DE69823055T3 - Abgabe von polyethylene glycol-molekül-konjugaten aus abbaubarem hydrogel - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft quervernetzte Hydrogelnetze, die das hydrophile Polymer Poly(ethylenglykol) enthalten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die chemische Anbindung des hydrophilen Polymers Poly(ethylenglykol) (PEG), das auch als Poly(ethylenoxid) (PEO) bekannt ist, an Moleküle und Oberflächen ist in der Biotechnologie von großem Nutzen. In seiner am häufigsten vorkommenden Form ist PEG ein geradkettiges Polymer, das an den Enden jeweils durch Hydroxylgruppen terminiert ist: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
  • Dieses Polymer kann kurz als HO-PEG-OH wiedergegeben werden, wobei das -PEG-Symbol so zu verstehen ist, daß es für die folgende Struktureinheit steht: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
  • In der typischen Form liegt n im Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 2000.
  • PEG wird herkömmlichweise als Methoxy-PEG-OH bzw. abgekürzt mPEG verwendet, bei dem es sich bei dem einen Terminus um die relativ inerte Methoxygruppe handelt, während der andere Terminus eine Hydroxylgruppe ist, die sich leicht chemisch modifizieren läßt. CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH mPEG
  • PEG wird weiterhin herkömmlich in verzweigten Formen verwendet, die sich durch Addition von Ethylenoxid an verschiedene Polyole wie Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit darstellen lassen. Als Beispiel sei das vierarmige, verzweigte PEG, das aus Pentaerythrit hergestellt wird, unten gezeigt: C(CH2-OH)4 + n C2H4O → C[CH2O-(CH2CH2-O)n-CH2CH2-OH]4
  • Die verzweigten PEGs können in allgemeiner Form als R(-PEG-OH)n wiedergegeben werden, wobei R für das zentrale „Kern"molekül wie z.B. Glycerin oder Pentaerythrit steht und n für die Anzahl der Arme steht.
  • Bei PEG handelt es sich um ein häufig verwendetes Polymer, das in Wasser und vielen organischen Lösungsmitteln löslich sowie nicht toxisch und nicht immunogen ist. Eine Verwendung von PEG ist zur kovalenten Anbindung des Polymers an unlösliche Moleküle, wodurch das so erhaltene PEG-Molekül-„Konjugat" löslich wird. In J. Org. Chem., 60, 331–336 (1995), haben Greenwald, Pendri und Bolikal beispielsweise gezeigt, daß das wasserunlösliche Arzneimittel Taxol, wenn man es mit PEG kuppelt, wasserlöslich wird.
  • Davis et al. beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 4,179,337 an PEG gekuppelte Proteine, die aufgrund einer verminderten Nieren-Clearance und einer verminderten Immunogenität länger im Blutkreislauf verweilen. Daß das Polymer nicht toxisch ist und schnell aus dem Körper entfernt wird, sind für pharmazeutische Anwendungen vorteilhafte Merkmale. Diese Anwendungen und viele maßgebliche Literaturstellen finden sich in dem Buch von Harris (J. M. Harris, Hrsg., „Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry", Plenum, New York, 1992).
  • Für die Kupplung von PEG an ein Molekül wie z.B. ein Protein ist es erforderlich, ein „aktiviertes Derivat" des PEG mit einer funktionellen Endgruppe, die mit einer Gruppe auf der Oberfläche bzw. am Protein (wie z.B. einer Aminogruppe) reagieren kann, zu verwenden. Zu den vielen brauchbaren aktivierten Derivaten von PEG zählt auch der von K. Iwasaki und Y. Iwashita in der US-Patentschrift Nr. 4,670,417 offenbarte succinimidyl-„aktivierte Ester" von carboxymethyliertem PEG. Diese Chemie wird anhand der Umsetzung des aktivierten Esters mit Aminogruppen eines Proteins veranschaulicht (die Succinimidylgruppe und das Protein sind als NHS bzw. PRO-NH2 wiedergegeben): PEG-O-CH2-CO2-NHS + PRO-NH2 → PEG-O-CH2-CO2-NH-PRO
  • Bei den succinimidyl-„aktivierten Estern" wie PEG-O-CH2-CO2-NHS handelt es sich um häufig verwendete Formen von aktivierten Carbonsäuren, die durch Umsetzung von Carbonsäuren mit N-Hydroxylsuccinimid dargestellt werden.
  • Im Stand der Technik gab es Probleme. Einige der funktionellen Gruppen, die zum Aktivieren von PEG verwendet wurden, können bei einer Verwendung zur in-vivo-Verabreichung von Arzneimitteln zu toxischen oder anderweitig. unerwünschten Resten führen. Einige der Verknüpfungen, die zur Bindung von funktionellen Gruppen an PEG entwickelt wurden, können eine unerwünschte Immunreaktion zur Folge haben. Einige der funktionellen Gruppen haben eine unzureichende oder anderweitig ungeeignete Selektivität für eine Reaktion mit bestimmten Gruppen in Proteinen und können eine Desaktivierung der Proteine bewirken.
  • PEG-Hydrogele, bei denen es sich um mit Wasser aufgequollene Gele handelt, sind zur Abdeckung von Wunden und zur Verabreichung von Arzneimitteln verwendet worden. PEG-Hydrogele werden hergestellt, indem man das lösliche, hydrophile Polymer in ein chemisch quervernetztes Netz bzw. eine chemisch quervernetzte Matrix einbaut, so daß bei der Zugabe von Wasser ein unlösliches, aufgequollenes Gel gebildet wird. Für eine in-vivo-Verabreichung werden als Arzneimittel verwendbare Substanzen typischerweise nicht kovalent an das PEG-Hydrogel gebunden. Statt dessen sind die Substanzen in der quervernetzten Matrix eingeschlossen und treten durch die Zwischenräume in der Matrix aus. Die unlösliche Matrix kann auf unbestimmte Zeit im Körper verbleiben, und die Steuerung der Freisetzung des Arzneimittels kann etwas ungenau sein.
