность биокатализатора.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ иммобилизации микробной биомассы путем ее включения в ксерогель диоксида кремния [ВИ 2341560, С12Р 19/24, С12Ы 11/04, 20.12.2008]. Для этого используют микробную биомассу в виде пасты влажностью 75-80%. Диоксид кремния используют в виде гидрогеля с набором свойств, описанных в (ВИ 2341560), а именно: влажность 60-95%, величина удельной поверхности и насыпной плотностью продукта, получаемого после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет соответственно 30-550 м²/г и 0,1-0,7 г/см³. Иммобилизацию бактериальных клеток проводят путем смешения микробной биомассы в виде влажной пасты, диоксида кремния в виде гидрогеля и солей магния и двухвалентного кобальта в виде водных растворов сульфатов, или нитратов, или хлоридов с последующей сушкой полученной смеси на воздухе при температуре 50-70°С в течение не более 2 ч, прессованием и грануляцией в частицы размером 0,4-3,0 мм.

Существенными недостатками данного способа являются:

1) низкая ферментативная активность биокатализатора, составляющая 25 ЕА/г при 70°С;

2) сравнительно низкая устойчивость к разрушению в водных буферных средах при рН 7,8, обусловленная введением в состав биокатализатора ионов магния и кобальта в виде растворимых солей;

3) низкая стабильность биокатализатора, время полуинактивации (1_1/2) которого составляет 22 ч при 70°С.

- 1 017266

Изобретение решает задачу оптимизации состава биокатализатора с целью увеличения его активности и стабильности и разработки эффективного способа получения глюкозофруктозных сиропов с участием приготовленного биокатализатора.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в увеличении ферментативной активности, стабильности биокатализатора и его устойчивости к разрушению в водной реакционной среде путем оптимизации его состава.

Задача решается использованием в процессе изомеризации моносахаридов твердого биокатализатора, приготовленного путем иммобилизации биомассы микроорганизмов, продуцирующих клеточносвязанную глюкозоизомеразу (микробная биомасса).

Биокатализатор содержит микробную биомассу, диоксид кремния (8Ю₂) и нерастворимые гидроксосоединения кобальта (Со_хО_у), при этом соотношение компонентов биокатализатора (микробной биомассы, диоксида кремния и нерастворимых гидроксосоединений кобальта) зависит от таксономической принадлежности микроорганизмов, продуцирующих глюкозоизомеразу. Например, для актинобактерий рода Лг111гоЬае1сг оптимальный состав биокатализатора, в пересчете на сухой вес (в мас.%), следующий: микробная биомасса - 10-15; 8Ю₂ - 45-60; Со_хОу - 20-40.

Предлагаемый биокатализатор для получения глюкозофруктозных сиропов в процессе изомеризации моносахаридов включает микробную биомассу с глюкозоизомеразной активностью, диоксид кремния и соединение кобальта(П) в виде нерастворимых гидроксосоединений и имеет состав, в мас.% по сухим веществам: микробная биомасса - 10-60; диоксид кремния - 20-70; нерастворимое гидроксосоединение кобальта(П) - 20-40.

Диоксид кремния содержится в виде гидрогеля со следующим набором свойств: величина удельной поверхности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотностью продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.

Готовый (сухой) биокатализатор имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор 0,3-0,9 см³/г; диаметр пор - 10-15 нм.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора для получения глюкозофруктозных сиропов, по которому микробные клетки, обладающие глюкозоизомеразной активностью, иммобилизуют в диоксид кремния путем тщательного смешения диоксида кремния в виде гидрогеля, свежеосажденных гидроксосоединений кобальта в виде влажного осадка, микробной биомассой в виде влажной пасты и раствора бифункционального сшивающего реагента с последующей сушкой полученной смеси до суховоздушного состояния, прессованием при избыточном давлении 150 атм и грануляцией в частицы размером 0,2-4,0 мм, полученный биокатализатор имеет состав, в мас.% по сухим веществам: микробная биомасса - 10-60; диоксид кремния - 20-70; нерастворимое гидроксосоединение кобальта(П) - 20-40.

