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W-sserunlösliche Proteinpräparate und deren Herstellung Die Erfindung
betrifft neue biologisch aktive Präparate, die einen wasserunlöslichen Träger umfassen,
an den ber ein Zwischenglied verhältnismäßig großer Lange biologisch aktive Proteine
kovalent gebunden sind, und mehr ins einzelne gehend neue biologisch aktive Präparate,
die in Säulenform benutzt werden können, und - verglichen mit bekannten trägergebundenen,biologisch
aktiven Proteinen - eine Anzahl von vorteilhaften Eigenschaften aufweisen, wie s)
das Zwischenglied zwischen Träger und Proteinmolekülen ist verhältnismäßig lang,
wodurch die biologische Aktivität im Vergleich zu anderen Präparaten erhöht wird;
b) die biologisch aktiven Proteine können in verhältnismäßig großen Mengen von dem
Träger gebunden werden, wodurch man ein Produkt hoher Aktivität erhält, und c) die
neuen Substanzen können so hergestellt werden, daß sie frei von elektrischen Ladungen
sind, wodurch vermieden wird, daß die Substanz Ionenaustauschereigenschaften aufweist.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die aktiven
Substanzen so mit dem Träger verbunden, daß mögliche Verluste an gebundenem aktivem
Material stark verringert oder vollständig verhindert werden.
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Es sind verschiedene trägergebundene, biologisch aktive Proteinpräparate
bekannt. Einige von Ihnen basieren auf synthetischen Peptiden, andere auf der Bindung
an Zellulose oder deren Derivate. Eines der Hauptprobleme besteht darin, ein Präparat
hoher spezifischer biologischer Aktivität herzustellen, das seine Aktivität während
der Lagerung und wiederholtem Gebrauch behält. Verluste an gebundenen Molekülen
sollen so weit wie möglich vermieden werden.
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Verschiedene Präparate dieser Art weisen elektrische Ladungen auf,
was verschiedene Probleme nach sich zieht, wenn die Materialien angewendet werden.
Außerdem wirkt sich die direkte Bindung von aktiven Proteinen an ein Polymergerdst
(polymer backbone) häufig bis zu einem gewissen Ausmaß hinderlich auf die biologische
Aktivität des Produktes aus.
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Mit den neuen Produkten der Erfindung werden die Nachteile der bekannten
trägergebundenen, biologisch aktiven Proteine weitgehend vermieden, und die Produkte
der Erfindung können mit Erfolg in verschiedenen Verfahren eingesetzt werden.
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Die Bezeichnung biologisch aktive Proteine1' umfaßt so verschiedenartige
Proteinsubstanzen, wie Enzyme, Antikörper, Rinderserumalbumin udgl. Es wird angenommen,
daß die kovalente Bindung des Proteins über die Aminogruppen des Proteins geht,
die für dessen biologische Aktivität nicht wesentlich sind. Die exakte chemische
Bindung ist nicht bekannt; es wird jedoch angenommen, wie es weiter unten näher
erklärt ist, daß sie entweder über die Schiff-Base-eaktion oder über eine Addition
vom Michael-Typ erfolgt. AuPgrund der hohen Stabilität der Produkte ist es jedoch
vermutlich wahrscheinlicher, daß die Reaktion hautpsächlich über die Addition vom
Michael-yp erfolgt. Die Erfindung betrifft auch ein neues Verfahren zur Herstellung
irartiger biologisch aktiver, trägergebundener Proteine.
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Das Verfahren der Erfindung umfaßt im wesentlichen die Herstellung
eines Hydrazid eines gewünschten, geeigneten PolymerträgerA, Kupplung eines geeigneten
Dialdehyds, wie Glutaraldehyds, an das
so hergestellte Hydrazidderivat
und Herstellung einer kovalenten Bindung zu dem biologisch aktiven Protein iiber
die freie Aldehydgruppe des Dialdehyds. Wie bereits weiter oben gesagt ist, wird
angenommen, daß diese Bindung über die freie Aldehydgruppe und über eine Aminogruppe
des Proteins erfolgt, die für dessen biologische Aktivität nicht notwendig ist.
