DE2420747A1 - Polymere traeger zur bindung biologisch aktiver proteine - Google Patents
Polymere traeger zur bindung biologisch aktiver proteineInfo
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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Description
ΙΙΙ/Κ FRANKFURT (MAIN), 2 C
YEDA Research and Development Oo. Ltd. Rehovot, Israel
Die Erfindung betrifft polymere Träger zur Bindung von biologisch aktiven Proteinen, insbesondere von Enzjeen. Träger
gemäß der Erfindung sind Reaktionsprodukte aus einem Athylenmaleinsäureanhydrid-copolymer (EMA.) und einem Diemin, wie
Hydrazin (EMA-Hydrazinharz), ρ ,ρ' -Diaainodiphenylmethan (EMA-MDA-Harz) oder einem primären aliphatischen Diamin, wie 2,6-Diaminohezan (EMA-HMD-Harz). EMA-Hydrazid und EMA-MDA-Harze
sind anionisch. Die Erfindung betrifft ebenfalls kationische Harze, die aus den erstgenannten Harzen dirch Reaktion mit
N,N-Dimethyl-1,3-propan-diamin (DMPJL) in Gegenwart eines Aktivierungsmittels entstehen. Die Erfindung betrifft auch die
Reaktionsprodukte dieser Harze mit biologisch aktiven Proteinen und insbesondere trägergebundene Enzyme, die durch Kupplung solcher Harze mit Enzymen hergestellt sind. Die Erfindung
betrifft ferner enzymatisch^ Prozesse, die durch diese neuen trägergebundenen Enzyme bewirkt werden, insbesondere Prozesse,
wie die Gesinnung von Milch durch Zusammenbringen eines geeigneten EMA-HMD-Pepsin-Präparates mit Milch.
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Immobilisierte Enzymderivate dienen als spezifische, leicht
entfernbare Katalysatoren, die wiederholt in Kolonnen bzw. Säulen und in Ansatzreaktoren verwendet werden können. Eine
große Anzahl von immobilisierten Enzymsystemen sind in der Literatur beschrieben, z.B. von L.Goldstein und E.Katchalski
"Z.Anal.Ghem.M 2£5 (1968) 375.
Die meisten, für die kovalente Bindung von Enzymen verwendeten
natürlichen hydrophilen Polymere sind Polysaccharide (z.B.Cellulosederivate
oder vernetzte Sextrane) und deren chemische Reaktivität und mechanische Stabilität sind auf die Eigenschaften
der Monomereneinheit beschränkt.
Synthetische polymere Träger eröffnen einen viel weiteren Bereich der Eigenschaften und können durch Modifizierung der chemischen
Materialzusammensetzung spezifischen Bedürfnissen angepaßt werden. In vielen fällen zeigen an synthetische Polymere
gebundene Enzyme eine Stabilität bei niedrigen !Temperaturen und der Lyophilisierung, was auf die hydrophobe Natur
des Trägers zurückzuführen sein dürfte.
fixe Erfindung betrifft neue hydrophile, anionische oder kationische
polymere Reagenzien, die Diazoniumacylazid oder primäre funktioneile Amingruppen enthalten. Bas Ausgangsmaterial ist
ein im Handel erhältliches 1 si-Copolymer aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid
(EHA). Durch Kupplung von EHA mit ρ ,p'-Diaminodiphenylmethan
(Methylendianilin, HIiA), mit Hydrazin oder mit 2,6-Diaminohexan (HHD) erhält man anionische Arylamine, Acylhydrazide
oder primäre aliphatische Aminharze von hoher Kapazität· Ik nachfolgenden Schema 1 sind diese Harze unter A und B
als EMA-HDA, EHA-Hydrazid und EHA-HMD- bezeichnet. Die anioniseilen
EHA-HDA- und EHA-Hydrazidharze dienen als Stammvertendüngen
für die umwandlung in die kationisch em Amidopropyldimethylamino-Präparate*
Dies erfolgt durch Kupplung der freien Carboxylgruppen des Harzes mit N,li-Dimethyl-1s3-propandiamin
(DiQBA) in Gegenwart von Dieyclohexylearbodiimid (DCO), wie im
Schema 2 dargestellt.
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Schema 1
Athylen-Haleinsäureanhydrid-Gopolymer (EMA)
-CO.NH.NH,
-GOOH
-GO-HH.NH, -GOOH
-COOH
j-GOOH EMA-MBl-Harz
Synthese von MA-MDA und ΕΜΑ,-Hydrazid-Harzen
ri
-GOHH. -COOH |
(CH2 H N |
SH2 |
-CONH. -GOOH |
(GH2 | |
)6.NH2 .(CH0),-.] |
||
DGC | ||
)6.NH2 |
Athylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer
(ΈΝΑ)
2 g2 -GOHH(CH2)eHH2
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ema 2
-COX
-COOH
-COZ
-COOH
-COZ
-CO.HH. CSH2. GH2. CSH2.li(0H3)2 -COZ -OQ.NH.CH2. CH2.CH2
Z m -
Die anionischen und kationischen EKA-MDA- und EMA-Hydrazide und
die EHA-HHD-Harze werden nach zweckmäßiger Aktivierung mit verschiedenen Enzymen gekuppelt. Die EMA-Proben werden vor der
Verwendung während 48 Stunden bei 110°C im Vakuum Über P3O5 getrocknet. Alle Heagentien und Puffer sind in bester Qualität
erhältlich.