Для увеличения стабильности биокатализатора проводят обработку бифункциональными сшивающими реагентами - диальдегидом (глутаровым альдегидом, ГА) или карбодиимидом (1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил) карбодиимид мето-4-толуолсульфонат, КД), добавляя данные реагенты в расчете 20-400 мг на 1 г сухой микробной биомассы. Поскольку сшивающий реагент уменьшает глюкозоизомеразную активность микробной биомассы, то для уменьшения негативного действия его добавляют на последней стадии приготовления биокатализатора. Следовательно, порядок смешения компонентов является существенным признаком приготовления биокатализаторов: сначала тщательно смешивают гидрогель диоксида кремния и влажный осадок гидроксосоединений кобальта, к этой смеси добавляют микробную биомассу и перемешивают до однородного состояния, затем в эту смесь добавляют раствор сшивающего реагента, снова тщательно перемешивают и высушивают до суховоздушного состояния (влажность 10-12%).

Для приготовления биокатализатора используют микробную биомассу, обладающую глюкозоизомеразной активностью не менее 600 ЕА на 1 г сухих клеток, в виде пасты влажностью 75-80%.

Диоксид кремния используют в виде гидрогеля со следующим набором свойств: влажность 60-95%, величина удельной поверхности и насыпной плотности продукта, получающегося после высушивания гидрогеля при 105-120°С, составляет соответственно 30-550 м²/г и 0,1-0,7 г/см³.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия или калия с минеральной кислотой, выбранной из ряда серная, азотная или угольная кислоты, или путем взаимодействия с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислот, при рН 6,5-9,0, температуре 20-90°С, скорости осаждения 30-300 г 81О₂/л_сусп-ч с последующей отмывкой и фильтрацией гидрогеля [КИ 234156020].

Нерастворимые гидроксосоединения кобальта получают осаждением из растворов нитрата кобальта Со(ИОз)₂ раствором аммиака при интенсивном перемешивании при 20-22°С. Осадок формируют в течение 20 ч при 22°С, затем многократно отмывают дистиллированной водой.

- 2 017266

Задача решается также способом получения глюкозофруктозных сиропов в процессе изомеризации моносахаридов (глюкозы), в котором используют описанный выше биокатализатор. Процесс проводят в проточном реакторе с неподвижным слоем при температуре (65±5)°С и при скорости непрерывного потока реакционной среды через слой биокатализатора, не превышающей 2 мл/ч. Биокатализатор используют в виде частиц размером 0,2-4,0 мм, для улучшения гидродинамических свойств неподвижного слоя биокатализатора используют стеклянные шарики диаметром 2 мм в качестве инертного наполнителя,

Технический результат достигается вследствие реализации следующих групп отличительных признаков:

1) оптимизацией состава биокатализатора по массовому содержанию составляющих компонентов;

2) введением Со(11) в состав биокатализатора в виде нерастворимых гидроксосоединений;

3) порядком смешения составляющих компонентов биокатализатора;

4) проведением процесса изомеризации моносахаридов (глюкозы) до глюкозофруктозного сиропа в проточном реакторе с неподвижным слоем приготовленного биокатализатора, имеющего оптимальный состав.

Метод приготовления биокатализатора отличается простотой и универсальностью, все компоненты доступны и имеют относительно низкую стоимость. Использование Со(11) в виде нерастворимых гидроксосоединений приводит к значительному снижению (на порядок) концентрации ионов переходного металла Со²⁺ в конечном продукте - глюкозофруктозном сиропе.