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Zur Herstellung der biologisch aktiven Substanzen gemäß Erfindung
kann man einen weiten Bereich von Polymerträgnrn benutzen. Einige Beispiele hierfür
sind Polysaccharide, Sepharose, Sephadex, Zellulose und deren Derivate, Polyacrylamid,
Polyäthylenmaleinsäureanhydrid, Stärkealdehydderivate, wie "Sumstar", verschiedene
Polyamide, wie verschiedene Typen von Nylon, poröses Glas etc.
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Das Verfahren zur Herstellung des Hydrazids ist der Natur der Polymergrundlage
anzupassen. Dies ist in einfacher Weise möglich und nicht mit übermäßigen Schwierigkeiten
verbunden. Die Herstellung einer repräsentativen Anzahl von Polymeren ist in den
folgenden Beispielen beschrieben.
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Bei Substanzen, wie Sepharose, Sephadex und Zellulose, wird zunächst
eine Bromcyanaktivierung oder eine Perjodatspaltung (clearage) bewirkt. Danach läßt
sich die so aktivierte Grundlage leicht mit einer Substanz, wie Hydrazin, Adipinsäuredihydrazin,
Polyacrylsäurehydrazid, Polyglutaminsäurehydrazid odgl. kuppeln.
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Die Hydrazidderivate der Polyacrylamide werden durch Erhitzen zum
Sieden in Hydrazin hergestellt.
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Zur Herstellung der Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-derivate wird Polyäthylenmaleinsäureanhydrid
mit Hydrazin, Adipinsäuredihydrazid, umgesetzt, wobei mittels der Polyhydrazide
eine Verbindung an vielen Punkten bewirkt wird. Polyamide, wie verschiedene Typen
von Nylon, werden der geregelten partiellen Hydrazinolyse mittels Hydrazin unterworfen,
Stärke-aldehydderivate werden mit Hydrazin, porösem Glas oder aminosubstituiertem
porösem Glas umgesetzt.
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Mit den so hergestellten Hydrazidderivaten wird ein Dialdehyd gewöhnlich
der Formel OHO(CH2)nCHO in der n eine kleine ganze Zahl. ist, verbunden. Der am
leichtesten zugängliche und billigste Dialdehyd ist der Glutardialdehyd (Glutaraldehyd).
Es ist anzunehmen, daß die Hälfte, die mit dem Polymer (P) verbunden ist, von folgender
Natur ist: (P)-NH-NH#CH-(CH2)n-1-CHO Es wird weiter angenommen, daß das Protein
Aminogruppen enthält, die für dessen biologische Aktivität nicht wichtig sind und
die bei Reaktion mit einer Endaldehydgruppe der weiter oben näher angegebenen Moiekülhälfte
ein stabiles Produkt bilden. Aufgrund der Stabilität der gemäß Erfindung erhaltenen
Produkte ist eher anzunehmen, daß zwischen den Aldehyd- und den Aminogruppen eher
eine Additionsreaktion vom Michael-Typ stattfindet als die Schiff-Base-Reaktion.
So kann eine große Menge biologisch aktives Protein über die weiter oben näher definierten
Bindungen an einen gewünschten Polymerträger kovalent gebunden werdn,wobei die biologische
Aktivität des natUrlichen Proteins in hohem Maße erhalten bleibt. Lagertests haben
gezeigt, daß die Produkte verhältnismäßig beständig sind und daß selbst während
langer Lagerung keine Verschlechterung eintritt.
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Auf Grund der Natur des Zwischenglieds (spacer), das für die kovalente
Bindung zwischen aktivem Protein und Polymergerüst benutzt wird, werden keine elektrischen
Ladungen gebildet, und die so hergestellten Substanzen weisen keine lonenaustauschereigenschaften
auf.
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Die -Hydrazidoagarosederivate lassen sich durch Kupplung von Dihydraziden
mit Agarose, die durch Bromcyan aktiviert ist, nach dem Verfahren von Lamed et al.,
veröffentlicht in Biochem. Biophys. Acta 504, 231 (1973), herstellen. Um Vernetzung
der Agaros kügelchen zu verhindern, wurde während der Reaktion ein großer Uberschuß
von Dihydrazid zugegeben. So können Agarosederivate mit freien Hydrazidgruppen gut
von der festen Matrix getrennt <
hergestellt erden. Es wurden
zwei alternative Methoden benutzt.