EHA-HDA, EHA-Hydrazid und EHA-HHD bezeichnen die Harze, die durch Kupplung von EHA nit ρ,ρ'-Diaminodiphenylmethan, Hydrazin
oder 1,6-Diaainohexan hergestellt sind (vgl. Schema i).
Aus der Vielzahl der Möglichkeiten werden einige Ausftihrungsbeispiele angegeben.
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Herstellung von EMA-Hydrazid-Harz
a) Herstellung von anionischem EMA-Hydrazid-Harz EMA-Hydrazid-Harz wird in zwei Stufen hergestellt. Zuerst wird
EMA. durch Zusatz von 30 Mol.% Hydrazin vernetzt. Das vernetzte
unlösliche EMA wird dann zur vollständigen Umwandlung des restlichen Anhydrids in Acylhydrazidgruppen mit einem zweifachen
Überschuß an Hydrazin umgesetzt. Hierzu wurde folgendermaßen vorgegangen:
12,6 g ofengetrocknetes EMA (0,1 Mol Anhydrid) wurden unter
BUhren in 100 ml zweifach destilliertem DimethyldulfoxLd (ISlSO)
gelöst. Eine Lösung von 1,5 g (0,03 Mol) Hydrazin-hydrat in
50 ml IMSO wurde dann unter starkem Rühren langsam zugegeben.
Das Beaktionsgemisch verfestigte sich sofort zu einem glasigen
Gel. Diese Masse wurde mit einem Glasstab zerstoßen und bei Raumtemperatur 24 Stunden in einem geschlossenen Gefäß stehen
gelassen, um die Vernetzungsreaktion zu vervollständigen. Das feste, glasige Material wurde mit einem Überschuß an trockenem
Aceton überdeckt, dann einige Minuten gerührt und absitzen gelassen.
Nach Dekantieren der Flüssigkeit wurde dieser Vorgang wiederholt. Das feste Material wurde wieder in Aceton suspendiert,
in einem Homogenisator vermählen und absitzen gelassen. Das Mahlen bzw. Suspendieren wurde mehrere Male mit frischem
Aceton wiederholt, bis das Material eine harte Harzstruktur angenommen hatte, was sich durch leichte Filtrierbarkeit auf
einem Saugfilter zeigt. Zur Entfernung des Acetone wurde einige Minuten auf dem Filter getrocknet, dann wurde das Harz in 100 ml
UMSO suspendiert und mit einer Lösung von 10 g (0,2 Mol) Hydrazinhydrat in 100 ml DMSß versetzt. Das Beaktionsgemisch wurde
über Nacht bei Baumtemperatur gerührt.
Dann wurde das Beaktionsgemisch in Aceton gegossen. Nach Dekantieren
wurde der Feststoff mehrere Male mit Aceton vermählen, dann aif dem Saugfilter mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet.
Spuren des Lösungsmittels wurden im Exsiccator über I^5 bei
hohem Vakuum während weniger Stunden entfernt. Das Gewicht des
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trockenen EMA-Hydrazid-Harzes lag Dei 10 bis 12 g.
b) KationisierunK des EMA-Hydrazid-Harzes
2 g anionisches EMA-Hydrazid-Harz (1,3 3c 10" Basenmol Carboxyl)
wurden in einer Lösung von 6 g (3,0 χ 10 Mol3 Dicyclohexylcarbodiimid
in 60 ml ISISO suspendiert. Sann wurden 10 ml (0,1 Mol) N,N-Dimethyl-1,3-propandiamin (DMPA) langsam zu der magnetisch
gerührten Suspension zugefügt. Das Beaktionsgemiscii wurde über Nacht bei Baumtemperatur gerührt. Bann wurde das Harz
abzentrifugiert, wieder in EMSO suspendiert, einige Minuten magnetisch gerührt und wieder zentrifugiert. Dies wurde zweimal
wiederholt, um die Entfernung der Beagenzien zu gewährleisten. Das kationisierte Harz wurde dann in Aceton suspendiert, einige
Minuten magnetisch gerührt und auf dem Saugfilter abgetrennt. Nach mehrmaliger Waschung mit Aceton wurde das Harz an der Luft
getrocknet und dann zur Entfernung von Spuren des Lösungsmittels Über Nacht in einem hochevakuierten Exsiccator über ^c0B gebraü.
Für dieses Verfahren können auch andere Amino-alkyl-N-dialkylamino-Derivate
verwendet werden.
c) Aktivierung des EHA-Hydrazid-Harzea
100 mg EMA-Hydrazid-Har» wurden in S ml 50%iger Essigsäure
(0,1 η in HGl) suspendiert und 30 min bei Bäumtemperatur gerührt.