Биокатализатор для получения глюкозофруктозных сиропов содержит следующие компоненты, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - до 60; диоксид кремния - до 70; Со_хО_у - до 40. Содержание микробной биомассы в биокатализаторе определяется таксономической принадлежностью микроорганизма, продуцирующего глюкозоизомеразу. Гидрогель диоксида кремния, используемый для приготовления биокатализатора, получают описанным способом [КП 234156020]. Гидрогель диоксида кремния инертен, отличается высокой химической и микробной устойчивостью. Гидроксосоединения Со(11), используемые для приготовления биокатализатора, получают осаждением из растворов нитрата кобальта Со(ИО₃)₂ раствором аммиака при интенсивном перемешивании при 20-22°С. Осадок формируют в течение 20 ч при 22°С, затем многократно отмывают дистиллированной водой. Использование Со(11) в виде нерастворимых гидроксосоединений Со_хО_у повышает устойчивость приготовленных биокатализаторов к разрушению в водной среде (по сравнению с прототипом), обеспечивает поступление в микроокружение клеток ионов Со²⁺, необходимых для увеличения термостабильности клеточно-связанной глюкозоизомеразы. При этом добавление в реакционную среду ионов Со²⁺ не требуется, что повышает качество и чистоту конечного продукта - глюкозофруктозного сиропа. При использовании описанных в научнотехнической литературе биокатализаторов ионы кобальта добавляют в реакционную среду в концентрации не менее 1 мМ, затем проводят очистку конечного продукта на ионообменных смолах.

Биокатализатор для изомеризации глюкозы готовят путем смешения до однородного состояния гидрогеля диоксида кремния, нерастворимых гидроксосоединений Со_хО_у, микробной биомассы, затем в данную смесь добавляют раствор бифункционального сшивающего реагента. В качестве бифункционального сшивающего реагента используют диальдегиды, предпочтительно глутаровый диальдегид. Полученную смесь высушивают до суховоздушного состояния, например, в течение 2-8 ч при 20-25°С. Температура сушки не должна превышать 70°С, дальнейшее повышение температуры приводит к потере ферментативной активности биокатализатора. Высушенную смесь прессуют при избыточном давлении 150 атм и механически измельчают до частиц размером 0,2-4,0 мм.

В результате получают гранулированный твердый биокатализатор, обладающий глюкозоизомеразной активностью, равной 100-350 ЕА/г сухого биокатализатора (в прототипе 25 ЕА/г). Время полуинактивации приготовленного биокатализатора в условиях реакции изомеризации глюкозы при 70°С превышает 500 ч (в прототипе 22 ч). Таким образом, заявляемый состав биокатализатора, а также способ его приготовления обеспечивают высокую активность и стабильность биокатализатора в условиях проведения реакции изомеризации глюкозы до конечного продукта - глюкозофруктозного сиропа.

Биокатализатор обладает следующим набором свойств: удельная поверхность - 50-300 м²/г; суммарный объем пор - 0,6-0,9 см³/г; средний размер пор - 10-15 нм. Как видно из приведенных текстурных параметров, биокатализатор имеет мезопористую структуру, что обеспечивает его работу в реакции изомеризации моносахаридов в кинетической области (без диффузионных ограничений). Начальная глюкозоизомеразная активность биокатализатора составляет 100-350 ЕА/г сухого биокатализатора.

Таким образом, существенными отличительными признаками заявляемого биокатализатора и способа его приготовления, по сравнению с прототипом, являются следующие:

1) высокая глюкозоизомеразная активность биокатализатора (в >10 раз выше, чем в прототипе);

2) более высокая стабильность биокатализатора в процессе изомеризации моносахаридов при 6070°С (в >20 раз выше, чем в прототипе);

3) более высокое качество конечного продукта (глюкозофруктозного сиропа) из-за значительного (в 70 раз) снижения содержания в нем ионов переходного металла Со²⁺.

- 3 017266

Заявляемый набор свойств биокатализатора (состав, способ приготовления, ферментативная активность и стабильность) обеспечивают высокую эффективность работы данного биокатализатора в реакции изомеризации глюкозы в глюкозофруктозные сиропы в проточных реакторах различного типа (с неподвижным слоем биокатализатора, вихревые реакторы).

Для характеристики приготовленных биокатализаторов используют следующие физико-химические методы.

