DE2906504C2 - Glycoproteinderivat-Zubereitungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als diagnostische Reagentien oder hydrolytische Katalysatoren - Google Patents

Glycoproteinderivat-Zubereitungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als diagnostische Reagentien oder hydrolytische Katalysatoren

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Description

unter Bedingungen umgesetzt wird, die für die Bildung der Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brükkenbindung und/oder Thioacetal- oder Acetal-Brükkenbindung geeignet sind.
2. Konjugat, erhältlich mit den Maßnahmen des Anspruchs 1.
3. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 2 als diagnostisches Reagens oder als hydrolytischer Katalysator.
Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstand.
Neuerdings werden physiologisch aktive, wasserunlöslich gemachte Glycoproteine in großem Umfange bei der Synthese, der Zersetzung, der Trennung, der Reinigung oder Analyse der verschiedensten Substanzen oder zum Markieren von bestimmten Substanzen für Analysezwecke verwendet. Bei den bisher bekannten Verfahren zum lnsolubilisiercn von Glycoproteincn durch kovalente Bindungen oder zum Markieren von anderen Substanzen mit Glycoproteinen wird von einer oder mehreren funktioneilen Gruppen (wie ζ. Β. λ- oder f-Amino-, λ-, β- oder y-Carboxyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Imidazolyl- oder Phenylgruppcn) Gebrauch gemacht, die in dem Proteinanteil eines Glycoproteinmolekjls vorhanden sind.
Diese Verfahren zum Binden von Glycoproteinen an andere Substanzen haben jedoch den Nachteil, daß in einigen Fällen eine wirksame Bindung nicht erzielt werden kann wege einer unzureichenden oder einer zu geringen Menge an verfügbaren funktionellen Gruppen, wie sie oben erwähnt sind, und daß diese funktionellen Gruppen, die in vielen Fällen eine wichtige Rolle bei der Manifestation ihrer physiologischen Aktivitäten spielen, diese Aktivitäten vollständig oder in einem beträchtlichem Ausmaße verlieren, wenn sie auf diese Weise gebunden werden.
In der DE-OS 25 34 412 wird z. B. ein Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Glycoproteinenzymkonjugaten durch Oxidation eines Kohlenhydratanteils des Glycoproteins zu einer Carbonylgruppe und Umsetzung derselben mit einer Aminogruppe eines aminohaltigen Cellulosematerials beschrieben. Die Stabilität der dabei erhaltenen Derivate ist jedoch nicht zufriedenstellend.
Erfindungsgemäß werden demgegenüber sehr stabile Glycoproteinderivatkonjugate, die sich von einem aklehydgruppenhaltigen Glycoprotein ableiten, geschaffen, bei denen im Vergleich zu bekannten derartigen Konjugaten geringere Verluste in bezug auf physiologische Aktivität auftreten und die somit eine Aktivität besitzen, die praktisch äquivalent zu derjenigen des Ausgangsglycoproteins ist.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert.
(A) Aldehydgruppenhaitige Glycoproteine
Unter dem hier verwendeten Ausdruck »Glycoprotein«, gelegentlich auch als »Glucoproteid« bezeichnet, ist ein konjugiertes Protein zu verstehen, das in seinem Molekül ein Kohlenhydrat (oder ein Derivat davon) enthält Der Gehalt des Kohlenhydratanteils in dem Glycoprotein unterliegt keinen spezifischen Beschränkungen, er beträgt jedoch vorzugsweise 1 bis 70 Gew.-°/o, insbesondere 5 bis 50 Gew.-%, und zu geeigneten Beispielen gehören Hexosamine (wie Glucosamin, Galactosamin), Hexosen (wie Mannose, Galactose), Hexuronsäuren (wie Glucuronsäure, Galacturonsäure) und dergleichen. Das Glycoprotein ist nicht besonders kritisch. Geeignete Beispiele für Glycoproteine sind Ovalbumin (oder Eialbumin), Antikörper, wie y-Globulin, Enzyme (Glycoenzyme), wie /?-Galactosidase, Λ-Amylase. Glucoamylase, Glucoseoxidase, Peroxidase. Invertase und dergleichen. Unter den Glycoproteinen sind die Enzyme und Antikörper bevorzugt.
Bei der Umsetzung mit dem mindestens eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material zur Herstellung der erfindungsgemäßen Glycoproteinderivate ist es wesentlich, daß das Glycoprotein mindestens eine Aldehydgruppe an seinem Kohlenhydratanteil enthält.
J5 Die Aldehyilgruppe kann durch Oxidieren des Kohlenhydratanteils mit einem Oxidationsmittel gebildet werden oder es kann sich um eine ursprünglich in dem Molekül vorhandene Aldehydgruppe handeln.
Bekanntlich führt die Oxidation des Kohlenhydratanteils oder des Kohlenhydratrestes der Glycoproteine zur Bildung von Aldehydgruppen und für diese Oxidation können die verschiedensten Oxidationsmittel verwendet werden. Beispiele für geeignete Oxidationsmittel sind Metallsalze, wie Bleitetraacetat, Mangan(lll)acetat, Kobaltacetat, Thallium(lll)acetat und Cer(lV)sulfat, Sauerstoffsäuren und Salze davon, wie z. B. Perjodsäure, Paraperjodsäure, Natriummetaperjodat und Kaliummctaperjodat. Unter diesen sind die Sauerstoffsäuren und ihre Salze bevorzugt im Hinblick darauf, daß eine Peroxidation kaum stattfindet und daß Sekundär- oder Nebenreaktionen selten sind, wenn sie verwendet werden.