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Eine fiir wasserlösliche Dihydrazide, die andere fir wasserunlösliche
Dihydrazide. Die letztere wird in Essigsäure durchgeführt Beispiel 1 Herstellung
von #-Hydrazioagerose unter Verwendung von wasserlöslichen Dihydraziden Agarose
wurde mit 250 mg Bromcyan pro ccm gepackte Gel gemäß Porath et Fl. in Nature 215,
1491 (1s67) ode-r Porath es a1. in J. Chromat. 86, 53 (1973) aktiviert. Die Menge
an Bromcyan und Puffer wurde für jeden Fall eingestellt. Das aktivierte Agarosegel
wurde in einem gleichen Volumen einer kalten gesättigten Lösung des Dihydrazids
suspendiert. In den meisten Fallen wurden die Versuche mit dem leicht erhältlichen
Adipinauredihydrazid durchgeführt, das nach dem Verfahren von Lamad in Biochem.
Biophys. Acta 304, 231 (1973) hergestellt worden war. Rei Verwendung von Adipinsäuredihydrazid
benutzte man z.B. eine Lösung von etwa 90 g/l in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer vom
pH 9 und ließ die Reaktion über Nacht bei 4°C unter Rühren oder leichten SchTitteln
weiter fortschreiten. Das Agarose-Hydrazid-Gel wurde dann gründlich mit Wasser und
mit 0,2 M Natriumchlorid-lösung gewaschen, bis Proben der Waschwässer bei dem 2,4,6-Trinitrobenzol-sulfonattest
gemäß Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970) nur eine schwache Färbung hatten.
Es wurde ein Agarosegel mit 6 bis 15 pMol Hydrazid pro Mol gepackte Agarose erhalten,
das bei 400 gelagert wurde. Die Menge Hydrazid, die mit der Agarosematrix gekuppelt
hatte, wurde durch die Reaktion mit überschüssigem 2,4,6-Trinitrobenzol-sul-fonat
bestimmt, wobei die nicht in Reaktion getretene Menge 2,4,6-Dinitrobenzolsulfonat
gemessen und von der bekannten Initialmenge abgezogen wurde. Das Gel wurde vor weiteren
Reaktionen wieder gewaschen.
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Beispiel 2 Herstellung von w-Hydrazidagarose unter Verwendung von
wasserunlöslichem Dihydrazid Das durch Bromcyan aktivierte Agarosegel wurde in 2
Volumen einer gesättigten Lösung von Dihydrazid in Essigsäure bei 200C suspendiert
(etwa 50 g/l). Die Reaktion ließ man über Nacht unter
Rohren bei
Raumtemperatur weiter fortschreiten, dann wusch man das Produkt gründlich mit einer
Lösung von Essigsäure/Wasser (1:1) und danach so lange mit Wasser, bis Proben der
Waschwässer mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonat keine Verfärbung zeigten. Es urden
Gele, die etwa 6 bis 15 Mol Hydrazid pro com gepackter Agarose enthielten, erhalten.
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Beispiel 3 Herstellung von Polyacrylsäurehydrazid Polymethylacrylat
(5 g) wird in 70 ccm Hydrazinhydrat (98 %) dispergiert, die Reaktionsmischung heftig
gerührt und in einem siedenden Wasserbad auf 1000C erhitzt. Nach 3 Stunden erhält
man eine klare viskose Lösung. Man läßt die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur
abkühlen, filtriert die unlöslichen Teilchen durch Gaze ab, gießt das Filtrat unter
kostantem Rühren in 500 ccm eiskaltes Methanol - das 1 ccm Eisessig enthält -, filtriert
den ausgefallenen Niederschlag ab, wäscht ihn mit kalter Methanol/ Essigsäure (500:1)
und löst ihn wieder in 150 ccm Wasser. Die unlöslichen Teilchen filtriert man ab.