  • Ein Ansatz zur Herstellung dieser Hydrogele ist in dem US-Patent Nr. 4,894,238 von Embrey und Graham beschrieben, bei dem die Enden des geradkettigen Polymers über verschiedene starke, nicht abbaubare chemische Bindungen verbunden sind. So kann man beispielsweise geradkettiges PEG durch Umsetzung mit einem Triol und einem Diisocyanat unter Bildung von hydrolytisch stabilen („nicht abbaubaren") Urethanbindungen in ein quervernetztes Netz einbauen.
  • Ein verwandter Ansatz zur Herstellung von nicht abbaubaren PEG-Hydrogelen wurde von Gayet und Fortier in J. Controlled Release, 38, 177–184 (1996), gezeigt, wobei geradkettiges PEG als p-Nitrophenylcarbonat aktiviert und durch Umsetzung mit dem Protein Rinderserumalbumin quervernetzt wurde. Bei den gebildeten Bindungen handelt es sich um hydrolytisch stabile Urethangruppen.
  • In der US-Patentschrift Nr. 3,963,805 beschreibt N.S. Chu nicht abbaubare PEG-Netze, die durch ein statistisches Verdrillen von PEG-Ketten mit anderen, unter Verwendung von mit multifunktionellen Monomeren gemischten Radikalstartern gebildeten Polymeren hergestellt wurden. In der US-Patentschrift Nr. 3,149,006 beschreibt P.A. King die Herstellung von nicht abbaubaren PEG-Hydrogelen durch strahlungsinduziertes Quervernetzen von hochmolekularem PEG.
  • In der US-Patentschrift Nr. 4,424,311 beschreiben Nagaoka et al. PEG-Hydrogele, die durch Copolymerisation von PEG-Methacrylat mit anderen Comonomeren wie Methylmethacrylat hergestellt werden. Diese Vinylpolymerisation liefert ein Polyethylenskelett mit angebundenem PEG. Das Methylmethacrylat-Comonomer wird zugesetzt, um dem Gel zusätzliche physische Stärke zu verleihen.
  • In Macromolecules, 26, 581 (1993), beschreiben Sawhney, Pathak und Hubbell die Darstellung von mit Acrylatgruppen terminierten Blockcopalymeren von Polyglycolid oder Polylactid und PEG, wie unten gezeigt: CH2=CH-CO-(O-CH2-CO)n-PEG-(O-CH2-CO)n-O-CO-CH=CH2
  • In der obigen Formel sind die Glycolidblöcke die -O-CH2-CO-Einheiten; durch Addition einer Methylgruppe an das Methylen erhält man einen Lactidblock; bei n kann es sich um ein Vielfaches von 2 handeln. Die Vinylpolymerisation der Acrylatgruppen liefert ein unlösliches, quervernetztes Gel mit einem Polyethylenskelett. Die Polylactid- bzw. Polyglycolidsegmente des Polymerskeletts, bei denen es sich um Estergruppen handelt, unterliegen einer langsamen hydrolytischen Zersetzung mit dem Ergebnis, daß das quervernetzte Gel langsam abgebaut wird und in Lösung geht.
  • In das Hydrogel werden wesentliche Nicht-PEG-Elemente eingebracht. Nicht-PEG-Elemente machen das Hydrogel komplexer, und der Abbau und die Auflösung der Matrix kann zur Folge haben, daß unerwünschte bzw. toxische Komponenten in den Blutkreislauf gelangen, wenn die Hydrogele in vivo zur Verabreichung von Arzneimitteln verwendet werden.
  • Es wäre wünschenswert, alternative PEG-Hydrogele bereitzustellen, die sich für die Verabreichung von Arzneimitteln eignen und einzigartige Eigenschaften aufweisen, durch die Systeme zur Verabreichung von Arzneimitteln verbessert werden können.
  • Kurze Darstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine abbaubare, quervernetzte polymere Struktur bereit, enthaltend
    • – hydrolytisch instabile Bindungen zwischen einem oder mehreren Poly(ethylenglycol/en)
    • – Konjugate des Poly(ethylenglycols) und eines oder mehrerer biologisch aktiver Mittel, und
    • – ein oder mehrere nichtpeptidische Polymere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(vinylalkohol), Poly(alkylenoxiden), poly(ethoxylierten Polyolen), poly(ethoxyliertem Sorbit), poly(ethoxylierter Glucose), Poly(oxazolin), Poly(acryloylmorpholin), Poly(vinylpyrrolidon) und auf den Monomeren dieser Polymere basierende statistische oder Block-Copolymere und Terpolymere;
    und wobei die hydrolytisch instabilen Bindungen in wässriger Lösung unter Freisetzung von Konjugaten der biologisch aktiven Mittel und des Poly(ethylenglycols) zerfallen, wobei die Struktur durch Umsetzung aktivierter Derivate von Poly(ethylenglycol) mit Aminogruppen in den biologisch aktiven Mitteln und mit Aminogruppen am/an den nichtpeptidischen Polymer/en gebildet wird. Auf diese Weise ermöglicht die Erfindung eine kontrollierte Freisetzung von Konjugaten von PEG und verschiedenen Molekülen einschliesslich beispielsweise Konjugaten von PEG und Enzymen, Polypeptiden, Arzneimitteln, Nukleosiden, Phospholipiden und anderen biologisch aktiven Substanzen. Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Herstellung der Hydrogele bereit.
