CN103889443A - 使用透明质酸降解酶的持续皮下胰岛素输注法 - Google Patents

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Abstract

提供的是用于持续皮下胰岛素输注(CSII)的方法，其采用透明质酸降解酶，包括重组人PH20(rHuPH20)。该方法可以用于更一致地控制CSII过程期间的血液葡萄糖。该方法可以用于治疗具有糖尿病或其他胰岛素相关疾病或状况的对象。

Description

使用透明质酸降解酶的持续皮下胰岛素输注法
相关申请的交叉引用
要求于2011年10月27日提交的美国临时申请号61/628,389、于2011年6月17日提交的美国临时申请号61/520,940、和于2012年6月8日提交的美国临时申请号61/657,606的优先权利益，所述美国临时申请各自名称为“Continuous Subcutaneous Insulin Infusion Methods With aHyaluronan-Degrading Enzyme”。
本申请涉及名称为“CONTINUOUS SUBCUTANEOUS INSULININFUSION METHODS WITH A HYALURONAN-DEGRADINGENZYME”，与此同一天提交的序列号13/507,261的美国申请，所述美国申请要求美国临时申请号61/628,389、美国临时申请号61/520,940和美国临时申请号61/657,606的优先权。上述相关申请各自主题整体引入作为参考。
本申请还涉及名称为“Stable Co-formulations of a Hyaluronan-DegradingEnzyme and Insulin”，于2011年6月17日提交的号61/520,962临时申请。本申请还涉及名称为“STABLE FORMULATIONS OF AHYALURONAN-DEGRADING ENZYME”，各自与此同一天提交的序列号(代理人案号3320.03085.US01/3085)和美国申请序列号(代理人案号33320.03085.US02/3085B)的美国申请，所述美国申请要求美国临时申请号61/520,962的优先权。本申请还涉及名称为“STABLE FORMULATIONS OFA HYALURONAN-DEGRADING ENZYME”，与此同一天提交的号(代理人案号33320.03085.WO01/3085PC)的国际PCT申请，所述国际PCT申请要求美国临时申请号61/520,962的优先权。
本申请还涉及于2009年4月28日提交，名称“Super Fast-Acting InsulinCompositions”，给予发明人Gregory Frost、Igor Blinsky、Daniel Vaughn和Barry Sugarman，以美国公开号US20090304665公开的号12/387,225的申请，所述申请要求2008年4月28日提交的美国临时申请的优先权。
上述相关申请各自的主题整体引入作为参考。
引入作为参考的电子提供的序列表
随同提交了电子版本的序列表，其内容整体引入作为参考。电子文件于2012年6月15日创建，大小860千字节，并且标题为3097seqPC1.txt。
技术领域
提供的是用于持续皮下胰岛素输注(CSII)的方法，其采用透明质酸降解酶，例如重组人PH20(rHuPH20)。该方法可以用于更一致地控制CSII过程期间的血液葡萄糖。该方法可以用于治疗具有糖尿病或其他胰岛素相关疾病或状况的对象。
背景技术
由于胰腺不能产生足够量的胰岛素或由于细胞不能适当合成且释放胰岛素，糖尿病导致慢性高血糖。高血糖还可以由危重患者经历，导致增加的死亡率和发病率。胰岛素已作为治疗剂施用，以治疗具有糖尿病包括例如1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病的患者。胰岛素还已施用于具有高血糖的危重患者，以控制血液葡萄糖水平。一般地，将速效胰岛素施用于此类对象，以响应高血糖或预期高血糖例如在进餐消费后，这可以导致血糖控制。然而，目前的速效型胰岛素具有吸收和作用中的延迟，并且因此不接近快速内源胰岛素作用。因此，此类制剂无法足够快速地起作用，以切断在这个胰岛素释放的第一阶段后不久发生的肝葡萄糖生产。由于药理作用中的延迟，速效胰岛素制剂应在用餐前施用，以便实现所需血糖控制。进一步地，必须施用的剂量导致促成低血糖的延长的作用持续时间，并且在许多情况下，导致肥胖。因此，存在胰岛素疗法的改良方法以控制糖尿病患者中的血液葡萄糖水平的需要。
发明内容
提供的是用于控制通过持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法治疗的对象中的血液葡萄糖的方法、组合物和用途。一般地，待治疗的对象具有糖尿病，例如但不限于1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。
本文提供的方法包括给对象施用以治疗有效量的含有透明质酸降解酶的组合物，所述治疗有效量足以催化玻尿酸水解以增加组织穿透性；并且进行CSII疗法以将包含速效胰岛素的组合物递送给对象。透明质酸降解酶的施用一般与CSII疗法分开施用。例如，透明质酸降解酶在CSII疗法施用前通过前沿施用。为了实践这些方法，透明质酸降解酶以这样的量提供，所述量在CSII设备的输注装置寿命开始时实现超快速胰岛素应答。该方法可以校正在CSII疗法过程中观察到的胰岛素吸收和/或作用中的变化或差异，其在输注装置寿命期内降到最低或得到减少。
例如，本文提供的是通过下述经由持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法控制对象中的血液葡萄糖的方法：给对象施用含透明质酸降解酶的组合物；且随后通过CSII给对象持续输注速效胰岛素，其中与在不存在透明质酸降解酶的情况下进行的CSII相比较，在输注装置寿命期内在胰岛素吸收中的差异降到最低或得到减少。在本文方法的例子中，透明质酸降解酶可以以这样的量提供，所述量在对象中的输注装置寿命开始时实现超快速胰岛素应答。在本文的其他例子中，透明质酸降解酶可以以这样的量施用，所述量足以催化玻尿酸水解以增加组织穿透性。
为了实践该方法，CSII疗法用持续输注设备实现，所述持续输注设备包括胰岛素泵、含有速效胰岛素的储库、任选的葡萄糖监测仪和用于组合物的皮下输注的输注装置。在一些例子中，CSII疗法用持续输注设备实现，所述持续输注设备包括胰岛素泵、含有速效胰岛素的储库、葡萄糖监测仪和用于组合物的皮下输注的输注装置。持续输注设备可以提供开环或闭环系统。
在实践该方法中，CSII疗法步骤进行或持续预定时间。一般地，透明质酸降解酶组合物在速效胰岛素输注前施用。透明质酸降解酶组合物可以在第一个间隔之前、之后或过程中或与开始第一个间隔同时施用。透明质酸降解酶组合物定期重输注。一般地，CSII疗法进行预定间隔；并且在每个间隔开始时，施用透明质酸降解酶组合物。在每个间隔结束时，可以替换输注装置(或整个泵)。一般的预定间隔一般为超过一天、几天例如2天到4天，或可以更久，例如一周。
透明质酸降解酶可以在CSII设备的胰岛素组合物输注部位处或附近施用，包括通过相同注射部位或不同注射部位施用。透明质酸降解酶和速效胰岛素组合物可以顺次、同时或间歇施用。透明质酸降解酶一般在开始CSII疗法前或在更换CSII设备或输注装置时施用。因此，透明质酸降解酶在CSII疗法的任何间隔中在胰岛素之前施用。透明质酸降解酶组合物的递送可以在通过CSII的输注起始之前或在CSII装置开始之时或之前立即施用。例如，胰岛素输注可以在透明质酸降解酶施用数秒或数分钟内起始。在一些情况下，透明质酸降解酶在胰岛素输注起始前至少一小时例如至少2小时施用。例如，透明质酸降解酶一般在胰岛素输注前约或大约或15秒到1小时，在CSII开始前30秒到30分钟、1分钟到15分钟、1分钟到12小时、5分钟到6小时、30分钟到3小时或1小时到2小时施用。在一些例子中，透明质酸降解酶的递送可以是在CSII疗法后，例如之后1分钟到12小时、5分钟到6小时、30分钟到3小时或1小时到2小时。因为CSII疗法一般是持续的，所以透明质酸酶降解酶将以预定间隔与疗法一起施用，或如果在CSII疗法过程中观察到胰岛素吸收和/或作用中的变化或差异，则可以根据需要施用。一般地，透明质酸降解酶在速效胰岛素施用前不超过2小时施用。
在这些方法中，施用的透明质酸降解酶量在功能上等于在下述之间或大约在下述之间：1单位-200单位、5单位-150单位、10单位-150单位、50单位-150单位或1单位-50单位酶。例如，施用的透明质酸降解酶特别是通过核酸表达产生的酶的量一般在8ng-2μg、20ng-1.6μg、80ng-1.25μg或200ng-1μg之间，所述核酸编码CHO细胞中的氨基酸36-482，或施用等量的其他透明质酸酶降解酶。
还提供的是特别在用胰岛素和透明质酸降解酶(例如超速效胰岛素组合物)的共制剂治疗的对象中用于控制血液葡萄糖的持续皮下胰岛素输注(CSII)给药方案。依照这些方案，可以定期施用额外胰岛素，以便抵制在施用速效胰岛素与透明质酸降解酶的共制剂和任选的基础胰岛素时发生的血液葡萄糖水平或作用或增加中的任何降低。
该方法通过下述实践：a)依照设定的胰岛素的基本速率和推注剂量，进行CSII以将含有超速效胰岛素组合物的组合物递送给对象；和b)与在不存在透明质酸降解酶的情况下施用的设定的胰岛素基础速率和推注剂量相比较，在疗程期间至少一次使施用的基础胰岛素和/或推注胰岛素的量增加至少1%，从而增加胰岛素作用。步骤b)可以每天进行至少一次。在一些实施方案中，基础胰岛素速率增加，并且在其他实施方案中，胰岛素推注剂量增加，并且在其他实施方案中，基础胰岛素和推注剂量都增加。对于这些方案，推注剂量可以是关于给定平均值的膳食剂量和/或关于给定高血糖校正的校正推注。基础速率和/或推注剂量可以增加1%-50%、5%-40%、10%-20%或5%-15%。
对于其中施用超速效胰岛素组合物(其含有速效胰岛素和透明质酸酶降解酶)的这些方案和任何方法，此类超速效胰岛素组合物含有：用于控制血液葡萄糖水平的治疗有效量的速效胰岛素；和足以使组合物变成超速效胰岛素组合物的透明质酸降解酶量。示例性组合物是这样的，其中：速效胰岛素的量是或是约10U/mL-1000U/mL；并且使组合物变得超速效的透明质酸降解酶的足够量在功能上等于1U/mL-10,000U/mL，例如其中速效胰岛素的量是或是约100U/mL，并且使组合物变得超速效的透明质酸降解酶的足够量在功能上等于600U/mL或约600U/mL；其中速效胰岛素的量是或是约0.35mg/mL-35mg/mL；并且使组合物变得超速效的透明质酸降解酶的足够量在功能上等于8ng/mL-80μg/mL。
在本文提供的所有方法中，透明质酸降解酶可以是透明质酸酶或软骨素酶。透明质酸降解酶可以是在中性pH下活性的透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸降解酶缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当通过细胞表达时不是膜结合的，例如缺乏GPI锚的透明质酸酶降解酶，或通常具有GPI锚但具有一个或多个氨基酸残基的C末端截短，以去除所有或部分GPI锚的酶。透明质酸酶降解酶包括透明质酸酶，其为PH20，例如非人或人PH20，例如具有含SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列、或具有这样的氨基酸序列的PH20，所述氨基酸序列与含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85%序列同一性且保留透明质酸酶活性，或含有这样的氨基酸序列的PH20，所述氨基酸序列与含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性且保留透明质酸酶活性。示例性此类PH20多肽是具有这样的氨基酸序列的那些，其含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短，或是其与氨基酸序列显示出至少85%序列同一性的变体，所述氨基酸序列含有在SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短且保留透明质酸酶活性，或与氨基酸序列具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，所述氨基酸序列含有在SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短且保留透明质酸酶活性。包括的是其为C末端截短的PH20酶的透明质酸降解酶，所述C末端截短的PH20酶包含具有SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列。
在本文提供的所有方法中，当单独或在超速效胰岛素组合物中施用速效胰岛素时，它们可以是单体、二聚或六聚的。这些包括普通胰岛素，一般为人胰岛素，但它们可以是猪胰岛素。胰岛素包括从动物来源中分离的天然胰岛素、重组产生的胰岛素和合成胰岛素。示例性胰岛素包括具有SEQID NO:103中所示的氨基酸序列的A链和SEQ ID NO:104中所示的氨基酸序列的B链的普通胰岛素，或具有如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置88-108所示的氨基酸序列的A链和如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置25-54所示的氨基酸序列的B链的胰岛素。
在使用的速效胰岛素中还有胰岛素类似物和经改造为类似地速效或更速效的任何其他胰岛素。胰岛素类似物包括称为门冬胰岛素、赖脯胰岛素或谷赖胰岛素的那些。示例性胰岛素类似物是选自下述的胰岛素类似物：具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列的A链和SEQ NO:147-149中任一所示的氨基酸序列的B链的胰岛素。
在本文提供的方法中，胰岛素组合物可以含有其为或其为约10U/mL-1000U/mL的量，例如以100U/mL或约100U/mL，或者0.35mg/mL-35mg/mL或约0.35mg/mL-35mg/mL。
含有胰岛素的组合物可以是超速效胰岛素组合物，其为含有速效胰岛素特别是胰岛素类似物和透明质酸降解酶例如上文所述那些中的任何的组合物。透明质酸降解酶的量是使组合物变得超速效的量。组合物可以这样配制，从而使得它们是稳定的，特别地，从而使得胰岛素的效力保持在或超过其起始效率的约90%。示例性超速效胰岛素组合物用合适的盐、pH和防腐剂和需要时的稳定剂进行配制，从而使得它们在32℃-40℃或约32℃-40℃下稳定至少3天，从而使得例如组合物中的透明质酸降解酶在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天保留至少50%的起始透明质酸酶活性；并且组合物中的胰岛素在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天保留组合物中的起始胰岛素水平的至少90%效力或恢复；和/或在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天保留至少90%的起始胰岛素纯度；和/或在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天保留小于2%的高分子量(HMWt)胰岛素种类。
示例性此类超速效胰岛素组合物是还具有6.5-7.5或约6.5-7.5的pH的组合物；并且该组合物含有：以120mM-200mM或约120mM-200mM的浓度的NaCl；抗微生物有效量的防腐剂或防腐剂混合物；和一种或多种稳定剂。稳定剂包括透明质酸酶抑制剂和阻止、抑制或降低胰岛素和透明质酸酶降解酶降解的其他化合物。示例性透明质酸酶抑制剂包括但不限于蛋白质、透明质酸降解酶底物、多糖、脂肪酸、羊毛甾类(lanostanoid)、抗生素、抗线虫药、合成有机化合物和植物衍生的生物活性组分，特别是不与透明质酸酶降解酶或胰岛素形成共价复合物的抑制剂。植物衍生的植物活性组分包括但不限于生物碱、抗氧化剂、多酚、黄酮类、萜类和消炎药。其他透明质酸酶抑制剂包括但不限于糖胺聚糖(GAG)、血清透明质酸酶抑制剂、催眠睡茄(Withania somnifera)糖蛋白(WSG)、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、壳聚糖、β-(1,4)-低聚半乳糖、硫酸毛蕊花糖、硫酸车前糖、果胶、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)、硫酸葡聚糖、海藻酸钠、来自裙带菜(Undariapinnatifida)的多糖、扁桃酸缩合聚合物、二十碳三烯酸、神经酸、齐墩果酸、马兜铃酸、阿马林、利血平、黄酮、去甲氧基醉椒素(desmethoxycentauredine)、槲皮苷、芹菜素、山柰酚、水飞蓟宾、木犀草素、木犀草素-7-糖苷、根皮素、芹菜苷、橙皮苷、磺化橙皮苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、黄酮-7-硫酸钠、黄酮7-氟-4’-羟基黄酮、4’-氯-4,6-二甲氧基查耳酮、5-羟基黄酮7-硫酸钠、杨梅酮、芸香苷、桑色素、甘草甜素、维生素C、D-异抗坏血酸、D-糖1-4内酯、L-抗坏血酸-6-十六酸酯(Vcpal)、6-O-酰化维生素C、儿茶素、去甲二氢愈创木酸、姜黄素、N-没食子酸丙酯、鞣酸、鞣花酸、没食子酸、呋哺昆布醇(phlorofucofuroeckol)A、二鹅掌菜酚、8,8’-双鹅掌菜酚、原花青素、棉酚、塞来考昔、尼美舒利、地塞米松、吲哚美辛、非诺洛芬、苯基保泰松、羟布宗、水杨酸酯、色甘酸二钠、金硫丁二钠、transilist、曲呫诺、伊维菌素、林可霉素和壮观霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶、硫酸新霉素、3α-乙酰多孔酸A、(25S)-(+)-12α-羟基-3α-甲基羧基-乙酸酯-24-甲基羊毛甾-8,24(31)-二烯-26-酸、羊毛甾类、多孔酸c、PS53(氢醌-硫酸-甲醛聚合物)、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)聚合物、VERSA-TL502、1-十四烷磺酸、扁桃酸缩合聚合物(SAMMA)、1,3-二乙酰苯并咪唑-2-硫酮、N-单乙酰化苯并咪唑-2硫酮、N,N’-二乙酰化苯并咪唑-2-硫酮、烷基-2-苯基吲哚衍生物、3-丙酰苯并噁唑-2-硫酮、N-烷基化吲哚衍生物、N-酰化吲哚衍生物、苯并噻唑衍生物、N-取代吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物、N-取代吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物的卤代类似物(氯和氟)、2-(4-羟苯基)-3-苯基吲哚、吲哚甲酰胺、吲哚乙酰胺、3-苯甲酰-1-甲基-4-苯基-4-哌啶醇、苯甲酰苯甲酸苯酯衍生物、1-精氨酸衍生物、HCL胍、L-NAME、HCN、亚麻苦苷、苦杏仁苷、常春藤苷配基、七叶皂甙、CIS-扁柏树脂酚和1,3-二-P-羟苯基-4-戊烯-1-酮。还包括的是其为透明质酸酶底物的透明质酸酶抑制剂，例如透明质酸(HA)寡糖，包括例如二糖或四糖。HA寡糖可以含有反应的还原末端，从而使得它不形成复合物。抑制剂的合适浓度可以凭经验确定。例如，HA可以是或是约1mg/mL-20mg/mL。
还提供的是含有用于使在持续皮下胰岛素输注(CSII)内发生的胰岛素吸收中的变化降到最低的透明质酸降解酶的组合物，和透明质酸降解酶组合物用于使在持续皮下胰岛素输注期内发生的胰岛素吸收中的变化降到最低的用途。用于这些用途的组分和组合物如上文对于用于控制通过持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法治疗的对象中的血液葡萄糖的方法描述的。
还提供的是用作持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法中的前沿的一种或多种组合物用于治疗糖尿病的用途，所述组合物含有配制用于以这样的量直接施用的透明质酸降解酶，所述量使经过持续皮下胰岛素输注(CSII)的过程发生的胰岛素吸收中的变化降到最低，由此关于胰岛素疗法的前沿治疗剂是在通过CSII施用胰岛素组合物前施用的组合物。在本文提供的用于前沿疗法的用途和组合物中，透明质酸降解酶以足够催化玻尿酸水解以增加组织穿透性的治疗有效量。
在用于前沿疗法的组合物和用途的特定例子中，透明质酸降解酶是透明质酸或软骨素酶。例如，透明质酸降解酶是在中性pH下活性的透明质酸酶。透明质酸降解酶包括缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚或当通过细胞表达时不是膜结合的酶。在一些例子中，透明质酸降解酶含有一个或多个氨基酸残基的C末端截短，且缺乏所有或部分GPI锚。
在本文提供的用于前沿疗法的用途和组合物中，组合物可以含有其为PH20透明质酸酶的透明质酸降解酶。PH20可以是非人或人PH20。PH20可以具有含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列，或具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464的氨基酸序列具有至少85%序列同一性且保留透明质酸酶活性。例如，组合物中的PH20可以与氨基酸序列具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，所述氨基酸序列含有SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464且保留透明质酸酶活性。在一些例子中，PH20多肽具有这样的氨基酸序列，其含有在SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短，或是其与氨基酸序列显示出至少85%序列同一性的变体，所述氨基酸序列含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短且保留透明质酸酶活性。例如，PH20与氨基酸序列具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，所述氨基酸序列含有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后的C末端截短且保留透明质酸酶活性。用于本文前沿疗法的组合物中的示例性透明质酸降解酶，透明质酸降解酶是C末端截短的PH20酶，其具有SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：4-9的任何一个中所示的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。例如，PH20具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：4-9的任何一个中所示的氨基酸序列显示出至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在特定例子中，PH20具有SEQ ID NO：4-9的任何一个中所示的氨基酸序列。
在本文提供的用于前沿疗法的用途和组合物中，组合物中的透明质酸降解酶以这样的量，其在功能上等于在下述之间或大约在下述之间：1单位-200单位、5单位-150单位、10单位-150单位、50单位-150单位或1单位-50单位。组合物中的透明质酸降解酶可以以这样的量，其是或是约8ng-2μg、20ng-1.6μg、80ng-1.25μg或200ng-1μg。在特定例子中，组合物中的透明质酸降解酶以下述的量或大约下述的量：30单位/mL-3000U/mL、100U/mL-1000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL或600U/mL-1000U/mL。例如，组合物中的透明质酸降解酶以这样的量，其是至少或是约至少或是30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL或3000U/mL。
在本文提供的用于前沿疗法的用途和组合物中，用于在持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法中使用的胰岛素组合物是速效胰岛素。速效胰岛素可以是单体、二聚或六聚的。速效胰岛素可以是速效人胰岛素。在一些例子中，速效胰岛素是普通胰岛素。例如，普通胰岛素是人胰岛素或猪胰岛素。普通胰岛素可以是具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列的A链和SEQ IDNO:104中所示的氨基酸序列的B链的胰岛素，或具有如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置88-108所示的氨基酸序列的A链和如SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置25-54所示的氨基酸序列的B链的胰岛素。速效胰岛素可以是重组胰岛素，是合成的或部分合成的或是分离的。在特定例子中，速效胰岛素是胰岛素类似物。例如，胰岛素类似物可以是具有SEQ IDNO:103中所示的氨基酸序列的A链和SEQ ID NO:147-149中任一所示的氨基酸序列的B链的胰岛素。在本文提供的用于在前沿疗法中使用的任何组合物中，速效胰岛素类似物是门冬胰岛素、赖脯胰岛素或谷赖胰岛素。速效胰岛素以这样的在用于持续皮下输注的组合物中配制，所述量是或是约100u/mL-1000U/mL或500U/mL-1000U/mL。
还提供的是含有用在改善总胰岛素作用降低中的推注施用的胰岛素的组合物，所述总胰岛素作用中的降低由超速效胰岛素组合物的持续皮下胰岛素输注引起，和推注胰岛素用于改善由超速效胰岛素组合物的持续皮下胰岛素输注引起的总胰岛素降低作用中的用途。用于这些用途的组分和组合物如上文对于持续皮下胰岛素输注(CSII)给药方案描述的。
附图说明
图1描述了对于门冬胰岛素
Figure BDA0000465955830000111
和门冬-PH20条件，关于第1钳夹和第2钳夹研究的血清免疫反应性胰岛素(以pmol/L表示的IRI)浓度与时间的关系。该图显示了在PH20的存在下，在1/2天CSII(第1钳夹)和21/2天CSII(第2钳夹)后，与单独的门冬相比较，门冬吸收是加速的。该图还显示了对于两种商业门冬
Figure BDA0000465955830000112
相对于1/2天(第1钳夹)CSII，胰岛素吸收在21/2天(第2钳夹)后是加速的。这个加速还对于门冬-PH20条件观察到，但是减少的。
图2描述了与仅门冬胰岛素
Figure BDA0000465955830000113
相比较，如在推注胰岛素施用后通过测定维持血液葡萄糖正常所需的葡萄糖输注率测量的门冬-PH20的糖动态变化。
图3描述了如通过血液葡萄糖要求保护方法测定的总胰岛素作用(输注的累积葡萄糖(Gtot))。该图显示了总胰岛素作用在输注装置寿命期间的下降，尽管对于门冬胰岛素-PH20制剂至更大的程度。
图4描述了通过对于总胰岛素作用标准化作为累积时间-作用曲线图的结果。该图显示了从第1钳夹到第2钳夹加速的输注葡萄糖百分比(%)，并且PH20的添加导致在两个时间点更快速的时间-作用概况。
图5描述了通过连同或不连同用rHuPH20预施用(前沿)的持续皮下施用输注的胰岛素的药物代谢动力学概况。结果显示rHuPH20预施用在输注开始时加速胰岛素吸收，并且导致胰岛素吸收中降低的可变性，如通过与输注装置结束时相比较，在输注装置开始时的早期胰岛素暴露中无显著差异证明的。在不存在rHuPH20预施用的情况下，随着输注装置老化，存在变动胰岛素吸收。
图6描述了如通过在推注胰岛素输注后维持血液葡萄糖正常所需的葡萄糖输注率证明的，根据时间的胰岛素作用的糖动态变化概况。结果显示伴随用rHuPH20(前沿，和更短的作用持续时间)预处理，在输注开始时存在胰岛素作用的加速开始(更大的作用和更早的作用开始)。在不存在rHuPH20预施用的情况下，随着输注装置老化，存在胰岛素作用中增加的变动。
具体实施方式
概要
A.定义
B.胰岛素疗法
1.胰岛素、糖尿病和现有速效胰岛素疗法
2.持续皮下输注(CSII)
C.使用透明质酸降解酶的胰岛素的持续皮下输注(CSII)方法
