DE2906504A1 - Glycoproteinderivat-zubereitungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostische reagentien oder hydrolytische katalysatoren - Google Patents
Glycoproteinderivat-zubereitungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostische reagentien oder hydrolytische katalysatorenInfo
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- Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Glycoproteinderivat-Zubereitungen, die dabei erhaltenen
Produkte und ihre Verwendung; sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Glycoprotein-Zubereitungen,
die als insolubilisierte Glycoproteine oder für Markierungszwecke verwendet werden können, die dabei erhaltenen
Produkte und deren Verwendung.
Neuerdings werden physiologisch aktive, wasserunlöslich gemachte Glycoproteine in großem Umfange bei der Synthese,
der Zersetzung, der Trennung, der Reinigung oder Analyse der verschiedensten Substanzen oder zum Markieren
von bestimmten Substanzen für Analysezwecke verwendet· Bei den bisher bekannten Verfahren zum Insolubilisieren
(Unlöslichmachen) von Glycoproteinen durch kovalente Bindungen oder zum Markieren von anderen Substanzen mit
Glycoproteinen wird von einer oder mehreren funktioneilen Gruppen (wie z. B. öl- - oder £ -Amino-, OL-, β - oder y-
-Carbosyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Imidaeolyl- oder
Fhenylgruppen) Gebrauch gemacht, die in dem Proteinanteil eines Glycoproteinmoleküls vorhanden sind·
Diese Verfahren zum Binden von Glycoproteinen an andere Substanzen haben jedoch den Nachteil, daß in einigen Fällen
eine wirksame Bindung nicht erzielt werden kann wegen einer unzureichenden oder einer zu geringen Menge an verfügbaren
funktioneilen Gruppen, wie sie oben erwähnt sind, und daß diese funktioneilen Gruppen, die in vielen
Fällen eine wichtige Holle bei der Manifestation ihrer
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physiologischen Aktivitäten spielen, diese Aktivitäten vollständig oder in einem beträchtlichem Ausmaße verlieren,
wenn sie auf diese Veise gebunden werden.
Tor kurzem wurde ein Verfahren zur Herstellung von
Glycoproteinderivaten durch Oxidation eines Kohlenhydratanteils
des Glycoproteins zu einer Carboxylgruppe und Umsetzung der dabei erhaltenen Carboxylgruppe mit
einer Arainogruppe eines aminohaltigen Materials entwikkelt.
Die Stabilität der bei diesem Verfahren erhaltenen Derivate ist jedoch nicht zufriedenstellend.
Angesichts des vorstehend erörterten Standes der Technik wurden nun umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um
die Hachteile der bekannten Verfahren zu eliminieren, und dabei gelangte man schließlich zu der vorliegenden Erfindung.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, sehr stabile Glycoproteinderivat-Zubereitungen (oder -Konjugate) und
ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln und sie
als diagnostische Beagentien oder hydrolytische Katalysatoren zu verwenden. Ziel der Erfindung ist es ferner,
Glycoproteinderivat-Zubereitungen (oder -Konjugate) anzugeben,
bei denen geringere Verluste in bezug auf ihre physiologische Aktivität, die ihren Ursprung in dem Ausgangsglycoprotein
hat, auftreten, die somit eine Aktivi-^
tat besitzen, die praktisch äquivalent zu. derjenigen des
Glycoproteins ist, verglichen mit konventionellen Glycoproteinderivaten.
Diese und weitere Ziele werden erfindungsgemäß erreicht
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durch ein. Verfahren zur Herstellung einer Glycoproteinderivat-Zubereitung,
bei dem ein aldehydgruppenhaltiges Glycoprotein (A) mit mindestens einem mindestens eine SH-
oder OH-Gruppe enthaltenden Material (B) umgesetzt wird,
vorzugsweise ein solches, bei dem (Α) über eine Hemithioacetaloeler
Hemiacetal- und/oder Thioacetal- oder Acetal-Brückenbindung
zwischen der Aldehydgruppe an (A) und der SH- oder OH-Gruppe an (β) an (Β) gebunden wird.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsformen
näher erläutert.
(A) AldehjdgruggenhaJ-tige^ljcogroteine
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Glycoprotein", gelegentlich auch als "Glucoproteid" bezeichnet, ist ein
konjugiertes Protein zu verstehen, das in seinem Molekül ein Kohlenhydrat (oder ein Derivat davon) enthält. Der
Gehalt des Eohlenhydratanteils in dem Glycoprotein unterliegt keinen spezifischen Beschränkungen, er beträgt jedoch
vorzucsweise 1 bis 70 Gew.%, insbesondere 5 bis 50
Gew.%5 mad zu geeigneten Beispielen gehören Hexosamine
(wie Glucosamin, Galactosamin), Hexosen (wie Mannose, Galactose), Hexuronsäuren (wie Glucuronsäure, Galacturonsäiore)
und dergleichen. Das Glycoprotein ist nicht besonders kritisch. Geeignete Beispiele für Glycoproteine sind
Ovalbumin (oder Eialbumin), Antikörper, wie Y -Globulin,
Enzyme (GIy co enzyme), wie j3 -G-alactosidase, c^-Amylaae,
Glucoamylase, Glucoseoxidase, Peroxidase, Invertase und
dergleichen. Unter den Glycoproteinen sind die Enzyme und
Antikörper bevorzugt.
909835/070S
Bei der Umsetzung mit dem mindestens eine SH- oder OH-Gruppe
enthaltenden Material zur Herstellung der erfindungsgemäßen Glycoproteinderivate ist es wesentlich, daß
das Glycoprotein mindestens eine Aldehydgruppe an seinem Kohlenhydratanteil enthält. Die Aldehydgruppe kann durch
Oxidieren des Kohlenhydratanteils mit einem Oxidationsmittel gebildet werden oder es kann sich um eine ursprünglich
in dem Molekül vorhandene Aldehydgruppe handeln. Es können auch Glycoproteine mit einer Eetongruppe
(oder Carbonylgruppe) in ihrem Kohlenhydratanteil verwendet
werden·
Bekanntlich führt die Oxidation des Kohlenhydratanteils oder des Kohlenhydratrestes der Glycoproteine zur Bildung
von Aldehydgruppen und für diese Oxidation können die verschiedensten Oxidationsmittel verwendet werden. Beispiele
für geeignete Oxidationsmittel sind Metallsalze, wie Bleitetraacetat, Mangan (EI I) acetat, Kobaltacetat,
Thallium(III)acetat und Cer (IY) sulfat, Sauer st off säuren
und Salze davon, wie z. B. Perjodsäure, Paraperjodsäure,
Katriummetaperjodat und Kaliummetap^rjodat. Unter diesen
sind die Sauerstoff säuren und ihre Salze bevorzugt im Hinblick darauf, daß eine Peroxidation kaum stattfindet
und daß Sekundär- oder Nebenreaktionen selten sind, wenn sie verwendet werden.