Dann wurde die Suspension auf 4*0 gekühlt, tropfenweise mit
einer Lösung von 40 mg Natriumnitrat in 1 ml Wasser versetzt und 1 Stunde über Eis gerührt. Das aktivierte Harz wurde auf dem
Saugfilter abgetrennt und auf dem Filter ganz gründlich mit kaltem Wasser gewaschen. Dann wurde in Wasser suspendiert und äurcli
tropfenweis· Zugabe von 0,5 η NaOH auf pH 9 gebracht. Hierbei
wurde durch Zugabe von gestoßenem Eis die Temperatur niedrig gehalten. Das polymere Acylazid wurde durch Filtration abgetrennt,
mit 0,2 m Borat-Puffer (pH 8,4) gewaschen, wieder suspendiert und unmittelbar für die Kupplung verwendet.
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e) Kupplung des anionisehen EHA-Hy&gazid-Harzeg mit Proteinen
Eine frisch hergestellte, kalte Lösung von 10 Ms 40 ng Enzym,
wie Trypsin, Chymotrypsin, Subtilisin novo, Subtilisin Oarlsberg,
Papain und Pepsin, in 2 ml 0,2 m Boratpuffer (pH 8,4) wurde langsam einer magnetisch gerührten Suspension von 100 mg
EHA-Hydrazid in 5 al des gleichen Puffers zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wurde über Nacht bei 4·Ο gerührt. Sas wasserunlösliche
EHA-Hydrazid-Enzymderivat wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser, 1 m KQl und nochmals mit Wasser gewaschen
und dann in Wasser suspendiert.
f) Kupplung des kationischen EHA-Hydrazid-Harzes mit Proteinen
Die Kupplung erfolgte in o,2 m Borat bei pH 8. Sie nachfolgen-'
den Waschungen des unlöslichen Enzymderivates wurde ebenso wie bei dem anionischen Derivat durchgeführt.
Herstellung von EHA-HBA-Harz
a) Herstellung des anionischen EHA-HBA-Harz es 12,6 g ofengetrocknetes EHA (0,1 Hol Anhydrid) wurden unter
Rühren in 100 ml redestilliertem Dimethyleulfoxid gelöst. Eine
Lösung von 39»6 g (0,2 Hol) pjp'-Diaminodiphenylmethan in
200 ml SMSO wurde unter heftigem Bahren zugegeben. Sas Reaktionsgemisch
verfestigte sieh nach 2 bis 3 Hinuten· Sie feste
Hasse wurde mit einem Glasstab zerstoßen und bei Raumtemperatur
24 bis 48 Stunden in einem geschlossenen Gefäß stehen gelassen. Sas harte, glasige Gel wurde mit Aceton Uberschichtet und einige
Hinuten gerührt. Nach Absitzen des Feststoffs wurde dekantiert. Siese Behandlung wurde zweimal wiederholt. Sas gehärtets opake
Haterial wurde mit Aceton vermählen und dann auf dem Saugfilter von der Flüssigkeit abgetrennt. Siese Behandlung wurde wiederholt,
bis ein feines hartes Pulver von Harzstruktur entstanden war. Bas Pulver wurde auf dem Filter mit Aceton gewaschen und
^.aftgetrocknet. Spuren des Lösungsmittels wurden während weniger
Stunden im Exsiccator über PpOc hei angeschlossener Hochvakuumpumpe
entfernt. Han erhielt etwa 28 g trockenes EMA-HSA-Harz.
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b) Eationisierung des EMA-MDA-Harzes
Die Kationisierung wurde ebenso wie bei dem EMA-Hydrazid-Harz
durchgeführt.
o) Diazotierung des EMA-MDA-Harzes
100 mg EMA-MDA-Harz wurden in 8 ml 50%iger Essigsäure (0,1 η
in HOl) suspendiert und während etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. ftLe gerührte Suspension wurde auf 4·0 abgekühlt
und tropfenweisi mit einer Lösung von 40 mg Natriumnitrit in
1 ml Wasser versetzt. Das Diazotierungsgemisch wurde 1 Stunde über Eis gerührt, auf dem Saugfilter filtriert und zur Entfernung
der Säure mit !filtern Wasser gewaschen. Dann wurde das Harz in Wasser suspendiert und durch tropfenweise Zugabe von
0,5 η NaOH auf einen pH-Wei?t von etwa 10 gebracht. Ua die Temperatur
niedrig zu halten, wurde gestoßenes Eis zugegeben. Das dunkle, rotbraune Polydiazoniumharz wurde abfiltriert, mit
käLtem 0,2 m Phosphatpufrer/gewaschen, wieder suspendiert und
unmittelbar für die Kupplung verwendet.