Die Oxidation der Glycoproteine mit diesen Oxidationsmitteln kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bei der Oxidation wird das Glycoprotein im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung verwendet, deren Konzentration im allgemeinen 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 50 mg/ml beträgt. Wenn eine Sauerstoffsäure oder ein Salz davon
bo als Oxidationsmittel verwendet wird, wird es im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung verwendet und die konzentration betragt im allgemeinen 0.001 bis 1OM. vorzugsweise 0,01 bis 0.1 M. Die Menge der Sauerstoffsäure oder des Sal/cs davon hang! von der Art des Glycoproteins ab. im allgemeinen wird sie (es) im Überschuß, beispielsweise in einer Menge verwendet, die dem 2- bis lOfachen der Menge des in dem Glycoprotein enthaltenen kohlenhydratanteils ent-
spricht. Die optimale Menge kann jedoch experimentell bestimmt werden.
In dem Verfahren zur Oxidation von Glycoproteinen mit Saiierstoffsäuren oder Salzen davon beträgt der pH-Wert der Reaktionslösung im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 500C, vorzugsweise 5 bis 200C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 15 Minuten bis 3 Stunden.
Wenn eine genügende Menge Aldehydgruppen für die Umsetzung mit einem SH oder OH enthaltenden Material in der nachfolgenden Stufe gebildet worden ist, wird vorzugsweise ein Polyhydroxyalkohol, wie z. B. Äthyleng'ykol oder Glycerin, zugegeben, um die Reaktion zu beenden und um danach verunreinigende Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht durch Dialyse oder unter Anwendung eines anderen geeigneten Verfahrens zu entfernen, so daß nur das oxidierte Glycoprotein zurückbleibt. Zur Entfernung der Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse sind Pufferlösungen beispielsweise in einer Konzentration von 0,01 M und bei einem pH-Wert von 4 bis 9 verwendbar.
In den Fällen, in denen die Blockierung der Aminogruppe des Glycoproteins keine Hinderung für den in Getracht gezogenen Verwendungszweck des Derivats ist, ist es bevorzugt, die Aminogruppe des Glycoproteins vor der Oxidation desselben zu blockieren, so daß die Ausbeute des gewünschten Derivats verbessert werden kann. Als ein Beispiel für das Aminoblockierungsverfahren kann das in »Biochemical Journal«, 39, 507-515 (1945), beschriebene Verfahren erwähnt werden.
Während der Oxidation des Glycoproteins mit einer Sauerstoffsäure oder einem Salz davon wird Licht vorzugsweise ausgeschlossen, um eine übermäßige Oxidation des Glycoproteins zu verhindern.
(B) SH oder OH enthaltende Materialien
Bezüglich der Art des SH oder OH enthaltenden Materials besteht keine spezielle Beschränkung, solange es mindestens eine freie SH- oder OH-Gruppe enthält. Bei dem SH oder OH enthallenden Material kann es sich um ein wasserlösliches oder um ein in Wasser unlösliches Material handeln.
(1) Beispiele für geeignete wasserlösliche, SH oder OH enthaltende Materialien sind wasserlösliche Thioalkohole (wie z. B. Äthylmcrcaptan), wasserlösliche Alkohole (wie z. B. Äthanol) und SH oder OH enthaltende Peptide einschließlich Oligopeptiden, und Proteine (Polypeptide), wie z. B. Enzyme (wie Lipase, Papain, Trypsin), Antikörper (z. B. Antiinsulin, Anti-AFP (Anti-Ä-Fetoprotein)) und derglei chen. Antikörper sind besonders geeignet.
Andere Beispiele für geeignete wasserlösliche, SH oder OH enthaltende Materialien sind solche Produkte, die hergestellt wurden durch Einführung mindestens einer SH- oder OH-Gruppe in wasser lösliche Materialien unter Anwendung von verschiedenen chemischen Verfahren (beispielsweise unter Verwendung von Sulfhydrylierungsmitteln, wie sie nachfolgend näher beschrieben werden, oder Hydroxylierungsmitteln). Die wasserlöslichen Materialien, in die eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, sind nicht besonders kritisch. Derartige Materialien sind z. B. Peptide einschließlich Oligopeptiden und Proteinen, wie Enzyme und Antikörper (diese Peptide können entweder eine SH- oder OH-Gruppe aufweisen oder nicht) und wasserlösliche Polymere, wie Polyvinylalkohol, Hydroxyäthyl(meth)acrylatpoly- > mere und Polyoxyalkylenether mit Oxyäthylenge-
halten von nicht weniger als 50%. Zu den Peptiden gehören die obengenannten SH oder OH enthaltenden Peptide und andere Peptide. Besonders geeignet sind Antikörper.
κι (2) Beispiele für in Wasser unlösliche SH oder OH enthaltende Materialien sind natürliche und synthetische Polymere mit SH- oder OH-Gruppen. Zu solchen natürlichen Polymeren gehören beispielsweise Cellulose und Stärke. Zu Beispielen für
π synthetische Polymere gehören Polyurethane mit endständigen SH- oder OH-Gruppen (Reaktionsprodukte von Polyisocyanaten, wie z. B. Tolylendi-isocyanat, mit einem Überschuß eines aktive Wasserstoffatome enthaltenden Materials mit mindestens einer SH- oder OH-Gruppe, wie
z. B. Polypropylenglykol), Copolymere von SH oder OH enthaltenden Vinylmonomeren (wie z. B. Hydroxyalkyl(meth)acrylate,
CH2 = CH-CONHCH(COOH)CHrSH
und dergleichen) und Polythiole (wie z. B. Mercaptoderiv.jte von Vinylpolymeren, wie Polyacrylamid, z. B. das von der Firma Koch-Lite Laboratories Ltd., Großbritannien, erhältliche »Enzacry! PoIy-
Xi thiol«). Zu anderen Beispielen für geeignete, in Wasser unlösliche, SH oder OH enthaltende Materialien gehören solche Produkte, wie sie durch Einführung mindestens einer SH- oder OH-Gruppe in in Wasser unlösliche Materialien unter Anwen-
ii dung verschiedener chemischer Verfahren (beispielsweise unter Verwendung eines Sulfhydrylierungsmittels oder eines Hydroxylierungsmittels) erhalten werden.