1.给药方案法
a.前沿
b.改善总胰岛素作用的方法
2.胰岛素泵及其他胰岛素递送设备
a.开环系统
b.闭环系统
c.示例性设备
D.胰岛素多肽
速效胰岛素
a.普通胰岛素
b.速效类似物
i.赖脯胰岛素
ii.门冬胰岛素
iii.谷赖胰岛素
E.透明质酸降解酶
1.透明质酸酶
a.哺乳动物型透明质酸酶
PH20
b.细菌透明质酸酶
c.来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶
2.其他透明质酸降解酶
3.截短的透明质酸降解酶或其他可溶形式
a.C末端截短的人PH20
b.rHuPH20
4.透明质酸降解酶的糖基化
5.透明质酸降解酶改善其药物代谢动力学概况的修饰
F.超速效胰岛素制剂及其稳定制剂
1.稳定共制剂
a.NaCl和pH
b.透明质酸酶抑制剂
c.缓冲液
d.防腐剂
f.稳定剂
i.表面活性剂
ii.其他稳定剂
2.其他赋形剂或试剂
G.产生编码胰岛素或透明质酸降解酶的核酸及其多肽的方法
1.载体和细胞
2.接头部分
3.表达
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.昆虫细胞
d.哺乳动物细胞
e.植物
4.纯化技术
H.治疗用途
1.糖尿病
a.1型糖尿病
b.2型糖尿病
c.妊娠糖尿病
2.用于危重患者的胰岛素疗法
I.组合疗法
J.制造物品和试剂盒
K.实施例
A.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。除非另有说明，否则本文整体公开内容自始至终提及的所有专利、专利申请、公开申请和出版物、基因库序列、数据库、网站及其他公开材料整体引入作为参考。在存在用于本文术语的多个定义的情况下，以这个部分中的定义为准。当提及URL或其他此类标识符或地址时，应当理解此类标识符可以改变，并且在因特网上的特定信息可以是不定的，但等价信息可以通过搜索因特网找到。对其的提及证明此类信息的可用性和公开传播。
如本文使用的，持续皮下胰岛素输注疗法(CSII)指胰岛素给药方案，由此胰岛素经由连接至泵的输注装置通过输注以设定速率经过几天过程由小型输注器或泵皮下施用。一般地，CSII疗法在输注装置和泵储库必须替换前持续2-4天。治疗组合持续基线胰岛素释放(基础速率)以及在餐前和响应高血糖值的另外胰岛素推注剂量(即校正推注)。CSII疗法一般使用电池供电的注射器驱动器、胰岛素泵或其他相似设备，以根据给药方案递送速效胰岛素，特别是胰岛素类似物。一般地，持续基线胰岛素释放的时间安排由医生对于每个患者设置。推注剂量基于膳食需要和血糖应答进行确定。因此，CSII疗法是患者特异性的。取决于患者的需要及其他患者特异性参数例如患者的重量、年龄、锻炼、饮食和临床症状，对于每个患者确定特定胰岛素给药方案完全在熟练的医生和患者的水平内。
如本文使用的，输注装置指附着至胰岛素泵的系统，其将来自泵中储库的胰岛素直接递送到皮肤下。一般地，胰岛素输注装置含有下述中的一种或多种：管道系统；将装置插入皮肤下的皮下插管、钢针或其他插入设备；将插入设备固定至施用部位例如腹壁的粘合式安装；和/或泵药液筒连接器。输注装置还可以含有快速断开器，其将插入设备和粘合式安装留在原地，以允许患者例如在进行活动例如淋浴或游泳时方便地去除设备。
如本文使用的，胰岛素的基础速率指没有食物的机体胰岛素需求。一般地，它是以单位(U/H)测量的预先设定或预定的特征。胰岛素的基础速率可以取决于生活方式变动例如锻炼、饮食或疾病和患者的需要而改变或变化。
如本文使用的，胰岛素的推注速率或剂量指补偿由于用餐在胰岛素需要中的改变或校正升高的血液葡萄糖水平的另外胰岛素需求。一般地，推注胰岛素通过用户根据需要进行递送，或设定为给予用于进餐、零食和/或校正升高的血液葡萄糖的胰岛素剂量。
如本文使用的，闭环系统是用于提供持续血糖控制的整合系统。闭环系统含有用于测量血液葡萄糖的机构、用于递送一种或多种组合物包括胰岛素组合物的机构、和用于测定待递送以达到血糖控制的所需胰岛素量的机构。一般地，因此，闭环系统含有葡萄糖传感器、胰岛素递送设备例如胰岛素泵、和接收来自葡萄糖传感器的信息且为胰岛素递送设备提供命令的控制器。命令可以由控制器中的软件生成。软件一般包括算法，以基于由葡萄糖传感器检测到的或由用户预期的血液葡萄糖水平，测定待递送以达到血糖控制的所需胰岛素量。
开环系统指类似于闭环系统的设备，除了该设备不自动测量且响应葡萄糖水平外。一般地，在开环系统中，胰岛素泵或其他相似设备设定为持续输注胰岛素，以递送基础速率的胰岛素，并且当患者能够时，借助于泵上的按钮或其他手动工具在进餐时间或接近进餐时间施用胰岛素的推注。施用的推注剂量基于已知或期望的葡萄糖水平进行确定，这可以手动监控或可以使用展示实时血液葡萄糖结果的葡萄糖监测仪进行监控。
如本文使用的，“胰岛素”指作用于增加葡萄糖摄取和贮存和/或降低内源葡萄糖生产的激素、其前体或合成或重组类似物。示例性人胰岛素翻译为含有24氨基酸信号肽的110氨基酸前体多肽，前胰岛素原(SEQ IDNO:101)，所述信号肽将该蛋白质导向信号序列在其中被切割的内质网(ER)，导致胰岛素原(SEQ ID NO:102)。胰岛素原进一步加工，以释放31氨基酸C肽或连接链肽(对应于SEQ ID NO:101中所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基57–87，和SEQ ID NO:102中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基33-63)。所得到的胰岛素含有通过二硫键交联的21氨基酸A链(对应于SEQID NO:101中所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基90-110，和SEQ IDNO:102中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基66-86)和30氨基酸B链(对应于SEQ ID NO:101中所示前胰岛素原多肽的氨基酸残基25-54，和SEQID NO:102中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基1-30)。适当交联的人胰岛素含有三个二硫键：在A链的第7位和B链的第7位之间的一个、在A链的第20位和B链的第19位之间的第二个、和在A链的第6和11位之间的第三个。提及胰岛素包括以单链或二链形式的前胰岛素原、胰岛素原和胰岛素多肽、其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，例如胰岛素类似物，包括与SEQ IDNO:101中所示的前体多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽或其成熟形式。示例性胰岛素类似物包括具有SEQ IDNO:103中所示A链和SEQ ID NO:147-149、152中所示B链的那些，以及含有SEQ ID NO:150、156、158、160、162和164中所示A链和/或SEQ IDNO:151、153-155、157、159、161、163和165中所示B链的那些。
示例性胰岛素多肽是具有哺乳动物包括人起源的那些。人起源胰岛素的示例性氨基酸序列(A和B链)在SEQ ID NO：101-104中显示。示例性胰岛素类似物包括具有SEQ ID NO:103中所示A链和SEQ ID NO:147-149、152中所示B链的那些，以及含有SEQ ID NO:150、156、158、160、162和164中所示A链和/或SEQ ID NO:151、153-155、157、159、161、163和165中所示B链的那些。胰岛素多肽还包括非人起源中的任何，包括但不限于SEQ ID NO:105-146中所示前体胰岛素多肽中的任何。提及胰岛素包括单体和多聚胰岛素，包括六聚胰岛素，以及人源化胰岛素。
如本文使用的，“速效胰岛素”指响应对象中的实际、感受到或预期的高血糖状况，用于急性施用于糖尿病对象的任何胰岛素或速效胰岛素组合物，所述高血糖状况在速效胰岛素施用时或在其后约四小时内出现(例如起因于或预期起因于进餐消费的膳食高血糖状况)，由此速效胰岛素能够阻止、控制或改善急性高血糖状况。一般地，速效胰岛素是在皮下施用于对象后四小时或大约不超过四小时显示出峰胰岛素水平的胰岛素。速效胰岛素包括重组胰岛素和分离的胰岛素(也称为“普通”胰岛素)，例如作为R销售的胰岛素、猪胰岛素和牛胰岛素，以及设计为由于氨基酸变化而快速起作用的快速作用的胰岛素类似物(在本文中也称为速效胰岛素类似物)。示例性普通胰岛素制剂包括但不限于人普通胰岛素，例如在商标
Figure BDA0000465955830000172
R，
Figure BDA0000465955830000173
R和
Figure BDA0000465955830000174
Insulin Human，USP和InsulinHuman Injection，USP下销售的那些，以及胰岛素的酸制剂，例如TorontoInsulin、Old Insulin和Clear Insulin，和普通猪胰岛素例如
Figure BDA0000465955830000175
(猪胰岛素)。普通胰岛素一般具有在30分钟到一小时的作用开始，和在施用后2-5小时的峰胰岛素水平。
如本文使用的，快速作用的胰岛素类似物(也称为速效胰岛素类似物)是具有快速的作用开始的胰岛素。快速胰岛素一般为已例如通过引入一个或多个氨基酸置换被改造为比普通胰岛素更快速起作用的胰岛素类似物。快速作用的胰岛素类似物一般具有注射后10-30分钟的作用开始，其中峰胰岛素水平在注射后30-90分钟观察到。示例性快速作用的胰岛素类似物包括但不限于例如赖脯胰岛素(例如
Figure BDA0000465955830000176
胰岛素)、门冬胰岛素(例如
Figure BDA0000465955830000177
胰岛素)和谷赖胰岛素(例如
Figure BDA0000465955830000178
胰岛素)、作为
Figure BDA0000465955830000179
和
Figure BDA00004659558300001710
销售的速效胰岛素组合物(参见例如美国专利号7,279,457)。还包括的是具有30分钟或更少的作用开始和在注射后90分钟一般为30-90分钟之前的峰水平的任何其他胰岛素。
如本文使用的，人胰岛素指其为合成的或基于人多肽重组产生的胰岛素，包括其等位基因变体和类似物。
如本文使用的，速效人胰岛素或人速效胰岛素组合物包括其为速效的任何人胰岛素或人胰岛素的组合物，但排除非人胰岛素例如普通猪胰岛素。
如本文使用的，术语“基础作用胰岛素”或“基础胰岛素”指作为用于治疗慢性状况例如糖尿病的总体治疗方案的部分，施用于维持基础胰岛素水平的胰岛素。一般地，基础作用胰岛素配制为当定期施用时(例如每天一次或两次)，通过胰岛素的控制释放维持接近稳态的胰岛素水平。基础作用胰岛素包括结晶胰岛素(例如NPH和
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鱼精蛋白胰岛素、胰岛素)、基础胰岛素类似物(甘精胰岛素、HOE901、NovoSol Basal)及胰岛素的其他化学制剂(例如阿拉伯树胶、卵磷脂或油悬浮液)，其延迟普通胰岛素的吸收率。如本文使用的，基础作用胰岛素可以包括一般理解为长效(一般达到相对低的峰浓度，同时具有经过约20-30小时的最大作用持续时间)或中效的(一般在施用后约4-12小时引起峰胰岛素浓度)。
如本文使用的，“血糖”指血糖(葡萄糖)水平。
如本文使用的，术语“高血糖状况”或“高血糖”指不希望有的血液葡萄糖升高。
如本文使用的，术语“低血糖状况”或“低血糖”指不希望有的血液葡萄糖下降。
如本文使用的，血糖控制或“控制血液葡萄糖水平”指血液葡萄糖浓度维持在所需水平，一般为70-130mg/dL或90-110mg/dL。
如本文使用的，糖基化血红蛋白(HbA1c)测试指提供血液中特定类型的经修饰的血红蛋白百分比的实验室测试。该测试确定经过过去三到四个月的糖尿病患者的血液葡萄糖控制水平。
如本文使用的，“胰岛素吸收”指在注射后血液中的游离和总胰岛素的出现。测定或测量胰岛素吸收的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于来自注射部位的放射性的消除或消失(外部γ计数)和/或血浆免疫反应性胰岛素的出现(IRI)(参见例如Fernqvist等人(1988)Diabetes，37:694-701；Bowsher(1999)Clinical Chemistry，45:104-110)。测量血浆免疫反应性胰岛素的方法包括使用放射标记的胰岛素示踪物的常规竞争性放射性免疫测定法(RIA)，以跟踪胰岛素吸收和抗胰岛素抗体。血清游离胰岛素浓度可以在用聚乙二醇沉淀后通过RIA进行测定，并且血清总胰岛素浓度可以用不含聚乙二醇沉淀的相同RIA程序进行测定。
如本文使用的，“胰岛素作用”是胰岛素活性的量度。它可以通过测量在正常血糖钳夹过程中维持同等血糖所需的葡萄糖输注率进行测定。它可以描述为在时间间隔中输注的总葡萄糖(g/kg)。
如本文使用的，“总胰岛素作用”是经过正常血糖钳夹实验过程的胰岛素作用的量度。它可以描述为经过实验过程输注的累积葡萄糖。
如本文使用的，“超速效胰岛素应答”指显示出更快进/更快出(PK)概况的胰岛素作用应答，从而使得存在胰岛素吸收中的加速和缩短的作用持续时间。如本文描述的，“超速效胰岛素应答”在胰岛素的持续输注过程期间在一段时间内观察到。此外，如本文描述的，“超速效胰岛素应答”可以通过使用透明质酸降解酶的前沿疗法生成。例如，超速效胰岛素应答可以在胰岛素输注或注射之前立即或之后立即施用透明质酸降解酶后40分钟到1小时内生成。“超速效胰岛素组合物”的施用还影响“超速效胰岛素应答”。
如本文使用的，就持续皮下胰岛素输注(CSII)而言的“前沿疗法”指通过持续皮下胰岛素输注在输注装置过程中施用胰岛素组合物(例如速效胰岛素组合物或超速效胰岛素组合物)前，施用透明质酸降解酶。前沿设计在输注部位引发泵，从而增加在输注装置寿命开始时的胰岛素吸收率，以从而降低随着输注装置老化发生的胰岛素吸收中的变动。提及前沿疗法一般仅指使用输注装置的CSII疗法的单个间隔或过程，其可以在使用后续输注装置的治疗过程期间重复。在每个间隔时，在胰岛素输注前，可以施用由透明质酸降解酶的前沿治疗。前沿施用一般在胰岛素施用前12(十二小时)内，且一般在施用2小时或更少内给予。
如本文使用的，“超速效胰岛素组合物”指这样的胰岛素组合物，其含有速效胰岛素一般为速效胰岛素类似物，和透明质酸降解酶(例如可溶性透明质酸酶，包括但不限于rHuPH20制剂)，从而使得经过在肠胃外施用于对象后的前四十分钟，胰岛素组合物在对象中提供的累积全身胰岛素暴露大于在不存在透明质酸降解酶的情况下，通过相同途径施用相同剂量的相同速效胰岛素后，经过相同时期给对象提供的累积全身胰岛素暴露。如本文描述的超速效胰岛素组合物任选可以包括基础作用胰岛素。
如本文使用的，给药方案指施用的胰岛素量和施用频率。给药方案是待治疗的疾病或状况的函数，并且因此可以改变。
如本文使用的，透明质酸降解酶指催化透明质酸聚合物(也称为玻尿酸或HA)切割成更小分子量的片段的酶。示例性透明质酸降解酶是透明质酸酶，且特别是具有使透明质酸解聚的能力的软骨素酶和裂解酶。其为透明质酸降解酶的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称为软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称为硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶(eliminase))和软骨素C裂解酶。软骨素ABC裂解酶包含两种酶，硫酸软骨素ABC内切裂解酶(EC4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外切裂解酶(EC4.2.2.21)。示例性硫酸软骨素ABC内切裂解酶和硫酸软骨素ABC外切裂解酶包括但不限于来自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内切裂解酶在SEQ ID NO:98中显示；Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝素黄杆菌(SEQ ID NO:99中所示)、Victivallis vadensis(SEQ ID NO:100中所示)和金黄色节杆菌(Arthrobacter aurescens)的那些(Tkalec等人(2000)Applied andEnvironmental Microbiology66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews inBiochemistry and Molecular Biology30(5):387-444)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属(Streptococcus)和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。
如本文使用的，透明质酸酶指一类透明质酸降解酶。透明质酸酶包括细菌透明质酸酶(EC4.2.2.1或EC4.2.99.1)，来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC3.2.1.36)，和哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)。透明质酸酶包括非人起源的任何，包括但不限于鼠、犬、猫、兔、禽类、牛、绵羊、猪、马、鱼、娃、细菌，以及来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的任何。示例性非人透明质酸酶包括来自下述的透明质酸酶：牛(SEQ ID NO:10、11、64和BH55(美国专利号5,747,027和5,827,721)、黄蜂(SEQ ID NO:12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO:14)、白脸大黄蜂(SEQ ID NO:15)、胡蜂(SEQ IDNO:16)、小鼠(SEQ ID NO:17-19、32)、猪(SEQ ID NO:20-21)、大鼠(SEQ IDNO:22-24、31)、兔(SEQ ID NO:25)、绵羊(SEQ ID NO:26、27、63和65)、猩猩(SEQ ID NO:28)、食蟹猴(SEQ ID NO:29)、豚鼠(SEQ ID NO:30)、黑猩猩(SEQ ID NO:185)、恒河猴(SEQ ID NO:186)、节杆菌属物种(Arthrobactersp.)(菌株FB24)(SEQ ID NO:67)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)(SEQ ID NO:68)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(SEQID NO:69)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(SEQ ID NO:70)；18RS21(SEQ ID NO:71)；血清型Ia(SEQ ID NO:72)；血清型III(SEQ IDNO:73)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(菌株COL)(SEQ IDNO:74)；菌株MRSA252(SEQ ID NO:75和76)；菌株MSSA476(SEQ IDNO:77)；菌株NCTC8325(SEQ ID NO:78)；菌株牛RF122(SEQ ID NO:79和80)；菌株USA300(SEQ ID NO:81)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)(SEQ ID NO:82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO:83)；血清型2、菌株D39/NCTC7466(SEQ ID NO:84)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(血清型M1)(SEQ ID NO:85)；血清型M2、菌株MGAS10270(SEQ ID NO:86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ IDNO:87)；血清型M6(SEQ ID NO:88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ IDNO:89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQ ID NO:91)；血清型M28(SEQ ID NO:92)；猪链球菌(Streptococcus suis)(SEQ ID NO:93-95)；费氏弧菌(Vibrio fischeri)(菌株ATCC700601/ES114(SEQ ID NO:96))，和Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对于玻尿酸是特异性的并且不切割软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.和Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta198:607)。透明质酸酶还包括人起源的那些。示例性人透明质酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO:36)、HYAL2(SEQ ID NO:37)、HYAL3(SEQ ID NO:38)、HYAL4(SEQ ID NO:39)和PH20(SEQ ID NO:1)。在透明质酸酶中还包括的是可溶性透明质酸酶，包括绵羊和牛PH20、可溶性人PH20和可溶性rHuPH20。商购可得的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的例子是
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(绵羊透明质酸酶)和
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(牛透明质酸酶)。
提及透明质酸降解酶包括前体透明质酸降解酶多肽和成熟透明质酸降解酶多肽(例如其中信号序列已去除的那些)、其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，包括与SEQ ID NO：1和10-48、63-65、67-100中所示的前体多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽，或其成熟形式。例如，提及透明质酸降解酶(例如PH20)包括SEQ ID NO:2中所示的成熟人PH20及其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和剪接变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，包括与SEQ ID NO:2具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽。例如，提及透明质酸降解酶包括SEQ IDNO:50-51中所示的人PH20前体多肽变体。透明质酸降解酶还包括含有化学或翻译后修饰的那些，以及不含化学或翻译后修饰的那些。此类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其他多肽修饰。
如本文使用的，PH20指在精子中出现并且是中性活性的一类透明质酸酶。PH20在精子表面上和在溶酶体衍生的顶体中出现，在其中它与顶体内膜结合。PH20包括任何起源的那些，包括但不限于人、黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、鼠、牛、绵羊、豚鼠、兔和大鼠起源。示例性PH20蛋白质包括但不限于人(SEQ ID NO:1中所示的前体多肽，SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽)、牛(SEQ ID NO：11和64)、兔(SEQ ID NO：25)、绵羊PH20(SEQ IDNO：27、63和65)、食蟹猴(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：30)、大鼠(SEQ ID NO：31)、小鼠(SEQ ID NO：32)、黑猩猩(SEQ ID NO：185)和恒河猴(SEQ ID NO:186)PH20多肽。提及PH20包括前体PH20多肽和成熟PH20多肽(例如其中信号序列已去除的那些)、其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，包括与SEQ ID NO:1、11、25、27、29-32、63-65、185或186中所示的前体多肽具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽，或其成熟形式。PH20多肽还包括含有化学或翻译后修饰的那些，以及不含化学或翻译后修饰的那些。此类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化及本领域已知的其他多肽修饰。商购可得的牛或绵羊可溶性透明质酸酶的例子是透明质酸酶(绵羊透明质酸酶)和
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透明质酸酶(牛透明质酸酶)。
如本文使用的，可溶性透明质酸酶指这样的多肽，其由细胞分泌并且不是膜锚定或结合的，并且因此可以通过其在生理条件下的可溶性进行表征。可溶性透明质酸酶可以例如通过其分配到加温至37℃的Triton X-114溶液的水相内进行区分(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.，256:1604-7)。膜锚定的例如脂质锚定的透明质酸酶将分配到富含去污剂的相内，但在用磷脂酶-C处理后将分配到去污剂很少的相或水相内。在可溶性透明质酸酶中包括的是其中与透明质酸酶锚定至膜相关的一个或多个区域已被去除或修饰的膜锚定的透明质酸酶，其中可溶形式保留透明质酸酶活性。可溶性透明质酸酶包括重组可溶性透明质酸酶和在天然来源中含有或由天然来源纯化的那些，例如来自绵羊或牛的睾丸提取物。示例性此类可溶性透明质酸酶是可溶性人PH20。其他可溶性透明质酸酶包括绵羊(SEQ ID NO:27、63、65)和牛(SEQ ID NO:11、64)PH20。
如本文使用的，可溶性人PH20或sHuPH20包括缺乏在C末端处的糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点的全部或部分的成熟多肽，从而使得在表达后，多肽不与它们在其中产生的宿主细胞的膜结合，从而使得它们被分泌，并且因此在细胞培养基中溶解。因此，可溶性人PH20包括C末端截短的人PH20多肽。示例性可溶性或C末端截短的PH20多肽包括具有SEQ IDNO：4-9、47-48、234-254和267-273中的任何一个所示的氨基酸序列的成熟多肽，或与SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中的任何显示出至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽。示例性sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO:4-9和47-48中的任何一个所示的氨基酸序列的成熟多肽。关于此类示例性sHuPH20多肽的前体多肽包括信号序列。示例性前体是SEQ ID NO:3和40-46中所示的那些，其各自含有在氨基酸位置1-35处的35氨基酸信号序列。可溶性HuPH20多肽还包括在本文描述的生产和纯化方法过程中或之后降解的那些。