d) Kupplung d es anionischen EMA-MDA-Harzes mit Proteinen Eine kalte lösung von 10 bis 40 mg Enzym in 2 ml o,2 m Phosphatpuffer
(pH 7)8) wurde langsam zu einer magnetisch gerührten
Suspension von 100 mg diazotierten. EMA-MDA in 4- ml des gleichen
Puffers zugegeben. Das fieaktionsgemisch wurde über Nacht bei
4-9G gerührt. Das wasserunlösliche EMA-MDA-Enzymderivat wurde
durch Zentrifugieren oder ^Filtrieren abgetrennt, mit Wasser, 1 m £01 und nochmals mit Wasser gewaschen und dann in Wasser
suspendiert.
e) Kupplung des kationischen EMA-MDA-Harzes mit Proteinen
Die Kupplung wurde ebenso wie bei den polyanionisehen EMA-MDA-Harzen
durchgeführt.
Beispiel 5 Herstellung von EMA-HMD-Harz
1,26 g ofengetrocknetes EHA (o,o1 Mol An-Jiydrid) wurden in 20 ml
redestilliertem DMSO gelöst. Eine Lösung von 3,5 g (0,03 Mol) HMD in 20 ml DMSO wurde langsam unter heftigem Eühren zugefügt.
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Bas Reaktionsgemisch verfestigte sieh fast sofort. Das harte
Gel wurde mit einen Glasstab zerstoßen und über Nacht bei Baum-, temperatur in einem geschlossenen Gefäß stehen gelassen. Pas
glasige Material wurde in einer lösung von 3 g (o,o145 Mol) Bicyclohexylcarbodiimid in 20 ml MSO dispergiert -und 3 bis
4 Stunden magnetisch gerührt. Pas gequollene Harz wurde zentrifugiert, wieder in BMSO suspendiert und wieder zentrifugiert.
Bie Ausfällung wurde zweimal mit heißem Äthanol gewaschen, um Spuren der Reagenzien und des Bicyclohesylharnstoffs zu entfernen. Bann wurde in Wasser suspendiert9in einem Mischte gemahlen und lyophilisiert. Man erhielt 3,1 g lyophilieiertes
Pulver.
f) Kupplung von PeO ein mit EMA-HMB-Harz
100 mg EMA-HMB-Harz Wurden in 2 ml 1 η HOl suspendiert und bei
Bäumtemperatur etwa 10 min gerührt. Bas gequollene Harz wurde
auf dem Saugfilter abgetrennt, auf dem filter mit 100 ml Wasser von pH 4 gewaschen und wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert. Bie Suspension wurde auf pH 4,0 gebracht. Eine
frisch zubereitete Lösung von. 10 mg Pepsin in 1 ml destilliertem Wasser wurde unter magnetischem Bohren zugesetzt und der pH-Wert auf 4,0 justiert. Bann wurden 2D mg EBG in 1 ml Wasser zugesetzt und der pH-Wert von 4,0 mittels 0,1 η HGl aufrecht
erhalten. Nach 30 bis 60 Minuten, wenn keine meßbare Änderung
des pH-Wertes mehr festgestellt werden konnte, wurde das Beaktionsgemisch in einen kalten Baum gebracht und Über Nacht gerührt. Bas immobilisierte Enzym wurde abzentrifugiert, mit 1 m
EGl gewaschen und mit 100 ml 0,01 η HCl auf pH 4 angesäuert.
Bann wurde es in 5 ml 0,01 η HGl suspendiert und bei 4*G gelagert.
g) Kupplung von Trypsin mit EMA-HMB-Harz
100 mg EMA-HMB-Harz wurden in 0,1 η NaOH suspendiert, etwa 5 min
gerührt, mit Wasser gewaschen und dann in 4 ml einer 12%igen Lesung von Glutaraldehyd von pH 9,0 suspendiert. Zur Herstellung
dieser Lösung wurde handelsüblicher 25%iger wäßriger Glutaraldehyd mit einem gleichen Volumen 0,2 m Borat von pH,9,0 verdünnt und der pH-Wert wieder eingestellt.
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Bas Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, ausgiebig mit Wasser und schließlich mit 0,1 m Phosphatpuffer
(pH 8,0)gewaschen. Das Harz wurde dann in 2 ml kaltem 0,1 m Phosphatpuffer
(pH 8,0) suspendiert. 10 mg Trypsin, gelöst in 1 ml des gleichen Puffers, wurden der magnetisch gerührten Suspension
zugesetzt. Die Reaktion erfolgte über Nacht im Kaltraum. Das immobilisierte Enzym wurde durch Zentrifugieren oder filtrieren
abgetrennt, mit 100 ml 1,0 m KCl und dann mit Wasser gewaschen
und darauf in Wasser suspendiert.
Zur feststellung der Teilchengröße des Harzes wurde die wäßrige
Suspension des Pulvers unter dem Mikroskop geprüft. Der mittlere Durchmesser der trockenen Harzteilchen lag bei 20 bis 40 μιι.
Nach Vorquellung in 50%iger Essigsäure oder Bindung von Protein
erhöhte sich der Durchmesser um den faktor 3 bis 4.