Текстурные параметры биокатализатора измеряют следующими методами. Величину удельной поверхности определяют по тепловой десорбции аргона (метод БЭТ). Объем пор и диаметр пор определяют методом ртутной порометрии.

Ферментативную активность приготовленных биокатализаторов определяют по скорости превращения (в мкмоль/мин^ЕА) 2 М (44% по сухим веществам) раствора моносахарида (глюкозы или фруктозы) в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,0-7,8 в глюкозофруктозный сироп в присутствии ионов магния Мд²⁴ (1 мМ) при температуре 60-75°С. Ферментативную активность микробных клеток в суспензии и в иммобилизованном состоянии выражают либо в ЕА/г сухих клеток, либо ЕА/г сухого биокатализатора.

Термостабильность биокатализаторов оценивают в условиях периодического испытания биокатализатора в реакции изомеризации моносахаридов при температуре выше 60°С по времени его полуинактивации (1_1/2). Время полуинактивации - это время, при котором отношение величины активности в текущем времени (А₁) к начальной активности (А_о) биокатализатора составляет 0,5.

Операционную стабильность биокатализатора оценивают по времени полуинактивации биокатализатора (Т_1/2) следующим образом. В проточный колоночный реактор загружают биокатализатор с размером гранул 0,2-4,0 мм и инертный наполнитель (стеклянные шарики) в объемном соотношении 1:(1-3), через этот неподвижный слой непрерывно прокачивают раствор глюкозы/фруктозы со скоростью 1,8 мл/ч. Концентрация субстрата составляет 2 М (44% по сухим веществам) в 0,02 М фосфатном буфере рН 7,0-7,8. Температура процесса поддерживается в диапазоне 65±5°С с помощью терморегулятора.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Оптимизация состава биокатализатора по содержанию микробной биомассы.

Пример 1. Приготовление биокатализатора.

В качестве микробной биомассы используют биомассу актинобактерий Лг111гоЬас1ег шеойаиае, продуцирующих глюкозоизомеразу [патент РБ № 11170, 30.10.2008]. Актинобактерии выращивают на благоприятных для роста средах, содержащих сахарозу или любой другой источник углерода, и собирают в поздней логарифмической фазе роста путем центрифугирования при 3-5 тыс. об/мин. Микробная биомасса представляет собой пасту бежевого цвета влажностью 75-80%. Глюкозоизомеразная активность микробной биомассы равна в среднем 600 ЕА/г сухих клеток при 70°С.

Гидрогель диоксида кремния получают путем взаимодействия силиката натрия с нитратом аммония при температуре 70°С, рН 7,5, скорости осаждения диоксида кремния в виде гидрогеля 300 г §1О₂/л-ч.

Приготовление биокатализатора осуществляют следующим образом: 10, г влажного гидрогеля диоксида кремния и 1,0 г свежеосажденных гидроксосоединений Со_хО_у перемешивают до однородной смеси, затем добавляют 0,5 г влажной биомассы, снова перемешивают до однородной смеси. Полученную смесь высушивают до суховоздушного состояния - в течение 8 ч при 20-25°С. Высушенную смесь прессуют при избыточном давлении 150 атм. Таблетки, полученные после прессования, механически размельчают и отсеивают фракции определенного гранулометрического состава на соответствующих ситах. Получают биокатализатор следующего состава, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 10; диоксид кремния - 50; Со_хО_у - 40.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 11 и 25 ЕА/г при 60 и 70°С соответственно. Время полуинактивации биокатализатора (1_1/2) составляет 45 ч при 75°С.

Пример 2. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 15; диоксид кремния - 45; Со_хО_у - 40.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 16 ЕА/г при 6О°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=22 ч при 75°С.

Пример 3. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 20; диоксид кремния - 40; Со_хО_у - 40.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 21 ЕА/г при 60°С. Для данного биокатализатора 1₁/₂=2 ч при 75°С из-за низкой устойчивости биокатализатора к разрушению в реакционной среде. Через 2 ч биокатализатор превращается в аморфную массу, теряя механическую прочность и форму гранул.