如本文使用的，被称为rHuPH20的重组人PH20指分泌的可溶形式的人PH20，其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组表达。可溶性rHuPH20是通过编码信号序列例如天然信号序列的核酸产生的产物，并且包括编码氨基酸36-482的核酸，并且关于其的示例性序列包括编码天然信号序列的核酸显示于SEQ ID NO:49中。还包括的是其为其等位基因变体及其他可溶性变体的DNA分子。编码可溶性rHuPH20的核酸在分泌成熟多肽的CHO细胞中表达。当在培养基中产生时，在C末端处存在异质性，从而使得产物包括种的混合物，所述种可以包括以不同丰度的SEQ ID NO.4-9中的任何一个或多个。还包括相应的等位基因变体及其他变体，包括对应于SEQ IDNO:50-51中所示的前体人PH20多肽的那些。其他变体可以与SEQ IDNO:4-9和47-48中的任何具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性，只要它们保留透明质酸酶活性并且是可溶的。
如本文使用的，制剂指含有至少一种活性药学试剂和一种或多种赋形剂的组合物。
如本文使用的，共制剂指含有两种或更多种活性药学试剂和一种或多种赋形剂的组合物。例如，速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂含有速效胰岛素、透明质酸降解酶和一种或多种赋形剂。
如本文使用的，如果与起始活性和/或纯度和/或效力或恢复相比较，组合物中的活性成分保留至少必要水平的活性和/或纯度和/或效力或恢复，则组合物被说成在限定条件下是稳定的。为了本文目的，如果组合物保留至少50%的透明质酸降解酶活性，和/或如果它保留至少90%的胰岛素效力或恢复和/或至少90%的胰岛素纯度，则它是稳定的。
如本文使用的，如果与起始活性和/或纯度和/或效力或恢复相比较，每种活性成分保留至少必要水平的活性和/或纯度和/或效力或恢复，则含有至少两种活性成分的稳定共制剂是稳定的。为了本文目的，如果共制剂保留至少50%的透明质酸降解酶活性，并且如果它保留至少90%的胰岛素效力或恢复和/或至少90%的胰岛素纯度，则它是稳定的。
如本文使用的，限定条件指贮存和/或使用条件。
如本文使用的，在其下测量稳定性的用于贮存或使用的限定条件包括温度条件、贮存条件和/或使用条件的时间。例如，限定的温度条件包括2℃-8℃的低温或冷藏温度，20℃-30℃的环境温度或32℃-40℃的高温。在另一个例子中，限定的时间条件指在不同温度条件下的贮存长度，例如贮存数天(至少3天、4天、5天、6天或7天)、数周(至少一周、至少两周、至少三周或至少四周)或数月(至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月、18个月、24个月或更多)。在进一步例子中，限定的使用条件指干扰或改变组合物混合物的条件，例如搅动条件。
如本文使用的，“贮存”意指在制备后不立即施用于对象，而是在使用前在特定条件下(例如特定温度；时间，液体或冻干形式)保存一段时间的制剂。例如，液体制剂可以在施用于对象前，在不同温度例如冷藏(0°-10℃，例如2°-8℃)、室温(例如高达32℃，例如18℃到约32℃或32℃)、或高温(例如30℃-42℃，例如32℃-37℃或35℃-37℃)下保存数天、数周、数月或数年。
如本文使用的，就与稳定性相关的条件而言的“使用”指采用制剂用于特定用途的动作。特定应用可以影响蛋白质或试剂的活性或性质。例如，某些应用可以需要对制剂实施某些温度某些时间段，实施温度中的波动或实施搅动、振荡、搅拌或可以影响活性剂的稳定性(例如活性和/或可溶性)的其他相似动作。示例性条件为持续输注法，由此活性剂经过几天的过程从用户相关的泵或输注器持续输注给对象。此类条件可以与搅动和温度中的波动相关。
如本文使用的，单一剂量制剂指用于直接施用的制剂或共制剂。一般地，单一剂量制剂是用于直接施用的含有单一剂量的治疗剂的制剂。单一剂量制剂一般不含任何防腐剂。
如本文使用的，多剂量制剂指含有多个剂量的治疗剂且可以直接施用以提供几个单一剂量的治疗剂的制剂。剂量可以经过数分钟、数小时、数周、数天或数月的过程施用。多剂量制剂可以允许剂量调整、剂量合并和/或剂量分割。因为多剂量制剂在一段时间内使用，所以它们一般含有一种或多种防腐剂，以阻止微生物生长。多剂量制剂可以配制用于注射或输注(例如持续输注)。
如本文使用的，“稳定多剂量注射共制剂”指在2℃-8℃或约2℃-8℃下稳定至少6个月和/或在20℃-30℃或约20℃-30℃下稳定至少14天的稳定共制剂，从而使得与起始活性和/或纯度和/或效力或恢复相比较，经过限定时间和温度保留必要水平的活性和/或纯度和/或效力或恢复。例如，在2℃-8℃或约2℃-8℃下至少6个月和/或在20℃-30℃或约20℃-30℃下至少14天，稳定多剂量注射制剂保留至少50%的透明质酸降解酶活性、和至少90%的胰岛素效力或恢复和/或至少90%的胰岛素纯度。
如本文使用的，“稳定持续胰岛素输注制剂”指在32℃-40℃或约32℃-40℃下稳定至少3天的稳定共制剂，从而使得与起始活性和/或纯度和/或效力或恢复相比较，经过限定时间和温度保留必要水平的活性和/或纯度和/或效力或恢复。例如，在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天，稳定持续胰岛素输注制剂保留至少50%的透明质酸降解酶活性、和至少90%的胰岛素效力或恢复和/或至少90%的胰岛素纯度。
如本文使用的，稳定剂指这样的化合物，即将其加入制剂中保护透明质酸降解酶或胰岛素或两者，例如在本文共制剂贮存或使用时的盐、pH和温度条件下不受降解。因此，包括的是阻止蛋白质由于组合物中的其他组分而降解的试剂。因此，它们是蛋白质稳定剂。示例性此类试剂是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲剂、表面活性剂、抑制剂或底物及如本文描述的其他试剂。
如本文使用的，抗微生物有效性测试证实产品中的防腐系统的有效性。产品用控制数量的特定生物体接种。测试随后比较经过28天时期，相对于测试样品，在对照样品上发现的微生物水平。如本文描述的，用于进行抗微生物有效性测试的参数是本领域技术人员已知的。
如本文使用的，防腐剂的抗微生物有效量指杀死或抑制样品中可能由贮存或使用而引入的微生物生物体繁殖的防腐剂的量。例如，对于多剂量容器，防腐剂的抗微生物有效量抑制可能由重复取出个别剂量而引入的微生物的生长。USP和EP(EPA和EPB)具有确定防腐剂有效性和在严格性方面不同的抗微生物需求。例如，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，从而使得在抗微生物防腐剂有效性测试(APET)中接种后7天时，发生细菌生物体中的至少1.0log10单位减少。在特定例子中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，从而使得在接种后7天时发生细菌生物体中的至少1.0log10单位减少，在接种后14天时发生细菌生物体的至少3.0log10单位减少，在接种后28天后至少未发生细菌生物体中的进一步增加；和在接种后7天后至少未发生真菌生物体中的进一步增加。在进一步例子中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，从而使得在接种后24小时发生细菌生物体的至少1.0log10单位减少，在接种后7天时发生细菌生物体的至少3.0log10单位减少，在接种后28天后未发生细菌生物体中的进一步增加，在接种后14天时发生真菌生物体的至少1.0log10单位减少，和在接种后28天后至少未发生真菌生物体中的进一步增加。在另外的例子中，防腐剂的抗微生物有效量是这样的量，从而使得在接种后6小时发生细菌生物体的至少2.0log10单位减少，在接种后24小时发生细菌生物体的至少3.0log10单位减少，在用微生物接种物接种组合物后28天后未发生细菌生物体的回收，在接种后7天时发生真菌生物体的至少2.0log10单位减少，和在接种后28天后至少未发生真菌生物体中的进一步增加。
如本文使用的，“赋形剂”指活性剂制剂中的化合物，当在不存在活性剂的情况下施用时，所述化合物不提供活性剂的生物学效应。示例性赋形剂包括但不限于盐、缓冲剂、稳定剂、张力调节剂、金属、聚合物、表面活性剂、防腐剂、氨基酸和糖。
如本文使用的，“缓冲剂”指尽管强酸或强碱的添加和温度、压力、体积或氧化还原电位的外部影响，仍可以保持其pH恒定的物质，一般为溶液。缓冲剂阻止另一种活性物质浓度中的变化，例如阻止氢离子浓度(pH)中的显著变化的质子供体和受体系统。所有缓冲剂的pH值都是温度和浓度依赖性的。维持pH值或范围的缓冲剂选择可以基于已知缓冲剂的已知缓冲能力由本领域技术人员凭经验决定。示例性缓冲剂包括但不限于碳酸氢盐缓冲液、二甲基胂酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。例如，Tris缓冲液(氨基丁三醇)是基于胺的缓冲液，其具有pKa8.06和有效pH范围7.9-9.2。对于Tris缓冲液，温度每降低一度pH增加约0.03单位，并且每十倍稀释度降低0.03-0.05单位。
如本文使用的，活性指与全长(完全)蛋白质相关的多肽或其部分的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于催化或酶促活性、抗原性(与多肽结合或竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、和与关于多肽的受体或配体特异性结合的能力。
如本文使用的，透明质酸酶活性指酶促催化玻尿酸切割的能力。用于透明质酸酶的美国药典(USP)XXII测定法通过测量在允许该酶在37℃下与HA反应30分钟后剩余的高分子量玻尿酸或透明质酸(HA)底物的量，间接测定透明质酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645美国药典公约，Inc，Rockville，MD)。参考标准溶液可以在测定法中用于确定以单位表示的任何透明质酸酶的相对活性。测定透明质酸酶例如可溶性rHuPH20的透明质酸酶活性的体外测定法是本领域已知且在本文中描述的。示例性测定法包括下文描述的微浊度测定法(参见例如实施例8)，其通过检测在未切割的玻尿酸与血清白蛋白结合时形成的不溶性沉淀物，间接测量通过透明质酸酶的玻尿酸切割。参考标准可以例如用于生成标准曲线，以测定以单位表示的待测试的透明质酸酶活性。
如本文使用的，就透明质酸降解酶而言的“功能上等价的量”或其语法变化，指达到与参考酶例如透明质酸酶的量(例如已知单位数目的透明质酸酶活性)相同效应的透明质酸降解酶量。例如，任何透明质酸降解酶的活性都可以与rHuPH20的活性相比较，以测定将达到与已知量的rHuPH20相同效应的功能上等价的透明质酸降解酶量。例如，透明质酸降解酶充当铺展剂或扩散剂的能力可以通过将其与锥虫蓝一起注射到小鼠的侧面皮肤内进行评估(参见例如美国专利公开号20050260186)，并且可以测定达到与例如100单位的透明质酸降解酶参考标准相同量的扩散所需的透明质酸降解酶量。因此，所需的透明质酸降解酶量在功能上等于100单位。在另一个例子中，例如下文实施例1中所述的，透明质酸降解酶增加共施用的胰岛素的吸收水平和速率的能力可以在人对象中进行评估，并且可以测定达到与例如施用rHuPH20数量相同的胰岛素吸收水平和速率中的增加所需的透明质酸降解酶量(例如通过评估血液中的最大胰岛素浓度(Cmax)、达到血液中的最大胰岛素浓度所需的时间(tmax)和经过给定时间段的累积全身胰岛素暴露(AUC)。
如本文使用的，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当提及例如由可检测标记例如荧光或放射性标记任选标记的探针或引物时，考虑单链分子。此类分子一般具有这样的长度，从而使得它们的靶是统计上独特的或具有低拷贝数(一般小于5，一般小于3)用于探测或引发文库。一般地，探针或引物含有与目的基因互补或等同的至少14、16或30个邻接核苷酸的序列。探针和引物可以长10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文使用的，肽指长度大于或等于两个氨基酸，并且长度小于或等于40个氨基酸的多肽。
如本文使用的，在本文提供的多种氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写进行鉴定(表1)。在多种核酸片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名进行指定。
如本文使用的，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两个或更多个氨基酸。为了本文目的，氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即，其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
如本文使用的，“氨基酸残基”指多肽在其肽键处的化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文描述的氨基酸残基假定为“L”异构形式。如此指定的以“D”异构形式的残基可以置换任何L-氨基酸残基，只要所需功能性质由多肽保留。NH2指在多肽的氨基末端处存在的游离氨基。COOH指在多肽的羧基末端处存在的游离羧基。与J.Biol.Chem.，243：3557-3559(1968)中所述且采用37C.F.R.§§1.821-1.822的标准多肽命名法一致，关于氨基酸残基的缩写显示于表1中：
表1–对应表
本文通过式表示的所有氨基酸残基序列具有以氨基末端到羧基末端的常规方向的左到右定向。此外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表1)中列出的氨基酸以及经修饰的和罕见的氨基酸，例如37C.F.R.§§1.821-1.822中提及且引入本文作为参考的那些。此外，在氨基酸残基序列开始或结束时的破折号指示与一个或多个氨基酸残基的进一步序列、氨基末端基团例如NH2或羧基末端基团例如COOH的肽键。
如本文使用的，“天然存在的氨基酸”指在多肽中出现的20种L-氨基酸。
如本文使用的，“非天然氨基酸”指这样的有机化合物，其具有类似于天然氨基酸的结构，但已在结构上进行修饰，以模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然存在的氨基酸因此包括例如除了20种天然存在的氨基酸外的氨基酸或氨基酸类似物，并且包括但不限于氨基酸的D-立体异构体(isostereomers)。示例性非天然氨基酸在本文中描述且是本领域技术人员已知的。
如本文使用的，DNA构建体是单链或双链、线性或环状DNA分子，其含有以在自然界中未发现的方式组合且并列的DNA区段。DNA构建体由于人为操作而出现，并且包括操作分子的克隆及其他拷贝。
如本文使用的，DNA区段是具有指定属性的更大DNA分子的部分。例如，编码指定多肽的DNA区段是更长DNA分子例如质粒或质粒片段的部分，当从5'到3'方向阅读时，其编码指定多肽的氨基酸序列。
如本文使用的，术语多核苷酸意指从5'到3'末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源中分离，在体外合成，或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)的方式给出。术语核苷酸用于其中上下文允许的单链和双链分子。当该术语应用于双链分子时，它用于指示总长度，并且应理解为等于术语碱基对。本领域技术人员应认识到，双链多核苷酸的两条链可以在长度中轻微不同，并且其末端可以是交错的；因此在双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以是不成对的。此类不成对末端一般不超过长度20个核苷酸。
如本文使用的，两种蛋白质或核酸之间的“相似性”指在蛋白质的氨基酸序列或核酸的核苷酸序列之间的关联性。相似性可以基于其中含有的残基序列和残基的同一性和/或同源性程度。用于评估蛋白质或核酸之间的相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，在评估序列相似性的一种方法中，两个氨基酸或核苷酸序列以获得序列间的最大同一性水平的方式进行比对。
如本文使用的，“同一性”指氨基酸或核苷酸序列对于其不变的程度。氨基酸序列和一定程度的核苷酸序列的比对还可以考虑氨基酸(或核苷酸)中的保守差异和/或频繁置换。保守差异是保存所涉及残基的理化性质的那些。比对可以是总体的(在序列整个长度上且包括所有残基的比较序列的比对)或局部的(仅包括最相似的一个或多个区域的序列部分的比对)。“同一性”本身具有领域公认的含义，并且可以使用公开技术进行计算。(参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在测量两种多核苷酸或多肽之间的同一性的许多方法，但术语“同一性”是技术人员众所周知的(Carrillo，H.&Lipton，D.，SIAM J Applied Math48:1073(1988))。
如本文使用的，同源的(就核酸和/或氨基酸序列而言)意指约大于或等于25%序列同源性，一般大于或等于25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列同源性；如果需要，则可以指定精确百分比。为了本文目的，除非另有说明，否则术语“同源性”和“同一性”通常可互换使用。一般而言，对于同源性或同一性百分比的测定，序列如此比对，从而使得获得最高级别的匹配(参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编辑，Academic Press，NewYork，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。通过序列同源性，通过标准比对算法程序测定保守氨基酸数目，并且可以与由每个供应商确定的缺省缺口罚分一起使用。基本上同源的核酸分子一般在目的核酸长度自始至终以中等严格性或高严格性杂交。还考虑的是含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。
任何两个分子是否具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“等同”或“同源”的核苷酸序列或氨基酸序列，可以使用已知计算机算法例如“FASTA”程序进行测定，使用例如如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444中的缺省参数(其他程序包括GCG程序包(Devereux，J.,等人，Nucleic Acids Research12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul，S.F.,等人，J Molec Biol215:403(1990))；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，编辑，AcademicPress，San Diego，1994和Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。例如，美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)数据库的BLAST函数可以用于测定同一性。其他商购可得或可公开获得的程序包括DNAStar"MegAlign"程序(Madison，WI)和University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)"Gap"程序(MadisonWI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或同一性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序比较序列信息进行测定(例如Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443，如由Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482修改的)。简言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)数目除以两个序列中较短的中的总符号数目。GAP程序的缺省参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有值1用于同一性和0用于非同一性)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如由Schwartz和Dayhoff，编辑，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，NationalBiomedical Research Foundation，第353-358页(1979)描述的；(2)关于每个缺口的罚分3.0和关于每个缺口中的每个符号的另外0.10罚分；和(3)对于末端缺口无罚分。
因此，如本文使用的，术语“同一性”或“同源性”表示测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。如本文使用的，术语至少“90%等同于”指相对于参考核酸或多肽的氨基酸序列，90-100%的同一性百分比。以90%或更多水平的同一性指示下述事实：为了例证目的假定比较100个氨基酸的测试和参考多肽长度。测试多肽中的不超过10%(即，100个中的10个)氨基酸不同于参考多肽的那种。相似比较可以在测试和参考多核苷酸之间作出。此类差异可以表示为在多肽整个长度上随机分布的点突变，或它们可以在不同长度的一个或多个位置上中聚类一直到可允许的最大值，例如10/100个氨基酸差异(约90%同一性)。差异定义为核酸或氨基酸置换、插入或缺失。在超过约85-90%的同源性或同一性水平上，结果应不依赖于程度和缺口参数设置；此类高水平的同一性可以通常通过手动比对而不依赖软件容易地进行评估。
如本文使用的，比对的序列指使用同源性(相似性和/或同一性)以比对核苷酸或氨基酸序列中的相应位置。一般地，比对通过50%或更多同一性相关的两个或更多个序列。比对的序列组指在相应位置处比对的2个或更多个序列，并且可以包括衍生自RNA的比对序列，例如EST和与基因组DNA序列比对的其他cDNA。
如本文使用的，基本上等同于产物意指足够相似的，从而使得目的性是足够未改变的，从而使得基本上等同的产物可以代替产物使用。
如本文使用的，还应当理解术语“基本上等同的”或“相似的”随着上下文而改变，如相关领域技术人员理解的。
如本文使用的，等位基因变体或等位基因变异提及占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种交替形式中的任何。等位基因变异通过突变天然出现，并且可以导致在群体内的表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在本文中用于指示由基因的等位基因变体编码的蛋白质。一般地，参考形式的基因编码来自物种的群体或单个参考成员的野生型和/或主要形式的多肽。一般地，包括物种间和物种中的变体的等位基因变体一般与来自相同物种的野生型和/或主要形式具有至少80%、90%或更多的氨基酸同一性；同一性程度取决于基因和比较是种间还是种内的。一般地，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式具有至少约80%、85%、90%或95%或更大的同一性，包括与野生型和/或主要形式的多肽96%、97%、98%、99%或更大的同一性。本文提及等位基因变体指在相同物种的成员中的蛋白质中的变异。
如本文使用的，在本文中可与“等位基因变体”互换使用的“等位基因”指基因或其部分的交替形式。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。当对象具有基因的两个等同的等位基因时，对象被说成对于该基因或等位基因是同源的。当对象具有基因的两个不同的等位基因时，对象被说成对于该基因是异源的。特定基因的等位基因可以在单个核苷酸或几个核苷酸中彼此不同，并且可以包括核苷酸的修饰例如置换、缺失和插入。基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。
如本文使用的，物种变体指在不同物种中的多肽中的变体，所述不同物种包括不同哺乳动物物种例如小鼠和人。
如本文使用的，修饰提及多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，并且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和替换。修饰多肽的方法对于本领域技术人员是常规的，例如通过使用重组DNA方法。
如本文使用的，分离或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分基本上不含来自蛋白质衍生自其的细胞或组织的细胞材料或其他污染蛋白质，或当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学制品。制剂可以测定为基本上不含，如果它们看起来不含可容易检测的杂质，如通过由本领域技术人员用于评估此类纯度的标准分析方法测定的，所述标准分析方法例如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)，或足够纯的，从而使得进一步的纯化将不可检测地改变物质的物理和化学性质，例如酶促和生物学活性。用于化合物纯化以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在此类情况下，进一步的纯化可能增加化合物的比活性。
术语基本上不含细胞材料包括其中蛋白质与它由其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。在一个实施方案中，术语基本上不含细胞材料包括这样的酶蛋白质制剂，其具有小于约30%(按干重计)非酶蛋白质(在本文中也称为污染蛋白质)、一般小于约20%非酶蛋白质或10%非酶蛋白质或小于约5%非酶蛋白质。当酶蛋白质重组产生时，它还基本上不含培养基，即培养基代表小于约或以20%、10%或5%的酶蛋白质制剂体积。
如本文使用的，术语基本上不含化学前体或其他化学制品包括这样的酶蛋白质制剂，其中蛋白质与涉及蛋白质合成的化学前体或其他化学制品分离。该术语包括小于约30%(按干重计)、20%、10%、5%或更少的化学前体或非酶化学制品或组分的酶蛋白质制剂。
如本文使用的，就例如合成核酸分子或合成基因或合成肽而言的合成指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文使用的，通过经由使用重组DNA法的重组方法产生意指使用众所周知的分子生物学方法用于表达由克隆DNA编码的蛋白质。
如本文使用的，载体(或质粒)指用于将异源核酸引入细胞内用于其表达或复制的不连续元件。载体一般保持游离，但可以设计为实现基因或其部分整合到基因组的染色体内。还考虑的是其为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。此类媒介物的选择和使用是本领域技术人员众所周知的。
如本文使用的，表达载体包括能够表达与调节序列例如启动子区可操作地连接的DNA的载体，所述调节序列能够实现此类DNA片段的表达。此类另外的区段可以包括启动子和终止子序列，并且任选可以包括一个或多个复制起点、一种或多种可选标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般衍生自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入合适的宿主细胞内之后，导致克隆DNA的表达。合适的表达载体是本领域技术人员众所周知的，并且包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些，和保持游离的那些或整合到宿主细胞基因组内的那些。
如本文使用的，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是经改造的病毒，其与外源基因可操作地连接，以将外源基因(如媒介物或穿梭物)转移到细胞内。
如本文使用的，当提及DNA区段时，可操作地连接意指区段如此排列，从而使得它们为了其预期目的协同作用，例如启动子下游和任何转录序列的上游的转录起始。启动子通常为转录机制与之结合以起始转录且通过编码区段进行到终止子的结构域。