Die in Wasser unlöslichen Materialien, in die eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, unterliegen keinen speziellen Beschränkungen, besonders geeignet sind jedoch feste Materialien. Zu geeigneten Materialien gehören beispielsweise Gläser, Siliciumdioxid, Metalle (wie Eisen, Kobalt, Nickel, Aluminium, Magnesium, Kupfer, Zink, Silber, Gold), Metalloxide (wie Eisen(III)oxid, Trieisentetroxid, Aluminiumoxid, Zinkoxid) und Polymere, wie Olefinpolymere (z. B. Polyäthylen, Polypropylen), Styrolpolymere, Acrylpolymere, Polyurethane, Polyamide, Polyimide, Polyaminosäuren, Polysaccharide und Derivate davon (z. B. Cellulose und Derivate davon, Agarose und Derivate davon). Diese in Wasser unlöslichen Materialien sind vorzugsweise porös, so daß eine verhältnismäßig große Menge des Glycoproteins an jede Gewichtseinheit der in Wasser unlöslichen Materialien gebunden werden kann.
Selbst wenn ein Material von Natur aus eine SH- oder OH-Gruppe, jedoch in einem geringen Mengenanteil, aufweist, ist es bevoi zugt, unter Anwendung verschiede-
bo ner chemischer Verfahren vor der Verwendung desselben, d. h. vor der Umsetzung mit dem Glycoprotein, eine SH- oder OH-Gruppe einzuführen.
Für die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in verschiedene Materialien (wasserlösliche oder in Was-
h"> scr unslösliche Materialien) können verschiedene Verfahren angewendet werden. Die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Sulfhydrylierungsmittels oder eines
Hydroxylierungsmittels, nämlich einer Verbindung mit einer SH- oder OH-Gruppe [oder eines Vorläufers davon (z. B. einer acylierten SH- oder OH-Gruppe)] und einer mit dem Material reaktionsfähigen funktionellen Gruppe. Zu Beispielen für solche funktionellen Gruppen gehören Carboxyl-, Carbonsäureanhydrid-, Amino-(primäre und sekundäre). Epoxy-, Hydroxyl-, Mercapto-, Alkoxysilylgruppen (ζ. B. methoxy- oder äihoxysubstituierte Silylgruppen), Halogensilylgruppen (z. B. chlorsubstituierte Silyigruppen) und dergleichen. Bevorzugte Beispiele für solche Verfahren (1) die Verfahren, wie sie in »Archives of Biochemistry and Biophysics«, 96, 605-612 (1962), beschrieben sind, in denen Sulfhydrylierungsmittel oder Hydroxylierungsmittel, wie z. B. ein S-Acylmercapto-haltiges Säureanhydrid (wie S-Acetylmercaptobernsteinsäi'.reanhydrid) oder ein O-Acylhydroxyl-haltiges Säureanhydrid (wie O-Acetylhydroxybernsteinsäureanhydrid) verwendet werden, und (2) die Verfahren, wie sie in »Science«, 166,615-617(1969), beschrieben sind, die so modifiziert sind, daß anstelle von y-Aminopropyltriäthoxysilan ein Sulfhydryüerungsrr.ittel oder ein Hydroxylierungsmittel, wie z. B. ein SH oder OH enthaltendes Silankupplungsmittel (z. B. Mercaptoalkyltrialkoxysilane (wie y-Mercaptopropyltrimethoxysilan). Hydroxyalkyltrialkoxysilane (wie y-Hydroxypropyltrimethoxysilane) und dergleichen) verwendet wird. Das obengenannte Verfahren (1) ist besonders geeignet für die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in wasserlösliche Proteine und dergleichen, während das Verfahren (2) geeignet ist für die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in in Wasser unlösliche Materialien, insbesondere anorganische Materialien.
Bei dem Verfahren (1) wird ein S-Acylmercaptobernsteinsäureanhydrid (vorzugsweise S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid) oder ein O-Acylhydroxybernsteinsäureai.hydrid (vorzugsweise O-Acetylhydroxybernsteinsäureanhydrid) in einer Menge verwendet, die in der Regel 10 bis 300 Gewichtsteile, vorzugsweise 100 bis 200 Gewichtsteile, auf 100 Gewichtsteile des Materials beträgt, in das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll. Die Reaktion wird in der Regel in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung durchgeführt. Der pH-Wert der Reaktionslösung beträgt im allgemeinen 5 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7. Die Reaktionstemperatur beträgt beispielsweise 0 bis 50°C, vorzugsweise 10 bis 200C. Die P.eaktionsdauer beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 20 Minuten bis 1 Stunde. Nach der Reaktion können die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht entfernt werden, indem man das Reaktionsprodukt beispielsweise einer Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-K.olonne unterwirft. Die Entacetylierung kann beispielsweise bewirkt werden durch Zugabe von etwa 0,1 Volumenteil (pro Volumenteil des gereinigten Reaktionsprodukts) einer wäßrigen Hydroxylaminlösung. die in der Regel eine Konzentration von 0,01 bis 2 M, vorzugsweise von 0,1 bis 1 M (oder Mol/l) aufweist. Bei der Durchführung der Entacetylierung beträgt der pH-Wert der Reaktionslösung im allgemeinen 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt beispeilsweise 0 bis 400C, vorzugsweise 20 bis 400C. Die Reaktionsdauer beträgt in der Regel 5 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten. Auch hier wird die Reaktionsmischurg zur Reinigung des dabei erhaltenen, SH oder OH enthaltenden Materials beispielsweise einer Gelfiltration unterworfen, indem man sie beispielsweise durch die gleiche Sephadex G-25-Kolonne schickt.
ίο In dem Verfahren (2) w.rd das SH oder OH enthaltende Silankupplungsmittel in einer Menge verwendet, die im allgemeinen 0,1 bis 100 Gewichtsteile, vorzugsweise 1 bis 50 Gewichtsteile, auf 100 Gewichtsteile des Materials, in das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, beträgt. So wird beispielsweise dem Material, in das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, eine 0,1 bis 10 vol./vol.-%ige Lösung des SH oder OH enthaltenden Silankupplungsmittels, z. B. von y-Mereaptopropyltrimethoxysilan oder y-Hydroxypropyltrimethoxysilan, in Aceton zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten bis 10 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wird die überstehende Flüssigkeit entfernt und der Rückstand wird mit Aceton gründlich gewaschen, getrocknet und gelagert.