  • Die erfindungsgemässen Hydrogele werden gebildet, indem man aktivierte Derivate von Poly(ethylenglykol) mit Amingruppen in der biologisch aktiven Substanz oder einem anderen Molekül und mit Amingruppen in anderen Poly(ethylenglykol)molekülen oder verwandten, ähnlichen nichtpeptidischen Polymeren, die typischerweise keine hydrolytisch instabilen Bindungen enthalten, umsetzt. Die Poly(ethylenglykol)moleküle, die in ihrem Skelett schwache Bindungen enthalten, ermöglichen einen hydrolytischen Abbau der Quervernetzungen in der Polymermatrix und die Freisetzung der biologisch aktiven Substanz mit dem daran gebundenen anderen Poly(ethylenglykol) bzw. verwandtem nichtpeptidischen Polymer. Durch den Abbau des Gels in vivo werden PEG-Molekül-Konjugate in den Blutkreislauf abgegeben und im wesentlichen nicht toxische Polymerfragmente erzeugt, die typischerweise vom Körper beseitigt werden. Durch Variieren der Atome in der Nähe der hydrolytisch instabilen Bindungen ist es möglich, die Geschwindigkeit der hydrolytischen Zersetzung und die Freisetzung des Konjugats genau zu steuern.
  • Zu den hydrolytisch instabilen Bindungen im PEG-Polymer-Skelett zählen beispielsweise Carboxylatester, Phosphatester, Acetale, Imine, Orthoester, Peptide, Anhydride, Ketale und Oligonukleotide. Diese schwachen Bindungen werden bei der Reaktion von zwei PEGs mit verschiedenen Endgruppen gebildet, wie unten gezeigt: -PEG-Z + Y-PEG- → -PEG-W-PEG-
  • In der obigen Erläuterung steht -W- für die hydrolytisch instabile, schwache Bindung. Z- und Y- stehen für Gruppen, die sich am Terminus des PEG-Moleküls befinden und dazu in der Lage sind, miteinander unter Bildung schwacher -W-Bindungen zu reagieren. Paare aus Z- und Y-Gruppen, die miteinander unter Bildung hydrolytisch instabiler Bindungen W reagieren, sind beispielsweise Paare, die aus der aus Alkohol und Carbonsäure, die unter Bildung von Carboxylatestern reagieren, Amin und Aldehyd, die unter Bildung von Iminen reagieren, Hyrazid und Aldehyd, die unter Bildung von Hydrazonen reagieren, Alkohol und Phosphat, die unter Bildung von Phosphatestern reagieren, Aldehyd und Alkohol, die unter Bildung von Acetalen reagieren, Alkoholen und Format, die unter Bildung von Orthoestern reagieren, durch die Reaktion von PEG-Amin mit mit Carboxyl terminiertem PEG-Peptid unter Bildung einer neuen Peptidbindung gebildeten Peptiden, durch Reaktion von PEG-Carbonsäure mit mit Amin terminiertem PEG-Peptid unter Bildung einer neuen Peptidbindung gebildeten Peptiden und durch Reaktion von PEG-Phosphoramidit mit einem 5'-hydroxyl-terminierten PEG-Oligonukleotid gebildeten Oligonukleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  • Zur Bildung einiger der oben beschriebenen W-Gruppen können beispielsweise die folgenden Paare aus Z- und Y-Gruppen eingesetzt werden:
  • Figure 00080001
  • Die PEG-Hydrogel-Gele werden hergestellt, indem man drei Bestandteile mischt: (1) ein PEG mit hydrolytisch instabilen Bindungen W im Skelett und mit reaktiven Gruppen X am Ende der Kette, (2) ein verzweigtes PEG oder ein verwandtes nichtpeptidisches Polymer. mit reaktiven Gruppen Q am Ende der Kette und (3) ein biologisch aktives Molekül oder ein anderes Molekül, das reaktive Gruppen Q enthält. Die reaktiven Gruppen X sind aus der aus Succinimidyl (NHS), wie in -O-(CH2)n-CO2-NHS oder -O-CO2-NHS, und verwandten aktivierenden Gruppen einschließlich Sulfosuccinimidyl, Benzotriazol und p-Nitrophenyl bestehenden Gruppe ausgewählt. Bei den reaktiven Gruppen Q handelt es sich um Amin, -NH2.
  • Es entsteht ein quervernetztes Netz, das durch hydrolytisch instabile Gruppen W und Gruppen T, die hydrolytisch stabil sind, zusammengehalten wird. Durch die Hydrolyse der instabilen Gruppen W wird das biologisch aktive oder das andere Molekül mit daran über eine kovalente Bindung, die hydrolytisch stabil ist, gebundenem PEG oder einem verwandten Polymer freigesetzt.
  • Bei den Hydrogelen der vorliegenden Erfindung läßt sich der Verzweigungsgrad der Polymere variieren, wodurch die physische Stärke und die Kompressibilität der Gele gesteuert werden kann. Allgemein gilt: Je größer der Verzweigungsgrad und je kürzer die Zweige, desto größer die Stärke des Gels, desto kleiner die Poren und desto niedriger der Wassergehalt: Stärke ist in diesem Zusammenhang definiert als die Widerstandsfähigkeit gegenüber Kompression bzw. Strecken.
  • Die Freisetzungsgeschwindigkeit von in der Hydrogelmatrix eingeschlossenen Molekülen wird gesteuert, indem man die Geschwindigkeit des hydrolytischen Zerfalls des Gels kontrolliert. Die Geschwindigkeit des hydrolytischen Zerfalls des Gels läßt sich einstellen, indem man den Bindungsgrad der die Hydrogelmatrix bildenden PEGs steuert. Ein mehrarmiges PEG mit 10 Zweigen bzw. Armen wird sich langsamer zersetzen und Arzneimittelmoleküle langsamer freisetzen als ein dreiarmiges PEG.