如本文使用的，术语评估预期包括以获得关于样品中存在的蛋白酶或其结构域活性的绝对值，以及获得指示活性水平的指数、比例、百分比、视觉或其他值的含义的定量和定性测定。评估可以是直接或间接的，并且实际检测的化学种类当然无需是蛋白酶解产物自身，还可以例如是其衍生物或一些进一步的物质。例如，通过SDS-PAGE和使用考马斯蓝的蛋白质染色检测补体蛋白质的切割产物。
如本文使用的，生物学活性指在化合物、组合物或其他混合物体内施用后产生的化合物的体内活性或生理学应答。因此，生物学活性包含此类化合物、组合物和混合物的疗效和药学活性。生物学活性可以在设计为测试或使用此类活性的体外系统中观察到。因此，为了本文目的，蛋白酶的生物学活性是其中水解多肽的其催化活性。
如本文使用的，当提及两个核酸序列时，等价意指所讨论的两个序列编码相同氨基酸序列或等价蛋白质。当等价在提及两种蛋白质或肽中使用时，它意指两种蛋白质或肽具有基本上相同的氨基酸序列，仅具有基本上不改变蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸置换。当等价指性质时，该性质无需存在至相同程度(例如，两种肽可以显示出相同类型的酶促活性的不同比率)，但活性通常基本上是相同的。
如本文使用的，组合物指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文使用的，组合指两个或更多个项目之间或之中的任何结合。组合可以是两个或更多个分离项目，例如两种组合物或两个集合，可以是其混合物，例如两个或更多个项目的单一混合物，或其任何变化。组合的元件一般是功能上结合或相关的。
如本文使用的，“疾病或病症”指生物体中起因于病因或状况的病理状况，包括但不限于感染、获得状况、遗传状况，并且特征在于可鉴定的症状。本文感兴趣的疾病和病症包括糖尿病。
如本文使用的，“治疗”具有疾病或状况的对象意指对象的症状是部分或完全缓和的，或在治疗后保持静止。因此，治疗包含预防、治疗和/或治愈。预防指潜在疾病的阻止和/或疾病症状的恶化或进展的阻止。治疗还包含本文提供的胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂的任何药学用途。
如本文使用的，药学有效试剂包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉药、血管收缩剂、分散剂、常规治疗性药物包括小分子药物和治疗蛋白质。
如本文使用的，治疗意指其中状况、病症或疾病或其他适应症的症状得到改善或另外有利地改变的任何方式。
如本文使用的，疗效意指起因于对象治疗的效应，其改变、一般改善或改进疾病或状况的症状或者治愈疾病或状况。治疗有效量指在施用于对象后，导致疗效的组合物、分子或化合物的量。
如本文使用的，术语“对象”指动物，包括哺乳动物，例如人类。
如本文使用的，患者指显示出疾病或病症症状的人对象。
如本文使用的，特定疾病或病症的症状通过治疗例如通过施用药物组合物或其他治疗学的改善，指症状的任何减轻，无论是永久的还是暂时的、持久的还是瞬时的，其可以归于组合物或治疗剂的施用或者与组合物或治疗剂的施用相关。
如本文使用的，阻止或预防指其中发展疾病或状况的危险减少的方法。
如本文使用的，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指至少足以产生疗效的试剂、化合物、材料或含有化合物的组合物的数量。因此，它是阻止、治愈、改善、抑制或部分抑制疾病或病症症状所需的数量。
如本文使用的，治疗有效的胰岛素剂量是达到血糖控制所需或足够的胰岛素量。这个量可以凭经验确定，例如通过葡萄糖或用餐激发。本文提供的组合物含有治疗有效量或浓度的胰岛素，从而使得施用治疗有效剂量。
如本文使用的，单位剂型指如本领域已知的，适合于人和动物对象且个别包装的物理上不连续的单位。
如本文使用的，单一剂量制剂指用于直接施用的制剂。
如本文使用的，“制造物品”是制造且销售的产品。如本申请自始至终使用的，该术语意欲包含在相同或分开的包装物品中含有的速效胰岛素组合物和透明质酸降解酶组合物。
如本文使用的，流体指可以流动的任何组合物。流体因此包含以半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳膏及其他此类组合物形式的组合物。
如本文使用的，“试剂盒”指本文提供的组合物和用于下述目的的另一个项目的组合：包括但不限于重构、活化、用于递送的器械/设备、施用、诊断和生物学活性或性质的评估。试剂盒任选包括使用说明书。
如本文使用的，动物包括任何动物例如但不限于灵长类动物包括人、大猩猩和猴；啮齿类动物例如小鼠和大鼠；家禽例如鸡；反刍动物例如山羊、牛、鹿、绵羊；猪及其他动物。非人动物排除人作为考虑的动物。本文提供的酶来自任何来源，动物、植物、原核和真菌。大多数酶具有动物起源，包括哺乳动物起源。
如本文使用的，对照指基本上等同于测试样品的样品，除了它不用测试参数进行处理外，或如果它是血浆样品，则它可以来自未受目的状况影响的正常志愿者。对照还可以是内部对照。
如本文使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考。因此，例如，提及包含“细胞外结构域”的化合物包括具有一个或多个细胞外结构域的化合物。
如本文使用的，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约还包括确切量。因此，“约5个碱基”意指“约5个碱基”以及“5个碱基”。
如本文使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形的确发生或不发生，并且该描述包括其中所述事件或情形发生的情况和其中它不发生的情况。例如，任选取代的基团意指基团是未被取代的或被取代的。
如本文使用的，除非另有说明，否则关于任何保护基、氨基酸及其他化合物的缩写依照其常见用法、公认缩写、或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission on Biochemical Nomenclature)(参见(1972)Biochemistry11:1726)。
B.胰岛素疗法
加速用于多剂量注射(MDI)和持续皮下胰岛素输注(CSII)施用的膳食胰岛素产品的吸收和作用是期望的，以便更近似地模拟非糖尿病对象的内源(即天然)餐后胰岛素释放。已显示与当通过皮下输注或泵输注施用时的单独胰岛素相比较，共配制或共混合速效胰岛素(例如胰岛素类似物)与透明质酸降解酶例如PH20作用于加速吸收和作用，并且从而导致血糖控制中的改善(参见例如，美国专利公开号US20090304665)。
此外，也已知胰岛素的持续皮下输注(CSII)是加速在CSII输注装置的通常使用期(3-4)天内的胰岛素暴露和/或作用的机制(参见例如Swan等人(2009)Diabetes Care，32:240-244；Liu等人Diabetes Res.and Clin.Prac.(1991)12:19-24；Olsson等人Diabetic Medicine(1993)10:477-80；和Clausen等人Diabetes Tech Therapeutics(2009)11:575-580)。然而，先前研究已证实随着胰岛素输注装置老化，在快速作用的类似物胰岛素的暴露和作用中的不一致性(Swan等人(2009)Diabetes Care，32:240-244；Clausen等人Diabetes Tech Therapeutics(2009)11:575-580)。虽然更快进/更快出吸收在输注装置寿命晚期出现，但胰岛素吸收是不一致的，因为在输注装置寿命早期，观察到的胰岛素吸收比在输注装置寿命晚期中出现的少得多。这导致在CSII疗法后胰岛素暴露中的可变性，因为胰岛素吸收仅在输注装置寿命晚期增加或加速。例如，到最大胰岛素浓度的时间已观察到经过4天的输注装置寿命从55±3变化为45±4分钟(p=.019)。相应地，跨越输注装置寿命，胰岛素作用的开始改变25%，并且胰岛素吸收持续时间改变40分钟。
胰岛素暴露和作用中的这个可变性程度在糖尿病控制中是有意义的混杂因素。事实上，通过持续葡萄糖监测估计的经过输注装置使用的葡萄糖控制单臂研究已显示血糖控制中的急剧减退，在输注装置使用5天后具有从122.7mg/dL升高到163.9mg/dL(p<.05)的平均每日葡萄糖水平(Thethi等人(2010)J.Diab.and its Complications，24，73-78)。与平均每日葡萄糖中的升高一致，以180mg/dL过量的值百分比从14.5%升高到38.3%(p<.05)。此外，在本文中发现通过CSII的单独胰岛素递送还降低在输注装置寿命内时间的总胰岛素作用。这个现象的效应是在胰岛素暴露概况中对患者的可变性。
本文提供的是持续皮下胰岛素输注(CSII)给药方案法，以使跨越输注装置寿命(即，经过输注时间)的胰岛素加速效应降到最低，以便经过输注装置使用的持续时间一致地递送超速效胰岛素暴露和作用概况。在本文中发现当与透明质酸降解酶(例如PH20)共配制的胰岛素通过CSII输注时，CSII输注加速现象减少，但未消除，而总胰岛素作用的丧失增加(参见例如实施例2)。为了抵消总胰岛素作用的丧失，同时利用PH20对胰岛素暴露和/或作用的更一致效应，本文提供的是由此胰岛素施用随着输注装置寿命中的时间全身增加的方法，从而改善通过输注泵疗法包括通过开环和闭环系统在一段时间内的葡萄糖控制。
本文还提供的是控制胰岛素暴露和/或作用的方法，由此在CSII疗法中用胰岛素输注前的前沿给药方案中，在输注装置使用起始时施用透明质酸降解酶。在输注前透明质酸降解酶的预施用效应是在输注装置寿命内的时间发生的胰岛素暴露的可变性中的减少。如本文其他地方讨论的，认为在输注起始时，透明质酸充当凝聚(bulk)流体流动的障碍，从而限制胰岛素的吸收。随着输注装置老化，机体经过输注装置使用的过程天然恢复透明质酸障碍，以凝聚流体流动。通过在用胰岛素输注起始前施用透明质酸降解酶，凝聚流体流动的起始障碍得到减少。因此，在本文提供的方法中，透明质酸降解酶(例如PH20)可以减少在输注装置寿命内的胰岛素暴露和/或作用的加速，并且提供超速效胰岛素的更一致递送，其模拟非糖尿病对象的内源餐后胰岛素释放。
1.胰岛素、糖尿病和现有速效胰岛素疗法
胰岛素是由胰腺分泌的天然存在的多肽激素。胰岛素是机体细胞有效吸收且使用来自血液的葡萄糖所需的。葡萄糖是执行细胞功能的主要的能量底物。除了是碳水化合物稳态的主要调节剂外，胰岛素还对脂肪代谢有作用。它可以尤其改变肝和脂肪组织释放脂肪贮存的能力。胰岛素具有遍及全身的多种药效效应，包括但不限于脂质合成增加、脂质分解减少、蛋白质合成增加、调节葡萄糖代谢中的关键酶和过程(包括葡萄糖摄取刺激、葡萄糖氧化刺激、增加的糖原合成和减少的糖原分解)。
尽管胰岛素是基础分泌的，通常在0.5-1.0单位/小时的范围内，但它的水平在用餐后增加。在用餐后，胰腺响应葡萄糖升高而分泌一团胰岛素。胰岛素刺激葡萄糖摄取到细胞内，并且给肝发信号以减少葡萄糖生产；这导致血液葡萄糖回到正常水平。在正常成人中，存在响应用餐的胰岛素释放的两个时期。早期是在进食2-15分钟内发生的胰岛素释放波峰。晚期释放延长约2小时。早期负责关闭肝葡萄糖生产，从而减少血液葡萄糖水平且使周围组织致敏或发信号，以增加葡萄糖摄取。在肌肉中，大量葡萄糖作为糖原贮存。一些糖原分解成乳酸盐，其循环至肝并且可以转换回葡萄糖且作为糖原贮存。在两餐之间，肝分解这些糖原贮存以给脑及其他组织提供葡萄糖。
由于胰腺不能产生足够量的胰岛素或胰腺产生足够量的胰岛素的能力减少，或由于细胞不能合成和/或释放所需胰岛素或细胞合成和/或释放所需胰岛素的能力减少，糖尿病导致慢性高血糖。在糖尿病患者中，上述第一期应答的有效性降低或不存在，导致升高的餐后葡萄糖水平。例如，在第一个餐后四小时(即进食后的前四小时)过程中的血液葡萄糖曲线下面积(AUC)在糖尿病患者中是非糖尿病患者中的2.5-3.0倍。餐后葡萄糖波动促成总体高血糖和升高的HbA1c水平，并且这些波动是在2型糖尿病早期中可见的HbA1c升高的主要贡献者。
当胰腺产生不足够量的胰岛素，或不能使用它产生的胰岛素以维持足够的血糖控制时，许多糖尿病患者需要用胰岛素治疗。胰岛素已作为治疗剂施用，以治疗具有糖尿病的患者，包括例如1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，以便模拟在正常个体中发生的内源胰岛素应答。胰岛素还已施用于具有高血糖的危重患者，以控制血液葡萄糖水平。
胰岛素替代疗法涉及基础和推注胰岛素替代。基础胰岛素替代或本底胰岛素用于控制禁食例如过夜或在两餐之间时的血糖，并且通常以恒定的每天剂量施用。推注胰岛素替代负责碳水化合物即食物摄取以及高血糖校正，也称为胰岛素敏感因子。用于食物覆盖的推注剂量规定为胰岛素与碳水化合物比或碳水化合物覆盖比。胰岛素与碳水化合物比代表多少克碳水化合物被1单位的胰岛素覆盖或处置。一般地，一单位的快速作用胰岛素将处置12-15克碳水化合物。这个范围可以从4-30克或更多碳水化合物不等，取决于个体对胰岛素的敏感性。胰岛素敏感性可以根据每天的时间从人到人不等，并且受体力活动和压力影响。用于高血糖校正的推注剂量定义为多少个一单位的快速作用胰岛素将下降血糖。一般地，为了校正高血糖，需要一单位胰岛素以使血液葡萄糖下降50mg/dl。这个血糖下降范围可为15-100mg/dl或更多，取决于个体胰岛素敏感性及其他情形。由于更大的胰岛素抗性和缺乏，超重患者需要更高剂量的胰岛素。如果患者服用可以影响碳水化合物代谢或响应胰岛素的药物，则也可能需要剂量调整。肝或肾脏病也可以影响胰岛素的药物代谢动力学。此外，锻炼、疾病、压力、异常进食模式、酒精和旅行也可以使剂量调整成为必要。
用于估计胰岛素剂量的算法不同，并且是本领域技术人员已知的(参见例如Hirsch等人，(2005)Clinical Diabetes23:78-86；Global Guideline for Type2Diabetes，Chapter10：Glucose control：insulin therapy，International DiabetesFederation,(2005)第39-42页；Zisser等人，(2009)J Diabetes Sci Technol3(3):487-491)。起始方案主要由如通过血液葡萄糖监测和A1C值测量的高血糖程度决定。体重也用于计算合适的起始胰岛素剂量。血液葡萄糖监测是估计给药方案必需的。一般地，测量且记录至少一个空腹和一个餐后血液葡萄糖值。血液葡萄糖测试的频率和时机主要取决于胰岛素方案。使用每日多次注射(MDI)疗法的那些通常需要在每餐前、偶然在餐后2小时和在每天睡觉时检查血液葡萄糖水平。手指针刺(Finger sticks)可以在一餐前和后完成，以测定每餐胰岛素剂量的影响，并且可以相应作出调整。选择的一餐应这样改变，从而使得在评估期结束时，每餐研究至少一次。测试过夜和第二天早晨提供关于基础胰岛素影响的信息。
为了计算基础胰岛素剂量或本底胰岛素剂量，必须首先估计或计算每日胰岛素总剂量。每日胰岛素总需求(以单位表示)一般定义为以磅表示的患者重量除以4，或可替代地，以千克表示的患者重量乘以0.55。例如，如果患者重量160磅，则每日胰岛素总需求将为40单位胰岛素/天(160÷4)。具有胰岛素敏感性的患者可能需要更高的每日胰岛素总剂量，或可替代地，对胰岛素敏感的患者可能需要更低的每日胰岛素总剂量。基础胰岛素剂量随后基于每日胰岛素总剂量(TDI)进行计算。基础胰岛素剂量是每日胰岛素总剂量的大约40-50%。因此，对于具有超过40单位TDI的患者，基础或本底胰岛素剂量是20单位。
碳水化合物覆盖比或由一单位胰岛素覆盖的碳水化合物克数通过式500÷每日胰岛素总剂量进行计算。因此，如果你的TDI为40单位，则你的碳水化合物覆盖比为12g碳水化合物/单位胰岛素(等于500÷40)。高血糖校正因子或将降低血糖的1单位胰岛素的量(以mg/dl表示)通过将1800除以每日胰岛素总剂量进行计算。因此，如果你的TDI为40单位，则你的校正因子为45mg/dl(等于1800÷40)。
为了计算关于碳水化合物或食物摄取的推注胰岛素剂量，将一餐中的碳水化合物总克数除以由1单位胰岛素处置的碳水化合物克数，即上文描述的碳水化合物覆盖比。例如1单位快速作用类似物可以对于每10-15克消费的碳水化合物给予。因此，含有90克碳水化合物的一餐将需要6单位胰岛素的推注剂量(1:15比)。为了计算用于高血糖校正的推注胰岛素剂量，考虑实际血糖和靶血糖之间的差异(即实际血糖减去靶血糖)且除以校正因子。一般而言，1单位胰岛素将使你的血糖下降50点(mg/dl)，并且因此高血糖校正因子是50。因此，如果患者测量的血液葡萄糖水平为220mg/dl并且他的餐前血糖靶标为120mg/dl，则高血糖校正所需的剂量为(220-120mg/dl)÷50，导致2单位胰岛素的剂量。一般地，使用MDI或胰岛素泵的患者可以基于估计的一餐碳水化合物含量以及血液葡萄糖读数来调整进餐试剂胰岛素剂量。例如，假定患者将要进食估计为含有90克碳水化合物的一餐，并且患者的每餐血液葡萄糖靶标为100mg/dL，但测量的血液葡萄糖水平为200mg/d，可以确定推注胰岛素剂量。因此，使用1:15的胰岛素:碳水化合物比，患者将服用6单位的门冬胰岛素以覆盖90克碳水化合物(90克碳水化合物/15)，加上另外2单位的门冬胰岛素以校正超过靶葡萄糖水平的100mg/dL。他的推注胰岛素总剂量将为8单位。
取决于患者需要，使用不同胰岛素来源。商业胰岛素制剂可以取决于其活性持续时间进行分类(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistryand Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus(第481-500页)McGraw-Hill Professional)。例如，胰岛素在速效制剂以及中效或长效制剂中提供，后面两个分类在本文中被称为基础作用的胰岛素。速效形式具有快速开始，一般在2-3小时或更少和不超过四小时内显示出峰胰岛素水平。因此，速效形式的胰岛素用于膳食葡萄糖调节中。其他形式的胰岛素包括在皮下施用后约4-12小时达到峰胰岛素浓度的中效胰岛素，和达到相对适度的峰且具有20-30小时的最大作用持续时间的长效胰岛素。中效和长效形式通常由无定形和/或结晶胰岛素制剂组成，并且主要用于基础疗法中。
速效胰岛素组合物的膳食施用目标为在进餐时间之前、过程中或之后不久，通过速效胰岛素的肠胃外施用获得在一段时间内稳定的血液葡萄糖水平。以这种方式，胰岛素的血液水平暂时升高，以(a)关闭肝葡萄糖生产和(b)增加葡萄糖摄取；因此在与一餐消化相关的血液葡萄糖升高过程中维持血糖控制。
重组人胰岛素(也称为普通胰岛素；例如
Figure BDA0000465955830000441
R胰岛素)用于在进餐时间前通过注射自施用。不幸的是，重组人胰岛素必须在进餐时间前大约一个半小时或更久通过注射给药，以便确保血液葡萄糖升高不由于没有遭到外源胰岛素水平反对而发生。关于重组人胰岛素缓慢吸收的原因之一是因为胰岛素在体内和体外在锌离子的存在下形成六聚复合物。此类六聚含锌复合物比缺乏锌的单体胰岛素更稳定。在注射后，在这些胰岛素六聚体可以通过毛细血管床吸收且经过大循环之前，它们必须解离成更小的二聚体或单体。六聚体解离为二聚体和单体是浓度依赖性的，仅在胰岛素从注射部位扩散时的较低浓度发生。因此，局部胰岛素储存在注射部位处出现，提供在注射部位处起始高浓度的六聚胰岛素，其直到胰岛素浓度下降时才能被吸收(Soeborg等人，(2009)Eur.J.Pharm.Sci.36:78-90)。随着胰岛素从注射部位缓慢扩散，胰岛素浓度随着与注射部位的距离增加而降低，导致六聚体的解离以及胰岛素单体和二聚体的吸收。因此，尽管六聚胰岛素复合物的分散在体内天然发生，但它可以花费一些时间发生，延迟胰岛素的全身可用性。进一步地，由于这个浓度依赖性吸收，更高的胰岛素浓度和更高的剂量更缓慢地吸收(Soeborg等人，(2009)Eur.J.Pharm.Sci.36:78-90)。
因为以单体形式的胰岛素更快速地吸收，虽然以六聚状态的胰岛素更稳定，但速效类似物(也称为快速作用的)形式的胰岛素已得到开发，其在施用后显示出从六聚体到单体的更快速解离。此类胰岛素是例如通过氨基酸变化进行修饰的，以增加解离速率，从而在注射后赋予更快速的药效活性。如部分D中所述，速效类似物形式的胰岛素包括但不限于谷赖胰岛素、门冬胰岛素和赖脯胰岛素。
速效形式的胰岛素包括速效类似物具有吸收和作用中的延迟，并且因此不接近具有在进食后约10分钟发生的早期的内源胰岛素。因此，此类制剂不足够快速起作用，以关闭在这个胰岛素释放的第一个时期后不久发生的肝葡萄糖生产。为此，即使速效胰岛素类似物制剂也必须在用餐前给予，以便达到所需血糖控制的任何机会。尽管估计在15分钟内的进食时间比在普通胰岛素所需的30-60分钟内更容易，但存在患者可能进食太早或太晚而不能提供最佳血液葡萄糖控制的危险。
进一步地，用任何胰岛素疗法包括速效胰岛素疗法治疗的主要副作用之一是低血糖。低血糖定义为低血液葡萄糖，并且与多种病态相关，所述病态范围可以从饥饿到麻烦的症状例如颤栗、出汗、意识模糊或一直到抽搐、昏迷和死亡。低血糖可以由于下述而发生：未能充分进食、跳过一餐、比平常锻炼更多或服用太多胰岛素或使用具有不适当长的暴露和作用持续时间的膳食胰岛素制剂。例如，因为许多速效胰岛素疗法必须在用餐前给予，所以存在患者可能放弃或跳过该餐的危险，导致低血糖。另外，在速效胰岛素施用后，血清胰岛素水平和胰岛素作用(例如作为葡萄糖输注率(GIR)测量的)一般在膳食葡萄糖负荷已缓和时保持升高，威胁低血糖。通过增加胰岛素剂量更好地控制峰葡萄糖负荷的尝试进一步增加这个危险。此外，因为餐后低血糖是胰岛素疗法的常见结果，所以它通常促使患者在两餐之间进食零食或使患者必须在两餐之间进食零食。这促成通常与胰岛素疗法相关的重量增长和肥胖。
与透明质酸降解酶(例如PH20例如rHuPH20)共施用的胰岛素的先前研究已证实，更好地复制在健康个体中对用餐的天然胰岛素应答的胰岛素药物代谢动力学(参见例如美国专利公开号US20090304665；Vaughn等人(2009)Diabetes Technol.Ther.，11:345-52；Muchmore和Vaughn(2010)J.Diabetes Sci.Technol.，1:419-428)。特别地，胰岛素与PH20的共施用加速胰岛素作用的开始(早期t50%max)、峰胰岛素浓度的时间(tmax)和胰岛素作用的抵消(晚期t50%max)。PH20共施用还增加峰胰岛素浓度，增加早期胰岛素暴露，且减少晚期餐后胰岛素暴露。在健康志愿者中，这个胰岛素暴露的加速导致加速的葡萄糖代谢，如通过在正常血糖钳夹过程中的葡萄糖输注率测量的。在具有I型和2型糖尿病的对象中，胰岛素暴露的加速已显示减少餐后高血糖，如通过响应标准化液体测试餐发生的峰血液葡萄糖，餐后两小时葡萄糖和葡萄糖波动总面积>150mg/d测量的。
2.持续皮下输注(CSII)
持续皮下胰岛素输注(CSII)经过过去三十年已在临床上用于治疗糖尿病，并且使用CSII用于输出控制组分的闭环“人工胰腺”系统处于开发中。CSII允许不能通过皮下注射达到的胰岛素疗法的管理控制。例如，胰岛素泵可以负责伴随软件中的残留胰岛素作用，以阻止与经过短时期给予的多重推注剂量相关的低血糖。
CSII泵疗法与随着输注装置老化增加的葡萄糖可变性相关，这可以成为管理中的问题(Swan等人(2009)Diabetes Care，32:240-244)。例如输注装置的延长使用(例如高达4天)导致标准推注剂量更早的峰作用和更短的作用持续时间，这对于不同速效胰岛素类似物是相似的。这个效应可以促成糖尿病患者中的每天可变性和血浆葡萄糖不利条件。
这个效应已在几个研究中观察到。
例如，通过Liu等人(Diabetes Res.and Clin.Prac.(1991)12:19-24)的论文证实在胰岛素输注装置使用的第1天和第4天之间发生的胰岛素暴露的加速，而无总胰岛素暴露中的任何变化。值得注意的是，在第1天时执行的测试在更换输注装置后立即(在10分钟内)进行。与第1天相比较，胰岛素暴露时机中的变化与在第4天时推注剂量(1单位/10kg体重)递送后血液葡萄糖水平中的更快速和更大的下降相关。结论是胰岛素吸收率随着输注装置老化而增加，并且吸收中的变化与更快速的胰岛素作用相关，如通过胰岛素推注施用和后续用餐后的血液葡萄糖下降评估的。
相似研究由Olsson等人(Diabetic Medicine(1993)10:477-80)报告，并且当比较在输注装置使用第1、3和5天执行的研究时，未能显示胰岛素暴露的时机中的任何有意义的差异。如在通过Liu等人的研究中，总胰岛素暴露跨越研究日是可比较的。值得注意的是，在这个研究中，在第1天时的胰岛素推注在更换输注装置后约12小时施用。该作者通过跟踪在胰岛素的每天早晨推注后给予的标准餐后的血液葡萄糖水平来评估胰岛素作用，发现这是相当恒定的。在血液葡萄糖中不存在统计上的显著差异，尽管注意到存在血糖分别在第1、3和5天时更快速进行性升高的趋势，并且空腹血糖趋于在第5天时大于第1或3天时。
在通过Swan等人(Diabetes Care(2009)32:240-244)的更近期研究中，在第1天时(在输注装置更换后12小时)的胰岛素作用与第4天(在输注装置更换后84小时)相比较。胰岛素作用通过测量在一段时间内的葡萄糖输注率进行评估，所述葡萄糖输注率是在胰岛素推注剂量后维持血糖正常所需的。在这个研究中不测量胰岛素血液水平。该作者发现随着输注装置老化发生的胰岛素作用的显著加速。该作者得出结论当比较第4天与第1天时，通过在实验过程中输注的总葡萄糖测量的总胰岛素作用并无不同，尽管当比较第4天与第1天时，数据的确显示适度但不显著的胰岛素作用减少的趋势。与先前两个研究形成对比，输注部位是臀部而不是腹部，并且对象是青少年。
由Clausen等人(Diabetes Tech Therapeutics(2009)11:575-580)报告的研究评估皮下血液流量和每天在正常男性志愿者中由CSII递送的胰岛素药物代谢动力学，共四天(第0-3天)。胰岛素推注在输注装置插入后90分钟给予；在推注递送后，对象接受盐水的持续输注直至下一个排定的推注。结果证实Liu等人的那些，在输注装置寿命内，具有胰岛素暴露的进行性加速，而无总暴露中的变化。未执行胰岛素作用评估。
这些发现一般支持在输注装置寿命内全身加速的胰岛素暴露和作用的想法。一般地，在输注或注射到皮下组织内之后，胰岛素建立储存，这最终通过细胞间隙扩散到血管床，在其中六聚体解离的单体或二聚体被吸收到血管床内。关于在输注晚期时推注剂量的更早开始和更短持续时间的原因可以是由于多种因素，例如由于血管微环境中的变化(例如由在输注部位处的炎症反应引起的)在输注部位周围增加的血液流量，由于装置中的沉淀的胰岛素丧失或输注装置由胰岛素的部分性遮闭(Swan等人(2009)DiabetesCare，32:240-244)。此外，在早期时跨越膜的胰岛素转运也可能受胰岛素储存的建立、扩散能力或血液流量限制。例如，加速可以是由于在输注开始时凝聚流体流动的透明质酸障碍。这个凝聚流体流动的障碍在晚期输注时可能不存在，或由其他因素补偿。在本文提供的方法中，在一段时间内胰岛素暴露和/或作用中的差异可以通过前沿治疗降到最低，由此透明质酸降解酶在输注装置使用起始时施用，随后为使用单独的胰岛素或胰岛素-PH20组合或共制剂的CSII。在经过输注装置使用过程的晚期时，机体天然恢复透明质酸障碍以凝聚流体流动，以便减少加速。
开环和闭环系统都获益于含有PH20的胰岛素制剂的开发，其具有在注射和作用之间减少的滞后时间。与胰岛素组合的PH20的存在减少经过输注装置时间的胰岛素暴露的加速。使用PH20和/或胰岛素的给药方案进一步减少胰岛素暴露的加速中的可变性，且从而控制经过输注时间发生的胰岛素暴露中的可变性。本文提供的是CSII给药方案法，其使跨越输注装置寿命(即，经过输注时间)的胰岛素加速效应降到最低，以便经过输注装置使用的持续时间一致地递送超速效胰岛素暴露和作用概况。控制胰岛素暴露和/或作用的方法可以用于CSII方法中，并且用于治疗糖尿病和/或更一致地控制对象中的血液葡萄糖水平。
C.使用透明质酸降解酶的胰岛素的持续皮下输注(CSII)方法
本文提供的是用于控制对象中的血液葡萄糖水平的持续皮下胰岛素(CSII)给药方案法。该方法可以用于治疗具有糖尿病或其他胰岛素相关疾病或状况的方法。本文提供的方法基于下述发现：包括透明质酸降解酶的给药方案经过输注装置使用的持续时间一致地递送超速效胰岛素暴露和作用概况。因此，特别是在前沿施用中使用透明质酸降解酶的本文方法可以用于使对象中经过胰岛素输注的时间在胰岛素吸收中的差异降到最低。
