ES2198792T3

ES2198792T3 - Conjugado de polisacarido capaz de unirse a celulosa.

Info

Publication number: ES2198792T3
Application number: ES98966867T
Authority: ES
Inventors: Mark John Berry; Paul James Davis; Michael John Gidley
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-01-16
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: US6225462B1; EP1047725B2; BR9813358A; TR200002050T2; AR014316A1; AU2515099A; EP1047725A1; CA2316894C; WO1999036469A1; EP1318171A1; DE69815396T3; EP1047725B1; ZA99191B; DE69815396D1; CA2316894A1; DE69815396T2; ES2198792T5

Abstract

Un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido con una entidad adherida que tiene un peso molecular de al menos 5000, siendo el conjugado de polisacárido capaz de unirse a celulosa, y siendo la entidad adherida una enzima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

Description

Conjugado de polisacárido capaz de unirse a celulosa.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la unión de polisacáridos y trata de un conjugado de polisacárido que se une a celulosa, de productos que incluyen el conjugado de polisacárido, y métodos para seleccionar dianas usando el conjugado de polisacárido. En el contexto de la invención, el término ``polisacárido'' está destinado a cubrir polisacáridos y oligosacáridos, y las referencias a ``polisacárido'' y ``conjugado de polisacárido'' se deben interpretar en consecuencia. El término ``conjugado'' se usa para referirse a unidades unidas o aseguradas juntas (física y/o químicamente), comprendiendo el ``conjugado de polisacárido'' un polisacárido unido o asegurado a otra entidad.

Antecedentes de la invención

Se sabe que diversos polisacáridos de origen natural, tales como xiloglucano de guisante, xiloglucano de semilla de tamarindo, etc., se unen a celulosa mediante una interacción polisacárido:polisacárido; de hecho, esta capacidad de unión es importante en el funcionamiento de las paredes celulares de la planta.

El documento US-A-3297604 se refiere a composiciones polímeras que contienen galactosa oxidada para formar un grupo carbonílico en la posición C6. El grupo carbonílico activo puede reaccionar de manera conocida, por ejemplo para formar cianohidrinas, compuestos de adición de bisulfitos, oximas, hidrazonas, etc. Las composiciones también pueden actuar para reticular polímeros, incluyendo celulosa. El polímero puede ser, por ejemplo, goma guar, goma de algarroba, etc. No hay descripción alguna de un conjugado de polisacárido con entidad adherida de peso molecular de al menos 5.000. Aunque la propia composición polímera puede ser capaz de unirse a celulosa, esto no es inesperado, y no hay ninguna descripción de un conjugado de polisacárido que sea capaz de unirse a celulosa.

El documento US-A-2949397 se refiere al uso de carga mineral revestida, al menos parcialmente, con coloide orgánico disperso en agua, para promover la retención de la carga en fibras celulósicas en la obtención de papel. El coloide puede ser, por ejemplo, un galactomanano, o un manano sustituido tal como goma de algarroba y goma guar. La carga revestida es atraída a las fibras de celulosa mediante acción electrostática. La carga y el coloide se mezclan juntos, pero se separan al dejar reposar y por tanto están en forma de una mezcla simple y no como un conjugado de polisacárido.

El trabajo de Hayashi y otros, titulado ``Pea Xyloglucan and Cellulose'' en Plant Physiol. (1987) 83, 384-389, describe investigaciones de unión de xiloglucano de guisante a celulosa, usando xiloglucano marcado con fluoresceína, preparado tratando xiloglucano con CNBr e incubándolo con fluoresceinamina, y también usando xiloglucano radioyodado preparado por reacción de ^{125}I con el resto fluoresceínico en xiloglucano. Estos marcadores se usaron para rastrear la unión del polisacárido y están entre las entidades de marcado isotópico moleculares más pequeñas conocidas.

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que los polisacáridos con entidades adheridas mucho mayores que aquellas usadas por Hayashi y otros, pueden aún unirse rápidamente con elevada eficiencia a celulosa mediante interacción de polisacárido:polisacárido. Esto es sorprendente debido a que la unión ocurre en múltiples sitios a lo largo de las cadenas principales de los polisacáridos, en vez de en un único sitio de unión como con las interacciones anticuerpo-antígeno, y se habría predicho que la unión habría sido interrumpida por la adhesión de grandes entidades a polisacáridos que se unen a celulosa. La invención abre de este modo la posibilidad de usar polisacáridos para seleccionar como dianas a entidades adheridas a celulosa, por ejemplo en tejido, papel, etc.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido con una entidad adherida que tiene un peso molecular de al menos 5.000, siendo capaz el conjugado de polisacárido de unirse a celulosa, y siendo la entidad adherida una enzima, anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El conjugado de polisacárido es preferiblemente capaz de unirse a celulosa mediante interacción polisacárido: polisacárido.