  • Das folgende PEG wurde mit zwei hydrolytisch instabilen Esterbindungen in seinem Skelett hergestellt: NHS-O2C-CH2-O-PEG-O-CH2-CO2-PEG-O2C-CH2-O-PEG-O-CH2-CO2-NHS
  • Das obige PEG ist an beiden Termini durch eine N-Hydroxylsuccinimideinheit (NHS) aktiviert, wobei es sich bei der aktiven Succinimidylestereinheit um NHS-CO2- handelt, die mit Aminogruppen reagiert. Kuppelt man das obige Molekül mit einem mehrarmigen PEG-Amin und beispielsweise mit einem Protein, das zusätzliche Aminogruppen enthält, so erhält man ein quervernetztes Netz, das durch stabile Amidbindungen und hydrolytisch instabile Esterbindungen zusammengehalten wird. Die stabilen Amidbindungen werden durch die Reaktion des aktiven NHS-Esters mit Amin gebildet.
  • Das obige Beispiel erläutert einige der vorteilhaften Merkmale der Erfindung. Zunächst wird das quervernetzte Netz durch Hydrolyse der hydrolytisch instabilen Esterbindungen (W) im PEG-Skelett abgebaut, bzw. es zerfällt. Zweitens setzt das Gel, wenn es zerfällt, PEG und Proteinkonjugate frei, die potentiell für eine therapeutische Anwendung geeignet sind. Drittens ist es durch subtile Variationen bei der Esterbindung möglich, die Geschwindigkeit des hydrolytischen Zerfalls zu steuern.
  • In dem obigen Beispiel hat die Esterbindung die folgende Struktur: -PEG-O-CH2-CO2-PEG-
  • Diese Estergruppe hydrolysiert bei einem pH-Wert von 7 und bei 37°C mit einer Halbwertszeit von 4 Tagen. Verwendet man jedoch einen Ester mit der folgenden Struktur, dann beträgt die Halbwertszeit für den hydrolytischen Abbau der Esterbindungen bei einem pH-Wert von 7 und 37°C 43 Tage. -PEG-O-(CH2)n-CO2-PEG- n = 2
  • Indem man die Identität der der Esterbindung benachbarten Atome steuert, ist es somit möglich, die Geschwindigkeit des hydrolytischen Zerfalls des Gels zu variieren. Es ist daher möglich, die Geschwindigkeit der Freisetzung von in der Matrix gebundenen Proteinkonjugaten und PEG zu steuern. Im allgemeinen wird, wenn man den n-Wert erhöht, bei dem es sich um die Anzahl der Methylengruppen in der obigen Struktur handelt, die Hydrolysegeschwindigkeit herabgesetzt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit unter anderem abbaubare PEG-Hydrogele mit hydrolytisch instabilen Bindungen bereit, bei denen sich die Geschwindigkeit der Hydrolyse der instabilen Bindungen zur Freisetzung von Konjugaten von PEG oder verwandten nichtpeptidischen Polymeren und Proteinen oder anderen Molekülen mit einer therapeutischen Wirkung in den Blutkreislauf steuern läßt.
  • Die obigen und andere Aufgaben der Erfindung und die Weise, auf die diese gelöst werden, werden in Anbetracht der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit der beigefügten Zeichnung, die ein Ausführungsbeispiel illustriert, leichter verständlich sein.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Bei der 1 handelt es sich um ein Freisetzungsprofil eines erfindungsgemäß hergestellten PEG-Hydrogels eines Modellproteins (FITC-BSA), das kovalent an PEG gebunden ist.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Aus quervernetzten, polymeren PEG-Strukturen hergestellte erfindungsgemäße Hydrogele können für Systeme zur Verabreichung von Arzneimitteln und für Wundverbände verwendet werden. Die Wundverbände könnten intern eingesetzt werden, wodurch Verbände bereitgestellt werden, die im Verlauf der Zeit im Körper abgebaut werden. Die erfindungsgemäßen Hydrogele könnten sinnvoll in Systemen zur Verabreichung von Arzneimitteln bei Brandverletzungen angewendet werden, um polymerkonjugierte therapeutische Mittel an die Brandverletzungen zu verabreichen. Es lassen sich Systeme zur Verabreichung von Arzneimitteln herstellen, bei denen die Geschwindigkeit der Hydrolyse des Hydro gels gesteuert ist, so daß es zu einer kontrollierten Freisetzung der Arzneimittelkomponenten kommt.
  • Unter „Arzneimittel" sind alle Substanzen zu verstehen, die für die Diagnose, Heilung, Linderung, Behandlung oder Prävention von Krankheiten bei Menschen und anderen Tieren bestimmt sind oder auf andere Weise das physische bzw. geistige Wohlbefinden verbessern. Die Erfindung läßt sich allgemein für die Verabreichung von biologisch wirksamen Substanzen verwenden, die in einem lebenden Organismus oder in einer aus einem lebenden Organismus entnommenen Substanz eine Wirkung oder Funktion haben.
  • Die Ausdrücke „Gruppe", „funktionelle Gruppe", „Einheit", „aktive Einheit", „reaktive Stelle" und „Rest" werden in der chemischen Technik alle in gewissem Grade synonym verwendet und bezeichnen in der Technik und hier spezifische, definierbare Teile bzw. Einheiten eines Moleküls und Einheiten, die eine Funktion bzw. Wirkung haben und mit anderen Molekülen oder Molekülteilen reagieren.