在本文的任何方法中，如果持续皮下胰岛素例如由于泵失败的泵关闭、导管阻塞或用户错误而中断或暂停，则胰岛素作用可以比更慢作用的胰岛素更快速停止。这可以加速高血糖和最终的酮症酸中毒的时间。因此，在本文提供的任何方法中，根据需要，以适当间隔施用长效(亦称基础)胰岛素是任选步骤。一般地，长效胰岛素将是具有至少约12小时的作用持续时间的胰岛素。本领域已知的示例性长效胰岛素包括但不限于诺和平(Levemir)、地特胰岛素、NPH胰岛素或德谷胰岛素(degludec)。长效胰岛素可以施用大约在约5%-50%患者每日胰岛素总剂量之间，例如约1/3或33%患者每日胰岛素总剂量。基础胰岛素可以以合适间隔递送，例如取决于特定胰岛素的作用持续时间和患者偏爱，每输注装置至少一次。例如，基础胰岛素可以每周递送至少一次或两次或者每天递送至少一次或两次。
1.给药方案法
a.前沿
在一个例子中，本文提供的方法包括在速效胰岛素的CSII起始前，给对象施用透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20。细胞间隙中的透明质酸充当障碍以凝聚流体流动，从而导致在输注开始时胰岛素暴露的作用速率更慢。这个凝聚流体流动的障碍在晚期输注时可能不存在，或由其他因素补偿。因此，如本文显示的，与输注早期相比较，经过输注装置的过程，在输注装置寿命晚期存在胰岛素的加速作用，从而使得在输注装置寿命晚期的胰岛素作用显示出超快速胰岛素应答。在输注装置寿命内，这使胰岛素作用和吸收变得可变和不一致。在本文提供的方法中，在一段时间内在胰岛素暴露和/或作用中的差异可以通过下述降到最低：在输注装置使用起始时或接近输注装置使用起始施用透明质酸降解酶，随后为使用单独的胰岛素或胰岛素-PH20超速效组合物的CSII。例如，透明质酸降解酶通过前沿治疗施用。在经过输注装置使用过程的晚期时，机体天然恢复透明质酸障碍以凝聚流体流动，以便减少随着输注装置老化在胰岛素加速中的差异。这使经过CSII疗法的过程在患者中发生的胰岛素暴露和作用中的可变性得到减少或降到最低。
在该方法中，给对象施用以治疗有效量的含有透明质酸降解酶的组合物，所述治疗有效量足以催化玻尿酸水解以增加组织穿透性。透明质酸降解酶的量是在输注装置寿命开始时实现超快速胰岛素应答的量。在透明质酸降解酶施用后，使用CSII将速效胰岛素递送给对象。通过持续皮下胰岛素输注法的实践，使在输注寿命内的胰岛素吸收中的差异降到最低或得到减少。因此，本文还提供的是用于使胰岛素吸收中的差异降到最低的含有透明质酸降解酶的用途、过程或组合物，所述胰岛素吸收中的差异经过持续皮下胰岛素输注(CSII)的过程发生。
通过CSII疗法递送的胰岛素的特定量和给药方案包括基础速率和推注剂量依照患者特异性方案，所述患者特异性方案取决于患者的特定特征和需要。CSII疗法是本领域技术人员众所周知的(Boland等人(1999)DiabetesCare，22:1779-1784)。依照已知和现有方案和建议使用CSII治疗患者完全在技术人员的技术内。取决于使用的特定方案和持续输注设备，CSII疗法可以通过一般经由泵例如开环或闭环泵的胰岛素输注实现。一般地，CSII进行预定间隔，所述预定间隔匹配待使用的输注装置寿命或持续输注设备的性能。对于含有输注装置的胰岛素泵，所述输注装置含有管道系统和插入设备例如插管，间隔一般为仅几天，例如每2-4天。例如，输注装置每2-4天进行替换。在一个例子中，输注装置每周替换两次。
在此类方法中，可以使用任何透明质酸降解酶，例如下文部分E中所述的任何。在本文例子中，可以凭经验确定施用的透明质酸降解酶的量，以催化玻尿酸水解以增加组织穿透性。透明质酸降解酶的活性可以使用本领域众所周知的方法进行评估。例如，用于透明质酸酶的USP XXII测定法通过测量在允许该酶在37℃下与透明质酸(HA)反应30分钟后剩余的未降解的玻尿酸或HA底物的量，间接测定透明质酸酶活性(USP XXII-NFXVII(1990)644-645美国药典公约，Inc，Rockville，MD)。透明质酸酶参考标准(USP)或国家处方集(National Formulary)(NF)标准透明质酸酶溶液可以在测定法中用于确定以单位表示的任何透明质酸酶的活性。在一个例子中，使用微浊度测定法或使用生物素化的玻尿酸的微量滴定测定法来测量活性(参见例如Frost和Stern(1997)Anal.Biochem.251:263-269，美国专利公开号20050260186)。其他测定法也是已知的(参见例如Delpech等人，(1995)Anal.Biochem.229:35-41；Takahashi等人，(2003)Anal.Biochem.322:257-263)。还可以评估透明质酸降解酶充当铺展剂或扩散剂从而增加穿透性的能力。例如，可以将锥虫蓝染料连同或不连同透明质酸降解酶一起皮下注射到裸鼠每侧上的侧面皮肤内。随后例如用测微计测量染料面积，以测定透明质酸降解酶充当铺展剂的能力(美国专利公开号20060104968)。相似实验可以在其他对象中进行。
一般地，透明质酸降解酶以在功能上等于在下述之间或大约在下述之间的量施用：0.5单位-500单位、1单位-200单位、5单位-150单位、10单位-150单位、50单位-150单位或1单位-50单位。例如，透明质酸降解酶以至少1单位、5单位、10单位、50单位、100单位、150单位、200单位、300单位、400单位、500单位或更多的量施用。在其他例子中，透明质酸降解酶以其为在下述之间或大约在下述之间的量施用：1ng-10μg、8ng-2μg、20ng-1.6μg、80ng-1.25μg或200ng-1μg。例如，透明质酸降解酶以至少1ng、8ng、80ng、1.0μg1.25μg、1.6μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg或更多的量施用。施用的透明质酸降解酶的体积一般为0.1mL-50mL，例如0.5mL-5mL，一般在0.5mL-2.0mL之间或大约在0.5mL-2.0mL之间，例如至少或约或0.20mL、0.50mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL或更多，例如至少或约至少或1.0mL。
在本文方法中，透明质酸降解酶一般在CSII起始后立即施用。然而，一般地，它仅在输注装置寿命的间隔过程中施用一次。因此，在本文方法中，透明质酸降解酶在CSII起始时施用一次。一般地，在每个间隔结束时，替换输注装置并且重复给对象施用透明质酸降解酶的步骤。例如，透明质酸降解酶可以经过输注装置间隔的过程与通过CSII递送的速效胰岛素组合物顺次、同时或间歇地施用。
在特定例子中，在每个输注装置间隔中，透明质酸降解酶在前沿给药方案中的输注起始前施用。随后，在透明质酸降解酶施用后，使用CSII将速效胰岛素递送给对象。透明质酸降解酶可以在下述时间之间或大约在下述时间之间或约下述时间施用：在输注起始前10秒到1小时、在输注起始前30秒到30分钟、在输注起始前1分钟到15分钟、在输注起始前1分钟到12小时例如在输注起始前5分钟到6小时、在输注起始前30分钟到30小时、或在通过CSII输注速效胰岛素起始前1小时。一般地，在通过CSII输注速效胰岛素起始前不超过2小时施用透明质酸降解酶。换言之，在速效胰岛素输注起始前2小时内施用透明质酸降解酶。例如，在速效胰岛素类似物输注前至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少1小时或至少2小时施用透明质酸降解酶。
在其他例子中，在每个输注装置间隔中，透明质酸降解酶与CSII起始同时或接近同时施用。例如，透明质酸降解酶可以在输注起始前0到1分钟之间或大约在输注起始前0到1分钟之间，或在输注起始后0到1分钟之间或大约在输注起始后0到1分钟之间施用。
应当理解在一些例子中，透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20在速效胰岛素的CSII起始后立即施用于对象。在此类例子中，透明质酸降解酶的施用时机是这样的，即在足够影响在输注装置寿命早期的胰岛素吸收的增加，从而降低在不存在透明质酸降解酶施用的情况下在经历CSII疗法的患者中发生的可变性。因此，虽然透明质酸降解酶的施用不在胰岛素的输注之前，但透明质酸降解酶仍实现前沿效应，因为它能够去除透明质酸以允许在输注装置寿命早期增加的胰岛素吸收。
因此，在进一步例子中，在每个输注装置间隔中，透明质酸降解酶可以在输注起始后施用。因此，在透明质酸降解酶施用前，速效胰岛素使用CSII递送给对象。可以在输注起始前1分钟到12小时或大约在输注起始前1分钟到12小时，例如在输注起始前5分钟到6小时或大约在输注起始前5分钟到6小时，在输注起始前30分钟到3小时或大约在输注起始前30分钟到3小时，或在输注起始前1小时到2小时或大约在输注起始前1小时到2小时施用透明质酸降解酶。一般地，在此类例子中，在通过CSII输注速效胰岛素起始前不超过2小时施用透明质酸降解酶。
透明质酸降解酶可以通过任何合适途径进行施用，例如肠胃外施用，包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内和真皮内施用。透明质酸降解酶还可以静脉内施用。一般地，透明质酸降解酶皮下施用。透明质酸降解酶可以在速效胰岛素的输注部位处或附近施用。在一些例子中，透明质酸降解酶通过与速效胰岛素的CSII相同的注射部位施用。在其他例子中，透明质酸降解酶在与速效胰岛素的CSII不同的注射部位处施用。
任何速效胰岛素例如下文部分D中所述的任何可以用于通过CSII递送的本文方法中。一般地，储库含有速效胰岛素组合物，其含有在下述之间或大约在下述之间的速效胰岛素量：10U/mL-1000U/mL、50U/mL-500U/mL、100U/mL-250U/mL，例如至少或约至少或25U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL或更多，例如至少或约至少100U/mL。在一些例子中，组合物中的胰岛素量在下述之间或大约在下述之间：0.35mg/mL-35mg/mL、0.7mg/mL-20mg/mL、1mg/mL-15mg/mL、5mg/mL-10mg/mL，例如至少或约至少0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL或更多。一般地，速效胰岛素是速效胰岛素类似物(也称为快速作用类似物)。在一些例子中，通过CSII递送的速效胰岛素是超速效胰岛素组合物，其含有速效胰岛素或速效胰岛素类似物和足以使组合物变得超速效的透明质酸降解酶(作为美国公开号US20090304665公开)。超速效胰岛素组合物在本文下文部分F中描述。在进一步例子中，如下文进一步和临时申请号61/520,962中描述的，超速效胰岛素组合物是在32℃-40℃下稳定至少3天的稳定组合物。
任何持续输注设备都可以用于本文方法中以通过CSII递送速效胰岛素。一般地，持续胰岛素输注设备包括胰岛素泵，含有速效胰岛素或超速效胰岛素组合物的储库和用于设备的皮下输注的输注装置。该设备可以是开环或闭环设备。示例性胰岛素泵和用于持续胰岛素输注的其他胰岛素递送设备在下文部分C.2中描述。
在该方法的示例性例子中，持续输注设备的新泵储库充满有效浓度的速效胰岛素，例如速效胰岛素类似物组合物。组合物中的胰岛素量一般为约或至少或100U/mL。患者随后一般在腹部部位处插入新输注装置。插入针或插管由粘合垫附着。输注装置随后附着至填充的泵储库。输注装置随后用胰岛素引发。在经由泵起始胰岛素输注到患者内之前，将含有下述酶量的1.0mL透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)组合物在输注部位处或附近注射到患者内：至少或约或100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL或600U/mL。例如，透明质酸降解酶经由注射器或一般含有针用于注射的其他相似设备或管引入。其他设备可以是对于通过插管或输注部位插入相容的连接器(adaptor)。一般地，将酶施用到与将用于输注相同的注射部位内且经由与将用于输注相同的插管施用。透明质酸降解酶缓慢施用于患者，一般不小于20秒到30秒。在透明质酸降解酶注射后立即，从插管或其他相似插入设备中取出透明质酸降解酶输注装置，且替换为含胰岛素的泵/输注装置。泵随后设定为递送固定的引发胰岛素，取决于插管的大小(例如0.2U-1.0U，取决于插管的大小；例如0.4U用于6mm插管和0.6U用于9mm插管)，并且随后持续递送预定的患者特异性设定的基础输注率。因此，在本文的示例性方法中，透明质酸降解酶一般在胰岛素输注约5秒到20分钟之内或约5秒到20分钟，例如1分钟到15分钟施用。
b.改善总胰岛素作用的方法
在本文中发现当在CSII给药方案中施用超速效胰岛素组合物时，在输注装置寿命内存在降低的总胰岛素作用。在输注装置的时间内，在总胰岛素作用中的这种降低在含有透明质酸降解酶的超速效胰岛素制剂中大于速效制剂中。在一段时间内全身增加的胰岛素施用将抵消胰岛素作用的丧失，并且通过开环和闭环控制改善葡萄糖控制。因此，本文提供了方法，由此超速效胰岛素组合物中的胰岛素的基础或推注剂量在输注装置寿命内增加，以便补偿在一段时间内可见的总胰岛素效应中观察到的减少。
本文提供的是用于控制血液葡萄糖的持续皮下胰岛素输注(CSII)给药方案法，其提供在输注装置寿命内更一致的超速效胰岛素概况。在此类例子中，进行CSII以依照设定的胰岛素的基础速率和推注剂量将超速效胰岛素组合物递送给患者。部分F描述了超速效胰岛素组合物。在一些例子中，在该方法中采用稳定共制剂。用于持续输注的任何胰岛素递送设备都可以用于该方法中，包括提供闭环或开环系统的设备。此类设备的例子在下文C.2中描述。
在该方法中，在给药方案的过程期间，与使用不含透明质酸降解酶的速效胰岛素组合物用于患者的正常设定给药方案相比较，施用的基础和/或推注超速效胰岛素的量增加至少1%。在特定例子中，与使用不含透明质酸降解酶的速效胰岛素组合物用于患者的正常设定给药方案相比较，胰岛素的基础速率和/或推注剂量增加1%-50%、5%-40%、10%-20%或5%-15%。通过该方法的实践，与经过输注装置的过程不包括胰岛素递送中的全身增加的给药方案相比较，总胰岛素作用是增加的。例如，如通过在正常血糖钳夹实验中的累积葡萄糖输注(U/kg)测量的，总胰岛素作用可以增加至少或约或1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或更多。
在一些例子中，基础胰岛素和/或推注胰岛素在输注装置寿命的过程期间每天增加至少一次。可以增加的推注胰岛素包括关于给定餐的膳食剂量和/或关于给定高血糖校正的校正推注和在胰岛素的广泛数量上的推注。
在进一步例子中，在进行使用超速效胰岛素的CSII前，在CSII输注起始之前立即或之后立即将透明质酸降解酶施用于患者，如上文C.1.a中所述。透明质酸降解酶是本领域技术人员众所周知的，并且在下文部分E中描述。通过在本文方法中超速效胰岛素组合物的CSII起始之前立即或之后立即施用，任何此类透明质酸降解酶都可以用于该方法的实践中。
2.胰岛素泵及其他胰岛素递送设备
在本文方法中使用的胰岛素递送设备包括胰岛素泵或能够持续皮下胰岛素输注的其他相似设备。胰岛素递送设备包括开环和闭环系统，一般含有至少一个含有胰岛素制剂的一次性使用的储库、泵(包括任何控制、软件、处理模块和/或电池)和一次性使用的输注装置，其包括用于皮下注射的插管或针和将插管或针连接至胰岛素储库的管。闭环递送设备另外包括葡萄糖监测仪或传感器。对于在本文方法中的使用，胰岛素递送设备可以含有储库，其含有速效胰岛素或胰岛素和透明质酸降解酶的超速效胰岛素共制剂。
胰岛素或超速效胰岛素共制剂可以持续和/或在推注注射中施用。用户设置泵以全天持续给予稳态滴流或“基础”量的胰岛素制剂。泵还在用餐时和基于用户输入在血糖太高时释放另外的(“推注”)剂量的胰岛素制剂。频繁的血液葡萄糖监测是测定胰岛素剂量且确保胰岛素适当递送必需的。这可以通过手动监测、分开的或含有的葡萄糖监测仪来达到。进一步地，胰岛素递送设备用户具有通过调整推注影响胰岛素概况的能力。例如，可以施用标准推注，其因立即抽泵所有剂量而类似于不连续注射的输注。延长推注是在一段时间内的缓慢输注，这避免高起始剂量且延长组合物的作用。含有标准推注和延长推注的组合推注也可以使用胰岛素泵或其他持续递送系统施用。
胰岛素递送设备是本领域已知且在其他地方描述的，包括但不限于美国专利号6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,025,743和7,109,878中。胰岛素递送设备还可以连接至葡萄糖监测仪或传感器例如闭环系统，和/或可以含有基于血液葡萄糖水平、一餐的碳水化合物含量或其他输入计算推荐的胰岛素剂量的工具。进一步的胰岛素递送设备可以是可植入的或可以是对于对象外部的。外部胰岛素输注泵的使用需要个体的谨慎选择、细心监测和完整的教育和长期进行的随访。这个护理一般由具有关于胰岛素泵治疗的个体管理中的专门知识和经验的保健专业多学科团队提供。
a.开环系统
开环系统可以与本文提供的共制剂一起使用。开环系统一般包含含有胰岛素制剂的至少一个一次性使用的储库、泵(包括任何控制、软件、处理模块和/或电池)和一次性使用的输注装置，其包括用于皮下注射的插管或针和将插管或针连接至胰岛素储库的管。开环系统每数分钟以小(基础)剂量和患者手动设置的大(推注)剂量输注。但是，开环系统不含有葡萄糖监测仪或传感器，并且因此不能响应患者的血液葡萄糖水平中的变化。用于测量血液葡萄糖水平的多种方法和设备是本领域技术人员已知的。由许多糖尿病患者用于个人监测其血液葡萄糖水平的常规技术包括定期抽血，将血液应用于测试条，且使用量热、电化学或光度检测测定血液葡萄糖水平。多种设备已开发用于在血流或间隙液中的分析物例如葡萄糖的持续或自动监测。这些设备中的一些使用直接植入患者的血管内或皮下组织中的电化学传感器。用于监测葡萄糖水平的示例性方法和设备包括但不限于美国专利号5,001,054、5,009,230,5,713,353、6,560,471、6,574,490、6,892,085、6,958,809、7,299,081、7,774,145、7,826,879、7,857,760和7,885,699中所述的那些，所述专利引入本文作为参考。
胰岛素递送系统例如胰岛素泵是本领域已知的且可以用于开环系统中。示例性开环胰岛素递送设备(例如上文描述的那些)包括但不限于美国专利号4,562,751、4,678,408、4,685,903、4,373,527、4,573,994、6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854、7,109,878、7,938,797和7,959,598中所述的那些，所述专利引入本文作为参考。这些和可通过本领域技术人员容易地鉴定的相似系统可以用于递送本文提供的共制剂。胰岛素递送设备一般含有一个或多个储库，其一般为一次性使用的，含有胰岛素制剂，例如本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂。在一些例子中，使用输注管和插管或针递送共制剂。在其他例子中，输注设备直接附着至皮肤，并且共制剂从输注设备流经插管或针直接进入体内，而无需使用管。在进一步例子中，输注设备对于机体是内部的，并且输注管任选可以用于递送共制剂。
b.闭环系统
闭环系统有时称为人工胰腺，对于与本文提供的共制剂一起使用是特别有利的。闭环系统指具有整合的持续葡萄糖监测仪、胰岛素泵或其他递送系统和控制器的系统，所述控制器包括基于血液葡萄糖水平的实时测量不断计算用于血糖控制的所需胰岛素输注的数学算法。此类系统在最佳化时，可以促进恒定和非常紧密的血糖控制，类似于在健康非糖尿病对象中观察到的天然胰岛素应答和血糖控制。然而，为了有效，闭环系统需要可靠和准确的持续葡萄糖监测仪，和以非常快速的动作递送胰岛素。例如，与速效胰岛素的皮下递送相关的胰岛素吸收和作用中的延迟可以导致餐后血糖大波动(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23:1-12)。由于胰岛素吸收的延迟、胰岛素作用、间质性葡萄糖动力学和基于离体监测系统例如基于微透析技术的那些的转运时间，可以导致从胰岛素递送时到其可检测的葡萄糖降低效应的峰总体100分钟或更多的时滞(Hovorka等人(2006)DiabeticMed.23:1-12)。因此，在施用后，胰岛素将继续增加其可测量效应接近2小时。这可以使在使用闭环系统有效降低一餐消化后的葡萄糖浓度复杂化。首先，必须检测葡萄糖增加。然而，这一般仅在约10–40分钟滞后发生。该系统必须测定一餐已消化并且施用合适的胰岛素剂量。系统随后补偿‘误判’胰岛素剂量的能力通过长延迟和在施用后不能‘撤消’胰岛素而妥协。此类问题至少部分可以通过使用速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂例如本文提供的那些得到克服，所述共制剂可以显示出增加的吸收率和水平以及与药效学中的相关改善(参见例如美国公开号US20090304665和国际PCT公开号WO2009134380)。速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂具有比单独的速效胰岛素减少的tmax(即更快速达到最大浓度)，并且比单独的速效胰岛素更快速地开始控制血液葡萄糖水平。这个增加的吸收率和作用开始减少在胰岛素作用和葡萄糖监测和输入之间的滞后，导致可以更紧密地控制血液葡萄糖水平的更有效的闭环系统，减少血糖波动。
闭环系统是本领域众所周知的并且已在其他地方进行描述，包括但不限于美国专利号5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,669,663、6,740,072、7,267,665、7,354,420和7,850,674，所述专利引入本文作为参考。这些和可通过本领域技术人员容易地鉴定的相似系统可以用于递送本文提供的共制剂。闭环系统包括传感器系统以测量血液葡萄糖水平、控制器和递送系统。这个整合系统设计为建模胰腺β细胞(β-细胞)，从而使得它控制输注设备，以在响应体内血液葡萄糖浓度中的变化时，将胰岛素与由全功能人β-细胞产生的相似的浓度概况递送到对象内。因此，该系统模拟机体对血液葡萄糖水平的天然胰岛素应答，并且不仅有效利用胰岛素，还同样负责其他机体功能，因为胰岛素具有代谢和促有丝分裂效应。进一步地，实现使用闭环系统达到的血糖控制，而不需要关于一餐大小和时机的任何信息或其他因素。该系统可以仅依赖实时血液葡萄糖测量。葡萄糖传感器生成代表体内血液葡萄糖水平的传感器信号，并且给控制器提供传感器信号。控制器接收传感器信号且生成传递给胰岛素递送系统的命令。胰岛素递送系统接收该命令且响应该命令将胰岛素输注到体内。
下文提供的是闭环系统的示例性组分的描述，所述闭环系统可以用于递送本文提供的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂。应当理解本领域技术人员可以容易地鉴定用于与共制剂一起使用的合适的闭环系统。此类系统已在本领域中进行描述，包括但不限于美国专利号5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,669,663、6,740,072、7,267,665和7,354,420中所述的那些。该系统的个别组分也已在本领域中个别地和在用于达到血糖控制的闭环系统的背景下进行描述。应当理解本文提供的例子仅是示例性的，并且其他闭环系统或个别组分可以用于递送本文提供的共制剂。
闭环系统含有持续起作用的葡萄糖传感器或监测仪。此类设备可以含有插入皮肤下且附着至小传输器的针型传感器，所述小传输器通过射频遥测术将葡萄糖数据无线传递给小接收器。在一些例子中，使用插入针将传感器插入通过对象的皮肤，一旦传感器置于皮下组织中，就将所述插入针取出且处置。插入针具有锋利末端和开放式空槽，以在插入皮肤内的过程中容纳传感器(参见例如美国专利号5,586,553和5,954,643)。在闭环系统中使用的传感器可以任选含有暴露于皮下组织中的间隙液(ISF)的三个电极。三个电极包括用于形成回路的工作电极、参考电极和对电极。当跨越工作电极和参考电极供应合适电压时，ISF提供电极之间的阻抗。模拟电流信号从工作电极流经机体且到对电极。在工作电极处的电压一般保持接地，并且在参考电极处的电压可以保持在设置的电压Vset，例如300-700mV。由电极间的电压差刺激的最显著反应是葡萄糖的减少，因为它首先与葡萄糖氧化酶(GOX)反应，以生成葡糖酸和过氧化氢(H2O2)。随后H2O2在工作电极表面上还原为水(H2O)和(O-)。O-吸引来自传感器电组分的正电荷，随后排斥电子且引起电流流动。这个导致与ISF中的葡萄糖浓度成比例的模拟电流信号，所述ISF与传感器电极接触(参见例如美国专利号7,354,420)。
在一些例子中，超过一个传感器用于测量血液葡萄糖。例如，可以使用冗余传感器，并且当传感器失败时可以通过遥测特性监测仪传输器电子设备通知对象。指示器还可以告知对象哪些传感器仍起作用和/或仍起作用的传感器数目。在其他例子中，传感器信号通过求平均值或其他方式合并。进一步地，可以使用不同类型的传感器。例如，内部葡萄糖传感器和外部葡萄糖传感器可以同时用于测量血液葡萄糖。
可以在闭环系统中使用的葡萄糖传感器是众所周知的，并且可通过本领域技术人员容易地鉴定且任选进一步修饰。示例性内部葡萄糖传感器包括但不限于美国专利号5,497,772、5,660,163、5,791,344、5,569,186、6,895,265和7,949,382中描述的那些。使用荧光的示例性葡萄糖传感器是美国专利号6,011,984中所述的那种。葡萄糖传感器系统还可以使用其他传感技术，包括光束、传导性、喷射取样、微透析、微穿孔、超声取样、反向离子电渗疗法或其他方法(例如美国专利号5,433,197和5,945,676以及国际专利公开WO199929230)。在一些例子中，仅工作电极位于皮下组织中且与ISF接触，并且对电极和参考电极位于机体外部且与皮肤接触。对电极和参考电极可以位于监测仪外壳表面上，并且可以作为遥测特性监测仪的部分保持至皮肤。在进一步例子中，对电极和参考电极使用其他设备保持至皮肤，例如运行对电极的线且将电极用胶布粘至皮肤，将电极加入接触皮肤的表的底面上。再进一步地，超过一个工作电极可以置于皮下组织内用于冗余。间隙液也可以从对象体内收获且流经未植入体内的外部传感器。
控制器接收来自葡萄糖传感器的输入。控制器设计为建模胰腺β细胞(β-细胞)且给胰岛素递送设备提供命令，以输注所需量的胰岛素用于血糖控制。控制器利用具有算法的软件，以基于由葡萄糖传感器检测的葡萄糖水平计算所需胰岛素量。示例性算法包括紧密建模β-细胞的那些，因为设计为使体内葡萄糖波动降到最低而不考虑递送多少胰岛素的算法，可以引起过量重量增长、高血压和动脉粥样硬化。一般地，该系统预期模仿体内胰岛素分泌模式，且调整这个模式与由正常健康个体经历的体内β-细胞适应一致。用于闭环系统的控制算法包括由比例-积分-导数(PID)控制器利用的那些。比例导数控制器和模型预测控制(MPC)算法也可以用于一些系统中(Hovorka等人(2006)Diabetic Med.23:1-12)。示例性算法包括但不限于下述描述的：那些Hovorka等人(Diabetic Med.(2006)23:1-12)，Shimoda等人，(Front Med Biol Eng(1997)8:197-211)，Shichiri等人(Artif.Organs(1998)22:32-42)，Steil等人(Diabetes Technol Ther(2003)5：953–964)，Kalatz等人，(Acta Diabetol.(1999)36:215)和美国专利号5,279,543、5,569,186、6,558,351、6,558,345、6,589,229、6,740,042、6,669,663、6,740,072、7,267,665和7,354,420以及美国专利公开号20070243567。
在一个例子中，PID控制器用于闭环系统中。PID控制器通过由下述三个角度评估葡萄糖波动来持续调整胰岛素输注：靶葡萄糖偏离(比例分量)、环境和靶葡萄糖之间的曲线下面积(积分分量)、和环境葡萄糖中的变化(导数分量)。一般地，对葡萄糖变化的体内β-细胞应答特征在于“第一”和“第二”期胰岛素应答。β-细胞的双相胰岛素应答可以使用比例、加上积分、加上导数(PID)分量的控制器进行建模(参见例如美国专利号7,354,420)。