El polisacárido puede ser aquél que se une naturalmente a la celulosa, o del que se ha obtenido un derivado o se ha modificado de otro modo para unirse a celulosa. El polisacárido puede ser de origen natural o sintético.

El polisacárido tiene deseablemente una estructura de cadena principal (azúcar generalizado) de \beta-glicano enlazado vía 1-4, que es estereoquímicamente compatible con celulosa, tal como una cadena principal de glucano (que consta de residuos de glucosa enlazados vía \beta 1-4), una cadena principal de manano (que consta de residuos de manosa enlazados vía \beta 1-4), o una cadena principal de xilano (que consta de residuos de xilosa enlazados vía \beta 1-4). Los polisacáridos adecuados incluyen xiloglucanos, glucomananos, mananos, galactomananos, \beta(1-3)- y (1-4)-glucano, y la familia de xilanos que incorpora glucurono-, arabino- y glucuronoarabinoxilano. Véase ``Physiology and Biochemistry of Plant Cell Walls'' (1990) por C. Brett y K. Waldron para una discusión de estos materiales.

El requisito de longitud mínima de cadena para que los oligómeros de celulosa se unan a la celulosa es de 4 unidades de glucosa. Para xiloglucanos, las cadenas laterales hacen a la unión menos eficiente, y se requieren 12 unidades de glucosa en la cadena principal (es decir, alrededor de 25 unidades totales de azúcar) para la unión a celulosa. Consideraciones estructurales sugieren que los galactomananos son intermedios en la eficiencia de unión, y se espera que se requieran alrededor de 6 a 8 residuos en la cadena principal para la unión a celulosa. De este modo, el polisacárido debe tener al menos 4, y preferiblemente al menos 10, residuos en la cadena principal, que están enlazados preferiblemente vía \beta 1-4.

Los polisacáridos de origen natural que se unen rápida y fuertemente a celulosa mediante interacción polisacárido:polisacárido incluyen xiloglucanos, tales como xiloglucano de guisante y xiloglucano de semilla de tamarindo (TXG) (que tiene una cadena principal de glucano enlazada vía \beta 1-4, con cadenas laterales de \alpha-D-xilopiranosa y -D-galactopiranosil-(1-2)-\alpha-D-xilopiranosa, ambas enlazadas vía 1-6 a la cadena principal: véase Gidley y otros Carbohydrate Research, 214 (1991) 200- 314 para una discusión de la estructura del polisacárido de semilla de tamarindo); y galactomananos, particularmente galactomananos con bajo contenido en galactosa, tal como goma de algarroba (LBG) (que tiene una cadena principal de manano de residuos de manosa enlazados vía \beta 1-4, con cadenas laterales de una sola unidad de galactosa enlazadas 1-6 a la cadena principal), guar modificada por enzimas (EMG) (goma guar que tiene las mismas unidades estructurales que LBG, pero que tiene un nivel mucho mayor de sustitución con galactosa, hasta el grado de que no hay suficiente cadena principal de manano accesible a través de la cual unirse a celulosa. La EMG se produce mediante eliminación enzimática, a partir de la goma guar, de un porcentaje controlable de los residuos de la galactosa para producir un intervalo de materiales que son capaces de unirse a celulosa, pero que son más baratos y están más consistentemente disponibles que LBG. Véase Bulpin y otros. en Carbohydrate Polymers 12 (1990) 155-168 para una discusión de EMG), galactomanano de tara y galactomanano de casia. Estos materiales están comercialmente disponibles y proporcionan de este modo fuentes potencialmente útiles de polisacáridos adecuados. Estos materiales tienen las ventajas de ser relativamente baratos, y ya se han aceptado para el uso alimentario.

El polisacárido tiene deseablemente residuos de galactosa en la cadena lateral susceptibles de oxidación mediante galactosa-oxidasa, para la producción de un grupo aldehído para el acoplamiento de una entidad proteínica, como se describirá más abajo. El TXG, la LBG y la EMG tienen tales residuos de galactosa.