Zusätzlich zu den beiden obengenannten Verfahren können auch die folgenden Verfahren SH oder OH enthaltende Materialien liefern: (3) ein Verfahren, bei dem man ein aminohaltiges Material mit einem Thioglycolid oder einem N-Acylhomocysteinthiolacton,
jo vorzugsweise N-Acetylhomocysteinthiolacton, umsetzt;
(4) ein Verfahren, bei dem man eine mit CNBr aktivierte Agarose mit einer Verbindung der allgemeinen Formel NH2 — R-SH (worin R ein Alkylen bedeutet) umsetzt;
(5) ein Verfahren, bei dem man ein Alkylenoxid oder Äthylenchlorhydrin oder dergleichen an ein aktiven Wasserstoff enthaltendes Polymeres, wie z. B. ein Polyamid, Polyimid oder Cellulose, addiert, und (6) ein Verfahren, bei dem man ein Copolymeres, das von einem Monomeren abgeleitet ist, das bei der Hydrolyse eine OH-Gruppe bilden kann, wie z. B. ein Acetat, hydrolysiert.
Im Hinblick auf die größere Reaktionsfähigkeit und die höhere Stabilität der Derivate sind die SH enthaltenden Materialien gegenüber den OH emhalten-
4r> den Materialien bevorzugt.
(C) Herstellung von Glycoproteinderivat-Zubereitungen
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Glycoproteinderivat-Zubereitungen erfolgt gemäß den im Patentanspruch 1 angegebenen Maßnahmen.
Die obigen Reaktionen laufen nacli den nachfolgend angegebenen Reaktionsgleichungen ab, wobei man Produkte erhält, die aus Glycoproteinderivaten mit einer Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brückenbindung (Derivate I) und/oder Glycoproteinderivaten mit einer Thioacetal- oder Acetal-Bindung (Derivate II) bestehen:
Reaktion (1):
RCHO + RXK
OH
R—-CH-X —R'
(Derivat I)
Reaktion (2):
OH
R —CH-X —R' + R'X'H
X' —R"
R —CH-X —R'
(Derivat II)
wobei in den obigen Formeln R den Glycoproteinrest, X und X' jeweils unabhängig voneinander O oder S und R' und R" jeweils unabhängig voneinander den Rest eines SH oder OH enthaltenden Materials bedeuten. Die nach der Reaktion (1) gebildeten Derivate I können selbstverständlich in Derivate Il überführt werden durch weitere Umsetzung der Derivate I mit dem »4»i»,;„l /D\ nJnr oinom onz-Won Ql-I /-uH»r Dl-I
IVIUlVl IUl ^1-*/ WVlWl WIIIVIlI UIlUWl W · 1 u.i *'u W · V ■ ·
enthaltenden Material.
Bei der Bindung eines aldehydgruppenhaltigen Glycoproteins an ein SH oder OH enthaltendes Material nach der vorliegenden Erfindung unterliegt das Gewichtsverhältnis zwischen dem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein und dem SH oder OH enthaltenden Material keinen spezifischen Beschränkungen, es kann jedoch innerhalb eines breiten Bereiches variiert werden und es beträgt im allgemeinen 1000 :1 bis 1 : 1000, vorzugsweise 100 :1 bis 1 : 100, insbesondere 10:1 bisl : 10.
Das aldehydgruppenhaltige Glycoprotein und das SH- oder OH-Gruppen-haltige Material werden unter Bedingungen miteinander umgesetzt, die für die Bildung der Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brückenbindungen und/oder Thioacetal- oder Acetal-Brückenbindungen geeignet sind.
In den Fällen, in denen ein wasserlösliches SH oder OH enthaltendes Material mit einem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein umgesetzt wird, wird das SH oder OH enthaltende Material im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung der Reaktion unterworfen, wobei die Konzentration der wäßrigen Lösung des SH oder OH enthaltenden Materials im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew./Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 10 Gew7Gew.-%, beträgt. Die Konzentration der wäßrigen Lösung des aidehydgruppenhaltigen Glycoproteins beträgt im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew./Gew.-o/o, vorzugsweise 0,01 bis 10 Gew7Gew.-%. Der pH-Wert des Reaktionssystems beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8, insbesondere 4,5 bis 5,4. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 50° C, vorzugsweise 10 bis 200C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 3 Stunden.
!n den Fällen, in denen ein in Wasser unlösliches SH oder OH enthaltendes Material mit einem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein umgesetzt wird, werden im allgemeinen 1000 bis 10 000 Gewichtsteile einer wäßrigen Lösung des aldehydgruppenhaltigen Glycoproteins mit einer Konzentration, die im allgemeinen 0,01 bis 50 Gew7Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew./Gew.-o/o beträgt, auf 100 Gewichtsteile des in Wasser unlöslichen SH oder OH enthaltenden Materials verwendet Das SH oder OH enthaltende Material kann in Form eines Feststoffes (in Form eines Pulvers oder in Form von Körnchen) oder in Form einer wäßrigen Dispersion zugegeben werden. Der pH-Wert der Reaktionsmischung beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 500C, vorzugsweise 10 bis 200C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren liefern die Derivate 1 oder Il und in den Fällen, in denen die
ίο Produkte die Derivate I sind, können diese durch weitere Umsetzung der Derivate I mit einem SH oder OH enthaltenden Material, je nach Bedarf, in die Derivate Il überführt werden. Auch in diesem Falle werden im allgemeinen 10 bis 10 000 Gewichtsteile
is einer wäßriger. Lösung eines SH oder OH enthaltenden Materials mit einer Konzentration, die im allgemeinen 0,01 bis 10 Gew./Gew.-% beträgt, der obengenannten Reaktionsmischung zugegeben. Das dabei verwendete SH oder OH enthaltende Material kann das gleiche sein oder es kann verschieden sein von demjenigen, das für die Herstellung des Derivats I verwendet worden ist. Wasserlösliche, insbesondere Materialien mit einem niederen Molekulargewicht, wie Äthylmercaptan, Äthylalkohol, Dithioäthylenglykol und Äthylenglykol, sind jedoch bevorzugt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 500C, vorzugsweise 10 bis 200C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgeinen 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden.