控制器生成用于所需胰岛素递送的命令。胰岛素递送系统例如胰岛素泵是本领域已知的，并且可以用于闭环系统中。示例性胰岛素递送设备(例如上文描述的那些)包括但不限于美国专利号4,562,751、4,678,408、4,685,903、4,373,527、4,573,994、6,554,798、6,641,533、6,744,350、6,852,104、6,872,200、6,936,029、6,979,326、6,999,854和7,109,878中描述的那些。胰岛素递送系统一般含有一个或多个储库，其一般为一次性使用的，含有胰岛素制剂，例如本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂。在一些例子中，共制剂使用输注管和插管或针递送。在其他例子中，使用输注管和插管或针递送共制剂。在其他例子中，输注设备直接附着至皮肤，并且共制剂从输注设备流经插管或针直接进入体内，而无需使用管。在进一步例子中，输注设备对于机体是内部的且输注管可以任选用于递送共制剂。闭环系统还可以含有另外组分，包括但不限于滤器、校准器和传输器。
c.示例性设备
外部胰岛素泵技术包括简单的电池供电泵以及能够与泵设备或其他类型设备的分离部分无线连接的泵。
一种此类泵
Figure BDA0000465955830000611
涉及具有无线射频连接的两个分离设备。这个设备的第一个部分称为"Pod"，是一次性使用的自粘单元，其加入胰岛素储库、微型计算机控制的胰岛素泵和插管设备。设备的"Pod"部分由个体充满胰岛素，并且随后使用自动插管插入器附着至皮肤。"Pod"一直到72小时耗损且随后替换。该设备的第二个部分称为"PDM"或“个体糖尿病管理器(Personal Diabetes Manager)”，是与"Pod"无线通讯的手提式控制单元，以控制基础速率和推注胰岛素施用。这个PDM还含有整合到Pod的控制系统内的血液葡萄糖监测仪(并非持续间质监测仪)，允许个体在剂量计算中使用这个数据。PDM加入FreeStyleTM血液葡萄糖计，其与标准单独血液葡萄糖监测仪类似工作，需要血样采集的常规手指针刺法。一旦"Pod"激活且按程序工作，PDM就无需由个体保持，直至它再次用于检查血液葡萄糖水平，给予推注剂量或调整基础胰岛素速率。
另一类无线胰岛素泵设备涉及外部胰岛素泵和持续葡萄糖传感器/传输器之间的连接。一种此类设备是Medtronic MiniMed Paradigm REAL-TimeSystem，其加入MiniMed范例模型胰岛素泵(型号522、722和更新的)与MiniMed持续葡萄糖传感器和MiniLinkTMREAL-Time Transmitter。使用这种系统，持续葡萄糖传感器-传输器给“实时”展示数据的泵单元无线传输间质性葡萄糖浓度数据(在24小时时期中288个读数)。然而，经由无线传播传输的数据不能无缝用于剂量计算。此类计算需要血液葡萄糖测量。葡萄糖传感器/传输器设备还可以与外部耗损持续葡萄糖接收器/监测仪(例如REAL-Time Continuous Glucose Monitoring System)无线整合。
D.胰岛素多肽
本文提供的CSII方法使用速效胰岛素制剂或速效胰岛素和PH20组合或共制剂(即，如部分F中所述的超速效胰岛素组合物)。速效胰岛素包括普通胰岛素或胰岛素类似物(例如称为速效类似物或快速作用类似物，在本文中可互换使用)，其进行修饰(例如通过氨基酸替换)以减少胰岛素的自联作用且导致更快速的六聚体解离。
胰岛素是由51个氨基酸残基组成的多肽，其分子量为5808道尔顿。它在胰腺中的胰岛β-细胞中产生。示例性人胰岛素翻译为含有至ER的24氨基酸信号肽的110氨基酸前体多肽，前胰岛素原(SEQ ID NO:101)，所述信号肽被切割，导致胰岛素原(SEQ ID NO:102)。随后通过称为激素原转换酶(PC1和PC2)的蛋白水解酶的作用和通过外切蛋白酶羧肽酶E的作用，将胰岛素原分子转换为成熟胰岛素。这导致4个碱性氨基酸残基的去除和剩余31氨基酸C肽或连接链(对应于SEQ ID NO:101中所示的前胰岛素原多肽的氨基酸残基57-87)。所得到的胰岛素含有通过二硫键交联的21氨基酸A链(对应于SEQ ID NO:102中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基66-86)和30氨基酸B链(对应于SEQ ID NO:102中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基1-30)。一般地，成熟胰岛素含有三个二硫键：在A链的第7位和B链的第7位之间的一个、在A链的第20位和B链的第19位之间的第二个、和在A链的第6和11位之间的第三个。成熟胰岛素A链的序列显示于SEQID NO:103中，并且B链的序列显示于SEQ ID NO:104中。
提及胰岛素包括以单链或二链形式的前胰岛素原、胰岛素原和胰岛素多肽、其具有活性的截短形式，并且包括等位基因和剪接变体、由剪接变体编码的变体、及其他变体，例如胰岛素类似物或其他衍生形式，包括与SEQ ID NO:101中所示的前体多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的多肽或其成熟形式，只要胰岛素与人胰岛素受体结合，以起始导致葡萄糖摄取和贮存增加和/或内源葡萄糖生产降低的信号级联。例如，胰岛素包括胰岛素的物种变体。这些包括但不限于衍生自牛(SEQ IDNO:133中所示)和猪(SEQ ID NO:123中所示)的胰岛素。牛胰岛素在A链的氨基酸8和10以及B链的氨基酸30处不同于人胰岛素。猪胰岛素仅在B链中的氨基酸30处不同于人胰岛素，其中如同牛序列，存在代替苏氨酸的丙氨酸置换。胰岛素的其他示例性物种变体在SEQ ID NO：105-146中任一显示。
在胰岛素变体中还包括，与SEQ ID NO：103和104(A和B链)中所示的人胰岛素相比较，含有一个或多个氨基酸修饰的胰岛素类似物。这些变体包括速效或更长效胰岛素类似物(在本文中都指名为速效胰岛素类似物，尽管应当理解为了本文目的，这包括快速作用和更长作用的胰岛素类似物形式)。示例性胰岛素类似物(A和/或B链)包括速效和更长效类似物形式，在SEQ ID NO:147-165、182-184中显示)。例如，胰岛素类似物包括但不限于谷赖(LysB3、GluB29；SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:149(B链)中所示)、HMR-1153(LysB3、IleB28；SEQ ID NO:103(A链)和SEQ IDNO:182(B链)中所示)、HMR-1423(GlyA21、HisB31、HisB32；SEQ IDNO:183(A链)和SEQ ID NO:184(B链)中所示)、门冬胰岛素(AspB28；SEQ IDNO:103(A链)和SEQ ID NO:147(B链)中所示)、和赖脯胰岛素(LysB28、ProB29；SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:148(B链)中所示)。在上文每一种情况下，类似物的命名法基于由链的N末端编号，在胰岛素的A或B链上的特定位置处的氨基酸置换的描述，其中序列的剩余部分是天然人胰岛素的那种。
因此，在本文输注法中使用的普通胰岛素是含有SEQ ID NO：103和104中所示的氨基酸序列的成熟胰岛素。示例性普通人胰岛素是指名
Figure BDA0000465955830000631
R的重组人胰岛素。普通胰岛素还包括具有A和B链的成熟胰岛素的物种变体，例如SEQ ID NO：105-146中任何的成熟形式。在本文的共制剂中包括的其他示例性胰岛素类似物包括但不限于这样的胰岛素，其具有EQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:149(B链)中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:147(B链)中所示的氨基酸序列；或SEQID NO:103(A链)和SEQ ID NO:148(B链)中所示的氨基酸序列。
上文胰岛素多肽中的任何包括通过来自任何物种例如人的胰腺产生的那些，并且还包括合成或使用重组技术产生的胰岛素。例如，如本文其他地方描述的，胰岛素可以通过下述生物合成产生：表达关于胰岛素A和B链的合成基因，表达完整胰岛素原且使其暴露于合适的酶促和化学方法，以生成成熟胰岛素，或表达由连接肽连接的A和B链(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’sDiabetes Mellitus(第481-500页)McGraw-Hill Professional)。
胰岛素还包括单体和寡聚形式，例如六聚形式。当胰岛素在血浆中循环时，它可以作为单体存在，并且它还在单体形式时与其受体结合。然而，胰岛素具有自联成二聚体的倾向，并且在金属离子例如Zn2+的存在下，可以容易地结合成更高级别的结构例如六聚体。存在关于Zn2+的两个对称的高亲和力结合位点，尽管其他更弱的锌结合位点也已得到报道(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenbergand Rifkin’s Diabetes Mellitus(第481-500页)McGraw-Hill Professional)。自联作用对于分子的稳定性是重要的，以阻止化学降解和物理变性。因此，在胰腺β-细胞中的贮存囊泡中，胰岛素作为六聚体存在。然而，在释放到细胞外间隙内之后，认为胰岛素六聚体可以经历pH至更中性条件的变化，并且含锌离子六聚体稀释，这使六聚体失稳。可以存在促成胰岛素六聚体在细胞外间隙中失稳的其他原因。胰岛素因此在血液中主要作为单体发现。为了利用稳定效应，大多数胰岛素商业制剂含有足够量的锌离子，以促进自联成六聚体。然而，六聚结构减慢这些制剂在皮下施用后的吸收率。
胰岛素用作例如在糖尿病患者中的血糖控制的治疗剂。存在多个类型的胰岛素制剂，取决于施用于控制葡萄糖的胰岛素是用于基础疗法、膳食疗法还是其组合。胰岛素制剂可以仅作为速效制剂，仅作为基础作用制剂(即中效和/或长效形式)，或作为其混合物提供(参见例如表2)。一般地，混合物含有速效和中效或长效胰岛素。例如，速效胰岛素可以以不同混合比与NPH胰岛素(如下文讨论的示例性中效胰岛素)组合，包括10:90、20:80、30:70、40:60和50:50。通过在单一制剂中方便地提供用餐相关和基础胰岛素需求，此类预混合制剂可以减少每日胰岛素注射数目。
胰岛素制剂包括胰岛素多肽或其以特定方式配制的变体(即类似物)。在一些情况下，它是制剂中对胰岛素赋予不同性质例如不同作用持续时间的组分和物质。例如，大多数胰岛素制剂在制剂中含有金属离子例如锌，其通过促进分子的自联作用稳定胰岛素。自联成六聚形式可以影响在施用后的胰岛素吸收。进一步地，一些长效基础胰岛素制剂通过经由锌的添加从乙酸盐缓冲液(代替磷酸盐)中沉淀胰岛素进行制备。当收集且重悬浮于乙酸钠-氯化钠溶液(pH7.2-7.5)中时，具有高锌含量的胰岛素大晶体在皮下注射后缓慢吸收，并且发挥长持续时间的作用。这个晶体制剂命名为延长胰岛素锌悬浮液(特慢胰岛素)。其他含锌胰岛素制剂包括例如半慢胰岛素(速效胰岛素锌悬浮液)和慢胰岛素(胰岛素锌悬浮液)，其主要在使用的锌浓度中不同。含新胰岛素制剂还包括由鱼精蛋白修饰的胰岛素，例如NPH胰岛素。
在另一个例子中，沉淀剂例如鱼精蛋白可以加入胰岛素多肽，以生成微晶悬浮液。一般地，与不以结晶形式存在的胰岛素相比较，结晶胰岛素具有延长的作用持续时间。当在水悬浮液中皮下注射时，鱼精蛋白锌胰岛素仅在沉积部位处缓慢溶解，并且胰岛素以迟缓速率被吸收。鱼精蛋白锌悬浮液胰岛素已在很大程度上由等项胰岛素悬浮液也称为NPH胰岛素替换。它是其为结晶的经修饰的鱼精蛋白锌胰岛素悬浮液。胰岛素、鱼精蛋白和锌的浓度如此安排，从而使得制剂具有在普通胰岛素和鱼精蛋白锌胰岛素悬浮液两者中间的作用开始和持续时间。
进一步地，制剂中的pH差异也影响胰岛素的类型和性质。大多数胰岛素在中性pH下配制。一个例外是甘精胰岛素，其作为以pH4.0的商业制剂提供。由于两个精氨酸加入B链的C末端，甘精胰岛素的等电点转变，使得它在酸性pH下更可溶。另外的氨基酸变化存在于A链(N21G)中，以阻止起因于酸敏感性天冬酰胺的脱酰胺作用和二聚化。甘精胰岛素的A链序列在SEQ ID NO:150中显示，并且B链在SEQ ID NO:151中显示。因为对生理学pH的暴露在施用后发生，所以形成微沉淀物，其使得甘精类似于结晶、长效胰岛素。
下表2概括多个类型的胰岛素，其作用开始及其应用。
最常用的胰岛素是速效胰岛素，其包括普通胰岛素(即天然或野生型胰岛素，包括其等位基因和物种变体)和速效胰岛素类似物。为了本文目的，除非上下文特别指出，否则提及胰岛素是速效胰岛素。
速效胰岛素
可以在本文提供的CSII输注法中使用的速效胰岛素包括普通胰岛素和速效胰岛素类似物，所述普通胰岛素为野生型或天然胰岛素。由于其与基础作用胰岛素相比较的快吸收率，速效胰岛素主要用于餐后控制目的。示例性速效胰岛素在下表3中显示。速效胰岛素还包括本领域已知的任何，例如但不限于公开于美国专利号7,279,457以及美国专利公开号20070235365、20080039368、20080039365、20070086952、20070244467和20070191757中的任何胰岛素制剂和设备。任何速效胰岛素都可以单独或与PH20组合或共配制而制备为用于在本文CSII方法中使用的制剂。此类制剂还可以进一步包括速效胰岛素与中效或长效胰岛素加上透明质酸降解酶的混合物。
Figure BDA0000465955830000661
a.普通胰岛素
普通胰岛素包括天然或野生型胰岛素多肽。这些包括人胰岛素，以及来自牛、猪及其他物种的胰岛素。普通人胰岛素作为
Figure BDA0000465955830000662
Figure BDA0000465955830000663
和
Figure BDA0000465955830000664
出售。猪胰岛素作为
Figure BDA0000465955830000665
出售。一般地，当单独皮下施用时，普通胰岛素具有30分钟的作用开始。最大血浆水平在1-3小时内可见，并且强度持续时间随着剂量增加。在皮下施用后的血浆半衰期为约1.5小时。
b.速效类似物(也称为快速作用胰岛素)
通常在本领域中称为快速作用胰岛素的速效胰岛素类似物，是一般含有一个或多个氨基酸变化的经修饰形式的胰岛素。类似物设计为与普通胰岛素相比较，减少胰岛素分子的自联作用以用于增加吸收率和作用开始的目的。一般地，此类类似物在锌的存在下配制，并且因此作为稳定的锌六聚体存在。然而，由于修饰，与普通胰岛素相比较，它们在皮下施用后具有来自六聚状态的更快速解离。
i.赖脯胰岛素
人赖脯胰岛素是含有在B链的第28和29位处的氨基酸变化的胰岛素多肽制剂，从而使得在SEQ ID NO:104中所示的野生型胰岛素B链中的这个位置处的Pro-Lys倒转为Lys-Pro。赖脯胰岛素的序列在SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO：148(B链)中显示。它以名称
Figure BDA0000465955830000671
(赖脯胰岛素，rDNA起源)出售。这两个氨基酸倒转的结果是具有降低的自联倾向的多肽，其允许更快速的作用开始。具体地，B链中的序列倒转导致两个疏水性相互作用的消除和稳定二聚体的两个β-折叠片氢键的减弱(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’sDiabetes Mellitus(第481-500页)McGraw-Hill Professional)。由于制剂中提供的赋形剂例如抗微生物剂(例如间甲酚)和用于稳定的锌，多肽自联且形成六聚体。然而，由于氨基酸修饰，赖脯胰岛素比普通胰岛素更快速起作用。
ii.门冬胰岛素
人门冬胰岛素是含有在SEQ ID NO:104中所示的人胰岛素B链的第28位处从脯氨酸到天冬氨酸的氨基酸置换的胰岛素多肽制剂。门冬胰岛素的序列在SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:147(B链)中显示。它以名称
Figure BDA0000465955830000672
(门冬胰岛素[rDNA起源]注射液)出售。门冬胰岛素中的修饰赋予带负电的侧链羧基，以产生电荷排斥且使单体-单体相互作用失稳。进一步地，脯氨酸的去除消除单体间的关键疏水性相互作用(参见例如DeFelippis等人(2002)Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.In Ellenberg and Rifkin’sDiabetes Mellitus(第481-500页)McGraw-Hill Professional)。类似物在很大程度上作为单体存在，并且与其他速效类似物例如赖脯相比较更不易于聚集。一般地，门冬胰岛素和赖脯胰岛素在其各自的药物代谢动力学和药效性质方面是相似的。
iii.谷赖胰岛素
人谷赖胰岛素是与SEQ ID NO:104中所示的人胰岛素的B链序列相比较，含有在B链中在第B3位处从天冬酰胺到赖氨酸和在氨基酸B29处从赖氨酸到谷氨酸的氨基酸置换的胰岛素多肽制剂。谷赖胰岛素的序列在SEQ ID NO:103(A链)和SEQ ID NO:149(B链)中显示。它以名称
Figure BDA0000465955830000681
(谷赖胰岛素[rDNA起源]注射液)出售。与人胰岛素相比较，修饰使多肽分子更不易于自联。与其他胰岛素类似物不同，多肽在不存在六聚体促进锌的情况下商业配制(Becker等人(2008)Clinical Pharmacokinetics，47:7-20)。因此，谷赖胰岛素具有比赖脯胰岛素和门冬胰岛素更快速的开始速率。
E.透明质酸降解酶
透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)可以用于本文CSII方法中。透明质酸降解酶可以分开配制用于例如在前沿实施方案中使用。在其他例子中，透明质酸降解酶可以连同速效胰岛素一起配制为共制剂用于CSII。
透明质酸降解酶通过切割透明质酸聚合物作用于降解透明质酸，所述透明质酸聚合物由重复二糖单位D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)组成，所述二糖单位经由交替的β-1→4和β-1→3糖苷键连接在一起。透明质酸链可以在长度中达到约25,000个二糖重复或更多，并且透明质酸的聚合物可以在体内大小范围为约5,000-20,000,000Da。透明质酸(也称为玻尿酸或透明质酸盐)是非硫酸化糖胺聚糖，其广泛分布于结缔、上皮和神经组织。透明质酸是细胞外基质的主要组分和间质障碍的主要组成成分。通过催化透明质酸水解，透明质酸降解酶降低透明质酸的粘度，从而增加组织穿透性且增加肠胃外施用的流体的吸收率。像这样，透明质酸降解酶例如透明质酸酶已例如与其他试剂、药物和蛋白质结合用作铺展剂或分散剂，以增强其分散和递送。
相应地，透明质酸降解酶包括具有催化透明质酸二糖链或聚合物切割的能力的任何酶。在一些例子中，降解酶切割透明质酸链或聚合物中的β-1→4糖苷键。在其他例子中，降解酶催化透明质酸链或聚合物中的β-1→3糖苷键的切割。本文提供的共制剂中的示例性透明质酸降解酶是当由细胞表达系统表达时，分泌到培养基内的透明质酸酶，包括不含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的天然透明质酸酶，或缺乏GPI锚的一个或多个氨基酸的截短的透明质酸酶，或当由其表达时不另外与细胞膜结合的透明质酸酶。此类透明质酸酶可以重组或合成产生。其他示例性透明质酸降解酶包括但不限于具有切割透明质酸的能力的特定软骨素酶和裂解酶。
在本文方法中提供的透明质酸降解酶还包括如本文描述的透明质酸降解酶的等位基因或物种变体或其他变体。例如，透明质酸降解酶可以含有在其一级序列中的一个或多个变异，例如氨基酸置换、添加和/或缺失。与不含该变异的透明质酸降解酶相比较，透明质酸降解酶的变体一般显示出至少或约60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性。任何变异都可以包括在透明质酸降解酶中用于本文目的，条件是酶保留透明质酸酶活性，例如至少或约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的不含该变异的透明质酸降解酶活性(如通过本领域众所周知和本文描述的体外和/或体内测定法测量的)。
多种形式的透明质酸降解酶包括透明质酸酶已进行制备且批准用于对象包括人中的治疗用途。例如，动物衍生的透明质酸酶制剂包括
Figure BDA0000465955830000691
(ISTA Pharmaceuticals)，纯化的绵羊睾丸透明质酸酶和
Figure BDA0000465955830000692
(Amphastar Pharmaceuticals)，牛睾丸透明质酸酶。(Baxter)是通过遗传改造的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的人重组透明质酸酶，所述CHO细胞含有编码截短的人PH20多肽(指名rHuPH20)的核酸。应当理解透明质酸降解酶例如任何透明质酸酶都可以包括在本文提供的稳定共制剂中(参见例如，整体引入本文作为参考的美国专利号7,767,429以及美国公开号20040268425和20100143457)。
一般地，为了本文用途，使用人透明质酸降解酶例如人PH20和特别是如本文描述的C末端截短的人PH20。尽管可以利用来自其他动物的透明质酸降解酶例如PH20，但此类制剂是潜在免疫原性的，因为它们是动物蛋白质。例如，显著比例的患者证实摄入食物继发的先前致敏，并且因为这些是动物蛋白质，所以所有患者都具有后续致敏的危险。因此，非人制剂可能不适合于长期使用。如果需要非人制剂，则它们可以制备为具有减少的免疫原性。此类修饰在本领域技术人员的水平内，并且可以包括例如在分子上的一个或多个抗原表位的去除和/或替换。
在本文提供的共制剂中使用的透明质酸降解酶(包括透明质酸酶(例如，PH20))可以重组产生，或可以由天然来源例如由睾丸提取物纯化或部分纯化。用于产生重组蛋白质包括重组透明质酸降解酶的方法在本文其他地方提供，并且是本领域众所周知的。
1.透明质酸酶
透明质酸酶是透明质酸降解酶大家族的成员。一般存在三类透明质酸酶：哺乳动物型透明质酸酶，细菌透明质酸酶以及来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶。此类酶可以用于本文提供的共制剂中。
a.哺乳动物型透明质酸酶
哺乳动物型透明质酸酶(EC3.2.1.35)是内切-β-N-乙酰-己糖胺酶，其将透明质酸的β-1→4糖苷键水解成多个寡糖长度例如四糖和六糖。这些酶具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，一般为C4-S和C6-S。这类透明质酸酶包括但不限于来自下述的透明质酸酶：母牛(牛)(SEQ ID NO:10、11、64和BH55(美国专利号5,747,027和5,827,721)、绵羊(绵羊(Ovis aries))(SEQ ID NO：26、27、63和65)、黄蜂(SEQID NO:12和13)、蜜蜂(SEQ ID NO:14)、白脸大黄蜂(SEQ ID NO:15)、胡蜂(SEQ ID NO:16)、小鼠(SEQ ID NO:17-19、32)、猪(SEQ ID NO:20-21)、大鼠(SEQ ID NO:22-24、31)、兔(SEQ ID NO:25)、猩猩(SEQ ID NO:28)、食蟹猴(SEQ ID NO:29)、豚鼠(SEQ ID NO:30)、黑猩猩(SEQ ID NO:185)、恒河猴(SEQ ID NO:186)和人透明质酸酶。
哺乳动物透明质酸酶可以进一步再分成主要在睾丸提取物中发现的中性活性、和主要在器官例如肝中发现的酸性活性的那些。示例性中性活性透明质酸酶包括PH20，包括但不限于衍生自不同物种例如绵羊(SEQ IDNO:27)、牛(SEQ ID NO:11)和人(SEQ ID NO:1)的PH20。人PH20(也称为SPAM1或精子表面蛋白质PH20)一般经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着至质膜。它天然涉及精-卵附着且通过消化玻尿酸帮助精子穿透卵丘细胞层。在此处共制剂中使用的示例性透明质酸酶是中性活性透明质酸酶。
除了人PH20(也称为SPAM1)外，在人基因组中已鉴定五种透明质酸酶样基因，HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和HYALP1。HYALP1是假基因，并且HYALP3(SEQ ID NO:38中所示的前体多肽)仍未显示具有针对任何已知底物的酶活性。HYALP4(SEQ ID NO:39中所示的前体多肽)是软骨素酶，并且显示出针对透明质酸的很少活性。HYALP1(SEQ ID NO:36中所示的前体多肽)是典型的酸性活性酶，并且PH20(SEQ ID NO:1中所示的前体多肽)是典型的中性活性酶。酸性活性透明质酸酶例如HYAL1和HYAL2(SEQ ID NO:37中所示的前体多肽)一般在中性pH(即pH7)下缺乏催化活性。例如，HYAL1超过pH4.5具有很少的体外催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochem.251:263-269)。HYAL2是在体外具有极低比活性的酸性活性酶。透明质酸酶样酶还可以特征在于一般经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着至质膜的那些，例如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova,等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA100(8):4580-5)，以及一般可溶的那些例如人HYAL1(Frost等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1):10-5)。
PH20
PH20，如同其他哺乳动物透明质酸酶，是内切-β-N-乙酰-己糖胺酶，其将玻尿酸的β-1→4糖苷键水解成多个寡糖长度例如四糖和六糖。它们具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解玻尿酸和硫酸软骨素(CS)，例如C4-S和C6-S。PH20天然涉及精-卵附着且通过消化玻尿酸帮助精子穿透卵丘细胞层。PH20位于精子表面上和溶酶体衍生的顶体中，在其中它与顶体内膜结合。质膜PH20具有仅在中性pH下的透明质酸酶活性，而顶体内膜PH20具有在中性和酸性pH下的活性。除了是透明质酸酶外，PH20还看起来是HA诱导的细胞发信号的受体，和围绕卵母细胞的透明带的受体。
示例性PH20蛋白质包括但不限于人(SEQ ID NO:1中所示的前体多肽、SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽)、牛(SEQ ID NO：11和64)、兔(SEQ ID NO：25)、绵羊PH20(SEQ ID NO：27、63和65)、食蟹猴(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：30)、大鼠(SEQ ID NO：31)、小鼠(SEQ ID NO：32)、黑猩猩(SEQ ID NO：185)和恒河猴(SEQ ID NO:186)PH20多肽。
牛PH20是553氨基酸前体多肽(SEQ ID NO:11)。牛PH20与人PH20的比对仅显示弱同源性，其中由于牛多肽中GPI锚的不存在，存在从氨基酸470直到各自羧基末端的多个缺口(参见例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4：427-440)。事实上，明确的GPI锚在除了人外的许多其他PH20物种中未预测到。因此，由绵羊和牛产生的PH20多肽作为可溶形式天然存在。尽管牛PH20非常松散地附着至质膜存在，但它不经由磷脂酶敏感性锚附着(Lalancette等人(2001)Biol Reprod.65(2):628-36)。牛透明质酸酶的这个独特特征已允许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为临床使用的提取物
Figure BDA0000465955830000721