Die Oxidation der Glycoproteine mit diesen Oxidationsmitteln kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt
werden. Bei der Oxidation wird das Glycoprotein im allgemeinen in Form einer wässrigen Lösung verwendet, deren
Konzentration im allgemeinen 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 50 mg/ml beträgt. Wenn eine Säuerst off säure
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oder ein Salz davon als Oxidationsmittel verwendet wird, wird es im allgemeinen in Form einer wässrigen Lösung
verwendet und die konzentration beträgt im allgemeinen
0,001 "bis 10 M, vorzugsweise 0,01 bis 0,1 M. Die Menge der
Sauerstoffsäure oder des Salzes davon hängt von der Art des Glycoproteins ab, im allgemeinen wird sie (es) im
Überschuß, beispielsweise in einer Menge verwendet, die dem 2- bis 10-fachen der Menge des in dem Glycoprotein
enthaltenen Kohlenhydratanteils entspricht. Die optimale
Menge kann jedoch experimentell bestimmt werden.
In dem Verfahren zur Oxidation von Glycoproteinen mit
Sauerstoff sauren oder Salzen davon beträgt der pH-Wert der Beaktionslösung im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise
4- bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen
bis 50°0, vorzugsweise 5 bis 20°0. Die Reaktionsdauer beträgt
im allgemeinen 5 Minuten bis 24- Stunden, vorzugsweise
15 Minuten bis 3 Stunden.
Wenn eine genügende Menge Aldehydgruppen für die Umsetzung mit einem SH- oder OH enthaltenden Material in
der nachfolgenden Stufe gebildet worden ist, wird vorzugsweise ein Polyhydroxyalkohol, wie z. B. Ithylenglykol
oder Glycerin, zugegeben, um die Reaktion zu beenden und um danach verunreinigende Substanzen mit einem niedrigen
Molekulargewicht durch Dialyse oder unter Anwendung eines anderen geeigneten Verfahrens zu entfernen, so daß nur
das oxidierte Glycoprotein zurückbleibt. 2ur Entfernung
der Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch Dialyse sind Pufferlösungen beispielsweise in einer Konzentration
von 0,01 M und bei einem pH-Wert von 4 bis 9 verwendbar.
90 983 5/0709
In den Fällen, in denen die Blockierung der Aminogruppe
des Glycoproteins keine Hinderung für den in Betracht gezogenen Verwendungszweck des Derivats ist, ist es bevorzugt,
die Aminogruppe des Glycoproteins vor der Oxidation desselben zu blockieren, so daß die Ausbeute des gewünschten
Derivats verbessert werden kann. Als ein Beispiel für das Aminoblockierungsverf ahren kann das in "Biochemical
Journal", JJg, 507-515 (194-5), beschriebene Yerfahren erwähnt
werden.
Während der Oxidation des Glycoproteins mit einer Sauerstoffsäure oder einem Salz davon wird Licht vorzugsweise
ausgeschlossen, um eine übermäßige Oxidation des Glycoproteins zu verhindern.
(B) S^oder^OH^enthaltende^aterialien
Bezüglich der Art des SH oder OH enthaltenden Materials
besteht keine spezielle Beschränkung, solange es mindestens eine freie SH- oder OH-Gruppe enthält· Bei dem SH
oder OH enthaltenden Material kann, es sich um ein wasserlösliches
oder um ein in Wasser unlösliches Material handeln«
(1) Beispiele für geeignete wasserlösliche, SH oder OH
enthaltende Materialien sind wasserlösliche Thioalkohole
(wie z. B· Äthylmercaptan), wasserlösliche Alkohole
(wie z.B. Äthanol) und SH oder OH enthaltende Peptide einschließlich Oligopeptiden,und Proteine (Polypeptide),
wie z. B. Enzyme (wie Lipase, Papain, Trypsin), Antikörper (z. B· Antiinsulin, Anti-AüP (Anti-ot-3?etoprotein))
und dergleichen· Antikörper sind besonders geeignet·
909835/0708
Andere Beispiele für geeignete wasserlösliche, SH oder OH
enthaltende Materialien sind solche Produkte, die hergestellt
wurden durch Einführung mindestens einer SH- oder OH-Gruppe in wasserlösliche Materialien unter Anwendung
von verschiedenen chemischen Verfahren ("beispielsweise unter Yerwendung von Sulfhydrylierungsmitteln, wie sie
nachfolgend näher beschrieben werden, oder Hydroxylierungsmitteln)»
Die wasserlöslichen Materialien, in die eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, sind
nicht besonders kritisch. Derartige Materialien sind z. B, Peptide einschließlich Oligopeptiden und Proteinen,
wie Enzyme und Antikörper (diese Peptide können entweder eine SH- oder OH-Gruppe aufweisen oder nicht) und wasserlösliche
Polymere, wie Polyvinylalkohol, Hydroxyäthyl-(meth)
acrylatpolymere und Polyoxyalkylenether mit Oxyäthylengehalten
von nicht weniger als 50 %- Zu den
Peptiden gehören die obengenannten SH oder OH enthaltenden Peptide und andere Peptide. Besonders geeignet sind
Antikörper.
(2) Beispiele für in Wasser unlösliche SH oder OH enthaltende Materialien sind natürliche und synthetische
Polymere mit SH- oder OH-Gruppen. Zu solchen natürlichen Polymeren gehören beispielsweise Cellulose und Stärke. Zu
Beispielen für synthetische Polymere gehören Polyurethane mit endständigen SH- oder OH-Gruppen (Reaktionsprodukte
von Polyisocyanaten, wie z. B. ö?olylendiisocyanat, mit
einem Überschuß eines aktive Vasserstoffatome enthaltenden
Materials mit mindestens einer SH- oder OH-Gruppe, wie a· B. Polypropylenglykol) s Copolymere von SH oder OH
enthaltenden Yinylmonomeren (wie z» B. Hydroxyalkyl (methacrylate,
OH2=CH-COIIiHCH(COQH)GH2SH und dergleichen) und
S0983B/Q7Ö8
Polythiole (wie ζ. Β. Mercaptoderivate von Yinylpolymeren,
wie Polyacrylamid, z. B. das von der Firma Koch-Lite Laboratories ltd., Großbritannien, erhältliche "Enzacryl
Polythiol")· Zu anderen Beispielen für geeignete, in Wasser
unlösliche, SH oder OH enthaltende Materialien gehören solche Produkte, wie sie durch Einführung mindestens
einer SH- oder OH-Gruppe in in Wasser unlösliche Materialien unter Anwendung verschiedener chemischer Verfahren
(beispielsweise unter Verwendung eines Sulfhydrylierungsmittels
oder eines Hydroxylierungsmitteis) erhalten werden«
Die in Wasser unlöslichen Materialien, in die eine SH-
oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, unterliegen keinen speziellen Beschränkungen, besondere geeignet sind jedoch
feste Materialien. Zu geeigneten Materialien gehören beispielsweise Gläser, Siliciumdioxid, Metalle (wie Eisen,
Kobalt, Nickel, Aluminium, Magnesium, Kupfer, Zink, Silber,
Gold), Metalloxide (wie Eisen(III)oxid, Trieisentetroxid,
Aluminiumoxid, Zinkoxid) und Polymere, wie Olefinpolykere (z. B. Polyäthylen, Polypropylen), Styrolpolymere,
Acrylpolymere, Polyurethane, Polyamide, Polyimide, Polyaminosäuren, Polysaccharide und Derivate davon
(z. B. Cellulose und Derivate davon, Agarose und Derivate davon). Diese in Wasser unlöslichen Materialien sind vorzugsweise
porös, so daß eine verhältnismäßig große Menge des Glycoproteins an (jede Gewichtseinheit der in Wasser
unlöslichen Materialien gebunden werden kann.