In den Fällen, in denen die dabei erhaltenen Derivate wasserlöslich sind, kann das Reaktionsprodukt einer Gelfiltration unterworfen werden, indem man es beispielsweise durch eine Sephadex G-100-Kolonne schickt, um das nicht-umgesetzte SH oder OH enthaltende Material und aldehydgruppenhaltige Glycoprotein zu entfernen. Wenn dagegen andererseits die erhaltenen Derivate wasserunlöslich sind, kann das Reaktionsprodukt beispielsweise dadurch gereinigt werden, daß man es mit einer wäßrigen 1 M Nairiumehloridlösung und danach mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gründlich wäscht.
Wenn ein in Wasser unlösliches Material mindestens als Teil des SH oder OH enthaltenden Materials verwendet wird, behält das dabei erhaltene Derivat (Konjugat) die Gestalt und Form und die Konsistenz des ursprünglichen SH oder OH enthaltenden Materials bei und es liegt deshalb im allgemeinen in Form eines Feststoffes vor, welcher das Aussehen eines Pulvers, von Körnchen. StäbeTii eines Films und dergleichen hat.
Wenn das gesamte ursprüngliche SH oder OH enthaltende Material wasserlöslich ist, liegt das dabei erhaltene Derivat in Form einer wäßrigen Lösung vor und es kann in diesem Zustand verwendet werden.
(D) Verwendung der Glycoprotein-Zubereitungen
Die erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteinderivate können für verschiedene Zwecke als Ersatz für die konventionellen Glycoproteine und deren Derivate verwendet werden. Sie bieten gegenüber den konventionellen Glycoproteinen und deren Derivate die folgenden Vorteile: (1) Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Glycoproteinderivate wei- sen eine höhere Wärmebeständigkeit auf als die Ausgangs-Glycoproteine, so daß sie bei höheren Temperaturen als diese verwendet werden können; (2) die erfindungsgemäß hergestellten, in Wasser unlösli-
chen Glycoproteinderivate können, wenn sie beispielsweise in Kolonnen eingefüllt werden, wiederholt verwendet und in kontinuierlichen Verfahren eingesetzt werden, so daß der Reaktionswirkungsgrad und die Wirtschaftlichkeit verbessert werden können im Vergleich zu den Fällen, in denen die Glycoproteine als solche verwendet werden; (3) die erfindungsgemäßen Derivate weisen geringere Verluste in bezug auf ihre physiologische Aktivität, die aus dem Ausgangs-Glycoprotein stammt, auf, d. h., sie besitzen eine Aktivität, die im wesentlichen derjenigen des Glycoproteins entspricht, verglichen mit konventionellen Glycoproteinderivaten;(4)die erfindungsgemäßen Glycoproteinderivate sind stabiler und können für einen längeren Zeitraum gelagert werden als die konventionellen Glyccproteinderivate; sie können mehr als ί Jahr lang bei 4°C in einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gelagert werden, ohne daß eine Qualitätsänderung auftritt. Diese Vorteile sind bei den Derivaten Il noch ausgeprägter.
Die erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteinderivat-Zubereitungen können als sehr bequeme diagnostische Reagentien, als Katalysatoren für Hydrolysereaktionen und für andere Zwecke verwendet werden.
Diagnostische Reagentien, als welche die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Glycoproteinderivate verwendet werden können, umfassen z. B. diagnostische Reagentien für die klinische Chemie, immunohämatologische diagnostische Reagentien und immunohistologische diagnostische Reagentien. Die Verwendung als diagnostische Reagentien für die klinische Chemie umfaßt die Bestimmung von Konzentrationen von chemischen Komponenten in Körperflüssigkeiten, wie Glucose, Cholesterin und Harnsäure. Die Bestimmung dieser Körperflüssigkeitskomponenten mit den Glycoproteinderivat-Zubereitungen kann nach irgendeinem der konventionellen Verfahren erfolgen, beispielsweise denjenigen, wie sie von Rinsho Byori (The Japanese Journal of Chemical Pathology), Ergänzung zu Band 25, S. 137 (1977), »Analytical Biochemistry«, 52,402-414 (1973), und Rinsho Byori, Ergänzung zu Band 24, S. 201 (1976), beschrieben sind. Die Verwendung als immunohämatologische diagnostische Reagentien umfaßt die Verwendung als Enzym-konjugierte Antigene oder -Antikörper, wie z. B. Peroxidasekonjugierte Human-Chorion-gonadotropin, Peroxidase-konjugiertes IgG und Glycoamylse-konjugiertes Insulin, und als Hapten-konjugierte Proteine, wie Penicillensäure-konjugierte Gelatine.
In dem Verfahren zur Durchführung der immunohärnaiolcgischsr! Diagnose unter Verwendung d?r G'ycoproteinderivat-Zubereitung als Enzym-konjugiertes Antigen oder Enzym-konjugierter Antikörper kann irgendeines der konventionellen Verfahren zur Anwendung kommen, beispielsweise derjenigen, wie sie in »FEBS letters«, 15, 232-236 (1971), »Journal of Biochemistry«, 73, 1319-1321 (1973), und Igaku no Ayumi (Advances in Medicine), 91, 207-208 (1974), beschrieben sind. Bei dem Verfahren zur Herstellung von Anti-Hapten-Antikörpern für die Verwendung in der immunohämatologischen Diagnose unter Verwendung des Glycoproteinderivats als Hapten-konjugiertes Protein kann es sich um irgendeines der bekannten Verfahren handeln, beispielsweise solche, wie sie in »Journal of Experimental Medicine«, 112, 1227 — 1247 (I960), beschrieben sind Die Verwendung als immunohistologische Diagnose-Reagentien umfaßt die Verwendung in Form eines Enzym-konjugierten Antikörpers, wie z. B. Peroxidase-konjugierten Immunoglobulinen. Das Verfahren zur Durchführung der immunohistologischen Diagnose unter Verwendung des Glycoproteinderivats in Form eines Enzym-konjugierten Antikörpers kann irgendeines der üblichen Verfahren sein, wie sie beispielsweise in »Protein, Nucleic Acid and Enzyme«, 20,1007 - 1013 (1975), beschrieben sind.