  • Mit dem Ausdruck „Bindung" werden Gruppen bezeichnet, die normalerweise als Resultat einer chemischen Umsetzung gebildet werden und bei denen es sich typischerweise um kovalente Bindungen handelt. Hydrolytisch stabile Bindungen bedeutet, daß die Bindungen in Wasser stabil sind und bei brauchbaren pH-Werten über einen ausgedehnten, potentiell unbegrenzten Zeitraum nicht mit Wasser reagieren. Hydrolytisch instabile Bindungen sind Bindungen, die mit Wasser reagieren, wobei es typischerweise zu einem Abbau eines Hydrogels und zu einer Freisetzung der in der Matrix eingeschlossenen Substanzen kommt. Die Bindung wird als hydrolyseempfindlich und hydrolysierbar bezeichnet. Die Zeitspanne, die für den Abbau der quervernetzten polymeren Struktur benötigt wird, wird als die Hydrolyse geschwindigkeit bezeichnet und gewöhnlich als deren Halbwertszeit gemessen.
  • Dem Fachmann wird bewußt sein, daß, wenn auf eine Z-Einheit Bezug genommen wird, die mit einer Y-Einheit reagiert, zur Herbeiführung der gewünschten Bindung W je nach Fall weitere Reagenzien oder Schritte gemäß allgemein akzeptierten chemischen Vorschriften und Standards eingesetzt bzw. angewendet werden können. Es gibt viele mögliche Wege, deren Zahl zu groß ist, als daß sie hier aufgeführt werden könnten, die beschritten werden können und die dem Fachmann geläufig sein sollten. So kann man beispielsweise von einem Fachmann erwarten, daß ihm klar ist, daß, wenn man einen Alkohol und eine Carbonsäure miteinander umsetzt, die Säure vor der Umsetzung mit dem Alkohol typischerweise in eine andere Form (das Säurechlorid) umgewandelt wird. Mehrere Beispiele sind in den Beispielen unten angeführt.
  • Es sollte weiterhin klar sein, daß man anstelle des verzweigten PEG-Polymers als Bestandteil bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogele auch verwandte verzweigte nichtpeptidische Polymere, die nicht über hydrolytisch instabile Bindungen verfügen, verwenden kann. Zu diesen anderen verzweigten Polymeren zählen Poly(vinylalkohol) („PVA"); andere Poly(alkylenoxide) wie Poly(propylenglykol) („PPG") und dergleichen; und poly(ethoxylierte Polyole) wie poly(ethoxyliertes Glycerin), poly(ethoxyliertes Sorbit) und poly(ethoxylierte Glukose) und dergleichen. Bei den Polymeren kann es sich um Homopolymere oder statistische oder Blockcopolymere und Terpolymere auf Basis der Monomere der obigen Polymere, die geradkettig oder verzweigt oder ähnlich mPEG substituiert oder unsubstituiert sind, und andere verkappte, monofunktionelle PEGs mit einer einzelnen aktiven Stelle, die für eine Bindung an ein Bindeglied zur Verfügung steht, handeln.
  • Als spezifische Beispiele für geeignete zusätzliche Polymere können Poly(oxazolin), Poly(acryloylmorpholin) („PAcM"), wie in der offengelegten italienischen Patentanmeldung MI-92-A-0002616, eingereicht am 17. November 1992, beschrieben, und Poly(vinylpyrrolidon) („PVP") erwähnt werden. PVP und Poly(oxazolin) sind im Stand der Technik gut bekannte Polymere, und ihre Herstellung und Verwendung in den beschriebenen Synthesen mit verzweigtem PEG sollten dem Fachmann leicht ersichtlich sein.
  • In den folgenden Beispielen wird die Darstellung von PEGs mit hydrolytisch instabilen Bindungen im Polymerskelett und deren Verwendung zur Herstellung abbaubarer Hydrogele für die Freisetzung von PEG und Biomolekülkonjugaten erläutert. PEGs mit hydrolytisch instabilen Bindungen und deren Darstellung sind auch in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung U.S.S.N. ..... mit dem Titel Degradable Poly(ethylene glycol) Hydrogels With Controlled Half-life and Precursors Therefor beschrieben, die am 12. September 1997 eingereicht wurde und die Priorität der provisorischen Anmeldung mit der Serien-Nr. 60/026,066, die am 13. September 1996 eingereicht wurde, beansprucht, wobei deren gesamter Inhalt, der die Herstellung von PEGs mit hydrolytisch instabilen Bindungen im Polymerskelett betrifft, durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung ist.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Synthese von PEG-Derivaten mit hydrolytisch instabilen Skelettbindungen und terminalen NHS-aktiven Carbonaten (NHS-OOCO-PEG-W-PEG-OCOO-NHS)
  • In einem 100-ml-Rundkolben wurde Benzyloxy-PEG-carboxymethylsäure 3400 (3,4 g, 1 mmol, Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) in Toluol zwei Stunden lang azeotrop destilliert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Eine Lösung von Thionylchlorid (2 M, 4 ml, 8 mmo1, Aldrich) in Methylenchlorid wurde injiziert, und die Mischung wurde über Nacht unter N2 gerührt. Das Lösungsmittel wurde abrotiert, und der Sirup wurde 4 Stunden im Vakuum über P2O5-Pulver getrocknet. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) und azeotrop getrocknetem Benzyloxy-PEG 3400 (2,55 g, 0,75 mmol) in Toluol (20 ml) versetzt. Nachdem das Benzyloxy-PEG-acylchlorid in Lösung gegangen war, wurde frisch destilliertes Triethylamin (0,6 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, das Triethylaminsalz wurde abfiltriert, und. das Produkt wurde durch Ausfällen mit Ethylether gesammelt. Es wurde durch Lösen in Wasser und Extrahieren mit Methylenchlorid weiter aufgereinigt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und in Ethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet. HPLC (GPC) des Produkts zeigte, daß 100% des Benzyloxy-PEG in den PEG-Ester umgewandelt worden waren und etwa 15 Gew.-% Benzyloxy-PEG-Säure zurückblieben.