- 4 017266

Пример 4. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что для приготовления биокатализатора используют микробную биомассу рекомбинантного штамма Ексйепсйиа сой - продуцента глюкозоизомеразы, полученного методом генетической инженерии. Глюкозоизомеразная активность микробной биомассы равна в среднем 1000 ЕА/г сухих клеток при 70°С.

Получают биокатализатор следующего состава, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса 20; диоксид кремния - 60; Со_хО_у - 20.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 70 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=8 ч при 70°С.

Пример 5. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 4, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 40; диоксид кремния - 40; Со_хО_у - 20.

Активность приготовленного биокатализатора равна 560 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=2 ч при 70°С.

Пример 6. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 4, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 60; диоксид кремния - 20; Со_хО_у - 20.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 310 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=2 ч при 70°С.

Пример 7. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 4, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 70; диоксид кремния - 10; СохОу - 20.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 260 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2 менее 2 ч при 70°С, поскольку через 2 ч функционирования в реакционной среде (рН 7,8) биокатализатор набухает, структура его гранул разрушается.

Из сравнения примеров 1-3 видно, что при увеличении содержания микробной биомассы актинобактерий Лг111гоЬас1сг шсойаиае, ферментативная активность биокатализатора возрастает пропорционально и линейно, а его стабильность резко уменьшается из-за потери устойчивости и механической прочности биокатализатора в реакционной среде. Таким образом, при использовании актинобактерий Лг11поЬас1ег шсойаиае оптимальное содержание микробной биомассы в биокатализаторе составляет 1015 мас.%. Из сравнения примеров 4-7 видно, что ферментативная активность биокатализатора, приготовленного с использованием рекомбинантного штамма ЕксйейсЫа сой, не возрастает при увеличении количества микробной биомассы выше 60 мас.%, и его стабильность является сравнительно низкой. Таким образом, при использовании рекомбинантного штамма ЕксйейсЫа сой оптимальное содержание микробной биомассы в биокатализаторе составляет 40-60 мас.%.

Результаты оптимизации состава биокатализаторов по содержанию микробной биомассы представлены в табл. 1.

Оптимизация состава биокатализаторов по содержанию Со_хО_у.

Пример 8. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 15; диоксид кремния - 80; Со_хО_у - 5.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 23 ЕА/г при 60°С. Для данного биокатализатора ΐ_1/2=22 ч при 75°С.

Пример 9. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 1, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 15; диоксид кремния - 65; Со_хО_у - 20.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 16 ЕА/г при 60°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=37 ч при 75°С.

Пример 10. Приготовление биокатализатора.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 18 ЕА/г при 60°С. Для данного биокатализатора 1_!/2=37 ч при 75°С

Пример 11. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 4, отличается тем, что состав приготовленного биокатализатора следующий, в мас % по сухим веществам: микробная биомасса - 15; диоксид кремния - 25; Со_хО_у - 60.

Активность приготовленного биокатализатора с размером гранул 0,2-4,0 мм равна 21 ЕА/г при 60°С. Для данного биокатализатора ΐ_1/2=16 ч при 75°С.

Из сравнения примеров 8-11 видно, что при увеличении содержании Со_хО_у активность биокатализатора практически не изменяется, а его стабильность увеличивается. Оптимальное содержание Со_хО_у составляет 20-40 мас%.

- 5 017266

Результаты по оптимизации состава биокатализаторов по содержанию гидроксосоединений кобальта представлены в табл. 2.

Оптимизация состава биокатализаторов по содержанию бифункционального сшивающего агента.

Пример 12. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что для приготовления биокатализатора используют бифункциональный сшивающий реагент - глутаровый диальдегид (ГА). Для этого гидрогель диоксида кремния, нерастворимые соединения Со_хО_у, раствор ГА и микробную биомассу тщательно смешивают, затем сушат, прессуют и гранулируют, как описано в примере 1. Раствор сшивающего реагента используют в таком количестве, чтобы в пересчете на 1 г сухих клеток приходилось 20 мг ГА.