Die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Glycoproteinderivat-Zubereitung als hydrolytischer Katalysator umfaßt die Verwendung als hydrolytischer Katalysator für Kohlenhydrate, wie Stärke, Saccarose und Lactose. Die Glycoproteinderivat-Zubereitung kann als Kohlenhydrathydrolyse-Katalysator in irgendeinem der konventionellen
!5 Verfahren verwendet werden, wie sie beispielsweise in »Biotechnology and Bioengineering«, 11, 349-362 (1969), »Hakko Kyokai-Shi«, 28, 391 bis 397 (1970), »Biotechnology and Bioengineering«; 15, 951 bis 962 (1973), ibid., 14,637-645(1972),»Agricultural Biological Chemistry (Tokyo)«, 30, 807 ff. (1976), »Journal of Fermentation Technology«, 51, 789-794 (1973), und »Biotechnology and Bioengineering«, 16, 295 — 313 (1974), beschrieben sind.
Andere Verwendungszwecke für die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Glycoproteinderivat-Zubereitungen sind beispielsweise die folgenden: (1) die Verwendung bei der Analyse, beispielsweise zur Bestimmung des Glucosegehaltes, des Cholesteringehaltes, des Harnsäuregehaites und dergleichen, für die Fermentation oder die Entwässerung, die einfache quantitative Schnellanalyse zur Bestimmung von H2O2 in Lösungen (vgl. »Analytical Biochemistry«, 14, 160 ff. [1966]); (2) die Verwendung in Synthesen, beispielsweise für die Bildung von Kohienstoff-Halogen-Bindungen; (3) die Verwendung zur Entfernung von bestimmten Substanzen, beispielsweise zur Entfernung von Sauerstoff aus Lösungen; (4) die Verwendung zum Trennen und Reinigen, beispielsweise in der Affinitätschromatographie unter Verwendung von unlöslich gemachten Glycoproteinen (z. B. unlöslich gemachten Enzymen oder Antikörpern) als Adsorbentien (vgl. z.B. »Biochemical Journal«, 117, 257 — 261 [1970]); (5) Verwendung bei der Oxidation, beispielsweise bei der Oxidation von Glucose, bei der Oxidation von Phenolen, Aminophenolen, Diaminen oder Aminosäuren in Gegenwart von Wasserstoffperoxid.
Bezugsbeispiel 1
Oxidation von Peroxidase mit Perjodsäure
100 mg Peroxidase (Reinheitszahl RZ = 0,8) wurden in 20 ml eines 0.01 M Phosphatpuffers (pH 6,0) gelöst. Zu der Lösung wurden 10 ml 0,06 M Perjodsäure zugegeben. Unter Abschirmung des Reaktionsgefäßes gegenüber Licht wurde sein Inhalt bei Raumtemperatur 2 Stunden lang langsam gerührt Dann wurden 5 ml einer 0,8 M Glycerinlösung zugegeben und das langsame Rühren wurde weitere 30 Minuten lang fortgesetzt wobei das Reaktionsgefäß im Dunkeln gehalten wurde. Schließlich wurde die Reaktionsmischung bei 4° C über einen Zeitraum von 12 Stunden gegenüber einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert. Der Prozentsatz der Zersetzung der Perjodsäure durch die Oxidationsreaktion wurde bestimmt nach dem in »Analytical Chemistry«, 26, 1092-1093 (1954), beschriebenen Verfahren, bei dem die Änderung der Extinktion (Absorption) bei 224 nm gemessen wurde, die etwa 70% betrug. Die dabei erhaltene, aldehydgruppenhaltige Peroxidaselösung wurde bei 4° C gelagert
Bezugsbeispiel 2 Oxidation von Glucoseoxidase mit Perjodsäure
100 mg Glucoseoxidase wurden in 20 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 6,0) gelöst und dann wurden 2 ml einer lvol./vol.-%igen Lösung von 2,4-Dinitrofluorbenzol in Äthanol zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur langsam gerührt. Dann wurden 5 ml einer 0,06 M Perjodsäurelösung zugegeben und das langsame Rühren wurde weitere 2 Stunden lang fortgesetzt, wobei der Reaktionsbehälter gegenüber Licht abgeschirmt wurde. Danach wurden 5 ml einer 0,8 M Glycerinlösung zugegeben und die dabei erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, während der Reaktionsbehälter im Dunkeln gehalten wurde. Schließlich wurde bei 4°C über einen Zeitraum von 12 Stunden eine Dialyse gegen einen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0) durchgeführt. Der Prozentsatz der Zersetzung der Perjodsäure als Folge der Oxidationsreaktion betrug etwa 87%. Die dabei erhaltene aldehydgruppenhaltige Glucoseoxidaselösung wurde bei 4° C gelagert.