  • Die Mischung wurde chromatographisch an einer Ionenaustauschersäule (DEAE-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) aufgereinigt, um die Benzyloxy-PEG-Säure zu entfernen. Der 100% reine α-Benzyloxy-ϖ-PEG-Ester 6800 (2 g, 0,59 mmol Endgruppe) wurde in 1,4-Dioxan (20 ml) mit H2 (2 atm Druck) und Pd/C (1 g, 10% Pd) über Nacht hydrogenolysiert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Produkt in Ethylether ausgefällt, nachdem das meiste Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer abgezogen worden war. Der α-Hydroxy-ϖ-Hydroxy-PEG-Ester 6800 wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,5 Gramm (75%).
  • Der α-Hydroxy-ϖ-Hydroxy-PEG-Ester 6800 (1,5 g, 0,44 mmol Endgruppe) wurde mit 100 ml Acetonitril azeotrop getrocknet und auf Raumtemperatur abgekühlt. Diese Lösung wurde mit Disuccinimidylcarbonat (DSC) (0,88 mmol, Fluka) und Pyridin (0,1 ml) versetzt, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen, und der Sirup wurde getrocknet. Das Produkt wurde in 35 ml trockenem Methylenchlorid gelöst, der unlösliche Feststoff wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde mit mit Natriumchlorid gesättigtem Acetatpuffer (pH-Wert 4,5) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und in Ethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde im Vakuum über P2O5 getrocknet. Ausbeute: 1,4 g (93%). NMR (DMSO-d6): (1) Produkt aus Benzyloxy-PEG-Propionsäure: δ 3,5 (br m, PEG), 2,55 (t, -OCH2CH 2COOPEG-), 4,13 (t, -PEG-COOCH 2CH2O-), 4,45 (t, -PEGOCH2CH 2OCO-NHS), 2,80 [s, NHS, 4H]; (2) Produkt aus Benzyloxy-PEG-Carboxymethylsäure: δ 3,5 (br, m, PEG), 4,14 (s, -OCH 2COOPEG-), 4,18 (t, -OCH2COOCH 2CH2-), 4,45 (t, -PEGO-CH2CH 2OCONHS), 2,81 [s, NHS, 4H].
  • Beispiel 2
  • Synthese von PEG-Derivaten mit hydrolytisch instabilen Skelettbindungen und terminalen NHS-aktiven Estern (NHS-OOC-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-CO2-PEG-O2C-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-COONHS)
  • In einem 100-ml-Rundkolben wurden difunktionales PEG 2000 (2 g, 1 mmol, Shearwater Polymers) und difunktionale PEG-Säure 2000 (4 g, 2 mmol, Shearwater Polymers) mit 70 ml Toluol unter N2 azeotrop destilliert. Nach 2 Stunden wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Zinn(II)-2-ethylhexanoat (200 mg, Sigma Chemical) versetzt. Die Lösung wurde dann 24 Stunden lang unter N2 auf Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum abgedampft, und der Sirup wurde in 100 ml Ether ausgefällt. Das Produkt wurde abfiltriert, im Vakuum getrocknet und in Natriumacetatpufferlösung (pH-Wert 5,0) gelöst. Die leicht milchige Lösung wurde zentrifugiert, und die obere, klare Lösung wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Vakuum eingeengt und in Ether ausgefällt. Das Product wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. HPLC: 70% Produkt, 15% Disäurereaktionspartner und 15% Monosäure. Das Produkt wurde weiter durch Ionenaustauschchromatographie und Gelpermeationschromatographie aufgereinigt. Ausbeute: 3 g (50%). 1H-NMR (DMSO-D6): (1) Produkt aus PEG-Carboxymethylsäure: δ 3,5 (br m, PEG), 4,15 (s, -OCH 2COOCH2-), 4,18 (t, -OCH2COOCH 2CH2-), 3,98 (s, -PEG-OCH2COOH); (2) Produkt aus PEG-Propionsäure; δ 3,5 (br m, PEG), 2,55 (t, -PEGOCH2CH 2COOCH2-), 4,13 (t, -OCH2CH2COOCH 2CH2-), 2,43 (t, -PEGOCH2CH 2COOH).
  • In einem Rundkolben wurden die (im vorherigen Schritt erhaltene) difunktionale Säure mit schwachen Bindungen (3 g, ungefähr 1 mmol Endgruppe) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) (126 mg, 1,05 mmol) in 50 ml trockenem Methylenchlorid gelöst. Diese Lösung wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid (240 mg, 1,15 mmol) in 5 ml trockenem Methylenchlorid versetzt. Die Mischung wurde über Nacht unter N2 gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Sirup in 15 ml wasserfreiem Toluol gelöst. Das unlösliche Salz wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde in 200 ml trockenem Ethylether ausgefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 2,7 g (90%). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 3,5 (br m, PEG), 2,8 (s, NHS, 4H), 4,6 (s, -PEG-O-CH 2-COONHS) oder 2,85 (t, -PEG-O-CH2CH 2-COONHS).
  • Beispiel 3
  • Hydrolysekinetik der Esterbindungen in der Mitte der PEG-Derivate
  • Zur genauen Messung der Hydrolysekinetik der Esterbindungen wurde wasserlösliches, nicht quervernetztes mPEG-O-(CH2)n-COO-PEGm wie in Beispiel 2 synthetisiert. Die Hydrolyse erfolgte in Pufferlösungen (0,1 M) bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen, worauf sich eine HPLC-GPC (Ultrahydrogel® 250, Waters) anschloß. Die Halbwertszeiten der Esterbindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Tabelle 1 Hydrolysehalbwertszeiten (Tage, ±10%) der Ester von mPEG-O-(CH2)n-COO-PEGm in 0,1 M Phosphatpuffer.