Zusammensetzung und Eigenschaften der nach den Beispielen 1 bis
hergestellten Harze sind in Tabelle 1 angegeben.
Zusammensetzung und Eigenschaften von anionischen EMA-Hydrazid-
und EMA-HMD-Harzen
Harz | Stick stoff gehalt m * |
MDA-Hydrazin- bzw. HMD-Ge- halt ** (Μοί/κ) |
Verhältnis EMA zu MDA, Hydrazin bzw. HMD |
Kupplungs kapazität *** (Aquiv./g) |
EMA-MDA EMA-Hy- drazid EMA-HMD |
6,54 10,5 11,17 |
2,34 χ 10~5 3,75 x 10~5 3,99 χ 10"3 |
1,83 1,86 1,07 |
o,8o χ ΙΟ""5 o,122 χ 10~3 o, 92 χ 10"3 |
* bestimmt nach der Dumas-Verbrennungsmethode (Steyermark A. "A
"Quantitative Organic Microanalysis, 2nd Ed., S.I77-I78, Academic
Press, New Xork (1961))
** Berechnet aus dem Stickstoffgehalt der Harze
**♦ Geschätzt bei EMA-MDA, aus dem Stickstoff- und Bromgehalt des
!Conjugates des diazotierten Harzes mit p-Bromphenol (L.Goldstein,
M.Pecht, S.Blumberg, D.Atlas, Y.Levin "Biochemistry" ^ (1970), S.
2322)} bei EMA-Hydrazid aus dem Glycingehalt des Konjugats des
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Konjugates des aktivierten Harzes ait Glycin und "bei EMA-HMD
aus dem primären Amino stickstoff, bestimmt nach der Van Slyke-Methode
(R.M.Archibald, "Methods Enzymol." £ (1957) 4-58).
Die Aktivitäten der verschiedenen Enzyme und wasserunlöslichen
Derivate, mit Ausnahme von Pepsin und EMA-HMD-Pepsin, wurden bestimmt bei 25· 0 mittels der pH-stat-Methode unter Verwendung
eines geeigneten Estersubstrates. Es wurde ein Radiometer-pH-st at
bestehend aus einer SBR 2o/ßBU-1/TTA3 Titrationseinrichtung und einem PHM 260-pH-Meter verwendet. Zur Titration diente 0,1 η NaOH.
Die aus den Anfängsgeschwindigkeiten der Substrathyd»olyse berechneten
Aktivitäten sind ausgedrückt in Esteraseeinheiten. Eine Einheit der Esteraseaktivität ist definiert als die Enzymmenge,
welche die Hydrolyse von 1*Mol Substrat pro Minute unter
bestimmten Versuchsbedingungen katalysiert. Trypsin und Papain wurden unter Verwendung von Beirayl-L-argininäthylester als Substrat
geprüft. Das Versuchsgemisch (5 ml) war 1,16 χ 10 m
Benzoyl-L-argininathylester, 0,01 m KGl für Trypsin und 0,05 m
Benzoyl-Ii-argininäthylester, 0,005 m Cystein, 0,002 m EDTA für
Papain. Chymotrypsin, Subtilisin Sbvo und Subtilisin Oarlsberg
wurden geprüft unter Verwendung von Acetyl-L-tyrosinäthylester
1,18 χ 10~2 m, 0,01 m KCl 5 ml als Substrat. Die optimalen pH-Werte
der Aktivitäten für Srypsin, Chymotrypsin, Subtilis^Novo,
Subtilisin Oarlsberg und Papain und deren immobilisiert Derivate sind in Tabelle 5 angegeben.
Die Enzymaktivität von kristallinem Pepsin und immobilisierten Pepsinderivaten wurde bestimmt bei 370C mittels der Hgmo go binmethod
e, wie sie bei Herriott "Methods Enzymol." 2 (1955) 3» beschrieben
ist. Das immobilisiertesEnzym enthaltende Reaktionsgemisch
wurde magnetisch gerührt, um eine wirksame Vermischung der Reagentien zu gewährleisten. Eine Einheit der Enzymaktivität ist
definiert als dieMenge an Pepsin bzw. immobilisiertem Pepsindarivat, die zu einer Änderung der A-bsorption bei 280 nm der TCA-löslichen
Fraktion von 0,001 pro Minute unter den Versuchsbedingungen führt.
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Milchgerinnungsversuche wurden routinemäßig durchgeführt bei
3O0O durch Zugabe von etwa 20 μς kristallisiertem Pepsin (etwa
80 Einheiten) oder der äquivalenten Menge von immobilisiertem Pepsin zu 10 ml rekonstituierter Hagermüeh (12 g Magerailchpulver, gelöst in 100 ml 0,01 m OaOl2, pH 5,6| vgl. H.Berridge
"J.Methods Enzymol" 2 (1955) 69).