Diese Lösung kann man sofort für die Kupplung an einen Träger, wie Sepharose, benutzen.
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Man kann sie aber auch gefriertrocknen, wobei man darauf achten muß,
daß jegliche Spur von Feuchtigkeit entfernt wird, um Vernetzung des Produktes zu
verhindern.
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Herstellung von Polyacrylsäurehydrazid-sepharose Sepharose 4B wird
mit Bromcyan aktiviert, die aktivierte Sepharose im dreifachen Volumen der weiter
oben angegebenen kalten Polyacrylhydrazidlösung in Wasser oder 0,1 n NaHCO3 suspendiert
und die Mischung über Nacht bei 400 unter langsamem Rühren reagieren gelassen. Das
Konjugat wird mit 0,1 M Natriumchloridlösung gewaschen, bis die Waschwasser bei
Reaktion mit 2,4,6-TrinitrobenzolsuZonat keine Verfärbung zeigen. Man erhält eine
durchschnittliche Kapazität von 2Obis 25 Mol verfügbares Hydrazid aro ccm Sepharose.
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a) Verwendung von wasserlöslichem Dihydrazid Agarose wurde mit 250
mg Bromcyan pro ccm gepacktes Gel unter Anwendung der regulären Methode oder der
Puffermethode nach
Pos ph et al. aktiviert. Die Menge CNBr und die
genaue Zusammensetzung des zu verwendenden Puffers sollte dem jeweiligen speziellen
System angepaßt werden. D aktivierte Agarosegel suspendiert@ man dann im gleichen
Volumen einer kalten gesättigten Lösung von Adipinsäuredihydrazid (nahezu 90 g/l)
in 0,1 M Natriumparbonatpuffer (pH 9) und ließ die Reaktion über Nacht bei 40C unter
Rühren oder leichtem Schütteln weiter fortschreiten. Das Agarose-hydrazid-gel wusch
man gründlich mit Wasser und 0,2 M NaCl, bis Proben der Waschwässer nur eine schwache
Färbung beim 2,4,6-Trinitrobenzol-sulfonat-Test ergaben. Säulen mit 6 bis 15 Mol
Hydrazid pro ccm gepackte Agarose wurden erhalten und bei 4°C gelagert. Die Menge
Hydrazid, die mit Agarose gekuppelt hatte, wurde durch Reaktion mit überschüssigem
2,4,6-Trinitrobenzolsulfonat bestimmt, wobei die nicht in Reaktion getretene Menge
2,4,6-Trinitrobenzolsulfonat gemessen und von der Anfangsmenge abgezogen wurde.
Die Kolonne wurde vor Gebrauch gewaschen.
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b) Verwendung von wasserunlöslichem Dihydrazid Man suspendierte durch
Bromcyan aktiviertes Agarosegel in dem doppelten Volumen einer gesättigten Lösung
von Dihydrazid in Essigsäure bei 20°C (nahezu 50 g/l), ließ die Mischung unter Rühren
über Nacht bei Raumtemperatur weiter reagieren, wusch das erhaltene Produkt gründlich
zunächst mit einer Lösung von Essigsäure/Wasser (1:1) und dann so lange mit Wasser,
bis Proben der Waschwässer bei Reaktion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonat keine Verfärbung
zeigten. Es wurden Kolonnen mit 6 bis 15 Mol Hydrazid pro ccm gepackt er Agarose
erhalten.
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Beispiel 4 Herstellung von Polyacrylamidhydrazid Vernetztes Polyacrylamid
in Kügelchenform wurde in das Hydrazidderivat nach dem Verfahren von Imman et al.
in Biochem. 8, 4074-82 (1969) übergeführt. Die trockenen Polyacrylamidkügelchen
ließ man über Nacht in destilliertem Wasser in einem siliconisierten konischen Glasstopfenkolben
quellen. Die Menge Wasser entsprach dem 1,3-fachen des Bettvolumens des hydratisierten
Geis. Der Kolben mit der Gelsuspension und ein mit einem Glas stopfen verschlossener
Zylinder mit einer berechneten Menge
Hydrazinhydrat oder einer wäßrigen
Hydrazinhydratlösung wurden in ein Wasserbad von konstanter Temperatur eingetaucht.