La entidad adherida se puede seleccionar de un amplio intervalo de entidades que generalmente realizan una función útil en proximidad a la celulosa, por ejemplo en tejido, papel, etc., y es una enzima, anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La enzima es convenientemente una oxidasa, peroxidasa, catalasa o ureasa. Estas enzimas funcionan mediante la difusión de sus sustratos a ellas, y generan un flujo de producto activo de moléculas que se difunden. Las enzimas redox, por ejemplo oxidasas tales como glucosa-oxidasa, generan peróxido de hidrógeno que puede actuar como un agente de blanqueo. La peroxidasa cataliza la oxidación por peróxido de hidrógeno de un número de sustratos. La ureasa cataliza la hidrólisis de urea, liberando un flujo de iones amonio que eleva el pH local. La catalasa es una oxidorreductasa que cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, en técnicas de separación o purificación, como se describe más abajo, o en inmunoensayos.

La entidad se puede adherir al polisacárido mediante un intervalo de medios físicos y químicos. Por ejemplo, las proteínas se enlazan químicamente de forma conveniente a polisacáridos que tienen cadenas laterales de galactosa oxidando enzimáticamente la galactosa, por ejemplo usando galactosa-oxidasa, para producir un grupo aldehídico al que se puede enlazar químicamente un grupo amino de una proteína. Como se señala anteriormente, el TXG, la LBG y la EMG tienen cadenas laterales adecuadas de galactosa. Para los polisacáridos que no tienen cadenas laterales adecuadas de galactosa, se pueden usar diferentes métodos de enlace químico de proteínas. Técnicas alternativas incluyen la oxidación limitada con peryodato, que requiere que el polisacárido tenga dos grupos hidroxílicos adyacentes en orientación cis, y da como resultado la producción de grupos aldehídicos que se pueden aminar de forma reductora. Una posibilidad adicional es la reacción con bromuro de cianógeno (CNBr) que se inserta en los anillos de los azúcares en dioles vecinales, tanto en la cadena principal como en las cadenas laterales, para proporcionar un enlace de isourea a los grupos amino de las proteínas. Se prefiere usar técnicas químicas que no afecten a la longitud de la cadena principal del polisacárido, lo que reduciría la capacidad de unión del polisacárido a la celulosa.

El polisacárido se adhiere físicamente de forma conveniente a las partículas, por ejemplo mediante adsorción. Por ejemplo, las partículas de sílice porosa tienen propiedades superficiales que permiten la adsorción firme del polisacárido. También se pueden usar técnicas de adhesión química. Por ejemplo, para partículas que tienen grupos amino en la superficie, la adhesión puede ser mediante las técnicas discutidas anteriormente para la adhesión de proteínas, por ejemplo vía oxidación de cadenas laterales de galactosa. Para partículas con grupos carboxílicos o hidroxílicos en la superficie, se pueden usar otras formas conocidas de enlazamiento químico. Como una posibilidad adicional, cuando la partícula es un liposoma o una micela, se pueden insertar colas hidrófobas fijadas al polisacárido.

Debido a que el conjugado de polisacárido se une a la celulosa, que está presente en el algodón y otros tejidos, papel, etc., la unión del conjugado a la celulosa aproxima mucho a la entidad adherida a una superficie de celulosa, o que contiene celulosa. La invención permite de este modo la selección como dianas de entidades adheridas para tales superficies. Esta función de selección como dianas es de uso en un número de diferentes aplicaciones potenciales, que incluyen las siguientes:

1. Selección como dianas de enzimas para unirlas a tejidos, por ejemplo enzimas oxidantes solubles, tales como glucosa-oxidasa. Tales enzimas actuarán liberando peróxido de hidrógeno que puede actuar como un agente de blanqueo y, de este modo, tiene un efecto de limpieza de los tejidos, o actúa bloqueando la transferencia de colorantes durante el lavado para evitar que se pierdan los colores o evitar que las prendas de color blanco se pongan de un color gris. Los conjugados de polisacárido-oxidasa encuentran uso de este modo en el tratamiento de nuevas prendas, particularmente prendas que contienen algodón, y como ingredientes en productos para la colada, tales como productos de lavado y acondicionamiento de tejidos.

2. Selección como dianas de enzimas, anticuerpos, partículas, etc., para unirlas a papel, por ejemplo para producir el blanqueo o el teñido del papel.