Selbst wenn ein Material von Natur aus eine SH- oder OH-Gruppe,
jedoch in einem geringen Mengenanteil, aufweist, ist es bevorzugt, unter Anwendung verschiedener
909835/0708
chemischer Verfahren vor der Verwendung desselben, d· n.
vor der Umsetzung mit dem Glyeoprotein, eine SH- oder OH-Gruppe einzuführen.
Mir die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in verschiedene
Materialien (wasserlösliche oder in Wasser unlösliche Haterialien) können verschiedene Verfahren angewendet
werden. Die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe kann
durchgeführt werden unter Verwendung eines Sulfhydrylierungsmittels
oder eines Hydroxylierungsmittels, nämlich einer Verbindung mit einer SH- oder OH-Gruppe [oder eines
Vorläufers davon (z. B. einer acylierten SH- oder OH-Gruppe)3
und einer mit dem Material reaktionsfähigen funktionellen Gruppe· Zu Beispielen für solche funktion
nellen Gruppen gehören Carboxyl-, Carbonsäureanhydrid-, Amino- (primäre und sekundäre), Epoxy-, Hydroxyl-,
Mercapto-, Alkoxysilylgruppen (ζ. Β· „methoxy- oder äthoxysubstituierte Silylgruppen), Halogensilylgruppen
(ζ. B. chlorsubstituierte Silylgruppen) und dergleichen. Bevorzugte Beispiele für solche Verfahren sind (1) die
Verfahren, wie sie in "Archives of Biochemistry and Biophysics", °£, 605-612 (1962), beschrieben sind, in denen,
Sulfhydrylierungsmittel oder Hydroxylierungsmittel, wie
z. B. ein S-Acylmercapto-haltiges Säureanhydrid (wie
S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid) oder ein O-Acylhydroxyl-haltiges
Säure anhydrid (wie O-Acetylhydroxybernsteinsäureanhydrid)
verwendet werden, und (2) die Verfahren, wie sie in "Science", 166, 615-617 (1969), beschrieben
sind, die so modifiziert sind, daß anstelle von ^"-Aminopropyltriäthoxysilan ein Sulfhydrylierungsmittel
oder ein Hydroxylierungsmittel, wie z. B. ein SH oder OH
enthaltendes Silankupplungsmittel (z.B· Mereaptoalkyl-
§09835/0708
trialkosysilane (wie Y -Mercaptopropyltrimethoxysilan),
HydrorKyalkyltrialkoxysilane (wie J -Hydroxypropyltrilaethoxysilane)
und dergleichen) verwendet wird. Das obengenannte Verfahren (1) ist "besonders geeignet für die
Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in wasserlösliche Proteine und dergleichen, während das Verfahren (2) geeignet
ist für die Einführung einer SH- oder OH-Gruppe in in Wasser unlösliche Materialien, insbesondere anorganische
Materialien.
Bei dem Verfahren (1) wird ein S-Acylmercaptobernsteinsäureanhydrid
(vorzugsweise S-Acetylmercaptoberasteinsäureanhydrid)
oder ein O-Acylhydroxybernsteinsäureanhydrid
(vorzugsweise O-Acetylhydroxybernsteinsäureanhydrid)
in einer Menge verwendet, die in der Regel 10 bis 300 Gewichtsteile, vorzugsweise 100 bis 200 Gewichtsteile,
auf 100 Gewichtsteile des Materials beträgt, in das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll. Die Reaktion
wird in der Regel in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung durchgeführt. Der pH-Wert der Reaktionslösung beträgt
im allgemeinen 5 bis 8, vorzugsweise 6 bis 7· Die
Reaktionstemperatur beträgt beispielsweise 0 bis 500C,
vorzugsweise 10 bis 20°C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 20 Minuten
bis 1 Stunde. Nach, der Reaktion können die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht entfernt werden, indem
man das Reaktionsprodukt beispielsweise einer Gelfiltration durch eine Sephadsoc G~25-Kolonne unterwirft· Die
Entacetylierung kann beispielsweise bewirkt werden durch Zugabe von etwa 0,1 Volumenteil (pro Volumenteil des gereinigten
Reaktionsprodukts) einer wässrigen Hydroxylaminlösung, die in der Regel eine Konzentration von 0,01
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bis 2 M1 vorzugsweise von 0,1 bis 1 M (oder Hol/l) aufweist.
Bei der Durchführung der Entaeetylierung beträgt
der pH-Wert der Reaktionslösung im allgemeinen 5 bis 9» vorzugsweise 6 bis 8. Die Eeaktionstemperatur beträgt
beispielsweise 0 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 4O°C. Die
Reaktiomsdauer beträgt in der Segel 5 Minuten bis 2 Stunden
, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten. Auch hier wird die
Eeafctionsmischung zur Reinigung des dabei erhaltenen, SH
oder OH enthaltenden Materials beispielsweise einer Gelfiltration,
unterworfen, indem man sie beispielsweise
durch die gleiche Sephadex G-25-Kolonne schickt.
In dem Yerfahren (2) wird das SH oder OH enthaltende
Silankupplungsmittel in einer Menge verwendet, die im
allgemeinen 0,1 bis 100 Gewichtsteile, vorzugsweise 1 bis
50 Gewichtsteile, auf 100 Gewichtsteile des Materials, in
das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, beträgt»
So wird beispielsweise dem Material, in das eine SH- oder OH-Gruppe eingeführt werden soll, eine 0,1 bis
10 vol./vol.%ige Lösung des SH oder OH enthaltenden
Silanknpplungsmittels, z. B. von j -Mercaptopropyltrimetiwojysilan
oder ^f -Hydroxypropyltrimethoxysilan, in
Aceton zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten bis 10 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wird
die überstehende Flüssigkeit entfernt und der Rückstand wird mit Aceton gründlich gewaschen, getrocknet und gelagert·
Zusätzlich, zu den beiden obengenannten Yerfahren können
auch die folgenden Verfahren SH oder OH enthaltende Materialien liefern % (3) ein. Verfahren* "bei dem man ein
amlnolialtises Material mit einem Ihioglycolid oder einem
90S83B/070I
N-Acylhomocysteinthiolacton, vorzugsweise IT-Acetylhomo—
cysteinthiolacton, umsetzt; (4) ein Verfahren, bei dem
man eine mit CNBr aktivierte Agarose mit einer Verbindung
der allgemeinen Formel KH2-B-SH (worin R ein Alkylen bedeutet)
umsetzt; (5) ein Verfahren, bei dem man ein Alkylenoxid oder Ithylenchlorhydrin oder dergleichen
an ein aktiven Wasserstoff enthaltendes Polymeres, wie z. B· ein Polyamid, Polyimid oder Cellulose, addiert, und
(6) ein Verfahren, bei dem man ein Copolymeres, das von einem Monomeren abgeleitet ist, das bei der Hydrolyse
eine OH-Gruppe bilden kann, wie z. B. ein Acetat, hydrolysiert.