Nach 45 Minuten gab man das Hydrazin zu dem Gel, verschloß den Kolben und rührte
die Mischung mit einem eintauchbaren Magnetrührer.
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Nach Beendigung der Reaktionsperiode wurde das Gel mit 0,1 M Natriumchloridlösung
auf einem Büchner-Trichter (in der Dampfhaube)und weiterhin durch Sedimentation
gewaschen. Die letztgenannte Operation wurde so lange wiederholt, bis die überstehenden
Flüssigkeiten praktisch frei von Hydrazin waren, was durch eine schwach violette
Färbung beim Test mit Natriumtrinitrobenzolsulfonat angezeigt wurde. Das Gel wurde
auf dem Filter gewaschen und in einer Pufferlösung zur Lagerung suspendiert.
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Beispiel 5 Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-adipinsäure-hydrazid Zu
einer Lösung von 4 g Adipinsäuredihydrazid in 25 ccm Wasser fügte man nach und nach
0,5 g Polyäthylenmaleinsäureanhydrid in Pulverform . Nach Rühren der gelartigen
Mischung fällte man das Produkt mit Methanol/Essigsäure (25 %), wusch es zunächst
mit dem gleichen Lösungsmittel, danach mit reinem Methanol und trocknete es.
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Beispiel 6 Herstellung von Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-hydrazid
Eine Menge von 2 ccm Hydrazinhydrat gab man bei Raumtemperatur zu 1 g trockenem
pulvrigem Polyäthylenmaleinsäureanhydrid. Die Reaktion fand unter Erhitzen der Reaktionsmischung
statt, die gekühlt wurde,Nach einer Stunde gibt man eine Mischung von 75 ccm Methanol
und 3 com Essigsäure zu der gelartigen Reaktionsmischung, wobei das Reaktionsprodukt
ausfi d . Nach Waschen mit den gleichen Lösungsmitteln wurde das Reaktionsprodukt
mit reinem Methanol gewaschen und getrocknet. Es enthielt etwa die theoretische
Menge an gebundenen Hydrazidgruppen.
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Beispiel 7 Herstellung des Aldehydderivats von Agarose-hydrazid g
g feuchtes Agarosehydrazid suspendierte man in 2 ccm
puffer (pH
7, 0,5 M) bei Raumtemperatur und fügte 2 ccm Gluteraldehyd (50 %, wäßrige Lösung)
zu. Nach 90 Minuten Rühren filtrierte man das Produkt sb und wusch es mit Wasser
und dem gleichen Puffer. Es wurde eine quantitative Umwandlung erzielt, was daraus
ersichtlicher war, daß beim 2,4,6-Trinitrobenzol-sulfonat-Test keine Verfärbung
auftrat.
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Beispiel 8 Herstellung von Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-aldehyd
D3s Produkt von Beispiel 6 suspendierte man in 5 ccm Wasser und gab 2 ccm Glutaraldehyd
(50 %, wäßrige Lösung) zu. Ncch 1 Sturde Rühren bei Raumtemperatur wurde das Produkt
gelb. Es wurde abfiltr-iert und mit Wasser und mit 0,15 M Natriumchloridlösung gewesehen.
Man erhielt insgesamt 8 feuchtes Frodukt. Das Produkt ist ds Ergebnis einer vollständigen
Konversion der Hydrazid gruppen an die gebundenen Alkylenaldehydgruppen.
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Beispiel 9 Herstellung von Sumstar-hydrazid 1 g Sumstar suspendierte
man in 2 ccm Wasser und fügte 2 ccm Hydrazinhydrat zu. Die Reaktionsmischung ließ
man über Nacht stehen, führte die Fällung mit Methanol/Essigsaure (10:1) durch,
filtrierte den gebildeten Niederschlag ab und trocknete ihn.
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Beispiel 10 Herstellung von erstrecktem (extended) Aldehydderivat
von Sumstar-hydrazid Das Produkt des Beispiels 9 wurde in 2 com Phosphatpuffer (pH
7) bei Raumtemperatur suspendiert und 2 ccm Glutaraldehyd (50 %, wäßrige Lösung)
zugefügt. Nach 1 Stunde Rühren filtrierte man das Produkt ab, wusch es mit Wasser
und Puffer und trocknete es.