3. La inmovilización de anticuerpos, enzimas u otras moléculas sobre una superficie que contiene celulosa, por ejemplo partículas de celulosa o papel, por ejemplo para uso en ensayos de diagnóstico o sistemas inmunoabsorbentes.

4. En técnicas de separación o purificación, que implican hacer pasar al conjugado de polisacárido a través de un lecho de celulosa para eliminar el conjugado. Por ejemplo, mediante uso de un conjugado adecuado de anticuerpo-polisacárido, el antígeno se puede unir al conjugado y eliminarlo a continuación, por ejemplo de la disolución, mediante la unión del conjugado (y del antígeno adherido) a la celulosa, por ejemplo en un lecho de celulosa.

Un beneficio adicional de la invención surge del hecho de que, a diferencia de la mayoría de las moléculas selectoras de dianas, los polisacáridos que se unen a celulosa son especialmente robustos. Las proteínas, tales como el dominio de unión a celulosa, se pueden inactivar (desnaturalizar) mediante calor o con tensioactivos agresivos, mientras que los polisacáridos tales como LBG, TXG, etc., no se ven afectados por tales tratamientos. Los conjugados de polisacárido de la invención ofrecen de este modo la ventaja considerable de una estabilidad extra y una compatibilidad de producto comparada con otras moléculas selectoras de dianas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un producto que incorpora un conjugado de polisacárido según la invención. El producto es convenientemente un producto para la colada, tal como un producto para el lavado de tejidos, por ejemplo un producto detergente, o un producto acondicionador de tejidos. En este caso, la entidad adherida puede ser una enzima.

La invención también encuentra aplicación en los productos personales. Otras aplicaciones incluyen, por ejemplo, sistemas analíticos de diagnóstico, productos papeleros, etc.

El producto puede ser, de otro modo, de una formulación generalmente convencional, como es bien conocida para los expertos en la técnica. Para una discusión de composiciones detergentes conocidas véase, por ejemplo el documento WO-A-95/34628, particularmente las páginas 11 a 15.

La presente invención también proporciona un método para seleccionar como diana la unión de una entidad a la celulosa mediante el uso de un conjugado de polisacárido según la invención.

La invención se describirá adicionalmente a título de ilustración, en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Conjugación de goma de algarroba con glucosa-oxidasa Materiales y métodos Purificación de goma de algarroba

Se purificó goma de algarroba (LBG) (suministrada por Meyhall) según el siguiente método. Se preparó una disolución acuosa de LBG al 1% (p/v) disolviendo 15 g de LBG en 1500 ml de agua a 80-90ºC durante 30 minutos con agitación mecánica en un homogeneizador Silverson. La disolución resultante se sometió a centrifugación a 27.000 g (Sorval RC5C, 6 disoluciones de 250 ml, rotor de GSA) durante 30 minutos. Se retiró el sobrenadante, y los gránulos que quedaron se disolvieron en 500 ml de agua desionizada, nuevamente a 80-90ºC durante 30 minutos con la ayuda del agitador Silverson. Esta disolución se centrifugó posteriormente como antes. Los sobrenadantes combinados resultantes se precipitaron entonces en isopropanol (1:2, sobrenadante:isopropanol) a temperatura ambiente. El precipitado filamentoso se lavó adicionalmente en isopropanol, se dejó reposar en acetona durante una hora y entonces se lavó dos veces con acetona reciente. Este LBG purificado se secó en aire, y entonces en un horno de vacío a 45ºC.

Oxidación de goma de algarroba por medio de galactosa-oxidasa

La LBG purificada se disolvió a 0,1% (p/v) en fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0) calentando hasta 80-90ºC, y agitando periódicamente con un homogeneizador Ultra-Turrax. Se disolvió galactosa-oxidasa (Sigma, G7907) en fosfato de sodio, pH 7,0, hasta una concentración de 50 \mug/ml. Se añadió una alícuota de 400 \mul de esta disolución a 1,2 ml de disolución de LBG (0,1% (p/v)), y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 5-16 horas, dependiendo del experimento particular.

Conjugación de glucosa-oxidasa (GOX) a LBG oxidada

La glucosa-oxidasa (producto de Sigma nº 7141, 12,5 mg) se pesó en un tubo, y se añadieron 0,5 ml de disolución de LBG oxidada/galactosa-oxidasa. A la mezcla se le dieron golpecitos suavemente para disolver la glucosa-oxidasa, y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió cianoborohidruro de sodio (NaBH_{3}CN, 10 \mul a 19 mg/ml), y el tubo se dejó a temperatura ambiente toda la noche. La glucosa-oxidasa tuvo un peso molecular aproximado de 160.000.