    Figure 00190001
  • Beispiel 4
  • Darstellung eines hydrolytisch instabilen PEG-Hydrogels aus verzweigtem PEG-Amin, Modellprotein (FITC-BSA) und PEG-Derivaten mit hydrolytisch instabilen Skelettbindungen und terminalen NHS-aktiven Carbonaten (NHS-OOCO-PEG-W-PEG-OCOONHS)
  • In einem Reagenzglas wurden 100 mg (14,7 μmol) difunktionelles aktives PEG-Carbonat 6800 (NHS-OOCO-PEG-W-PEG-OCOONHS, in Beispiel 1 dargestellt) in 0,75 ml Puffer (0,1 M Phosphat, pH-Wert 7) gelöst. Die Lösung wurde mit 0,15 ml 8-armigem PEG-Amin 10 000 (250 mg/ml) und 0,1 ml FITC-BSA (10 mg/ml) versetzt. Nach schnellem Schütteln durfte sich die Mischung setzen, und innerhalb von wenigen Minuten bildete sich ein Gel. Es wurde gefunden, daß sich als pH-Wert für den Puffer der Bereich von 5,5 bis 8 eignet.
  • Beispiel 5
  • Darstellung eines hydrolytisch instabilen PEG-Hydrogels aus verzweigtem PEG-Amin, Modellprotein und PEG-Derivaten mit hydrolytisch instabilen Skelettbindungen und terminalen NHS-aktiven Estern (NHS-OOC-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-CO2-PEG-O2C-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-COONHS)
  • 100 mg (ungefähr 16,6 μmol) difunktioneller aktiver PEG-Ester (NHS-OOC-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-CO2-PEG-O2C-(CH2)n-O-PEG-O-(CH2)n-COONHS, in Beispiel 2 dargestellt) wurde in 0,75 ml Puffer (0,1 M Phosphat, pH-Wert 7) gelöst: Die Lösung wurde mit 0,166 ml 8-armigem PEG-Amin 10 000 (250 mg/ml) und 0,1 ml FITC-BSA (10 mg/ml) versetzt. Nach schnellem Schütteln durfte sich die Mischung setzen, und innerhalb von wenigen Minuten bildete sich ein Gel. Es wurde gefunden, daß sich als pH-Wert für den Puffer der Bereich von 5,5 bis 8 eignet.
  • Beispiel 6
  • Untersuchungen zur Freisetzung von Modellproteinen aus hydrolytisch abbaubaren Hydrogelen
  • Alle mit Protein beladenen Hydrogelscheiben wurden vor den Freisetzungsuntersuchungen ausgewogen, und ihr Durchmesser wurde gemessen. Die einzelnen Gelscheiben wurden dann zum Zeitpunkt t = 0 in Phosphatpuffer (0,1 M, pH-Wert 7,0) eingetaucht. Die Menge an Puffer war mehr als 50mal größer als die des Gewichts des nassen Gels. Die Lösung wurde bei 37°C gehalten und sachte geschüttelt. Zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt wurde zur Bestimmung der Proteinkonzentration eine kleine Menge Pufferlösung entnommen und dann nach der Messung zurückgegeben. Die Proteinkonzentration wurde durch eine UV-Messung bei 495 nm bestimmt. 1 zeigt einige Freisetzungsprofile von PEG-FITC-BSA aus den Hydrogelen in gegen die Zeit in Tagen aufgetragenen Einheiten der Molfraktion zum Zeitpunkt t geteilt durch die Mole im Unendlichen, was als vollständiger Abbau des Hydrogels definiert ist.
  • Die Erfindung wurde anhand von bestimmten beispielhaften Ausführungsformen beschrieben. Die vorstehende Beschreibung soll die Erfindung jedoch nicht auf die beispielhaft angeführten Ausführungsformen einschränken, und dem Fachmann sollte bewußt sein, daß im Umfang der Erfindung, wie in der obigen Beschreibung beschrieben, Variationen möglich sind. Die Erfindung schließt alle Alternativen, Modifikationen und Entsprechungen ein, die zum Geist und Umfang der Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen definiert, gehören können.

Claims (22)

  1. Eine abbaubare, quervernetzte polymere Struktur, enthaltend – hydrolytisch instabile Bindungen zwischen einem oder mehreren Poly(ethylenglycol/en) – Konjugate des Poly(ethylenglycols) und eines oder mehrerer biologisch aktiver Mittel, und – ein oder mehrere nichtpeptidische Polymere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(vinylalkohol), Poly(alkylenoxiden), poly(ethoxylierten Polyolen), poly(ethoxyliertem Sorbit), poly(ethoxylierter Glucose), Poly(oxazolin), Poly(acryloylmorpholin), Poly(vinylpyrrolidon) und auf den Monomeren dieser Polymere basierende statistische oder Block-Copolymere und Terpolymere; und wobei die hydrolytisch instabilen Bindungen in wässriger Lösung unter Freisetzung von Konjugaten der biologisch aktiven Mittel und des Poly(ethylenglycols) zerfallen, wobei die Struktur durch Umsetzung aktivierter Derivate von Poly(ethylenglycol) mit Aminogruppen in den biologisch aktiven Mitteln und mit Aminogruppen am/an den nichtpeptidischen Polymer/en gebildet wird.
  2. Eine quervernetzte polymere Struktur, enthaltend Segmente der Formel poly-T-poly-W-PEG-W-poly-T-D, wobei PEG für ein verzweigtes oder geradkettiges Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 300 bis 200'000 Dalton steht; poly für ein Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(alkylenoxiden), poly(ethoxylierten Polyolen), poly(olefinischen Alkoholen) und Poly(acryloylmorpholin) steht; W für eine hydrolytisch instabile Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Orthoester, Anhydrid, Imin, Acetal, Ketal, Oligonukleotid und Peptid steht; T für eine hydrolytisch stabile Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amid, Urethan, Amin, Ether, Thioether und Harnstoff steht; und D für ein biologisch aktives Molekül steht.