Im Hinblick auf die größere !Reaktionsfähigkeit und die
höhere Stabilität der Derivate sind die SH enthaltenden Materialien gegenüber den OH enthaltenden Materialien bevorzugt
#
(C) Her st ellung_von_Gljcoprot einder ivat-Zuber e itungen
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Glycoproteinderivat-Zubereitungen
erfolgt durch Umsetzung eines aldehydgruppenhaltigen
Glycoproteins (A) mit einem SH oder OH enthaltenden Material (B) und erforderlichenfalls durch
weitere Umsetzung des dabei erhaltenen Produktes mit dem Material (B) oder einem anderen SH oder OH enthaltenden
Material. Die Herstellung erfolgt im einzelnen unter Anwendung· eines Einstufenverfahrens, bei dem man das GlycoprotF
.n (A) mit dem Material (B) umsetzt, oder unter Anwendung eines Zweistufenverfahrens, bei dem man zuerst
das Glycoprotein (A) mit einem SH oder OH enthaltenden Material (Bxj) umsetzt und anschließend das dabei erhaltene
909835/07 0.8
Produkt mit dem Material (E1) oder einem anderen SH oder
OH enthaltenden Material (B2) umsetzt. Bei dem zuletzt
genannten Verfahren können beispielsweise ein in Wasser unlösliches, SH oder OH enthaltendes Material als Material (B^) und ein wasserlösliches, SH oder OH enthaltendes
Material als Material (B2) verwendet werden·
Die obigen Reaktionen laufen nach den nachfolgend angegebenen Reaktionsgleichungen ab, wobei man Produkte erhalt,
die hauptsächlich aus Glycoproteinderivaten mit einer Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brückenbindung (Derivate
I) und/oder Glycoproteinderivaten mit einer Thioacetal-
oder Acetal-Bindung (Derivate II) bestehen:
OH Reaktion (1): ECHO + B1XE ——>
R-CH-X-R1
(Derivat I)
OH
Reaktion (2): R-CH-X-R1 + R11X1H
Reaktion (2): R-CH-X-R1 + R11X1H
X1 - R" R-CH-X-E1
(Derivat II)
wobei in den obigen Formeln R den Glycoproteinrest, X und
X1 jeweils unabhängig voneinander 0 oder S und E1 und Rw
Jeweils unabhängig voneinander den Rest eines SH oder OH
enthaltenden Materials bedeuten. Die nach der Reaktion (1)
gebildeten Derivate I können gewünschtenfalls in Derivate
II überführt werden durch weitere Umsetzung der Derivate
I. mit dem Material (B) oder einem anderes. SH ©der OH
909835/0701
. 29065Q4
enthaltenden Material.
Bei der Bindung eines aldehydgruppenhaltigen Glycoproteins an ein SH oder OH enthaltendes Material nach der
vorliegenden Erfindung unterliegt das Gewichtsverhältnis
zwischen dem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein und dem SH oder OH enthaltenden Material keinen spezifischen Beschränkungen,
es kann jedoch innerhalb eines breiten Bereiches variiert werden und es beträgt im allgemeinen
1000:1 bis 1:1000, vorzugsweise 100:1 bis 1:100, insbesondere 10:1 bis 1:10.
Das aldehydgruppenhaltige Glycoprotein und das SH- oder
OH-Gruppen-haltige Material werden unter Bedingungen miteinander
umgesetzt, die für die Bildung der Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brückenbindungen und/oder Thioacetal-
oder Acetal-Brückenbindungen geeignet sind.
In den Fällen, in denen ein wasserlösliches SH oder OH
enthaltendes Material mit einem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein umgesetzt wird, wird das SH oder OH enthaltende
Material im allgemeinen in Form einer wässrigen Lösung der Reaktion unterworfen, wobei die Konzentration
der wässrigen Lösung des SH oder OH enthaltenden Materials im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew./Gew.^, vorzugsweise
0,01 bis 10 Gew./Gew.% beträgt. Die Konzentration der
wässrigen Lösung des aldehydgruppenhaltigen Glycoproteins beträgt im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew./Gew.%,
vorzugsweise 0,01 bis 10 Gew./Gew.%. Der pH-Wert des Beaktionssystems
beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8, insbesondere Φ,5 bis 5,4. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 500C, vorzugs-
909835/0708
weise 10 bis 20°C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen
10 Minuten "bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten Ms 3 Stunden.
In äen !allen* in denen ein in Wasser unlösliches SH oder
OH enthaltendes Material mit einem aldehydgruppenhaltigen
Gljcoprotein tuagesetzt wird, werden im allgemeinen 1000 bis 1ö*,00Q Gewichtsteile einer wässrigen lösung des
aldebydgnippenhaltigen Glycoproteins mit einer Konzentrations
die im allgemeinen 0,01 bis 50 Gew./Gew.%, vorzugsweise
0,1 bis 10 Gew./Gew.% beträgt, auf 100 Gewichtsteile des in Wasser unlöslichen SH oder OH enthaltenden Materials
verwendet. Das SH oder OH enthaltende Material kann in Form eines Feststoffes (in Form eines !Pulvers
oder in Form von Körnchen) oder in Form einer wässrigen Dispersion zugegeben werden. Der pH-Wert der Reaktion3mischtmg
beträgt im allgemeinen 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8«, Die Heaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0
bis 500O, vorzugsweise 10 bis 20°C. Die Reaktionsdauer
beträgt im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden·
Die vorstehend beschriebenen Verfahren liefern die Derivate
I oder II und in den Fällen, in denen die Produkte die Derivate I sind, können diese durch weitere Umsetzung
der Derivate I mit einem SH oder OH enthaltenden Material, Je nach Bedarf, in die Derivate II überführt werden. Auch
in diesem Falle werden im allgemeinen 10 bis 10*000 Gewiclrbsteile
einer wässrigen lösung eines SH oder OH enthaltenden
Materials mit einer Konzentration, die im allgemeinen 0,01 bis 10 Gew./Gewe% beträgt, der obengenannten
ÄeakfciQBsmiselmng zugegebene Das dabei verwendete SH
oder OH enthaltende Material kann das gleiche sein oder
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es kann verschieden sein von demjenigen, das für die Herstellung des Derivats I verwendet worden ist. Wasserlösliche,
insbesondere Materialien mit einem niederen Molekulargewicht, wie Ithylmercaptan, Äthylalkohol, Dithioäthylenglykol
und Ithylenglykol, sind jedoch bevorzugt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung beträgt im allgemeinen
3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen 0 bis 500C, vorzugsweise 10 bis
200C. Die Reaktionsdauer beträgt im allgemeinen 10 Minuten
bis 24- Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 5 Stunden.