Die Proteaseaktivitäten verschiedener Enzyme und deren immobilisierten Derivaten wurden bestimmt bei pH 7,5 und 37*C mittels
der Oaseindigestionsmethode (M.laskoweki "Methods Eazymol." 2
(1955) 26). Die Menge an Enzymen bzw. unlöslichen Enzymderivaten r die dem Digestionsgemisch zugesetzt wurde, ist ausgedrückt in Einheiten der Esteraseaktivität. Die immobilisierte
Enzyme enthaltenden Reaktionsgemische wurden magnetisch gerührt, um einejwirksame Vermischung der Beagentien zu gewährleisten.
der verschiedenen Harze sind in Tabelle 2 angegeben.
Die EMA-MDA-Enzyaderivate haben Partikelform und sind 1«L cht
filtrierbar. Die immobilisierten Enzyme von EMA-Hydrazin und EMiL-HMD sind mehr gequollen, von weicherer Textur und langsam
filtrierbar.
Die Kickgewinnung der enzymatischen Aktivität bei den unter Standard-Bedingungen (10 mg Enzym pro 100 mg Harz im Kupplungsgemisch) hergestellten unlöslichen Derivate war höher, wenn als
Träger-EMA-Hydrazid verwendet iesrde(vgl. Tabelle 3)· Die gesamte rlickgewoxmene Aktivität in immobilisierter Form war abhängig von der Ladungscharakteristik des Trägers. Die anionischen Harze lieferten im allgemeinen eine höhere totale immobilisierte Aktivität (vgl. Tabelle 3).
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Tabelle 2
Proteinbindungskapazitäten von anionischen EMA-MDA- und EMA-Hydrazid-Harzen für verschiedene
*■» | EMA-MDA-Harz (A), EMA-HMD-Barz | berechnet | berechnet | Aktiv ι | (B) | qL | EMA-Hydrazid-Harz | berechnet, | Aktiv | gebundenes | OL | |
cd Srypsin | Proteingehalt | aus Bin | aus Amino- | gebundenes | 7» | Proteingehalt | aus Amino | Protein ** | 7* | |||
oo | dungskur | säureanaly- | Protein ** | säureana | ||||||||
^ Ohymotrypsin | ven ♦ (mg/ | se* (mg/ | berechnet | lyse* (mg/ | ||||||||
Enzyme | 2 Subtilisin Novo | 100 πικ) | 100 msc) | wie* | 34(A) | aus Bin | 100 meO | mg | 40 | |||
cn Subtilisin | 10(A) | 9,7 (A) | mg | 40(B) | dungskur | 29 | ||||||
-J Garleb erg | 10(B) | 9,8 (B) | 20(A) | ven * (mg/ | 13 | |||||||
Papain | 10(A) | 9,8(A) | 27(A) | 100 m«) | 24,1 . | 12,0 | 10 | |||||
Pepsin | 20(A) | 18 (A) | 3,4(A) | 30 | 9,7 | |||||||
4,0(B) | 10(A) | 3,2 | 10 W | |||||||||
20(A) | 24 (A) | 2,0(A) | 31,4 (A) | 25 | 9,8 | 1,0 | 60 | |||||
30(A) | 31 (A) | 5,4(A) | 30 (B) | 10 | 44,2 | - | ||||||
10(B) | 9,7 (B) | - | 1,0 | |||||||||
2,0(A) | 10 | 27 | ||||||||||
9,4(A) | 45 | — | ||||||||||
3,0(B) | - | |||||||||||
* Methode nach Goldstein et al "Biochemistry11 2. (197o) 2322
** Geschätzt aus der Esteraseaktivität des immobilisierten Enzympräparates
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Enzym | EMA-MDA-Harz | Katio- | EMA-Hydrazid· | Katio | EMA-HMD- H ar ζ |
Anio- | Anio-. | nisch | |||
misch GO |
9,5 | niseh | 75 | ||
Trypsin | 30 | 10 | 80 | 30 | 40 |
Chymotrypsin | 28 | 16 | 50 | 12 | - |
Subtilisin Hbvo | 27 | 18 | - | ||
Subtilisin | 3,5 | 19 | |||
Carlsberg | 14 | 30 | 34 | 55 | - |
Papain | 3* | — | 50 | — | - |
Pepsin | — | — | 31 |
10 mg Enzym pro 100 mg Harz im Kupplungsgemisch.
waren folgendes
!Trypsin
Papain 16 "
Pepsin 3150 "
35 Einheiten / mg
350 "
Eigenschaften der immobilisierten EMA-MDJL-. EMA-Hydrazid- und
ΕΜΑ,-HMD-Enzymderivate
*) Stabilität
Wäßrige Suspensionen von anionischen EMl-MDA-Derivaten von Chymotrypsin, Subtilisin Carlsberg und Subtilisin Ifovo können bei 4· C
während 3 bis 4 Monaten gelagert werden, ohne daß ein bedeutsamer Aktivitätsverlust eintritt. Suspensionen von EMA-MDA-Papain
und EMA.-MJUL-Trypsin können unter den gleichen Bedingungen für
Zeiträume bis zu 8 Monaten ohne Nachlassen der Aktivität gelagert werden. Sie entsprechenden kationischen EHA-MDA-Derivate
erleiden unter den gleichen Bedingungen einen Aktivität ever lust
von 20 bis 30 %.