Активность приготовленного биокатализатора равна 300 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1₁/2=20 ч при 70°С (ср. с примером 8 1_1/2=8 ч).

Пример 13. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что количество ГА, используемого для сшивки микробной биомассы, составляет 50 мг/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 110 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=65 ч при 70°С.

Пример 14. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что количество ГА, используемого для сшивки микробной биомассы, составляет 100 мг/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 100 ЕА/г. Для данного биокатализатора ΐι_/2=25 ч при 70°С.

Пример 15. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что количество ГА, используемого для сшивки микробной биомассы, составляет 160 мг/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 81 ЕА/г. Для данного биокатализатора ΐ_1/2=18 ч при 70°С.

Пример 16. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что количество ГА, используемого для сшивки микробной биомассы, составляет 240 мг/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 12 ЕА/г. Для данного биокатализатора 1;_/2=22 ч при 70°С.

Пример 17. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 5, отличается тем, что в качестве бифункционального сшивающего реагента используют карбодиимид (КД) - 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид мето-4толуолсульфонат. Количество КД, используемого для сшивки микробной биомассы, составляет 400 мг/г сухих клеток.

Активность приготовленного биокатализатора равна 72 ЕА/г. Для данного биокатализатора 1_1/2=8 ч при 70°С.

Из сравнения примеров 12-17 видно, что для повышения стабильности биокатализаторов, приготовленных путем иммобилизации рекомбинантного штамма-продуцента, необходимо использовать бифункциональные сшивающие реагенты (диальдегиды, диимиды). Глутаровый диальдегид проявляет максимальный стабилизирующий эффект и является относительно дешевым, доступным и, как следствие, наиболее широко используемым реагентом. Из сравнения примеров 12-16 видно, что при повышении количества глутарового диальдегида ферментативная активность биокатализатора (в 2-3 раза) уменьшается, в то же время зависимость стабильности от концентрации ГА имеет оптимум в диапазоне 20-100 мг ГА /г сухих клеток.

Результаты по оптимизации состава биокатализаторов по содержанию глутарового диальдегида представлены в табл. 3.

Оптимизация порядка смешения компонентов биокатализатора.

Пример 18. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 13, отличается тем, что порядок смешения компонентов биокатализатора следующий. Сначала смешивают гидрогель диоксида кремния, нерастворимые гидроксосоединения кобальта(11) и микробную биомассу до однородного состояния, затем в полученную смесь добавляют раствор ГА в оптимальном количестве (40 мг ГА/г сухих клеток).

Активность приготовленного биокатализатора равна 120 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора 1_1/2=100 ч при 70°С.

Пример 19. Приготовление биокатализатора.

Аналогичен примеру 18, отличается тем, что порядок смешения компонентов биокатализатора следующий. Сначала смешивают гидрогель диоксида кремния и нерастворимые гидроксосоединения кобальта(11). Микробную биомассу сшивают раствором ГА в оптимальном количестве (40 мг ГА/г сухих клеток). Затем смешивают гидрогель диоксида кремния, содержащего Со_хО_у, и микробную биомассу, сшитую ГА.

- 6 017266

Активность приготовленного биокатализатора равна 140 ЕА/г при 70°С. Для данного биокатализатора ΐι/2=45 ч при 70°С.

Из приведенных примеров видно, что порядок смешения компонентов, входящих в состав биокатализаторов, играет существенную роль в повышении стабильности биокатализатора. Оптимальным является порядок, когда глутаровый альдегид добавляют в смесь компонентов (диоксид кремния+гидроксосоединения кобальта+микробная биомасса) в последнюю очередь.

Пример 20. Получение глюкозофруктозного сиропа.