In den Fällen, in denen die dabei erhaltenen Derivate wasserlöslich sind, kann das Reaktionsprodukt einer Gelfiltration
unterworfen werden, indem man es beispielsweise durch eine Sephadex G-100-Kolonne schickt, um das
nicht-umgesetzte SH oder OB enthaltende Material und
aldehydgruppenhaltige Glycoprotein zu entfernen. Wenn dagegen andererseits die erhaltenen Derivate wasserunlöslich
sind, kann das Reaktionsprodukt beispielsweise dadurch gereinigt werden, daß man es nit einer wässrigen
1 M Natriumchloridlösung und danach mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung
(pH 7,3) gründlich wäscht.
Wenn ein in Wasser unlösliches Material mindestens als Teil des SH oder OH enthaltenden Materials verwendet
wird, behält das dabei erhaltene Derivat (Konjugat) die
Gestalt und Form und die Konsistenz des ursprünglichen SH oder OH enthaltenden Materials bei und es liegt deshalb
im allgemeinen in Form eines Feststoffes vor, welcher das Aussehen eines Pulvers, von Körnchen, Stäben, eines Films
909835/0708
und dergleichen hat. Venn das gesamte -ursprüngliche SH
oder OE enthaltende Material wasserlöslich ist, liegt das dabei erhaltene Derivat in Form einer wässrigen Losung
vor und es kann in diesem Zustand verwendet werden·
Die erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteinderivate
können für verschiedene Zwecke als Ersatz für die konventionellen Glycoproteine und deren Derivate verwendet
werden. Sie bieten gegenüber den konventionellen Glycoproteinen
und deren Derivate die folgenden Vorteile: (i) Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Glycoproteinderivate weisen eine höhere Warmebeständigkeit
auf als die Ausgangs-Glycoproteine, so daß sie
bei höheren Temperaturen als diese verwendet werden können; (2) die erfindungsgemäß hergestellten, in Wasser
unlöslichen Glycoproteinderivate können, wenn sie "beispielsweise
in Kolonnen eingefüllt werden, wiederholt verwendet und in kontinuierlichen Verfahren eingesetzt
werden, so daß der Eeaktionswirkungsgrad und die Wirtschaftlichkeit
verbessert werden können im Vergleich zu den Fällen, in denen die Glycoproteine als solche verwendet
werden; (3) die erfindungsgemäßen Derivate weisen geringere Verluste in bezug auf ihre physiologische Aktivität,
die aus dem Ausgangs-Glycoprotein stammt, auf, d.
h., sie besitzen eine Aktivität, die im wesentlichen derjenigen
des Glycoproteins entspricht, verglichen mit konventionellen G-lycoproteinderivaten; (4-) die erfindungsgemaßea
Glycoproteinderivate sind stabiler und können für
einen längeren Zeitraum gelagert werden als die konventionellen Glycoproteinderivate? sie können mehr als
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1 Jahr lang bei 40C in einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer
abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH
7,3) gelagert werden, ohne daß eine Qualitätsänderung
auftritt. Diese Vorteile sind "bei den Derivaten II noch ausgeprägter.
Die erfindungsgemäß hergestellten Glycoproteinderivat-Zubereitungen
können als sehr "bequeme diagnostische Reagentien, als Katalysatoren für Eydrolysereaktionen und
für andere Zwecke verwendet werden.
Diagnostische Reagentien, als welche die nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellten Glycoproteinderivate verwendet werden können, umfassen z. B. diagnostische Reagentien
für die klinische Chemie, immunohämatologische diagnostische Reagentien und immunohistologische diagnostische
Reagentien. Die Verwendung als diagnostische Reagentien für die klinische Chemie umfaßt die Bestimmung
von Konzentrationen von chemischen Komponenten in Körperflüssigkeiten, wie Glucose, Cholesterin und Harnsäure·
Die Bestimmung dieser Körperflüssigkeitskomponenten mit den Glycoproteinderivat-Zubereitungen kann nach irgendeinem
der konventionellen Verfahren erfolgen, beispielsweise denjenigen, wie sie von Sinsho Byori (The Japanese
Journal of Chemical Pathology), Ergänzung zu Band 25»
S. 137 (1977), "Analytical Biochemistry11, ^2, 402-414
(1973) j und Rinsho Byori, Ergänzung zu Band 24, S. 201 (1976)» beschrieben sind. Die Verwendung als immunohämatologische
diagnostische Reagentien umfaßt die Verwendung als Enzym—konjugierte Antigene oder -Antikörper, wie z.
B. Peroxidase-konjugierte Human-Ohorion- .gonadotropin,
Peroxidase-konjugiertes IgG und Glycoamylase-konjugiertes
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Insulin, und als Hapten-konjugierte Proteine, wie
Penicill ansäure-konjugierte Gelatine.
In dem Yerfahren. zur Durchführung der immunohämatologiachen
Diagnose unter Verwendung der Glycoproteinderivat-Zubereitung
als Enzym-konjugiertes Antigen oder Enzymkonjugierter
Antikörper kann irgendeines der konventionellen Verfahren zur Anwendung kommen, beispielsweise
derjenigen, wie sie in "EEBS letters", 1£, 232-236 (197Ό,
"Journal of Biochemistry", 21t 1319-1321 (1973), und
Jgaku, no Ayumi (Advances in Medicine), <£!, 207-208
(1974), beschrieben sind· Bei dem Verfahren zur Herstellung
von Anti-Hapten-Antikörpern für die Verwendung in der iEmunohämatologischen Diagnose unter Verwendung des
Glycoproteinderivats als Hapten-konjugiertes Protein kann
es sich um irgendeines der bekannten Verfahren handeln, beispielsweise solche, wie sie in "Journal of Experimental
Hedicine", 112, 1227-1247 (1960), beschrieben sind. Die
Verwendung als immunohistologische Diagnose-fieagentien
umfaßt die Verwendung in Form eines Enaym-konijugierten
Antikörpers,, wie z. B. Peroxidase-kongugierten Immunoglobuünen.