  3. Struktur gemäss Anspruch 1, wobei die hydrolytisch instabilen Bindungen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Orthoester, Anhydrid, Imin, Acetal, Ketal, Oligonukleotid und Peptid.
  4. Struktur nach Anspruch 1, weiter enthaltend hydrolytisch stabile Bindungen zwischen den nichtpeptidischen Polymeren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amid, Urethan, Amin, Ether, Thioether und Harnstoff.
  5. Struktur nach Anspruch 1, wobei die biologisch aktiven Mittel aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, Polypeptiden, Arzneimitteln, Nukleosiden und Phospholipiden ausgewählt sind.
  6. Struktur nach Anspruch 1, wobei die nichtpeptidischen Polymere verzweigte polymere Amine enthalten.
  7. Abbaubare, chemisch quervernetzte polymere Struktur, enthaltend Konjugate eines biologisch aktiven Moleküls und Poly(ethylenglykol) („PEG") mit wenigstens einer hydrolytisch instabilen Bindung im PEG-Polymergerüst, wobei das hydrolytisch instabile PEG kovalent an ein verzweigtes PEG-Amin gebunden ist und wobei die Struktur durch eine Kondensationsreaktion quervernetzt ist.
  8. Struktur nach Anspruch 7, wobei das verzweigte PEG-Amin die Formel R(CH2-O-PEG-NH2)p aufweist, wobei PEG für Poly(ethylenglycol) steht, R für eine zentrale verzweigende Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerin, Glycerinoligomeren, Pentaerythrit, Sorbit und Trimethylolpropan steht und p einen Wert von 3 bis 10 hat und den Verzweigungsgrad des verzweigten PEG-Polymers angibt.
  9. Struktur nach Anspruch 7, wobei das Konjugat des biologisch aktiven Moleküls und des hydrolytisch instabilen PEG die Struktur X-PEG-W-PEG-T-D aufweist, wobei PEG für Poly(ehtylenglycol) steht, D für das biologisch aktive Molekül steht, T für eine hydrolytisch stabile Bindung steht, W für die hydrolytisch instabile Bindung steht und X für eine Einheit steht, die mit Aminen in dem verzweigten PEG-Amin reagiert.
  10. Struktur nach Anspruch 9, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäureester, Sulfosuccinimidyl, Benzotriazol und p-Nitrophenyl und Di(trimethylolpropan).
  11. Struktur nach Anspruch 9, wobei W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Orthoester, Anhydrid, Imin, Acetal, Ketal, Oligonukleotid und Peptid.
  12. Struktur nach Anspruch 9, wobei X für -O-(CH2)n-CO2-NHS steht, wobei n = 0 bis 10.
  13. Struktur nach Anspruch 12, wobei die Hydrolyse-Halbwertszeit der hydrolytisch instabilen Bindung durch den Wert von n bestimmt wird.
  14. Struktur nach Anspruch 12, wobei W für eine Esterbindung -O-(CHR')r-CO2- steht, wobei r für 1 bis 10 steht und R' für Wasserstoff oder Alkyl steht.
  15. Struktur nach Anspruch 12, wobei T ausgewählt ist aus der Gruppe aus Amid, Urethan, Amin, Thioether und Harnstoff.
  16. System zur Verabreichung eines Arzneimittels enthaltend die polymere Struktur nach Anspruch 1.
  17. Verfahren zur Herstellung einer quervernetzten polymeren Struktur durch Polykondensation, wobei die Struktur unter Freisetzung von Konjugaten eines biologisch aktiven Moleküls mit Poly(ethylenglycol) hydrolysiert durch Umsetzung von (1) PEGs mit hydrolytisch schwachen Bindungen im Gerüst, (2) verzweigten, nichtpeptidischen polymeren Aminen und (3) biologisch aktiven Molekülen unter Bildung der Struktur, wobei die Umsetzung wie folgt dargestellt werden kann: X-PEG-W-PEG-X + R(CH2-O-poly-NH2)p + D-NH2 → Produkt wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bernsteinsäureester, Sulfosuccinimidyl, Benzotriazol und p-Nitrophenyl; R für eine zentrale verzweigende Gruppe steht, die zu verzweigten Polymeren führt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerin, Glycerinoligomeren, Pentaerythrit, Sorbit, Trimethylolpropan und Di(trimethylolpropan); p = 3 bis 10 ist und den Verzweigungsgrad des verzeigten Polymers wiedergibt; poly für ein Polymer steht ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(alkylenoxiden), poly(ethoxylierten Polyolen), poly(olefinischen Alkoholen) und Poly(acryloylmorpholin); W für eine hydrolytisch instabile Bindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäureester, Phosphorsäureester, Orthoester, Anhydrid, Imin, Acetal, Ketal, Oligonukleotid und Peptid steht; und D für ein biologisch aktives Molekül steht.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei X für -O-(CH2)n-CO2-NHS oder -O-CO2-NHS steht und wobei n = 1 bis 10.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei W für eine Esterbindung -O-(CHR')r-CO2- steht, wobei r = 1 bis 10 und R' für Wasserstoff oder Alkyl steht.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die verzweigten, nichtpeptidischen polymeren Amine keine schwachen Bindungen in ihrem Gerüst aufweisen.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei poly ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly(alkylenoxiden), Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Polyoxazolin und Poly(acryloylmorpholin).
  22. Struktur nach Anspruch 1, wobei das biologisch aktive Mittel ein therapeutisches Mittel ist und die Struktur ein Hydrogel zum Aufbringen von therapeutischen Mitteln auf Wunden und Narben ist.
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