Используют биокатализатор по примеру 1. Приготовленный сухой биокатализатор с активностью 22 ЕА/г при 70°С в виде гранул размером 0,2-4,0 мм, смешанный со стеклянными шариками диаметром 2 мм в объемном соотношении 1:1, загружают в колоночный проточный реактор. Через этот неподвижный слой прокачивают реакционную среду с объемной скоростью 1,8-2,0 мл/ч. Состав реакционной среды следующий: 0,02 М фосфатный буфер рН 7,8; концентрация глюкозы - 44 мас.%; концентрация Мд²⁺в виде сульфата - 1 мМ. Температуру поддерживают в интервале 65±5°С. Инертный наполнитель (стеклянные шарики) вводят для уменьшения гидродинамического сопротивления слоя биокатализатора потоку.

Пример 21. Получение глюкозофруктозного сиропа.

Используют биокатализатор по примеру 1. Приготовленный сухой биокатализатор с активностью 22 ЕА/г при 70°С в виде гранул размером 0,2-4,0 мм (без инертного наполнителя) загружают в колоночный проточный реактор. Через этот неподвижный слой прокачивают реакционную среду с объемной скоростью 1,8-2,0 мл/ч. Состав реакционной среды следующий: 0,02 М фосфатный буфер рН 7,8; концентрация глюкозы - 44 мас.%; концентрация Мд²⁺ в виде сульфата - 1 мМ. Температуру поддерживают в интервале 65±5°С. Через 2 ч гидродинамическое сопротивление слоя биокатализатора потоку раствора субстрата начинает увеличиваться, что, в конечном счете, через 2-3 сут приводит к тому, что из реактора прекращает вытекать глюкозофруктозный сироп.

Из сравнения примеров 20, 21 видно, что инертный наполнитель позволяет улучшить гидродинамические параметры неподвижного слоя биокатализатора.

Для описанных выше условий процесса изомеризации раствора глюкозы в глюкозофруктозный сироп время полуинактивации биокатализатора Т_1/2 составляет более 500 ч. Как отмечалось выше, в состав биокатализаторов вводят кобальт(11) в виде нерастворимых гидроксосоединений. В этом случае в реакционную среду ионы Со²⁺ не добавляют. Химический анализ проб, отобранных на выходе из реактора, показывает, что в течение 820 ч испытаний биокатализатора при 65±5°С содержание Со в глюкозофруктозном сиропе практически не изменяется и составляет (1-2)-10^-5 М. Из научно-технической литературы известно, что содержание Со²⁺ в глюкозофруктозном сиропе составляет 1 -10^-3 М. Таким образом, проведение процесса изомеризации глюкозы с помощью приготовленных биокатализаторов снижает содержание Со²⁺ в конечном продукте более чем в 50 раз.

Как видно из приведенных примеров, биокатализаторы, имеющие оптимальный состав, обладают высокой глюкозоизомеразной активностью (в 14 раз выше, чем в прототипе), высокой операционной стабильностью (в 23 раза выше, чем в прототипе), хорошей устойчивостью к разрушению в реакционной среде со значением рН 7,0-7,8, высокой механической прочностью для использования в проточных реакторах. При проведении процесса изомеризации глюкозы с участием приготовленных биокатализаторов содержание ионов Со²⁺ в глюкозофруктозном сиропе снижается более чем в 50 раз, что повышает его качество и не требует дополнительной очистки.

Таблица 1

Оптимизация состава биокатализаторов по содержанию микробной биомассы

№ приме ра	-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 Таксономическая принадлежность микроорганизма	— Содержание микробной биомассы, мас%	Содержание СохОу, мас%	Ферментативная ремя , полуинактивац активность, ЕА/г , ии, час (температура _ζ ’ ο/-Ί\ ι (температура определения, С) ^ν г /г ^г определения)
1	Аг1кгоЪас1ег зр.	10	40	11 (60) \| 45 (75)
2	15	40	16(60) 1 22(75)
3	20	40	21 (60) 2 (75)
4	зр.	20	20	70 (70) 1 8 (70)
5	40	20	560 (70)	2(70)
6	60	20 1 310(70)	2(70)
7	70	20 1 260 (70)	<2(70)

- 7 017266

Таблица 2

Оптимизация состава биокатализаторов по содержанию гидроксосоединений кобальта(П)