Das Verfahren zur Ihirchführung der immunohistologischen
Diagnose unter Verwendung des Glycoproteinderivats in Form eines Enzym-kon^ugierten Antikörpers
kann, irgendeines der üblichen Verfahren sein, wie sie
beispielsweise in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", 20, 1007-1015 (1975)» beschrieben sind»
Die VerwBniusg der nach flea erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Glycoproteinderivat-Zubereitung als hydro—
lyrischer Katalysator umfaßt die Verwendung als hydrolytischer
Katalysator für Kohlenhydrate, wie Stärke,
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Saccharose tmd Lactose. Die Glycoproteinderivat-Zubereitung
kann, als Eolilenhydrathydrolyse-Katalysator in irgendeinem
der konventionellen Verfahren verwendet werden, wie sie beispielsweise in "Biotednology and Bioengineeri*s",
H» 34-9-362 (1969), "Hakko Kyokai-Shi", 28, 391 bis
397 (1970), "Biotechnology and Bioengineering", 1£, 951
bis 962 (1973), ibid., 14, 637-645 (1972), "Agricultural Biological Chemistry (Tokyo)", ^O, 807 ff (1976),
"Journal of Fermentation [Technology", j?l, 789-794 (1973),
und "Biotechnology and Bioengineering", 16_, 295-313
(1974), beschrieben sind.
Andere Verwendungszwecke für die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Glycoproteinderivat-Zubereitungen
sind beispielsweise die folgenden: (1) die Verwendung bei der Analyse, beispielsweise zur Bestimmung
des Glucosegehaltes, des Cholesteringehaltes, des Harnsäuregehaltes
und dergleichen, für die Fermentation oder die Entwässerung, die einfache quantitative Schnellanalyse
zur Bestimmung von Hg(^ in Lösungen (vgl. "Analytical
Biochemistry", 14, 160 ff (1966); (2) die Verwendung in Synthesen, beispielsweise für die Bildung von Kohlenstoff-Halogen-Bindungen;
(3) die Verwendung zur Entfernung von bestimmten Substanzen, beispielsweise zur Entfernung
von Sauerstoff aus Lösungen; (4) die Verwendung zum Trennen und Reinigen, beispielsweise in der Affinitätschromatographie
unter Verwendung von unlöslich ge— machcen Glycoproteinen (z. B. unlöslich gemachten Enzymen
oder Antikörpern) als Adsorbentien (vgl. z. B. "Biochemical Journal", 11£, 257-261 (1970))» (5) Verwendung
bei der Oxidation, beispielsweise bei der Oxidation von Glucose, bei der Oxidation von Phenolen, Aminophenolen,
909835/0708
29Ü6504
Disuadnen oder Aminosäuren in Gegenwart von Wasserstoffperoxid.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden spezifischen Beispielen
anhand bevorzugter Ausführungsformen naher erläutert,
ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Bezugsbeispiel
Λ
100 mg Peroxidase (Reinheitszahl EZ = 0,8, ein Produkt
der 3?irma iDoyobo Co., Ltd.) wurden in 20 ml eines 0,01 H
Phosphatpuffers (pH 6,0) gelöst. Zu der Lösung wurden 10 ml 0,06 M Per jodsäure zugegeben. Unter Abschirmung des
Reaktionsgefäßes gegenüber Licht wurde sein Inhalt bei Raumtemperatur 2 Stunden lang langsam gerührt. Dann wurden
5 ml einer 0,8 M Glycerinlösung zugegeben und das langsame Rühren wurde weitere 30 Hinuten lang fortgesetzt, wobei
das Reaktionsgefäß im Dunkeln g3halten wurde. Schließlich wurde die Reaktionsmischung bei 4°C über
einen Seitraum von 12 Stunden gegenüber einem 0,01 H Phosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert. Der Prozentsatz der
Zersetzung der Perjjodsaure durch die Oxidationsreaktion
wurde bestimmt nach dem in "Analytical Chemistry", 26, 1092-1093 (1954), beschriebenen Verfahren, bei dem die
Änderung öer Extinktion (Absorption) bei 224 nm gemessen
wurde, die etwa 70 % betrug. Die dabei erhaltene, aldehydgrappenlialtxge
Peroxiäaselösung wurde bei 4°G gelagert.
S09835/07
100 mg Glucoseoxidase (eia Produkt der Firma Toyobo Co.,
Ltd·) wurden in 20 ml eines 0,01 M Phosphatpuffers (pH 6,0) gelöst und dann wurden 2 ml einer 1 ν öl ,/völligen
Lösung von 2,4—Dinitrofluorbenzol in Äthanol zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
langsam gerührt· Dann wurden 5 ml einer 0,06 H Per^odsäurelösung
zugegeben und das langsame Rühren wurde weitere 2 Stunden lang fortgesetzt, wobei der Reaktionsbehälter
gegenüber Idcht abgeschirmt wurde· Danach wurden 5 ml einer 0,8 M Glycerinlösung zugegeben und die dabei
erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, während
der Reaktionsbehälter im Dunkeln gehalten wurde· Schließlich wurde bei 40C über einen Zeitraum von 12 Stunden
eine Dialyse gegen einen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0) durchgeführt· Der Prozentsatz der Zersetzung der Perjodsäure
als Folge der Oxidationsreaktion betrug etwa 87 %·
Die dabei erhaltene aldshydgruppenhaltige Glucoseoxiäaselösung wurde bei 4°C gelagert.
10 mg (etwa 240 Einheiten) Rinderinsulin (von der Firma Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in 5 ml eines
0,01 M Phosphatpuffers (pH 6,2) gelöst. Unter Rühren mittels eines Magnetrührers wurden etwa 2 mg S-Acetyl-
909835/0700
mercaptobernsteinsäureanhydrid zugegeben» Bar pH-Wert der
Reafctionsmisohung wurde durch Zugabe von 0,05 η NaOH bei
6,2 bis 6,3 gehalten (mit fortschreitender Mercaptosuccinyliemsag
des Insulins nahm der pH-Wert ab), Hach etwa 40-minütiger Reaktion bei Raumtemperatur stockte die
pE-Wert-Abnahme, wodurch die Beendigung der Reaktion bestätigt
wurde· Die Reaktionsmischung wurde dann durch eine Sepitaöex G—25-Kolonne (1,5 cm χ 40 cm), die mit
einem 0,01 E Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M 3STaCl enthielt,
äqmlibriert worden war, geschickt, um die InsulinfraktioaeA
von den anderen Ferbindungen mit niedrigem
Molekulargewicht zu trennen. Die" eine Absorption bei 280 nm aufweisenden. Fraktionen wurden miteinander vereinigt
(etwa 8 ml), es wurden 0,8 ml einer O1,5 M Hydroxylaminlöstang
(pH 73) zugegeben und die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 30°C stehengelassen» Die dabei erhaltene Mischung
wurde erneut durch die gleiche Sephadex-Kolonna
wie oben geschickt, um das dabei erhaltene, SH enthaltende (oder sulfhydrylierte) Insulin von den anderen Verbindungen,
mit niedrigem Molekulargewicht zu trennen. Man erhielt etwa 5 al einer SH enthaltenden Insulinlösung· Die
Bestimmung der SH-Gruppe wurde nach dem in "Archieves of
Biochemistry and Biophysics", 119« 4-1-4-9 (1967), beschriebenem
Yerfahren durchgeführt, wobei festgestellt wurde, daß die SH-Gruppe in einer Menge von 1,0 bis 1,2
pro Insulinmolekül eingeführt worden war*
909835/07.0*
Zu 1g porösem Glas CPK-550 (der Firma Corning Glass
Works) wurden 5 ml einer 2 völ./vol.#igen Losung von
/ -Mercaptopropyltrimethoxysilan. (der Firma Shin-Etsu
Chemical Co., Ltd.) in Aceton zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter eignem verminderten
Druck (30 bis 100 mmHg) gehalten, so daß die
Luft in den Poren in dem porösen Glas entfernt werden
konnte, und dann wurde die Reaktion unter 2-stündigem langsamem Rühren bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen.