Ensayo para el conjugado activo (unión a celulosa) Procedimiento general

Todos los ensayos explotaron la capacidad de los galactomananos para unirse a celulosa mediante interacción polisacárido:polisacárido. Se usaron partículas de celulosa Sigmacell Tipo 20, con un tamaño medio de 20 m (de Sigma) para proporcionar una superficie sobre la que capturar las moléculas que se unen a la celulosa. Se obtuvo una suspensión de 50 mg/ml de Sigmacell en PBS + Tween (0,05%) (PBST). Los ensayos se realizaron en placas de filtro (Millipore, Producto nº MAHVN4550) con filtros de tamaño de poros de 0,45 m. Las placas siempre se pretrataron empapándolas toda la noche en PBST con albúmina de suero bovino (BSA, 2% p/v) para evitar la unión no específica de la enzima o del conjugado. Las disoluciones se extrajeron a través de la placa de filtro usando un colector de vacío comercialmente disponible (Anachem). La disolución de tratamiento (PBST/BSA) de la noche se eliminó antes del experimento. Se añadieron 100 \mul de la suspensión Sigmacell (agitada inmediatamente antes de la adición) a cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de conjugados de LBG diluidos apropiadamente (véase más abajo) a la suspensión de Sigmacell en placas de 96 pocillos, y se incubó durante 10 minutos para permitir la unión a la superficie de la celulosa. Tras 10 minutos, la disolución se eliminó a vacío, y la celulosa se lavó mediante adición de 150 \mul de PBS + Tween (0,05%), cinco veces. Los ensayos se continuaron entonces como se muestra más abajo para cada uno de los conjugados.

Ensayo de Conjugado de LBG/GOX

Se diluyó el conjugado madre de LBG/GOX, que contiene 25 mg/ml de glucosa-oxidasa y 0,1% (p/v) de LBG, hasta una concentración de 25 \mug/ml en PBST + PSA (2% p/v). También se diluyó hasta la misma concentración una mezcla de control que contiene 25 mg/ml de glucosa-oxidasa con LBG sin modificar, para comprobar la unión no específica. Tras la incubación con los conjugados, las partículas de Sigmacell se lavaron, y a continuación se añadió a cada pocillo el sustrato TMB GOx. El sustrato de TMB se preparó disolviendo los siguientes ingredientes en 20 ml de agua:

- fosfato disódico (0,45 mg),

- ácido cítrico (150 mg),

- D-glucosa (0,54 g),

- peroxidasa de rábano picante (100 ng) y

- 200 \mul de una disolución madre de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina en DMSO (100 mg/10 ml de DMSO).

El sustrato se dejó con las partículas durante varios minutos, hasta que apareció un color azul. Antes de que se registraran las densidades ópticas, la disolución del sustrato se acidificó mediante adición de 50 \mul de HCl 2 M a cada pocillo, y el producto amarillo se extrajo sobre una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se determinó la densidad óptica (OD) a 450 nm, y se registró en un lector automático de placas.

Resultados

El procedimiento de conjugación mediante aminación reductora produjo un conjugado activo de dos moléculas, GOx y LBG, como se muestra mediante los valores de densidad óptica en la Tabla 1. Se retuvieron tanto la actividad de unión a celulosa del galactomanano como la actividad enzimática de la GOx, y se combinaron efectivamente en el conjugado. Por contra, el bajo valor de la OD para la mezcla simple de LBG y GOx proporciona una confirmación de que el comportamiento del conjugado resultó de la conjugación química de las dos moléculas.

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TABLA 1 Valores de densidad óptica derivados del ensayo de muestras de prueba y de control producidas mediante el procedimiento de conjugación por aminación reductora. La incubación con el sustrato se continuó durante sólo 5 minutos antes de que se determinaran los valores de OD.

Muestra de ensayo	Densidad óptica
Conjugado de LBG/GOx	1,031
Mezcla de LBG/GOx	0,001

Ejemplo 2 Conjugación de goma de algarroba con anticuerpo monoclonal 3299 Materiales y métodos

La LBG se purificó y oxidó como se describe en el Ejemplo 1.