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Die EMA-Hydrazid-Derivate (sowohl anionische wie· kationische) von.
Trypsin, Chymotrypsin, Subtilisin Hovo, Subtilisin Oarlsberg und
Papain zeigen eine extrem hohe lagerstabilit&t· Mach Lagerung
der Suspension bsi 4· β während etwa eines Jahres in Gegenwart eines Bactericides konnte noch kein Aktivitätsverlust fastgestellt werden.
Die EMl-HMD-Derivate von Trypsin und Pepsin konnten bei 4· G während 4 Monaten ohne spürbaren Aktivitätsverlust gelagert werden.
Die Aktivitätsbewahrung verschiedener immobilisierter Sazymderivate nach der Lyophilisierung ist aus Tabelle 4 zu ersehen··
Tabelle 4
AKTIVITATSBEVAHRimG KlGH LTOPHILIßlERUlfG
Enzym |
EMi-MDA-
Harz |
Katio nisch W) |
EMA-Hyd.
Hir |
- | razid- Z |
EMl-SHD-
Harz |
Anio
nisch c%y |
46 |
Αηχο- ]
niseh : 06) |
Eatio-
oisch |
|||
Trypsin | 76 |
8
5 |
1CX) | 93 | 25 | |
Chymotrypsin
SubtilisnNovo |
30
60 |
22 |
50
70 |
91.
98 |
— | |
Subtilisin
Oarlsberg |
27 | - | 70 | 86 | ||
Papain | 42 | - | 90 | - | - | |
Pepsin | - | — | 80 |
Im Verhältnis zu den entsprechenden nativen Enzymen zeigen alle
anionischen EMA-Hydrazid- und anionischen EMl-MDA-Derivate und
die EMA-HMD-Derivate eine höhere Stabilität im alkalischen pH-Bereich. Eine erhöhte Stabilität im sauren pH-Bereich wurde für
die kationieehen EMA-Hydraziae und EMl-MDA-Derivate gefunden.
Auch aie Temperaturstabilität der EMl-Hyarazid-, EHl-MDA.- und
EMA-HMI)-Derivate war hSher als die der entsprechenden nativen
Enzyme« Die Enzyme-Derivate der kationischen EHl-MDA- und EMl-Hydrazid-Harze zeigten eine geringere Temperaturstabilität im
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Vergleich xu den anionischen Analogen.
b) Kinetische Eigenschaften
Die pH-Aktivitätsprofile der wasserunlöslichen Enzymderivate
waren breiter und die pH-Optima waren nach alkalischen pH-Verten hin verschoben im Vergleich zu den entsprechenden nativen
Enzymen. Die Werte der kinetischen Parameter aller untersuchten wasserunlöslichen Enzymderivate sind in Tabelle 5 angegeben.
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Kinetische Parameter der EMA-MDA-, EMA-Hydrazid- und EMA-HMD-
Enzym-Derivate
pH FV I |
optimal | pH Km< |
optimal | Natives Enzym |
EMA-MDA | Katio nisch |
EMA-Hydrazid | Katio nisch |
EMA- HMD |
|
pH V |
optimal i*.pp)mM |
pH | optimal >pp)mM |
8,0 <1o"5 |
Anio- nisch |
9,o 0,22+ o,15" |
Anio nisch |
9,2 2,8+ o,8~ |
9,5 | |
!Trypsin | pH optimal Km(app)mM |
8,3 0,7+ |
9,o 0,36+ o,1o |
9,2 1,45+ 0,8 |
9,2 0,28+ o,1o~ |
9,7
15±3 |
- | |||
Chymo trypsin |
Subtili- pH optimal sin Carls- berg K (app)mM |
8,2 54,5+ 1o,o |
9,5 7,9+ 0,8 |
9,o 126 + 25" |
9,7 4,7+ o,9 |
9,5
>1oo |
- | |||
Subtili- sin Mbvo |
Papain | 8,6 26+8 |
9,2 66+ 12" |
9,2 130+ 3o" |
9,5 >1oo |
9,2 84+12 |
— | |||
Pepsin | 6,3 1o,2± |
9,4 34+12 |
7,5
60* 8 |
9,25 76+18 |
- | - | ||||
2,5 | 7,5 41±5 |
— | 7,5 3o± 4 |
— | 2,5 | |||||
— | - |
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Die caseinolytischen Aktivitäten der immobil!serten Enzymderivate,
berechnet auf Basis der Menge an aktivem, gebundenem Enzym, waren geringer als-bei den entsprechenden nativen Enzymen.
c) Milchgerinnung
Versuche BLt rekonstituierter Magermilch (o,o1 m) ergaben, daß
die Gerinnung bei EMA-HMD-Pepsin etwa um den Faktor 2,5 geringer war als bei dem nativen Enzym.