Sie überstellende Acetonlösung wurde entfernt und das
Glas wurde gründlich mit Aceton gewaschen, getrocknet und gelagert. Die Menge der SH-Gruppen, die eingeführt worden
waren, wurde nach dem in "Archives of Biochemistry and Biophysics", 82, 70-77 (1959)» beschriebenen Verfahren
bestimmt und es zeigte sich, daß etwa 300 llM SH-Gruppen
pro Gramm des porösen Glases eingeführt worden waren.
umsetzung von aldehydgruppenhaltiger PeroxLdase mit SH
enthaltendem Insulin
0,5 ml der in dem Bezugsbeispiel 1 hergestellten PeroxL-daselösung
und 5 ^l des in dem Bezugsbeispiel 3 erhaltenen,
SH enthaltenden (sulfhydrylierten) Insulins wurden
miteinander gemischt und die Mischung wurde 30 Minuten
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lang Tbei 3O°C stehengelassen· Danach wurde der pH-Wert
mit 1 η HaOH auf 7,0 eingestellt -und zur Stabilisierung der Enzymaktivität wurden 0,1 ml 5%iges Rinderserum—
Albumin, und 1Ou-I 1 M MgCl2 zugegeben. Die dabei erhaltene
Mischung wurde durch eine Sepharose 6B-Kolonne (1,5 cm χ 50 cm), die mit einem 0,01 M Phosphatpuffer
(pH 7,0), der 0,1 m JJaCl, 1 mM MgGl2 und 0,1 %iges Rinderserum-Albumin
enthielt, äquilibr±ert worden war, geschickt, wobei man insgesamt etwa 20 ml Peroxidase-konjugierte
Insulinfraktionen erhielt· Die dabei erhaltene Peroxidase-konjugierte Insulinlösung wurde bei 4-0C gelagert·
umsetzung der aldehydsruppenhaltigen Glucoseoxidase mit
SH enthaltendem porösem Glas
2 g des in dem Bezugsbeispiel 4- hergestellten SH enthaltenden
porösen Glases wurden in 50 ml der an dem Bezugsbeispiel 2 durch Oxidation von Glucoseoxidase hergestellten
aldehjdgruppenhaltigen Glueoseoxidaselösung, die etwa
100 mg aldehydgruppenhaltige Glucoseoxidase enthielt, geworfen·
Die Mischung wurde 5 Minuten lang unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mmHg) gehalten, um die
Luft aus dem porösen Glas zu entfernen. Dana wurde die
Reaktion unter langsamem Rühren 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Danach wurden 10 ml
einer wässrigen 0,5 vol./vol.%igen Ithylmercaptanlösiang
zugegeben und das Rühren wurde weitere 2 Stunden lang bei
Raumtemperatiö? fortgesetzt· Fach, der Reaktion wurde die
überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde mit
einer 1 M wässrigen Hatriumchloridlösung gründlich, gewaschen,
bis die Vaschwässer keine Enzymaktivität mehr aufwiesen. Schließlich wurde das Glas mit einer mit einem
0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung
(pH 7>3) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 40C gelagert· Die Menge der an
das poröse Glas gebundenen GlucoseoxLdase betrug 4-1 mg/g
poröses Glas.
Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase wurde nach dem folgenden Verfahren errechnet:
Die Extinktion der oxidierten Glucoseoxidaselösung bei 280 nm wurde vor und nach der Reaktion bestimmt und daraus
wurde das Verhältnis der Bindung der oxidierten Glucoseoxidase an das poröse Glas errechnet. Die Menge der
gebundenen Glucoseoxidase wurde aus diesem Bindungsverhältnis, der eingesetzten Menge an oxidierter Glucoseoxidase
und der eingesetzten Menge an SH enthaltendem porösem Glas unter Anwendung der folgenden Gleichungen errechnet
:
Bindungsverhältnis (X) =
A-B
Menge 'an gebundener Glucoseoxidase T χ D (mg pro Gramm porösem Glas) C
worin bedeuten:
A = Extinktion der oxidierten Glucoseoxidaselösung vor
der Reaktion bei 280 nm
909835/0708
_ 29 - ■
B = Extinktion der überstehenden Flüssigkeit nach, der He-
- - aktion "bei 280 nm -
C = Hange-des eingeführten, SH enthaltenden porösen Glases
(g)
D = Menge eier eingeführten oxidierten Glueoseoxidase
(mg).
Heaktion. zwischen der aldehydgruppenhaltigen Glucosepxidase
"and Gellulose
1 s Celltilosepulver vruräe in 50 ml der nach dem in dem
BezTigabeispiel 2 beschriebenen Terfahren hergestellten
aldehydgrappenhaltigen Glucoseosadaselösiing, die etwa 100
mg der aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidase enthielt,
geworfen.■ Die Reaktion wurde "unter langsamem Eühren
3 Stunden lang bei Eaumtemperatur fortschreiten gelassen
■and dann wurde die Cellulose abfiltriert und mit einer
1 M Hatriumchloridlösung gründlich gewaschen, bis keine
Eazymaktivität in den Waschwässern mehr festgestellt werden
konnte. Schließlich wurde die Cellulose mit einer mit einem 0s01 H Phosphat puff er abgepufferten physiologischen
Kochsalzlösung (pH 7 »3) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung
eingetaucht und bei 4°C gelagert· Die Menge
der gebundenen Glucoseoxidase betrug 68 mg pro Gramm Cellulose (entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen
BerechnungsTerf ahren) ·
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Bindung der GlucoseoxLdase an aminohaltiges poröses Glas
über Glutaraldehyd
Zu 2 g eines porösen Glases mit eingeführtem HK^ (der
Firma Pierce Chemical Co., USA, Aminogehalt etwa 140 /*M/g) wurden 10 ml einer wässrigen 5%ig>en Glutaraldehydlösung
(pH 5) zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten lang unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mmHg) gehalten,
um Luftblasen aus dem porösen Glas zu entfernen. Nach dem anschließenden 30-minütigen langsamen Eühren bei
Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde mit entionisiertem Wasser so
lange gewaschen, bis kein Aldehydgeruch mehr festgestellt werden konnte. Schließlich wurde es einmal mit einem
0,05 H Phosphatpuffer (pH 7»5) gewaschen. Auf diese Weise
erhielt man ein aldehydgruppenhaltiges poröses Glas·
Zu dem oben erhaltenen, aldehydgruppenhaltigen porösen
Glas wurde eine Lösung von 100 mg Glucoseoxidase (der lirma Toyobo Co., Ltd.) in 50 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers
(pH 7i5) zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden
lang langsam gerührt, während das Reaktionsgefäß mit Eiswasser gekühlt wurde. Nachdem man die Mischung über
!facht in einem Kühlschrank stehengelassen hatte, wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und das Glas wurde
mit einer wässrigen 1 M Natriumchloridlösung gut gewaschen.