Conjugación del anticuerpo monoclonal 3299 con LBG oxidada

Se dializó toda la noche una disolución de un anticuerpo monoclonal denominado 3299 (MAb 3299, obtenido de Unipath), específico para la gonadotropina coriónica humana (HCG) de la hormona del embarazo, frente a tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,5. La concentración final del anticuerpo se ajustó a 10 mg/ml mediante dilución adicional con el mismo tampón, según sea apropiado. El MAb 3299 tuvo un peso molecular apropiado de 150.000.

Se mezcló una muestra (20 \mul) de esta disolución de MAb 3299 con 20 l de la disolución de LBG oxidada (como antes), y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió una disolución (1 \mul) de NaBH_{3}CN (19 mg/ml), y la reacción se dejó a temperatura ambiente, toda la noche.

Ensayo para el conjugado de LBG/anticuerpo monoclonal 3299

Se diluyó en PBST + BSA (2% p/v) la disolución madre del conjugado de LBG/MAb 3299, que contiene 5 mg/ml de MAb 3299 y 0,05% de LBG, hasta una concentración de anticuerpo de 25 \mug/ml. También se diluyó hasta la misma concentración una mezcla de control, que contiene 25 mg/ml de MAb 3299 con LBG sin modificar, para comprobar la unión no específica. Tras la incubación con las partículas de celulosa, y el posterior lavado, se determinó el anticuerpo monoclonal unido a celulosa por medio de moléculas trazadoras conjugadas de fosfatasa alcalina. Estas fueron (a) conjugado de IgG anti-ratón de conejo con fosfatasa alcalina, o bien (b) conjugado de HCG con fosfatasa alcalina. Estos conjugados trazadores se diluyeron en PBST + BSA (2% p/v).

a) El conjugado trazador (Sigma) de IgG anti-ratón de conejo con fosfatasa alcalina se diluyó 1/1000, y se añadieron 150 \mul de éste a cada mezcla celulósica de LBG/MAb en las placas de filtro. Tras 1 hora, el conjugado trazador se eliminó por filtración, y las placas se lavaron 10 veces con 200 \mul de PBST por pocillo. Se añadió sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma 104) a cada pocillo (200 \mul de fosfato de para-nitrofenilo, pNPP, 1 mg/ml en tampón de dietanolamina, pH 10), y se mantuvo a temperatura ambiente hasta que se produjo un color amarillo significativo (alrededor de 30 minutos). El producto amarillo se extrajo entonces sobre una placa de microtitulación de la forma habitual, y se determinó la OD a 405 nm.

b) El conjugado trazador de HCG con fosfatasa alcalina se diluyó 1/200, y se añadieron 150 \mul de éste a cada mezcla celulósica de LBG/MAb en las placas de filtro. El experimento transcurrió entonces como en (a) anterior.

Resultados

Se encontró que el procedimiento de aminación reductora era efectivo para conjugar anticuerpos con LBG, según se muestra mediante los valores en la Tabla 2. En cuanto a GOx, los valores muestran que fue necesario un procedimiento de reticulación química (más que un mezclamiento simple) para obtener un conjugado activo, y el procedimiento no dio como resultado la pérdida de la actividad de unión en ninguna de las moléculas. Las diferentes moléculas trazadoras (IgG anti-ratón, y HCG) confirmaron que el anticuerpo se había unido a la celulosa en una forma que retenía su capacidad de unión específica, inmunológica (HCG), así como sus cualidades de inmunoglobulina general (IgG anti-ratón).

Los bajos valores de unión, pero medibles, encontrados con la muestra mezclada es una evidencia de una ``pegajosidad'' general asociada con el anticuerpo monoclonal y las partículas de celulosa (adsorción no específica). Sin embargo, la diferencia entre los dos conjuntos es una clara evidencia de la eficiencia aceptable de la conjugación.

TABLA 2 Valores de la densidad óptica obtenidos a partir del ensayo de muestras de prueba y de control producidas mediante el procedimiento de conjugación por aminación reductora.

Muestra de ensayo	OD 405 nm
	a) IgG anti-ratón de conejo/FA	b) HCG/FA
Conjugado de LBG/MAb 3299	1.040	0,831
Mezcla de LBG + MAb 3299	0,063	0,071

Ejemplo 3 Conjugación de goma de algarroba con scFv3299 Materiales y métodos

La LBG se purificó y oxidó como se describe en el Ejemplo 1.