人PH20mRNA转录物通常翻译，以生成509氨基酸前体多肽(SEQ IDNO:1)，其含有在N末端处的35氨基酸信号序列(氨基酸残基位置1-35)和在C末端处的19氨基酸糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着信号序列(氨基酸残基位置491-509)。因此，成熟PH20是SEQ ID NO:2中所示的474氨基酸多肽。在前体多肽转运至ER和信号肽去除后，切割C末端GPI附着信号肽，以促进在对应于SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的第490位的氨基酸位置处GPI锚与新近形成的C末端氨基酸的共价附着。因此，产生具有SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的474氨基酸GPI锚定的成熟多肽。
尽管当人PH20经由GPI锚存在于质膜处时，它是中性活性透明质酸酶，但当它在顶体内膜上表达时，它在中性和酸性pH下显示出活性。看起来PH20含有在多肽的不同区域处的两个催化位点：肽1和肽3区(Cherr等人，(2001)Matrix Biology20:515-525)。证据提示对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的氨基酸位置107-137和SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的位置142-172的PH20的肽1区，是在中性pH下的酶活性所需的。在这个区域内的第111和113位处的氨基酸(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽)看起来对于活性是重要的，因为与野生型PH20相比较，通过氨基酸替换的诱变导致分别具有3%透明质酸酶活性或无法检测的透明质酸酶活性的PH20多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的氨基酸位置242-262和SEQID NO:1中所示的前体多肽的位置277-297的PH20的肽3区，看起来对于酸性pH下的酶活性是重要的。在这个区域内，在成熟PH20多肽的第249和252位处的氨基酸看起来对于活性是必需的，并且任一个的诱变导致基本上缺乏活性的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
除了催化位点外，PH20还含有透明质酸结合位点。实验数据提示这个位点位于肽2区中，这对应于SEQ ID NO:1中所示的前体多肽的氨基酸位置205-235和SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的位置170-200。这个区域在透明质酸酶中是高度保守的，并且类似于肝素结合基序。在第176位处(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽)的精氨酸残基至甘氨酸的突变导致仅具有野生型多肽的约1%透明质酸酶活性的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247:810-814)。
在SEQ ID NO:1中例示的多肽的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处，在人PH20中存在七个潜在N联糖基化位点。因为SEQ IDNO:1的氨基酸36-464看起来含有最低限度活性的人PH20透明质酸酶结构域，所以N联糖基化位点N-490不是适当透明质酸酶活性所需的。在人PH20中存在六个二硫键。在SEQ ID NO:1中例示的多肽的半胱氨酸残基C60和C351之间以及C224和C238之间的两个二硫键(分别对应于SEQ IDNO:2中所示的成熟多肽的残基C25和C316以及C189和C203)。进一步的四个二硫键在SEQ ID NO:1中例示的多肽的半胱氨酸残基C376和C387之间；C381和C435之间；C437和C443之间；以及C458和C464之间(分别对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽的残基C341和C352；C346和C400之间；C402和C408之间；以及C423和C429之间)形成。
b.细菌透明质酸酶
细菌透明质酸酶(EC4.2.2.1或EC4.2.99.1)降解透明质酸和不同程度的硫酸软骨素和硫酸皮肤素。从细菌中分离的透明质酸裂解酶的作用方式不同于透明质酸酶(来自其他来源例如透明质酸葡糖胺酶，EC3.2.1.35)。它们是内切-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，其催化透明质酸中的N-乙酰-β-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸残基之间的β1→4-糖苷键的消除反应，而不是水解，获得3-(4-脱氧-β-D-葡-4-糖醛酸基(enuronosyl))-N-乙酰-D-葡糖胺四糖和六糖，以及二糖终产物。该反应导致在其非还原端处具有不饱和已糖醛酸残基的寡糖形成。
用于本文提供的共制剂的来自细菌的示例性透明质酸酶包括但不限于微生物中的透明质酸降解酶，所述微生物包括节杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和链霉菌属(Streptomyces)菌株。此类酶的特定例子包括但不限于节杆菌属物种(菌株FB24)(SEQ ID NO:67)、噬菌蛭弧菌(SEQ IDNO:68)、痤疮丙酸杆菌(SEQ ID NO:69)、无乳链球菌((SEQ ID NO:70)；18RS21(SEQ ID NO:71)；血清型Ia(SEQ ID NO:72)；血清型III(SEQ IDNO:73)、金黄色葡萄球菌(菌株COL)(SEQ ID NO:74)；菌株MRSA252(SEQID NO:75和76)；菌株MSSA476(SEQ ID NO:77)；菌株NCTC8325(SEQ IDNO:78)；菌株牛RF122(SEQ ID NO:79和80)；菌株USA300(SEQ ID NO:81)、肺炎链球菌((SEQ ID NO:82)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO:83)；血清型2、菌株D39/NCTC7466(SEQ ID NO:84)、化脓性链球菌(血清型M1)(SEQ ID NO:85)；血清型M2、菌株MGAS10270(SEQ ID NO:86)；血清型M4、菌株MGAS10750(SEQ ID NO:87)；血清型M6(SEQ ID NO:88)；血清型M12、菌株MGAS2096(SEQ ID NO:89和90)；血清型M12、菌株MGAS9429(SEQ ID NO:91)；血清型M28(SEQ ID NO:92)；猪链球菌(SEQ IDNO:93-95)；费氏弧菌(菌株ATCC700601/ES114(SEQ ID NO:96))，和Streptomyces hyaluronolyticus透明质酸酶，其对于玻尿酸是特异性的并且不切割软骨素或硫酸软骨素(Ohya，T.和Kaneko，Y.(1970)Biochim.Biophys.Acta198:607)。
c.来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶
来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC3.2.1.36)是内切-β-葡糖醛酸苷酶，其生成四糖和六糖终产物。这些酶催化透明质酸中的β-D-葡糖醛酸盐和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1→3-键的水解。来自水蛭的示例性透明质酸酶包括但不限于来自下述的透明质酸酶：水蛭科(Hirudinidae)(例如医用水蛭(Hirudo medicinalis))、石蛭科(Erpobdellidae)(例如Nephelopsis obscura和Erpobdella punctata)、舌蛭科(Glossiphoniidae)(例如Desserobdella picta、静泽蛭(Helobdella stagnalis)、扁舌蛭(Glossiphoniacomplanata)、润饰盾蛭(Placobdella ornata)和晶蛭属物种(Theromyzon sp.))和黄蛭科(Haemopidae)(马蛭(Haemopis marmorata))(Hovingh等人(1999)Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.124(3):319-26)。具有与水蛭透明质酸酶相同作用机制的来自细菌的示例性透明质酸酶是来自蓝细菌聚球藻属物种(Synechococcus sp.)(菌株RCC307，SEQ ID NO:97)的那种。
2.其他透明质酸降解酶
除了透明质酸酶家族外，其他透明质酸酶也可以用于本文提供的CSII方法中。例如，可以采用具有切割透明质酸酶能力的酶，包括特定软骨素酶和裂解酶。可以降解透明质酸酶的示例性软骨素酶包括但不限于软骨素ABC裂解酶(也称为软骨素酶ABC)、软骨素AC裂解酶(也称为硫酸软骨素裂解酶或硫酸软骨素消除酶)和软骨素C裂解酶。用于在提供的组合物、组合和方法中使用的此类酶的生产和纯化方法是本领域已知的(例如，美国专利号6,054,569；Yamagata,等人(1968)J.Biol.Chem.243(7):1523-1535；Yang等人(1985)J.Biol.Chem.160(30):1849-1857)。
软骨素ABC裂解酶包含两种酶，硫酸软骨素ABC内切裂解酶(EC4.2.2.20)和硫酸软骨素ABC外切裂解酶(EC4.2.2.21)(Hamai等人(1997)JBiol Chem.272(14):9123-30)，其降解多种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的葡糖氨基聚糖。硫酸软骨素、硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸皮肤素是用于硫酸软骨素ABC内切裂解酶的优选底物，但该酶还可以以较低速率作用于透明质酸酶。硫酸软骨素ABC内切裂解酶降解多种硫酸软骨素和硫酸皮肤素类型的葡糖氨基聚糖，产生不同大小的Δ4-不饱和寡糖的混合物，其最终降解为Δ4-不饱和四糖和二糖。硫酸软骨素ABC外切裂解酶具有相同的底物特异性，但从聚合硫酸软骨素及其通过硫酸软骨素ABC内切裂解酶产生的寡糖片段的非还原端去除二糖残基(Hamai，A.等人(1997)J.Biol.Chem.272:9123-9130)。示例性硫酸软骨素ABC内切裂解酶和硫酸软骨素ABC外切裂解酶包括但不限于来自普通变形杆菌和肝素黄杆菌的那些(普通变形杆菌硫酸软骨素ABC内切裂解酶在SEQ ID NO:98中显示(Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1):39-46)。
软骨素AC裂解酶(EC4.2.2.5)对硫酸软骨素A和C、软骨素和玻尿酸具有活性，但对硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)不具有活性。来自细菌的示例性软骨素酶AC酶包括但不限于来自肝素黄杆菌和Victivallis vadensis(分别在SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100中所示)、和金黄色节杆菌的那些(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology30(5):387-444)。
软骨素酶C切割硫酸软骨素C，产生四糖加上不饱和6-硫酸化二糖(δDi-6S)。它还切割玻尿酸，产生不饱和的非硫酸化二糖(δDi-OS)。来自细菌的示例性软骨素酶C酶包括但不限于来自链球菌属和黄杆菌属的那些(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J.Biol.Chem.251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262:127-133)。
3.截短的透明质酸降解酶或其他可溶形式
透明质酸降解酶可以以膜约束或膜结合形式存在，或当由细胞表达时可以分泌到培养基内且从而以可溶形式存在。为了本文目的，透明质酸降解酶包括任何透明质酸降解酶，当由细胞表达且分泌时，所述透明质酸降解酶不与细胞膜结合，并且从而以可溶形式存在。可溶性透明质酸降解酶包括但不限于透明质酸酶，包括非人透明质酸酶(例如动物或细菌透明质酸酶)，例如牛PH20或绵羊PH20，和人透明质酸酶例如Hyal1，或截短形式的非人或人膜结合的透明质酸酶，特别是截短形式的人PH20，其等位基因变体及其他变体。在本文的共制剂中的示例性透明质酸降解酶是截短形式的透明质酸降解酶，其缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的一个或多个氨基酸残基且保留透明质酸酶活性。在一个例子中，通过在C末端处的GPI锚的全部或部分的截短和去除，可以使得通常经由GPI锚膜锚定的人透明质酸酶PH20可溶。
因此，在一些情况下，通常GPI锚定的透明质酸降解酶(例如人PH20)通过在C末端处的截短使得可溶。此类截短可以去除GPI锚附着信号序列的全部，或可以仅去除GPI锚附着信号序列的一些。然而，所得到的多肽是可溶的。在其中可溶性透明质酸降解酶保留GPI锚附着信号序列的部分的情况下，可以保留GPI锚附着信号序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸残基，条件是该多肽是可溶的(即当由细胞表达时，分泌的)和活性的。本领域技术人员可以使用本领域众所周知的方法确定多肽是否是GPI锚定的。此类方法包括但不限于使用已知算法预测GPI锚附着信号序列和ω-位点的存在和定位，并且在用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)或D(PI-PLD)消化前和后进行可溶性分析。
示例性可溶性透明质酸酶是来自任何物种的PH20，例如SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中任一所示的任何，或其缺乏C末端GPI锚的全部或部分的截短形式，只要透明质酸酶是可溶的且保留透明质酸酶活性。C末端截短的且缺乏GPI锚附着信号序列的全部或部分的示例性可溶性透明质酸酶包括但不限于灵长类动物起源的PH20多肽，例如人和黑猩猩PH20多肽。例如，可以通过SEQ ID NO:1、2或185中所示的成熟或前体多肽中的任何、或其等位基因或其他变异包括其活性片段的C末端截短，制备可溶性PH20多肽，其中所得到的多肽是可溶的，并且缺乏来自GPI锚附着信号序列的氨基酸残基的全部或部分。在可溶性透明质酸酶中还包括的是SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中的任何的等位基因变体或其他变体，或其截短形式。等位基因变体及其他变体是本领域技术人员已知的，并且包括与SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30-32、63-65和185-186中的任何具有60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更多序列同一性的多肽，或其截短形式。氨基酸变体包括保守和非保守突变。应当理解，重要的或透明质酸酶活性另外需要的残基，例如上文描述的或本领域技术人员已知的任何残基，一般是不变的且不能被改变。这些包括例如活性位点残基。因此，例如，人PH20多肽或其可溶形式的氨基酸残基111、113和176(对应于SEQ ID NO:2中所示的成熟PH20多肽中的残基)一般是不变的且不改变的。赋予糖基化和正确折叠所需的二硫键形成的其他残基也可以不变。
a.C末端截短的人PH20
示例性可溶性透明质酸酶是C末端截短的人PH20。C末端截短形式的重组人PH20已得到产生，并且可以用于本文描述的共制剂中。此类可溶形式的PH20的产生在美国专利号7,767,429以及美国专利申请号US20040268425；US20050260186、US20060104968和US20100143457中描述。
例如，C末端截短的PH20多肽包括至少含有氨基酸36-464(透明质酸酶活性所需的最小部分)的多肽，或包括与这样的氨基酸序列具有至少85%，例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%序列同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQID NO:1的至少氨基酸36-464且保留透明质酸酶活性。在这些多肽中包括的是人PH20多肽，其完全缺乏全部GPI锚附着信号序列。在这些多肽中还包括的是人PH20多肽，其缺乏GPI锚附着信号序列的邻接氨基酸残基的部分(称为延长的可溶性PH20(esPH20)；参见例如US20100143457)。与全长野生型多肽例如具有SEQ ID NO:1或2中所示序列的全长野生型多肽，或其等位基因或物种变体或其他变体相比较，C末端截短的PH20多肽可以是C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60个或更多个氨基酸的。因此，代替在ER中具有共价附着至蛋白质的C末端的GPI锚且锚定至质膜的细胞外片，当由细胞表达时，这些多肽是分泌的且是可溶的。
本文提供的示例性C末端截短的人PH20多肽包括任何下述多肽，其包括SEQ ID NO:1的至少氨基酸36-464，并且在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500后是C末端截短的，或其显示出与之至少85%序列同一性，例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%、98%序列同一性且保留透明质酸酶活性的变体。表4提供了示例性C末端截短的PH20多肽的非限制性例子。在下表4中，提供了前体和成熟多肽的长度(以氨基酸表示)，和其中显示C末端截短的PH20蛋白质的前体和成熟多肽的示例性氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。野生型PH20多肽也包括在表4中用于比较。
表4.示例性C末端截短的PH20多肽
Figure BDA0000465955830000781
Figure BDA0000465955830000791
b.rHuPH20
示例性C末端截短形式的SEQ ID NO:1是其在SEQ ID NO:1中所示的序列的氨基酸482后截短的多肽。此类多肽可以由编码氨基酸1-482的核酸分子(SEQ ID NO:3中所示)生成。此类示例性核酸分子在SEQ ID NO:49中显示。翻译后加工去除35氨基酸信号序列，留下447氨基酸可溶性重组人PH20(SEQ ID NO:4)。当在培养基中产生时，在C末端处存在异质性，从而使得指名rHuPH20的产物包括种类的混合物，所述种类可以包括以不同丰度的SEQ ID NO.4-9中的任何一个或多个。一般地，rHuPH20在促进正确N-糖基化以保留活性的细胞例如CHO细胞(例如DG44CHO细胞)中产生。
4.透明质酸降解酶的糖基化
一些透明质酸降解酶包括透明质酸酶的糖基化(包括N和O联糖基化)对于其催化活性和稳定性可以是重要的。虽然改变聚糖类型修饰糖蛋白可以对蛋白质的抗原性、结构折叠、可溶性和稳定性具有显著作用，但大多数酶不认为需要糖基化用于最佳酶活性。对于一些透明质酸酶，N联糖基化的去除可以导致透明质酸酶活性的几乎完全失活。因此，对于此类透明质酸酶，N联聚糖的存在对于生成活性酶是关键的。
N联寡糖分成几个主要类型(寡聚甘露糖、复杂、混合、硫酸化)，所有这些都具有经由Asn残基的酰胺氮附着的(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核，所述Asn残基属于-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)。对于凝固蛋白C，已报道在-Asn-Xaa-Cys-位点处的糖基化。在一些情况下，透明质酸降解酶例如透明质酸酶可以含有N-糖苷键和O-糖苷键。例如，PH20具有O联寡糖以及N联寡糖。存在SEQ ID NO：1中例示的人PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处的七个潜在N联糖基化位点。氨基酸残基N82、N166和N254由复杂型聚糖占据，而氨基酸残基N368和N393由高甘露糖型聚糖占据。氨基酸残基N235由约80%高甘露糖型聚糖和20%复杂型聚糖占据。如上所述，在N490处的N联糖基化不是透明质酸酶活性所需的。
在一些例子中，用于在本文中使用的透明质酸降解酶在糖基化位点中的一个或全部处是糖基化的。例如，对于人PH20或其可溶形式，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的2、3、4、5或6个是糖基化的。在一些例子中，透明质酸降解酶在一个或多个天然糖基化位点处是糖基化的。一般可溶形式的PH20使用蛋白质表达系统产生，所述蛋白质表达系统促进正确N-糖基化以确保多肽保留活性，因为糖基化对于透明质酸酶的催化活性和稳定性是重要的。此类细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如DG44CHO细胞)。
在其他例子中，透明质酸降解酶在一个或多个非天然糖基化位点处进行修饰，以在一个或多个另外位点处赋予多肽的糖基化。在此类例子中，另外的糖部分的附着可以增强分子的药物代谢动力学性质，例如改善的半衰期和/或改善的活性。
在其他例子中，在本文提供的方法中使用的透明质酸降解酶例如PH20或人PH20是部分去糖基化的(或N部分糖基化多肽)(参见例如US20100143457)。糖苷酶或糖苷水解酶是催化糖苷键水解的酶，以生成两个更小的糖。脊椎动物中主要类型的N-聚糖包括高甘露糖聚糖、混合聚糖和复杂聚糖。存在仅导致部分蛋白质去糖基化的几个糖苷酶，包括：EndoF1，其切割高甘露糖和混合型聚糖；EndoF2，其切割双触角复杂型聚糖；EndoF3，其切割双触角和更多支链的复杂聚糖；和EndoH，其切割高甘露糖和混合型聚糖。例如，用上述糖苷酶(例如EndoF1、EndoF2EndoF3和/或EndoH)中的一种或全部处理PH20(例如指名rHuPH20的重组PH20)导致部分去糖基化。这些部分去糖基化的PH20多肽可以显示出透明质酸酶酶促活性，其与完全糖基化的多肽可比较。相比之下，用PNG酶F(切割所有N-聚糖的糖苷酶)或用GlcNAc磷酸转移酶(GPT)抑制剂衣霉素处理PH20，导致所有N-聚糖的完全去糖基化，且从而使PH20变得酶促失活。因此，尽管所有N联糖基化位点(例如在SEQ ID NO:1中例示的人PH20的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393处的那些)可以是糖基化的，但与不用一种或多种糖苷酶消化的透明质酸酶相比较，用一种或多种糖苷酶处理可以使糖基化程度变得减少。
因此，部分去糖基化的透明质酸降解酶例如部分去糖基化的可溶性透明质酸酶可以通过用一种或多种糖苷酶消化产生，所述糖苷酶一般为不去除任何N聚糖而仅使蛋白质部分去糖基化的糖苷酶。部分去糖基化的透明质酸降解酶包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽，可以具有完全糖基化多肽的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%糖基化水平。在一个例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的1、2、3、4、5或6个是部分去糖基化的，从而使得它们不再含有高甘露糖或复杂型聚糖，而是含有至少N-乙酰葡糖胺部分。在一些例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166和N254的N-糖基化位点中的1、2或3个是去糖基化的，即，它们不含糖部分。在其他例子中，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸N82、N166、N235、N254、N368和N393的N-糖基化位点中的3、4、5或6个是糖基化的。糖基化的氨基酸残基最低限度含有N-乙酰葡糖胺部分。一般地，部分去糖基化的透明质酸降解酶包括部分去糖基化的可溶性PH20多肽显示出这样的透明质酸酶活性，其是由完全糖基化的多肽显示出的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%、1000%或更多透明质酸酶活性。
5.透明质酸降解酶的修饰改善其药物代谢动力学性质
透明质酸降解酶可以进行修饰，以改善其药物代谢动力学性质，例如增加其体内半衰期和/或活性。用于在本文提供的方法中使用的透明质酸降解酶的修饰可以包括经由接头直接或间接，例如共价或通过其他稳定连接附着聚合物，例如右旋糖酐、聚乙二醇(聚乙二醇化(PEG))或唾液酸基部分，或其他此类聚合物例如天然或糖聚合物。
治疗剂的聚乙二醇化已知增加对蛋白酶解的抗性、增加血浆半衰期且降低抗原性和免疫原性。聚合分子例如聚乙二醇部分(PEG)与透明质酸降解酶的共价或其他稳定附着(缀合)因此可以对所得到的酶-聚合物组合物赋予有利性质。此类性质包括改善的生物相容性、在对象内的血液、细胞和/或其他组织中的蛋白质(和酶促活性)半衰期的延长、蛋白质不受蛋白酶和水解的有效屏蔽、改善的生物分布、增强的药物代谢动力学和/或药效学、和增加的水溶性。
可以缀合至透明质酸降解酶的示例性聚合物包括天然和合成同聚物例如多元醇(即聚OH)、聚胺(即聚NH2)和聚羧酸(即聚COOH)，和进一步的杂聚物即包含一个或多个不同偶联基团例如羟基和氨基的聚合物。合适聚合分子的例子包括选自下述中的聚合分子：聚烷撑氧化物(PAO)例如聚烷撑二醇(PAG)，包括聚丙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚-D，L-氨基酸，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，右旋糖酐包括羧甲基-右旋糖酐，肝素，同源白蛋白，纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羧丙基纤维素，壳聚糖水解产物，淀粉例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜尔胶，支链淀粉，菊粉，黄原胶，角叉菜胶，果胶，海藻酸水解产物和生物聚合物。
一般地，聚合物为聚烷撑氧化物(PAO)例如聚氧化乙烯，例如PEG，一般为mPEG，其与多糖例如右旋糖酐、支链淀粉等相比较，具有能够交联的少数反应基团。一般地，聚合物是无毒聚合分子例如(m)聚乙二醇(mPEG)，其可以使用相对简单的化学作用共价缀合至透明质酸降解酶(例如蛋白质表面上的附着基团)。
用于附着至透明质酸降解酶的合适聚合分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物，例如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支链PEG和聚氧化乙烯(PEO)(参见例如Roberts等人，Advanced Drug Delivery Review2002，54：459-476；Harris和Zalipsky，S(编辑)"Poly(ethylene glycol)，Chemistry and BiologicalApplications"ACS Symposium Series680，1997；Mehvar等人，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.，3(1):125-136，2000；Harris，Nature Reviews2(3):214-221(2003)；和Tsubery，J Biol.Chem279(37):38118-24，2004)。聚合分子可以具有一般范围为约3kDa-约60kDa的分子量。在一些实施方案中，缀合至蛋白质例如rHuPH20的聚合分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或超过60kDa的分子量。