Schließlich wurde es mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung
(pH 7»3) gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei 40C gelagert.
909835/0708
Die Menge der gebundenen Glucoseoxidase betrug 23 mg pro
Gramm des porösen Glases (nach, dem in Beispiel 2 beschriebenen
Berechnungsverfahren).
Reaktion der aldehydgruppenhaltJKen Glucoseoxidase mit
dem aminonaltJKen porösen Glas
2 g eines H^-110I* 3-6en porösen Glases (der Firma Pierce
Chemical Co., Aminogehalt etwa 140 uM/g) wurden in 50 ml
einer aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidaselösung geworfen,
die nach dem in dem Bezugsbeispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Oxidieren von 100 mg Glucoseoxidase (der
Firma Toyobo Co., Ltd.) hergestellt worden war, die etwa
100 mg der aldehydgruppenhaltigen Glucoseoxidase enthielt·
Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einem verminderten Druck (50 bis 100 mmHg) gehalten,
um die luftblasen aus dem porösen Glas zu entfernen. Dann wurde die Reaktion unter langsamem Rühren 3
Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen. Haeh der Entfernung der überstehenden Flüssigkeit'wurde
das Glas mit einer 1 M Hatriumchloridlösung und danach mit einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten
physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gut gewaschen, in die gleiche Kochsalzlösung eingetaucht und bei A-0C gelagert.
Die Beuge der gebundenen Glucoseoxidase betrug 35 mg pro
Gramm des porösen Glases (nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Berechnungsverfahren)„
9098 35/070«
Versleichstest in bezug auf die spezifische Aktivität der
Glucoseoxidasederivate
Die in Beispiel 2 und in den Vergleichsbeispielen 1 und
erhaltenen Glucoseoxidasederivate wurden auf ihre spezifische
Enzymaktivität hin getestet und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.
Die Messung der Enzymaktivität wurde nach dem in "Biochimica et Biophysica Acta", 206, 54-60 (1970), beschriebenen
Verfahren durchgeführt·
!Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Glycoprotein)
Unbehandelte Glucoseoxidase 4-3
Derivat des Beispiels 2 41
Derivat des Vergleichsbeispiels 1 28
Derivat des Vergleichsbeispiels 2 39
Die in Beispiel 2 und in den Vergleichsbeispielen 1 und
909835/0703
erhaltenen Glxicoseoxidasederivate wurden jeweils in eine
mit einem O11OI M Phosphat puff er abgepufferte, physiologische
Kochsalzlösung (pH 7,3) eingetaucht und bei 4°C gelagert und sie wurden in bezug auf ihre Lagerbeständigkeit
miteinander verglichen» Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben· Die
Messung der Aktivität erfolgte nach dem in dem ■Vergleichsbeispiel
I angegebenen Verfahren.
relative Aktivität (%)
Glucose-» — . . ■
oxidase- unmittel- nach
derivat bar nach
von der Her- 1 Vo- 2 Wo- 1 Mo- 2 Mo- 6 Mo- Λ
stellung ehe chen nat naten naten
Beispiel 2 100 99,5 98,8 97,4- 98,1 92,3 90,2
gleichs-
beispiel 1 100 86,5 72,8 65,3 53,2 50,8 48,5
ßleichS"™
beispiel 2 100 98,2 90,5 85,0 76,1 62,3 51,8
¥ärmebeständiskeitstest des Glucoseoxidasederivats
Unbehazidelte 6-lucoseoxLdase (Kontrolle) und das in
§09835/0708
Beispiel 2 erhaltene Glucoseoxidasederivat wurden jeweils
in einer mit einem 0,01 M Phosphatpuffer abgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,3) gelöst oder in
diese eingetaucht und bei 600C gelagert. Die Ergebnisse
dieses Wärmebeständigkeitstests sind in der folgenden {Tabelle III angegeben·
\
\
| Glucose- oxidase |
relative Aktivität 00 nach χ Stunden | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 10 | 20 | 48 |
| unbehan- delte Glucose- oxidase |
0 | 48,2 | 26,5 | 10,5 | 5,6 | 2,8 | 1,6 | 0 | - | - |
| Derivat des Bei spiels 2 |
1OO | 75,1 | 63,8 | 51,3 | 41,8 | 34,8 | 31,3 | 23,5 | 18,3 | 15,2 |
| 100 |
909835/0708
Claims (1)
- E · DEUIEL · SCHÖN · H3ETEL PAT E BT TA N WA L T EDR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, D1PL.-PHYS.2 0, Feb. 1979S 3185Anmelders Sanyo Chemical Industries, Ltd. No. 1Ί-1, Ichinohashinomoto-cho, Higashiyama-ku, Kyoto, JapanGlycoproteinderivat-Zübereitrungenj Yerfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als diagnostische Heagentien oder hydrolytische KatalysatorenPatentansprüche1· Ton einem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein (A) abgeleitetes Eonjugat, dadurch gekennzeich net, daß das Glycoprotein (A) an ein mindestens eine SE- oder OH-Gruppe enthaltendes Material (B) kovalent gebunden ist.2« Soüjugat nach Anspruch 1S dadurch gekennzeichnet, daß (A) über eine Eeaithioacetal- oder Hemiacetal-Brückentinäung imö/oder über eins Thioacetal- oder Acetal-BrückenbindOng zwischen der Aldehydgruppe an (A) und909835/0701SItTNOKBK SB · SIEBEKSSSH.i. · BOSSSAOH 8807BO-KABBX.; MTTSBOPAT 'TEI.. (0S8> 49400S-TEI1EX 5-34S83der SH- oder OH-Gruppe an (B) an (B) gebunden ist..3. Verfahren zur Herstellung eines von einem aldehydgruppenhaltigen Glycoprotein (A) abgeleiteten Konjugats, insbesondere des Eonjugats nach Anspruch i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das aldehydgruppenhaltige Glycoprotein (A) mit einem mindestens eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material (B) umgesetzt wird. -4·. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß (A) und (B) unter solchen Bedingungen miteinander umgesetzt werden, daß eine Hemithioacetal- oder Hemiacetal-Brückenbindung und/oder eine Thioacetal- oder Acetal-Srückenbindung entsteht.5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in zwei Stufen durchgeführt wird:(1) Umsetzung von (A) mit einem eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material (B/j) und(2) anschließendes Umsetzen des Reaktionsproduktes mit (E1) oder einem anderen, eine SH- oder OH-Gruppe enthaltenden Material6. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 oder 2 als diagnostisches Reagens oder hydrolytischen Katalysator.909835/0708
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