El fragmento de anticuerpo Fv de cadena única de 3299 (scFv3299) es un fragmento genéticamente modificado por ingeniería que consta de las regiones variables del anticuerpo progenitor 3299, producido en microorganismos transformados con los genes relevantes, formateado adecuadamente para ese hospedante. Para trabajar con este material, primero fue necesario cultivar el organismo hospedador transformado, e inducir la expresión del gen y entonces purificar el scFv del fluido sobrenadante del cultivo. El scFv3299 modificado por ingeniería también llevó una ``cola'' corta de oligo-histidina, que se podría unir a iones de níquel inmovilizados como un medio de purificación (el procedimiento IMMAC). El scFv 3299 tuvo un peso molecular aproximado de 26.000.

Producción y Purificación de scFv

El fragmento de anticuerpo scFv3299, modificado por adición de una cola corta de oligo-histidina, se produjo en un microorganismo hospedante transformado (por ejemplo E. coli) usando métodos convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica. La proteína de scFv3299 se purificó mediante métodos estándares a través de un procedimiento IMMAC, y entonces a través de una cromatografía mono S (intercambio catiónico). La disolución proteínica purificada se sometió a un procedimiento de intercambio con tampón a través de una columna de filtración en gel de PD-10 (Pharmacia) en tampón de fosfato 0,1 M, pH 6,5.

Tiolación de scFv3299 con anhídrido 5-acetilmercapto-succínico (SAMSA)

El scFv3299 purificado a 1,4 mg/ml en tampón de fosfato, pH 6,5, 0,1 M (150 \mul), se colocó en un ``Reactivial'' (Pierce) de 0,6 ml. Entonces se añadió al vial una disolución (20 \mul) de SAMSA (suministrado por Sigma) disuelto en dimetilformamida a una velocidad de 6 mg/ml. Esta mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añadieron en sucesión los siguientes, agitándose la mezcla resultante durante 5 minutos tras cada adición:

25 \mul de EDTA 0,1 M, pH 8,0

100 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0

100 \mul de hidroxilamina 1 M

Tras la adición final, la mezcla se diluyó hasta 2,5 ml en fosfato de sodio 0,1 M + EDTA 5 mM, pH 6,5, y se aplicó a una columna de filtración en gel de PD-10. El conjugado de proteína-tiol se eluyó en 3 ml de tampón de fosfato + EDTA, que se concentró nuevamente reduciendo el volumen hasta 150 \mul a través de un dispositivo Centricon 10 (Amicon).

Obtención de LBG derivada con MPBH

Se disolvió hidrocloruro de hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH, producto de Pierce nº 22305) a 10 mg/ml en dimetilsulfóxido (DMSO). La LBG oxidada se preparó como se describe anteriormente, excepto que al final del procedimiento la galactosa-oxidasa dejada con el producto se desnaturalizó calentando a 98ºC durante 15 minutos. La disolución resultante se sometió a intercambio con tampón con acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5, mediante un dispositivo Centricon 30 (Amicon), y a continuación el volumen se ajustó nuevamente al volumen de partida mediante adición de más disolución de tampón, según sea apropiado. En este punto del procedimiento, se añadió MPBH en DMSO (21,3 \mul) a 600 \mul de la disolución de LBG oxidada, para dar una concentración de MPBH final de 1 mM. Esta mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. El producto de LBG derivada se sometió entonces a intercambio de tampón con tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5, mediante un dispositivo Centricon 30, tras lo cual se reajustó el volumen a 600 \mul.

Conjugación de scFv derivado por SAMSA con LBG derivada por MPBH

La disolución de scFv-SAMSA (75 \mul que contiene 0,105 mg) se mezcló con LBG-MPBH (25 \mul), y el volumen se llevó hasta 125 \mul con tampón de fosfato. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente toda la noche.

Ensayo para el conjugado LBG/scFv3299

La disolución madre del conjugado LBG/scFv3299, que contiene 0,34 mg/ml de scFv3299 y 0,02% de LBG, se diluyó en PBST + BSA (2% p/v) hasta una concentración de scFv de 34 \mug. Al igual que con todo el conjugado del anticuerpo, se diluyó hasta la misma concentración una mezcla de scFv y LBG, que contiene las mismas cantidades relativas. El procedimiento de ensayo fue como se describió anteriormente para todo el conjugado de anticuerpo, pero sólo con el conjugado trazador de HCG con fosfatasa alcalina (puesto que un fragmento de scFv no se podría detectar con IgG anti-ratón).