Номер примера	Таксономическая принадлежность микроорганизма	Содержание микробной биомассы, мас%	Содержание Со_хО_рмас%	Ферментативная активность, ЕА/г (температура определения, ’С)	Время полуинактивации, час (температура определения)
8	АнкгоЬаМег 5р.	15	5	23(60)	22 (75)
9	15	20	16 (60)	37 (75)
10	15	40	18 (60)	37(75
11	15	60	21(60)	21 (75)

Таблица 3

Оптимизация состава биокатализаторов по содержанию бифункционального сшивающего агента - глутарового диальдегида

Номер примера	Таксономическая принадлежность микроорганизма	Содержание сшивающего реагента глутарового альдегида, мг/г сухих клеток	Ферментативная активность, ЕА/г (температура определения, °С)	Время полуин активации, час (температура определения)
12	ЕзскегмЯиа зр.	20	300 (70)	20 (70)
13	50	110(70)	65 (70)
14	100	100(70)	25 (70)
15	160	81 (70)	18 (70)
16	240	12(70)	22 (70)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Биокатализатор для получения глюкозофруктозных сиропов в процессе изомеризации моносахаридов, включающий микробную биомассу с глюкозоизомеразной активностью, диоксид кремния и соединение кобальта(П), отличающийся тем, что катализатор содержит соединение кобальта(П) в виде нерастворимых гидроксосоединений и имеет состав, в мас.% по сухим веществам: микробная биомасса 10-60; диоксид кремния - 20-70; гидроксосоединение кобальта(П) - 20-40, а также имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г; объем пор - 0,3-0,9 см³/г; диаметр пор - 10-15 нм.
2. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что содержит диоксид кремния в виде гидрогеля со следующим набором свойств: величина удельной поверхности продукта, полученного после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 30-550 м²/г, насыпная плотность продукта, полученного после высушивания гидрогеля при 105-120°С, равна 0,1-0,7 г/см³.
3. Способ приготовления биокатализатора для получения глюкозофруктозных сиропов в процессе изомеризации моносахаридов, включающий смешение составляющих его компонентов, сушку, прессование и гранулирование, отличающийся тем, что компоненты биокатализатора смешивают в определенном порядке следующим образом: гидрогель диоксида кремния, нерастворимые гидроксосоединения кобальта(П) и микробную биомассу перемешивают до однородного состояния, затем вносят бифункциональный реагент для поперечной сшивки микробной биомассы, снова смешивают все компоненты, потом сушат до суховоздушного состояния, прессуют и формуют, в результате чего получают биокатализатор с составом, в мас.% по сухим веществам: микробная биомасса - 10-60; диоксид кремния - 20-70; гидроксосоединение кобальта(П) - 20-40, который имеет величину удельной поверхности 50-300 м²/г, объем пор - 0,3-0,9 см³/г, диаметр пор - 10-15 нм.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используют микробную биомассу в виде пасты влажностью 75-80%, гидрогель влажностью 60-95%, нерастворимые гидроксосоединения кобальта(П) в виде влажного осадка.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве бифункционального реагента используют диальдегиды, карбодиимид, предпочтительно глутаровый диальдегид в количестве 20-100 мг на 1 г сухих клеток.
6. Способ по п.3, отличающийся тем, что нерастворимые гидроксосоединения кобальта(П) получают из растворов нитрата кобальта(П) путем осаждения водным аммиаком при рН 8-10, температуре 2025°С с последующей отмывкой водой и фильтрацией осадка.
7. Способ получения глюкозофруктозных сиропов в процессе изомеризации моносахаридов, отличающийся тем, что используют биокатализатор для изомеризации моносахаридов по пп.1, 2 или приготовленный по пп.3-6 в смеси с инертным наполнителем.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что процесс получения глюкозофруктозных сиропов проводят в непрерывном режиме в проточном реакторе с неподвижным слоем биокатализатора при температуре 60-70°С, биокатализатор используют в виде частиц размером от 0,2 до 4,0 мм.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2