Die zwei Stufen des Gerinnungsprozesses - die enzymatisch Stufe
ind die sekundäre Koagulationsstufe - (vgl. B.Foltman "Corrpt. rend.trav. Lab.Garlsberg" J£ (1966) 143) können getrennt werden,
wenn die Gerinnung durch immobilisiertes Pepsin bewirkt wird. Die primäre enzymatische Stufe wird bei 4*G in Abwesenheit von
Ca++-Ionen durchgeführt. Das immobilisierte Enzym wird dann
durch Filtration entfernt,und die Koagulation wird bei 30·C, gefolgt
von einer Zugabe von CaGIg (o,o1m) in Abwesenheit des
Enzyms durchgeführt.
Die wiederholte Verwendung des immobilisierten Enzyms führt zu einer allmählichen Abnahme seiner Fähigkeiten für die Milchgerinnung.
Dies dürfte auf die Absorption von Gasein oder auf die langsame Bildung von geronnener Milch rund im die Enzymteilchen
zurückzuführen sein.
Die beschriebenen synthetischen Methoden sind nicht auf die dargestellten
Fälle beschränkt. Durch Auswahl der bifunktionellen Heagentien (z.B. aliphatische Diamine, Aminoalkohole etc) können
von EMA hergeleitete Harze in einem weiten Bereich von chemischen und Ladungscharakteristiken hergestellt werden.
Solche Harze sind auch leistungsfähige Träger für das Unlöslichmachen
von Enzymen. Eine für das immobilisierte Enzym geforderte
Eigenschaft kann in das Trägerpolymerisat eingebaut werden. Bei der Ghromatographie kann eine Eigenschaft des Trägers, z.B.
die Ladung, überlagert werden.
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Claims (9)
1) Polymerer Träger zur kovalenten Bindung biologisch aktiver
Proteine, gekennzeichnet durch das Beaktionsprodukt aus
einem Athylen-Maleinsäureanhydrid-Gopolymer (EHl) und einem
Diamin aus der Gruppe Hydrazin, Pjp'-Diaminodiphenylmethan
und 1,6-Diainohexan, einschließlich die kationisierten Derivate
von EMA-Hydrazid und EMA-p ,p'-Diaminodiphenylmethan.
2) Träger nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das
Polymer ein EMA-p,p'-Biaiainodiphenylaminomethan-]£on;jugat ist.
3) Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein EMA-1,6-Diaminohexan-Konjugat ist.
4-) Träger nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das
Harz ein EMA-Hydrazin-Konjugat ist·
5) Enzymetrisch aktive Substanz, enthaltend einen Träger nach
Anspruch 1 Ms 4, an den ein Enzym kovalent gebunden ist.
6) Enzymatisch aktive Substanz nach Anspruch 5j in der der
Träger anionisches oder kationisches EMi-MDA. und das Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Subtilisin Novo oder Subtilisin
Carlsberg ist.
7) Enzymatisch aktive Substanz nach Anspruch 5» in der der
Träger anionisches oder kationisches EMl-Hydrazid und das
Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Subtilisin Hovo oder Subtilisin Carlsberg ist.
8) Enzymatisch aktive Substanz nach Anspruch 5» in der der
Träger EMA-HMD und das Enzym Pepsin oder Trypsin ist.
9) Verwendung des EMA-HHD-Präparates zur Gerinnung von Milch.
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DE (1) | DE2420747A1 (de) |
GB (1) | GB1471024A (de) |
IL (1) | IL42254A (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0000651A1 (de) * | 1977-07-25 | 1979-02-07 | Monsanto Company | Verfahren zur Abtrennung eines Faktor IX-Präparats aus Blut-Plasma |
EP0561722A1 (de) * | 1992-03-17 | 1993-09-22 | Bio Merieux | Wasserlösliche Verbindungen aus Maleinsäureanhydridpolymeren und Copolymeren, und Verwendung dieser Verbindungen zu Trägern für biologische Moleküle |
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- 1973-05-13 IL IL42254A patent/IL42254A/en unknown
-
1974
- 1974-04-29 DE DE2420747A patent/DE2420747A1/de active Pending
- 1974-05-07 GB GB1997474A patent/GB1471024A/en not_active Expired
- 1974-05-10 US US05/469,043 patent/US4013511A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0000651A1 (de) * | 1977-07-25 | 1979-02-07 | Monsanto Company | Verfahren zur Abtrennung eines Faktor IX-Präparats aus Blut-Plasma |
EP0561722A1 (de) * | 1992-03-17 | 1993-09-22 | Bio Merieux | Wasserlösliche Verbindungen aus Maleinsäureanhydridpolymeren und Copolymeren, und Verwendung dieser Verbindungen zu Trägern für biologische Moleküle |
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US5760166A (en) * | 1992-03-17 | 1998-06-02 | Bio Merieux | Water-soluble compounds derived from a homopolymer or copolymer of maleic anhydride, and applications of the said compounds to supporting biological molecules |
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US4013511A (en) | 1977-03-22 |
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