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Man erhielt eine quantitative Konversion, was sich aus dem Behlen
jeglicher Verfärbung beim 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonat-Test ergab.
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Beispiel 'fl Kupplung von Trypsin an Agarosealdehyd Zu 1 ccm des
Produktes des Beispiels 7 in 4 ccm Phosphatpuffer von pH 7 gab man Trypsin. Es wurden
verschiedene Mengen in verschiedenen Versuchen im Bereich von 5 bis 50 mg Trypsin
benutzt.
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Das Trypsin gab man in 4 ccm Salzlösung (saline) bei pH 7 zu und
rührte die Reaktionsmischung über Nacht b-ei 40C. Es wurden weitere Ansätze bei
Raumtemperatur innerhalb von 2 Stunden durchgefiihrt, die die gleichen Ergebnisse
gaben. Das so erhaltene Präparat wurde abfiltriert und mit Phosphatpuffer (pH 7)
gewaschen. Man erhielt folgende Resultate: a) Mit 5 mg Trypsin: 5 mg an den Träger
gebunden b) Mit 50 mg Trypsin: 24,5 mg gebunden.
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Als Agarose wurde Sepharose 4B mit einem Trockengewicht von etwa
40 mg pro ccm Trockensubstanz benutzt. Somit betrug die Menge, die mit 40 mg Agarose
gekuppelt wurde, 5 mg pro 40 mg im ersten Fall und 24,5 mg im zweiten Fall.
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Zur Untersuchung der biologischen Aktivität des so gebundenen Trypsins
wurde seine Aktivität gegenüber 5 mg Benzoylargininäthylester in 5 ccm Wasser bestimmt.
Die Tests wurden bei pH 7,5 und 9 durchgeführt. Die Probe mit 5 mg trägergebundenem
Trypsin wies eine Aktivität von etwa 35 %, bezogen auf natives Trypsin, bei pH 7,5
und von 80 % bei pH 9,0 auf.
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Die Probe von 24,5 mg trägergebundenem Trypsin hatte eine Aktivität,
die 25 * der von nativem Trypsin bei pH 7,5 und von 70 96 ba pH 9,0 entsprach.
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Beispiel 12 Kupplung von Chymotrypsin an Agarosealdehyd Die Ansätze
wurden in der in dem vorhergehenden Beispiel beschriebienen Weise unter gleichen
Reaktionsbedingungen durchgeführt, wo bei Chymotrypsin anstelle von Trypsin eingesetzt
wurde. Aus den Mengen, die gekuppelt hatten, und den bestimmten Aktivitäten ergab
sich, daß praktisch identische Mengen gekuppelt hatten und die Aktivität die gleiche
war.
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Beispiel 13 Kupplung von Änti-dinitrohenyl-Antikörp ern Identische
Mengen von Anti-dinitrophenyl-Antikb.rpern wurden an das Produkt des Beispiels 7
gekuppelt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten: a) beginndnd mit 5 mg Dinitrophenyl:
5 mg b) beginnend mit 50 mg Dinitrophenyl: 20 mg Biologische Tests zeigen, daß etwa
1,4 Mol Haptene an das unlöslich gemachte Antikörperpräparat gebunden waren gegenüber
etwa 2,0 Mol des freien Präparats (theoretischer Wert), was einer Aktivität von
etwa 70 % entspricht.
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In analoger Weise wurde Rinderserumalbumin gekuppelt. Die gekuppelten
Mengen betrugen: 5 mg: 5 mg 250 mg: 18 mg.
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Das unlöslich gemachte Präparat ergab beim Test, daß es zahlreiche
verschiedene Blutfraktionen, wie Billirubin, adsorbierte.
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Beispiel 14 Kupplung von Trypsin an Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-aldehyl-Polymer
Das Polymer des Beispiels 8 wurde mit Trypsin umgesetzt. Zu 1 g Polymer gab man
eine Menge von 50 mg Trypsin in 4 ccm Phosphatpuffer (pH 7, 0,25 M). Nach Rühren
über Nacht bei 40C wurde das Präparat abfiltriert und mit dem gleichen Puffer gewaschen.