Bezugsbeispiel 3 Einführung einer SH-Gruppe in Insulin
10 mg (etwa 240 Einheiten) Rinderinsulin wurden in 50 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 6,2) gelöst. Unter Rühren mittels eines Magnetrührers wurden etwa 2 mg S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid zugegeben. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von 0,05 η NaOH bei 6,2 bis 6,3 gehalten (mit fortschreitender Mercaptosuccinylierung des Insulins nahm der pH-Wert ab). Nach etwa 40minütiger Reaktion bei Raumtemperatur stockte die pH-Wert-Abnahme, wodurch die Beendigung der Reaktion bestätigt wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann durch eine Sephadex G-25-Kolonne (1,5 cm χ 40 cm), die mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0). der 0.1 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war, geschickt, um die Insulinfraktionen von den anderen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu trennen. Die eine Absorption bei 280 nm aufweisenden Fraktionen wurden miteinander vereinigt (etwa 8 ml), es wurden 0,8 ml einer 0,5 M Hydroxylaminlösung (pH 7,3) zugegeben und die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 3O0C stehengelassen. Die dabei erhaltene Mischung wurde erneut durch die gleiche Sephadex-Kolonne wie oben geschickt, um das dabei erhaltene, SH enthaltende (oder sulfhydrylierte) Insulin von den anderen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu trennen. Man erhielt etwa 5 mi einer SH enthaltenden insuiiniosung. Die Bestimmung der SH-Gruppe wurde nach dem in »Archieves of Biochemistry and Biophysics«, 119, 41 —49 (1967), beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß die SH-Gruppe in einer Menge von 1,0 bis 1,2 Molekülen pro Insulinmolekül eingeführt worden war.
Bezugsbeispiel 4 Einführung einer SH-Gruppe in poröses Glas
Zu 1 g porösem Glas CPK-550 wurden 5 ml einer 2voiyvol.-%igen Lösung von y-Mercaptopropyltrimeth-oxysilan in Aceton zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mm Hg) gehalten, so daß die Luft in den Poren in dem porösen Glas entfernt werden konnte, und dann wurde die Reaktion unter 2stündigem langsamem Rühren bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Die überstehende Acetonlösung wurde entfernt und das Glas wurde gründlich mit Aceton gewaschen, getrocknet und gelagert. Die Menge der SH-Gruppen, die eingeführt worden waren, wurde nach dem in »Archives of Biochemistry and Biophysics«, 82, 70-77 (1959), beschriebenen Verfahren bestimmt und es zeigte sich, daß etwa 300 μΜ SH-Gruppen pro ίο Gramm des porösen Glases eingeführt worden waren.
Beispiel 1
Umsetzung von aldehydgruppenhaltiger Peroxidase
mit SH enthaltendem Insulin
0,5 ml der in dem Bezugsbeispiel 1 hergestellten Peroxidaselösung und 5 ml des in dem Bezugsbeispiel 3 erhaltenen, SH enthaltenden (sulfhydrylierten) Insulins wurden miteinander gemischt und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 3O0C stehengelassen. Danach wurde der pH-Wert mit 1 η NaOH auf 7,0 eingestellt und zur Stabilisierung der Enzymaktivitäi wurden 0,1 ml 5°/oiges Rinderserum-Albumin und 10 μΙ IM MgCI; zugegeben. Die dabei erhaltene Mischung wurde durch eine Sepharose 6B-Kolonne (1.5 cm χ 50 cm), die mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0.1 m NaCI. 1 mM MgCb und 0,l%iges Rinderserum-Albumin enthielt, äquilibriert worden war. geschickt, wobei man insgesamt etwa 20 ml Peroxidase-konjugierte Insulinfraktionen erhielt. Die dabei erhaltene Peroxidase-kon-
jugierte Insulinlösung wurde bei 4" C gelagert.
Beispiel 2
Umsetzung der aldehydgruppenhaltigen
Glucoseoxidase mit SH enthaltendem porösem Glas
2 g des in dem Bezugsbeispiel 4 hergestellten SH enthaltenden porösen Glases wurden in 50 ml der in dem Bezugsbeispiel 2 durch Oxidation von Glucoseoxidase hergestellten aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidaselösung, die etwa 100 mg aldehydgruppenhaltige Glucoseoxidase enthielt, geworfen. Die Mischung wurde 5 Minuten lang unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mm Hg) gehalten, um die Luft aus dem
•»5 porösen Glas zu entfernen. Dann wurde die Reaktion unter langsamem Rühren 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Danach wurden 10 ml einer wäßrigen 0,5voL/vol.-%igen Äthylmercaptanlösung zugegeben und das Rühren wurde weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach der Reaktion wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde mit einer i M wäßrigen Natriumchloridlösung gründlich gewaschen, bis die Waschwässer keine Enzymaktivität mehr aufwiesen.
Schließlich wurde das Glas mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 73) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 4° C gelagert Die Menge der an das poröse Glas gebundenen Glucoseoxidase betrug 41 mg/g poröses Glas.
Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase wurde nach dem folgenden Verfahren errechnet:
Die Extinktion der oxidierten Glucoseoxidaselösung bei 280 nm wurde vor und nach der Reaktion bestimmt und daraus wurde das Verhältnis der Bindung der oxidierten Glucoseoxidase an das poröse Glas errechnet Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase wurde aus diesem Bindungsverhältnis, der eingesetzten Menge
in oxidierter Glucoseoxidase und der eingesetzten Vienge an SH enthaltendem porösem Glas unter \nwendung der folgenden Gleichungen errechnet:
Bindungsverhältnis (Y) =
A-B
Menge an gebundener Glucoseoxidase (mg pro Gramm porösem Glas)
worin bedeuten:
YXD
während das Reaktionsgefäß mit Eiswasser gekühlt wurde. Nachdem man die Mischung über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen hatte, wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde mit einer wäßrigen 1 M Natriumchloridlösung g'it gewaschen. Schließlich wurde es mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 4°C gelagert.
ίο Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase betrug 23 mg pro Gramm des porösen Glases (nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Berechnungsverfahren).
A = Extinktion der oxidierten Glucoseoxidaselösung vor der Reaktion bei 280 nm
B = Extinktion der überstehenden Flüssigkeit nach der Reaktion bei 280 nm
C = Menge des eingeführten, SH enthaltenden porösen Glases (g)
D = Menge der eingeführten oxidierten Glucoseoxidase (mg).