Resultados

Se encontró que el fragmento de anticuerpo scFv3299 se conjugó con LBG, según se muestra a partir de los valores en la Tabla 3, incluso aunque se utilizó un método de conjugación más complejo y diferente. La diferencia entre los valores de la mezcla de control y los valores del conjugado es menor que con los otros sistemas, indicando bien una menor eficacia de conjugación o bien una mayor tendencia del material no conjugado a adsorberse no específicamente. Es más probable una menor eficiencia de la conjugación, puesto que se necesitó un tiempo de incubación más prolongado con el sustrato para producir valores de OD adecuados.

Sin embargo, los resultados muestran claramente que, incluso con el fragmento de scFv, se logró un grado significativo y útil de conjugación química.

TABLA 3 Valores de densidad óptica derivados del ensayo de muestras de prueba y de control producidas a través del procedimiento de conjugación con SAMSA/MPBH.

Muestra de ensayo	Densidad óptica (405 nm)
Conjugado de LBG/scFv3299	0,714
Mezcla de LBG + scFv3299	0,147

Ejemplo 4 Conjugación de proteínas activas a xiloglucano de semilla de tamarindo (TXG)

Se disolvió polisacárido de semilla de tamarindo (Glyoid 3S de Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japón) en agua desionizada (16 horas a 25ºC, o 10 minutos a 80ºC, seguido de 2-3 horas a 25ºC), para dar una suspensión al 0,5-1,0% p/v que se aclaró mediante centrifugación (20.000 g, 30 minutos), se dializó ampliamente frente a agua desionizada, y se liofilizó.

Entonces se formaron conjugados del TXG resultante con glucosa-oxidasa, MAb 3299 y con scFv 3299, exactamente como se describe en los Ejemplos 1, 2 y 3, y se encontró que los conjugados resultantes se unían a celulosa.

Claims

1. Un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido con una entidad adherida que tiene un peso molecular de al menos 5000, siendo el conjugado de polisacárido capaz de unirse a celulosa, y siendo la entidad adherida una enzima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

2. Un conjugado según la reivindicación 1, en el que el polisacárido tiene una estructura de cadena principal de

\hbox{ \beta -glicano}

enlazado vía 1-4.

3. Un conjugado según la reivindicación 2, en el que el polisacárido tiene una cadena principal de glucano, una cadena principal de manano o una cadena principal de xilano.

4. Un conjugado según la reivindicación 3, en el que el polisacárido se selecciona de xiloglucanos, glucomananos, mananos, galactomananos, \beta-(1-3)- y (1-4)-glucano, y la familia de xilanos que incorpora glucurono-, arabino- y glucuronoarabinoxilano.

5. Un conjugado según la reivindicación 4, en el que el polisacárido se selecciona de xiloglucanos tales como xiloglucano de semilla de tamarindo (TXG) y xiloglucano de guisante; y galactomananos, particularmente galactomananos con bajo contenido en galactosa, tales como goma de algarroba (LBG), goma guar modificada por enzimas (EMG), galactomanano de tara y galactomanano de casia.

6. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polisacárido tiene residuos de galactosa en la cadena lateral susceptibles de oxidación mediante galactosa-oxidasa.

7. Un conjugado según la reivindicación 1, en el que la enzima es una oxidasa, peroxidasa, catalasa o ureasa.

8. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la entidad adherida es una partícula.

9. Un conjugado según la reivindicación 8, en el que un agente de beneficio está asociado a la partícula.

10. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la entidad está adherida al polisacárido mediante medios físicos o químicos.

11. Un conjugado según la reivindicación 10, en el que la entidad tiene grupos amino disponibles, y está enlazada químicamente a grupos aldehídos formados en el polisacárido.

12. Un conjugado según la reivindicación 11, en el que una entidad proteínica está enlazada químicamente a TXG, LBG o EMG vía grupos aldehídicos producidos mediante oxidación enzimática de cadenas laterales de galactosa.

13. Un conjugado según la reivindicación 10, en el que las entidades de la partícula están enlazadas físicamente al polisacárido.

14. Un producto que incorpora un conjugado de polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. Un producto según la reivindicación 14, que comprende un producto para la colada tal como un producto para el lavado de tejidos, por ejemplo un producto detergente, o un producto para el acondicionamiento de tejidos.

16. Un producto según la reivindicación 15, en el que la entidad adherida es una enzima o una partícula que tiene fragancia.

17. Un método para seleccionar como diana la unión de una entidad a celulosa mediante uso de un conjugado de polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.