30mg des Enzyms waren kovalent an den Träger gebunden.
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Die biologische Aktivität des unlöslich gemachten Enzyms wurde gegenüber
5 ccm Benzoyl-I-argininäthylester bei pH 7,5 und 9,0 geprüft, wobei gefunden wurde,
daß die Aktivität bei pH 7,5 30 % und bei pH 9,0 70 % der des freien Enzyms betrug.
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Beispiel 15 Kupplung von Trypsin an Polyäthylenmaleinsäureanhydrid-adipinsäuealdehyd-Polymer
An 1 g des Produktes des Beispiels 5 wurde nach Kupplung mit Glutaraldehyd Trypsin
in der Weise, wie es in den vorangegangenen Beispielen beschrieben ist, verankert.
Aus dem Ausgangspolyäthylenmaleinsäureanhydrid-olymer wurden 9 g Endprodukt erhalten
aus 1 g trockenem Ausgangsmaterial. So wurden 1/9 des gesamten Produktes für die
Kupplungsreaktion benutzt. Ausgehend von 5 mg Trypsin wurden 4 mg gekuppelt, und
die Aktivität betrug 60 96, ausgehend von 50 mg wurden 23 mg gekuppelt, und die
Aktivität betrug 35 96.
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In gleicher Weise wurde Chymotrypsin gekuppelt. Ausgehend von 50 mg
wurden 26 mg an den Träger gekuppelt, und die Aktivität betrug 40 % der des nativen
Enzyms.
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Beispiel 16 Kupplung von Ohymotrypsin an Agaroseadipinsäurehydrazid-aldehyd
In analoger Weise wurde Chymotrypsin mit dem Träger verbunden.
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Ausgehend von 5 mg wurden 3,6 mg gebunden. Die Aktivität betrug 60
%. Ausgehend von 50 mg wurden etwa 18 mg gebunden, und die Aktivität betrug 40 96.
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Mit Trypsin wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: Ausgehend von
5 mg wurde eine Menge von 2,6 mg gebunden.
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Aktivität: nahezu die von nativem Enzym.
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Ausgehend von 50 mg wurden 24 mg gebunden.
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Aktivität: 30 bis 55 96 bei verschiedenen Ansätzen.
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In analoger Weise wurden Anti-dinitrophenyl-antisera (antisers) an
den Träger gebunden. Die biologische Aktivität des unlöslich gemachten Antiserum
betrug etwa 1,2 bis 1,3 Haptene pro Mol Antikörper, was einer Aktivität von 60 bis
65 96 des freien Antidinitrophesyl-antiserums entspricht.
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Beispiel 17 Kupplung an Agarosepolyacrylsäurehydrazid-aldehyd In der
in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Weise wurde Trypsin an den Träger
gebunden. husgehelld von 5 mg wurden 3,7 mg an den Träger gebunden. Aktivität: nahezu
theoretischer Wort.
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Ausgehend von 30 mg wurden 22 mg an den Träger gebunden.
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Aktivität: 60 %.
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Ausgehend von 50 der mg wurden 27 mg an den Träger gebunden.
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Aktivität: 40 % des freien Enzyms.
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Ausgehend von 50 mg Chymotrypsin wurden 25 mg an den Träger gebunden.
Aktivität: 40 %. %.
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Beispiel 18 Kupplung an Polyacrylsäurehydrazid-aldehyd Unter Benutzung
des Trägers des Beispiels 3 wurde die Reaktor mit Glutardialdehyd und die nachfolgende
Kupplung in genau derselben Weise durchgeführt, wie es in den vorangehenden Beispielen
angegeben ist.
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Ausgehend von 5 mg Trypsin wurden 4,8 mg pro g Polymer gebunden.
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Aktivität: 60 bis 70 %. Ausgehend von 50 mg wurden 36 mg gebunden.
Aktivität: 40 %. Identische Resultate wurden mit Chymotrypsin erhalten.