Beispiel 3
Reaktion zwischen der aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidase und Cellulose
1 g Cellulosepulver wurde in 50 ml der nach dem in dem Bezugsbeispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellten aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidaselösung, die etwa 100 mg der aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidase enthielt, geworfen. Die Reaktion wurde unter langsamem Rühren 3 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen und dann wurde die Cellulose abfiltriert und mit einer 1 M Natriumchloridiösung gründlich gewaschen, bis keine Enzymaktivität in den Waschwässern mehr festgestellt werden konnte. Schließlich wurde die Cellulose mit einer mit einem 0,01 -M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 4°C gelagert. Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase betrug 68 mg pro Gramm Cellulose (entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Berechnungsverfahren).
Vergleichsbeispiel 2
Reaktion der aldehydgruppenhaltigen
Glucoseoxidase mit dem aminohaltigen porösen
Glas
2 g eines NH2-haltigen porösen Glases (Aminogehalt etwa 140 μΜ/g) wurden in 50 ml einer aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidaselösung geworfen, die nach dem in dem Bezugsbeispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Oxidieren von 100 mg Glucoseoxidase hergestellt worden war, die etwa 100 mg der aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidase enthielt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mm Hg) gehalten, um die Luftblasen aus dem porösen Glas zu entfernen. Dann wurde die Reaktion unter langsamem Rühren 3 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Nach der Entfernung der überstehenden Flüssigkeit wurde das Glas mit einer 1 M Natriumchloridlösung und danach mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gut gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 4°C gelagert.
Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase betrug 35 mg pro Gramm des porösen Glases (nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Berechnungsverfahren).
40
45
Vergleichsbeispiel 1
Bindung der Glucoseoxidase an aminohaltiges poröses Glas über Glutaraldehyd
Zu 2 g eines porösen Glases mit eingeführtem NHi (Aminogehalt etwa 140 μΜ/g) wurden 10 ml einer wäßrigen 5%igen Giutaraldehydlösung (pH 5) zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten lang unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mm Hg) gehalten, um Luftblasen aus dem porösen Glas zu entfernen. Nach dem anschließenden 30minütigen langsamen Rühren bei Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde mit entionisiertem Wasser so lange gewaschen, bis kein Aldehydgeruch mehr festgestellt werden konnte. Schließlich wurde es einmal mit einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Auf diese Weise erhielt man ein aldehydgruppenhaltiges poröses Glas.
Zu dem oben erhaltenen, aldehydgruppenhaltigen porösen Glas wurde eine Lösung von 100 mg Glucoseoxidase (der Firma Toyobo Co, Ltd.) in 50 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers (pH 7,5) zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang langsam gerührt, Vergleichsversuch 1
Vergleichstest in bezug auf die spezifische Aktivität der Glucoseoxidasederivate
Die in Beispiel 2 und in den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Glucoseoxidasederivate wurden auf ihre spezifische Enzymaktivität hin getestet und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben. Die Messung der Enzymaktivität wurde nach dem in »Biochirnica et Biophysica Acta«, 206, 54-60 (1970), beschriebenen Verfahren durchgeführt
Tabelle I
Glucoseoxidase
Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Glycoprotein)
Unbehandelte Glucoseoxidase 43 Derivat des Beispiels 2 41 Derivat des Vergleichsbeispiels 1 28 Derivat des Vergleichsbeispiels 2 39
15 16
Vergleichs versuch II
Lagerbeständigkeitstest der Glucoseoxidasederivate
Die in Beispiel 2 und in den Vergleichsbeispielen 1 bezug auf ihre Lagerbeständigkeit miteinander vergli-
und 2 erhaltenen Glucoseoxidasederivate wurden 5 chen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der
jeweils in eine mit einem 0,01 M phosphatpuffer folgenden Tabelle II angegeben. Die Messung der
abgepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH 7,3) Aktivität erfolgte nach dem in dem Vergleichsbeispiel I
eingetaucht und bei 4° C gelagert und sie wurden in angegebenen Verfahren.
Tabelle II Relative Aktivität (%) nach 2 Wochen 1 Monat 2 Monaten 6 Monaten 1 Jahr
Glucose-
oxidasederivat von unmittel 1 Woche 98,8 97,4 93,1 92,3 90,2
bar nach 72,8 65,3 53,2 50,8 48,5
der Her 99,5 90,5 85,0 76,1 62,3 51,8
stellung 86,5
100 98,2
Beispiel 2 100
Vergleichsbeispiel 1 100
Vergleichsbeispiel 2
Vergleichsversuch III
Wärmebeständigkeitstest des Glucoseoxidasederivats
Unbehandelte Glucoseoxidase (Kontrolle) und das in Beispiel 2 erhaltene Glucoseoxidasederivat wurden jeweils in einer mit einem 0,01-M-PhosphatpufTer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (ph 7,3) gelöst oder in diese eingetaucht und bei 600C gelagert. Die Ergebnisse dieses Wärmebeständigkeitstests sind in der folgenden Tabelle III angegeben.
Tabelle III
Glucoseoxidase Relative
0		 Aktivität
0,5		 (%) nach
1		 χ Stunden
2 3		 5,6
41,8		 4 5 10 20 48
Unbehandelte Glucoseoxidase
Derivat des Beispiels 2		 100
100		 48,2
75,1		 26,5
63,8		 10,5
51,3		 2,8
34,8		 1,6
31,3		 8
23,5		 18,3 15,2

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines von einem a!dehydgruppenhaltigen Glycoprotein (A) abgeleiteten Konjugats, dadurch gekennzeichnet, daß das aldehydgruppenhaltige Glycoprotein (A)
(1) mit einem mindestens eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material (B), das wasserlöslich ist, oder
(2) mit einem in Wasser unlöslichen, mindestens eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material (Bi) und anschließend mit einem wasserlöslichen, mindestens eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material (B2), oder mit einem Material, in dem ein in Wasser unlösliches Material als Teil des SH- oder OH-enthaltenden Materials vorliegt,
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