通过共价附着(缀合)PEG或PEG衍生物(即，“聚乙二醇化”)修饰多肽的多种方法是本领域已知的(参见例如美国专利公开号20060104968和U.S.20040235734；美国专利号5,672,662和U.S.6,737,505)。用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门接头和偶联化学(参见例如Roberts等人，Adv.DrugDeliv.Rev.54:459-476，2002)、多个PEG部分与单个缀合位点的附着(例如经由支链PEG的使用；参见例如Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12:177-180，2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如Chapman等人，Nature Biotech.17:780-783，1999)、和定点酶促聚乙二醇化(参见例如Sato，Adv.Drug Deliv.Rev.，54:487-504，2002)(还参见例如Lu和Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.43:127-138；Lu和Felix(1993)PeptideRes.6:142-6，1993；Felix等人(1995)Int.J.Peptide Res.46:253-64；Benhar等人(1994)J.Biol.Chem.269:13398-404；Brumeanu等人(1995)J Immunol.154:3088-95；see also，Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10):1261-77和Molineux(2003)Pharmacotherapy23(8Pt2):3S-8S)。本领域描述的方法和技术可以产生具有附着至单个蛋白质分子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个PEG或PEG衍生物的蛋白质(参见例如美国专利公开号20060104968)。
用于聚乙二醇化的众多试剂已在本领域中得到描述。此类试剂包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活化PEG、琥珀酰亚胺基mPEG、mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺、mPEG琥珀酰亚胺基α-丁酸甲酯、mPEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羟基丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯、同双功能PEG丙醛、同双功能PEG丁醛、PEG马来酰亚胺、PEG酰肼、对硝基苯基碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支链mPEG2丁醛、mPEG乙酰基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG“无接头”马来酰亚胺、mPEG乙烯基砜、mPEG硫醇、mPEG邻吡啶基硫酯、mPEG邻二硫吡啶、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯基砜PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、荧光素PEG-NHS、和生物素PEG-NHS(参见例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6:62-69，1995；Veronese等人，J.Bioactive CompatiblePolymers12:197-207，1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324，844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795，569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990，237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；US2004/0235734；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP01064951；EP0822199；WO01076640；WO0002017；WO0249673；WO0500360；WO9428024；和WO0187925)。
F.超速效胰岛素制剂及其稳定制剂
超速效胰岛素组合物是含有速效胰岛素例如速效胰岛素类似物(或快速作用类似物)和透明质酸降解酶的共制剂。此类组合物可以用于本文的CSII方法中。与常规速效胰岛素例如胰岛素类似物相比较，超速效胰岛素组合物提供了更密切地模拟非糖尿病对象的内源(即天然)餐后胰岛素释放的超快速胰岛素应答。此类超速效胰岛素组合物是本领域已知的(参见例如美国公开号US20090304665)。
超速效胰岛素组合物含有用于控制血糖水平的治疗有效量的速效胰岛素和足以使组合物变成超速效胰岛素组合物的透明质酸降解酶量。在部分D中所述的任何速效胰岛素和部分E中所述的任何透明质酸降解酶都可以在共制剂中组合，以生成超速效胰岛素组合物，只要所得到的组合物在施用时实现超快速胰岛素应答。
一般地，在超速效胰岛素组合物中的速效胰岛素量是或是约10U/mL-1000U/mL，并且透明质酸降解酶的量在功能上等于1U/mL-10,000U/mL。例如，速效胰岛素的量是或是约或至少100U/mL，并且透明质酸降解酶的量在功能上等于或约或至少600U/mL。在其中速效胰岛素是普通胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或谷赖胰岛素或其他相似大小的速效胰岛素的一些例子中，超速效胰岛素组合物中的胰岛素量是或是约0.35mg/mL-35mg/mL。
在特定例子中，透明质酸降解酶是如美国临时申请号61/520,962中所述且名称为“Stable co-formulations of a hyaluronan-degrading enzyme andinsulin”的稳定共制剂。在特定例子中，为了持续皮下输注的目的，超速效胰岛素组合物在32℃-40℃或约32℃-40℃下稳定至少3天，
1.稳定共制剂
本文提供的共制剂含有治疗有效量的速效胰岛素，例如快速作用胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素或谷赖胰岛素)。例如，共制剂含有以在下述量之间或大约在下述量之间的速效胰岛素：10U/mL-1000U/mL10U/mL-1000U/mL、100U/mL-1000U/mL或500U/mL-1000U/mL，例如至少或约至少10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL、350U/mL、400U/mL、450U/ml、500U/mL或1000U/mL。例如，本文提供的共制剂含有以至少或至少约100U/mL的量的速效胰岛素，例如快速作用胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素或谷赖胰岛素)。
在稳定共制剂中的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的量是使组合物变得超速效的量。例如，透明质酸降解酶是在功能上等于至少或约至少30单位/mL的量。例如，稳定共制剂含有以在下述之间或大约在下述之间的量的透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)：30单位/mL-3000U/mL、300U/mL-2000U/mL或600U/mL-2000U/mL或600U/mL-1000U/mL，例如至少或约至少30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/ml、2000U/mL或3000U/mL。例如，本文提供的共制剂含有PH20(例如rHuPH20)，其为至少100U/mL-1000U/mL，例如至少或约至少或约或600U/mL的量。
稳定共制剂的体积可以是适合于它在其中提供的容器的任何体积。在一些例子中，共制剂在小瓶、注射器、笔、用于泵或闭环系统的储库、或任何其他合适容器中提供。例如，本文提供的共制剂在0.1mL-500mL之间或大约在0.1mL-500mL之间，例如0.1mL-100mL、1mL-100mL、0.1mL-50mL，例如至少或约至少或约或0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。
在稳定共制剂中，制剂中的胰岛素包括胰岛素类似物的稳定性是在至少或约32℃-40℃贮存下胰岛素的恢复、纯度和/或活性的函数。本文提供的制剂保留胰岛素恢复、纯度和/或活性，从而使得制剂适合于如本文描述的治疗用途。例如，在本文提供的制剂中，在一段时间内和在如本文描述的贮存或使用条件下的胰岛素纯度(例如如通过RP-HPLC或其他相似方法评估的)是在贮存或使用前制剂中的胰岛素的至少90%纯度、效力或恢复，例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。一般地，对于胰岛素纯度(例如通过RP-HPLC)，靶可接受规格是至少或约90%纯度或约或大于90%纯度。在其他例子中，可以例如使用非变性或变性尺寸排阻色谱法(SEC)，以胰岛素的聚集作为函数评估胰岛素纯度。在此类例子中，在本文提供的共制剂中含有按峰面积计小于2%高分子量(HMWt)胰岛素种类，例如小于1.9%、1.8%、1.7%、1.6%、1.5%、1.4%,1.3%、1.2%、1.1%、1.0%或更少。
在稳定共制剂中，透明质酸降解酶包括透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)在制剂中的稳定性是在至少或约32℃-40℃贮存下酶的恢复和/或活性的函数。本文提供的制剂保留透明质酸酶恢复和/或活性，从而使得制剂适合于如本文描述的治疗用途。在本文提供的稳定共制剂中，在32℃-40℃或约32℃-40℃下至少3天，透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20的活性一般大于起始透明质酸酶活性的50%，例如至少或大于55%、60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。一般地，对于透明质酸酶活性，关于稳定性的靶可接受规格是酶活性的至少62%。因此，例如，在用600U/mL透明质酸降解酶例如rHuPH20配制的溶液中，在一段时间内和在贮存或使用条件下保留至少或约至少360单位/mL、365U/mL、370U/mL、375U/mL、380U/mL、390U/mL、420U/mL、480U/mL、540U/mL、546U/mL、552U/mL、558U/mL、564U/mL、570U/mL、576U/mL、582U/mL、588U/mL、594U/mL或更多活性。在其他例子中，可以例如使用RP-HPLC根据酶的恢复评估稳定性。在此类例子中，在本文提供的稳定共制剂中的透明质酸降解酶恢复是60%-140%或约60%-140%。例如，在本文提供的制剂中，透明质酸酶恢复是3-7μg/mL或约3-7μg/mL。
一般地，化合物使用本领域众所周知的技术和程序配制成药物组合物(参见例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第四版，1985，126)。药学可接受的组合物考虑管理机构或其他机构批准制备，或依照一般公认的药典制备用于在动物和人中使用。制剂应适合施用方式。
稳定共制剂可以作为以液态形式的药物制剂如溶液、糖浆剂或悬浮液提供。以液态形式，药物制剂可以作为浓缩制剂提供，以在使用前稀释至治疗有效浓度。一般地，制剂以不需要稀释即可使用的剂型提供。此类液态制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂进行制备，所述药学可接受的添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在另一个例子中，药物制剂以冻干形式呈现用于在使用前用水或其他合适媒介物重构。
下文提供的是除了胰岛素和透明质酸酶外的进一步组分的描述，所述进一步组分在本文的稳定共制剂中提供。需要的特定平衡使如本文提供的共制剂中含有的两种蛋白质的稳定性达到最大，可达到共制剂的持续皮下输注至少3天，同时维持蛋白质的稳定性。组分或条件例如赋形剂、稳定剂或pH各自的描述在下文提供。
一般地，稳定共制剂组合物具有6.5-7.5或约6.5-7.5的pH，并且还含有以120mM-200mM或约120mM-200mM浓度的NaCl、抗微生物有效量的防腐剂或防腐剂混合物、稳定剂或试剂。
a.NaCl和pH
特别地，在本文中发现尽管胰岛素在2℃-8℃下在高盐浓度和低pH下结晶，但它在高盐浓度和低pH下在32℃-40℃的更高温度下不结晶。相应地，透明质酸降解酶(例如PH20)需要高盐浓度和低pH以维持其在32℃-40℃的高温下的稳定性的相反需求在更高温度下至少3天的至少短时间段更相容。此外，相同高盐和低pH制剂赋予在胰岛素类似物之间和之中的相似稳定性，尽管在更低温度下影响胰岛素稳定性的表观溶解度中的差异。
例如，在32℃-40℃的高温下稳定至少3天的本文提供的共制剂含有120mM-200mM NaCl，例如150mM NaCl-200mM NaCl或160mM NaCl-180mM NaCl，例如以或约120mM、130mM、140mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM NaCl。此外，在32℃-40℃的高温下稳定至少3天的本文提供的共制剂含有6.5-7.5或6.5-7.2的pH，例如或约6.5±0.2、6.6±0.2、6.7±0.2、6.8±0.2、6.9±0.27.0±0.2、7.10±0.2、7.20±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2或7.5±0.2的pH。特别在冷藏温度下的胰岛素溶解度在这些减少的pH和增加的盐浓度下降低。因此，此类制剂一般在使用前不贮存于冷藏或环境温度下。
b.透明质酸酶抑制剂
在另一个例子中，稳定共制剂含有透明质酸酶抑制剂作为稳定剂，以稳定共制剂中的透明质酸降解酶。在特定例子中，透明质酸酶抑制剂是这样的，其以结合和非共价方式与胰岛素或透明质酸降解酶反应，并且不与胰岛素或透明质酸降解酶形成共价复合物。透明质酸酶抑制剂至少以其平衡浓度提供。本领域技术人员熟悉多个类别的透明质酸酶抑制剂(参见例如Girish等人(2009)Current Medicinal Chemistry，16:2261-2288和本文引用的参考文献)。本领域技术人员了解且可以通过本领域的标准方法测定在本文的反应或稳定组合物中的透明质酸酶抑制剂的平衡浓度。透明质酸酶抑制剂的选择将取决于在组合物中使用的特定透明质酸降解酶。例如，当透明质酸降解酶是PH20时，透明质酸是用于在本文的稳定组合物中使用的示例性透明质酸酶抑制剂。
在本文中用作稳定剂的示例性透明质酸酶抑制剂包括但不限于蛋白质、糖胺聚糖(GAG)、多糖、脂肪酸、羊毛甾类、抗生素、抗线虫药、合成有机化合物或植物衍生的生物活性组分。例如，透明质酸酶植物衍生的植物活性组分可以是生物碱、抗氧化剂、多酚、黄酮类、萜类和消炎药。示例性透明质酸酶抑制剂包括例如血清透明质酸酶抑制剂、催眠睡茄糖蛋白(WSG)、肝素、硫酸肝素、硫酸皮肤素、壳聚糖、β-(1,4)-低聚半乳糖、硫酸毛蕊花糖、硫酸车前糖、果胶、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)、硫酸葡聚糖、海藻酸钠、来自裙带菜(的多糖、扁桃酸缩合聚合物、二十碳三烯酸、神经酸、齐墩果酸、马兜铃酸、阿马林、利血平、黄酮、去甲氧基醉椒素、槲皮苷、芹菜素、山柰酚、水飞蓟宾、木犀草素、木犀草素-7-糖苷、根皮素、芹菜苷、橙皮苷、磺化橙皮苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡糖苷、黄酮-7-硫酸钠、黄酮7-氟-4’-羟基黄酮、4’-氯-4,6-二甲氧基查耳酮、5-羟基黄酮7-硫酸钠、杨梅酮、芸香苷、桑色素、甘草甜素、维生素C、D-异抗坏血酸、D-糖1,4-内酯、L-抗坏血酸-6-十六酸酯(Vcpal)、6-O-酰化维生素C、儿茶素、去甲二氢愈创木酸、姜黄素、N-没食子酸丙酯、鞣酸、鞣花酸、没食子酸、呋哺昆布醇A、二鹅掌菜酚、8,8’-双鹅掌菜酚、原花青素、棉酚、塞来考昔、尼美舒利、地塞米松、吲哚美辛、非诺洛芬、苯基保泰松、羟布宗、水杨酸酯、色甘酸二钠、金硫丁二钠、transilist、曲呫诺、伊维菌素、林可霉素和壮观霉素、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶、硫酸新霉素、3α-乙酰多孔酸A、(25S)-(+)-12α-羟基-3α-甲基羧基-乙酸酯-24-甲基羊毛甾-8,24(31)-二烯-26-酸、羊毛甾类、多孔酸c、PS53(氢醌-硫酸-甲醛聚合物)、聚(苯乙烯-4-磺酸酯)聚合物、VERSA-TL502、1-十四烷磺酸、扁桃酸缩合聚合物(SAMMA)、1,3-二乙酰苯并咪唑-2-硫酮、N-单乙酰化苯并咪唑-2硫酮、N,N’-二乙酰化苯并咪唑-2-硫酮、烷基-2-苯基吲哚衍生物、3-丙酰苯并噁唑-2-硫酮、N-烷基化吲哚衍生物、N-酰化吲哚衍生物、苯并噻唑衍生物、N-取代吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物、N-取代吲哚-2-和3-甲酰胺衍生物的卤代类似物(氯和氟)、2-(4-羟苯基)-3-苯基吲哚、吲哚甲酰胺、吲哚乙酰胺、3-苯甲酰-1-甲基-4-苯基-4-哌啶醇、苯甲酰苯甲酸苯酯衍生物、1-精氨酸衍生物、HCL胍、L-NAME、HCN、亚麻苦苷、苦杏仁苷、常春藤苷配基、七叶皂甙、CIS-扁柏树脂酚和1,3-二-P-羟苯基-4-戊烯-1-酮。
例如，透明质酸酶(HA)包括在本文提供的共制剂中，其在32℃-40℃高温的应激条件下稳定至少3天。因为HA寡聚物是透明质酸降解酶与透明质酸的酶促反应的底物/产物，所以透明质酸寡聚物可以与酶活性位点结合且引起稳定效应。在本文例子中，稳定共制剂含有透明质酸(玻尿酸；HA)，其具有5kDa至5,000kDa、5kDa至或至约1,000kDa、5kDa至或至约200kDa或5kDa至或至约50kDa的分子量。特别地，HA的分子量小于10kDa。HA可以是由二糖组成的寡糖，例如2聚体到30聚体或4聚体到16聚体。胰岛素和透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的共制剂含有以下述浓度的HA：1mg/mL-20mg/mL或约1mg/mL-20mg/mL，例如至少或约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL或更多HA。示例性稳定共制剂包括8mg/mL-12mg/mL HA，或约8mg/mL–约12mg/mL HA，例如10mg/mL或约10mg/mL。在一些例子中，HA与透明质酸降解酶的摩尔比是或是约100,000:1、95,000:1、90,000:1、85,000:1、80,000:1、75,000:1、70,000:1、65,000:1、60,000:1、55,000:1、50,000:1、45,000:1、40,000:1、35,000:1、30,000:1、25,000:1、20,000:1、15,000:1、10,000:1、5,000:1、1,000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1或100:1或更少。
然而，还发现在一段时间内在32℃-40℃高温的应激条件下例如在37℃下大于1周或2周，透明质酸酶抑制剂例如HA在共制剂中的存在可以导致胰岛素的降解，从而导致共价HA-胰岛素类似物加合物。例如，通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，在本文提供的共制剂中高浓度HA的存在已显示引起在37℃下1周后的胰岛素
Figure BDA0000465955830000901
降解和在30℃下2周后的胰岛素
Figure BDA0000465955830000902
降解。液体色谱法-质谱法(LC-MS)分析指出一些降解产物是通过胰岛素与HA的还原端反应形成的共价HA-胰岛素类似物糖化加合物。例如，一个峰测定为胰岛素和HA7聚体的产物，而另一个峰是胰岛素
Figure BDA0000465955830000912
和HA2聚体的产物。
透明质酸酶抑制剂例如HA的存在也可以对共制剂的沉淀和变色具有作用。因此，虽然HA改善透明质酸降解酶在32℃-40℃高温的应激条件下的稳定性，但它还可以对共制剂的胰岛素降解、沉淀和变色具有作用。在所需安全和药理学参数和指导内监测这些条件在本领域技术人员的水平内。一般地，由于对这些参数的作用，含有透明质酸酶抑制剂例如HA的本文提供的稳定共制剂在高温下例如在32℃-40℃的应激条件下稳定至少3小时但不超过7天。
在本文提供的一些例子中，使用不能与胰岛素或透明质酸降解酶形成共价复合物的透明质酸酶抑制剂。因此，在本文制剂中考虑通过结合绑定起作用的非共价抑制剂。例如，稳定共制剂含有具有反应还原端的HA，从而使得它不再能够与胰岛素形成糖化加合物。例如，在一些例子中，在本文提供的共制剂中使用的HA已通过还原胺化进行修饰。还原胺化涉及醛和胺之间的希夫碱形成，所述希夫碱随后还原以形成更稳定的胺。糖即HA的还原端作为环状半缩醛形式和开链醛形式的平衡混合物存在。在本领域技术人员已知的合适条件下，胺基将与糖醛缩合，以形成可以用还原剂例如氰基硼氢化钠还原为胺的亚胺鎓(iminium)离子(参见例如Gildersleeve等人，(2008)Bioconjug Chem19(7):1485-1490)。所得到的HA与胰岛素不反应且不能形成胰岛素糖化加合物。
c.缓冲液
任何缓冲液都可以用于本文提供的共制剂中，只要它不会不利地影响共制剂的稳定性，且支持所需的必要pH范围。特别合适的缓冲液的例子包括Tris、琥珀酸盐、乙酸盐、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐、乌头酸盐、苹果酸盐和碳酸盐。然而，本领域技术人员应认识到本文提供的制剂并不限于特定缓冲液，只要缓冲液提供可接受程度的pH稳定性，或在所示范围内的“缓冲能力”。一般地，缓冲液具有在其pK约1pH单位内的足够缓冲能力(Lachman等人1986)。缓冲液适合性可以基于公开的pK列表进行估计，或可以通过本领域众所周知的方法凭经验进行确定。溶液的pH可以例如使用任何可接受的酸或碱调整至如上所述的范围内的所需终末点。
在本文提供的共制剂中可以包括的缓冲液包括但不限于Tris(氨基丁三醇)、组氨酸、磷酸盐缓冲液例如磷酸氢二钠和柠檬酸盐缓冲液。一般地，缓冲剂在本文中以维持共制剂的pH范围在7.0-7.6或约7.0-7.6之间的量存在。此类缓冲剂可以以下述浓度存在于共制剂中：1mM-100mM或约1mM-100mM，例如10mM-50mM或20mM-40mM，例如以或约30mM。例如，此类缓冲剂可以以下述浓度或约下述浓度存在于共制剂中：1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更多。
在本文的共制剂中的示例性缓冲液是非金属结合缓冲液例如Tris，与金属结合缓冲液例如磷酸盐缓冲液相比较，其减少胰岛素沉淀。在本文提供的共制剂中包括Tris作为缓冲液具有另外利益。例如，用Tris缓冲的溶液的pH受溶液保持在其下的温度影响。因此，当胰岛素和透明质酸降解酶共制剂在室温下在pH7.3下制备时，在冷藏后，pH增加至约pH7.6。此类pH促进在其中胰岛素否则可能不可溶的温度下的胰岛素溶解度。相反，在增加的温度下，制剂的pH降低至约pH7.1，这促进在其下酶否则可能变得不稳定的温度下的透明质酸降解酶稳定性。因此，与其他缓冲液相比较，当共制剂含有Tris作为缓冲液时，胰岛素和透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的溶解度和稳定性达到最大。进一步地，因为Tris是阳离子，所以无需NaCl加入溶液中作为抗衡离子。这还对共制剂的总体稳定性是有利的，因为以高浓度的NaCl对于胰岛素溶解度是有害的。
一般地，Tris以下述浓度或约下述浓度包括在本文提供的共制剂中：10mM-50mM，例如10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在特定例子中，共制剂含有或含有约20mM-30mM Tris，例如21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM或30mM Tris。在特定例子中，本文提供的共制剂含有以30mM或约30mM浓度的Tris。
d.防腐剂
防腐剂可以对胰岛素的溶解度以及透明质酸降解酶例如PH20(例如rHuPH20)的稳定性和活性具有有害作用，同时稳定六聚胰岛素分子并且作为多剂量制剂中的抗微生物剂是必需的。因此，共制剂中存在的一种或多种防腐剂基本上不能使透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)失稳，从而使得它经过贮存条件(例如在一段时间内和在不同温度下)丧失其活性。进一步地，这些防腐剂必须以足够浓度存在，以稳定胰岛素六聚体且发挥所需抗微生物效应，但无需如此浓缩以便降低胰岛素的溶解度。重要的是，防腐剂必须以足够浓度存在，以提供例如美国药典(USP)和欧洲药典的抗微生物需求。一般地，满足EP(EPA或EPB)抗微生物需求的制剂含有比仅满足USP抗微生物需求配制的那些更多的防腐剂。
因此，稳定共制剂含有一种或多种防腐剂，如在抗微生物防腐剂有效性测试(APET)中评估的，其量通过杀死或抑制组合物的样品中的微生物生物体繁殖显示出抗微生物活性。本领域技术人员熟悉抗微生物防腐剂有效性测试和在USP和EPA或EPB下待满足的标准，以便满足最低限度需求。一般而言，抗微生物防腐剂有效性测试涉及用合适微生物即细菌、酵母和真菌的指定接种物攻击组合物例如本文提供的共制剂，将接种的制剂贮存于指定温度下，以指定时间间隔取出样品且计数样品中的生物体(参见Sutton和Porter,(2002)PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology56(11)；300-311；The United States Pharmacopeial Convention，Inc.,(2002年1月1日生效)，The United States Pharmacopeia25th Revision，Rockville，MD，第<51>章Antimicrobial Effectiveness Testing；和EuropeanPharmacopoeia，第5.1.3章，Efficacy of Antimicrobial Preservation)。在攻击中使用的微生物一般包括三种细菌菌株，即大肠杆菌(E.coli)(ATCC编号8739)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC编号9027)和金黄色葡萄球菌(ATCC编号6538)，酵母(白色念珠菌(Candida albicans)ATCC编号10231)和真菌(黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC编号16404)，所有这些这样加入，从而使得接种的组合物含有105或106菌落形成单位(cfu)的微生物/mL组合物。如果在测试条件下，如下表5中指定的，在指定时间后和在指定温度下在接种的组合物中的微生物数目中存在显著下降或无增加，则组合物的防腐性质视为足够的。估计标准依据与起始样品或先前时间点相比较，活微生物数目中的对数减少给出。
Figure BDA0000465955830000941
特别地，将组合物例如共制剂等分到至少5个容器内，对于每种细菌或真菌各一个(大肠杆菌(ATCC编号8739)、铜绿假单胞菌(ATCC编号9027)、金黄色葡萄球菌(ATCC编号6538)、白色念珠菌(ATCC编号10231)和黑曲霉(ATCC编号16404))。随后将每个容器用测试生物体之一接种，以获得105或106微生物的接种物/mL组合物，其中接种物不超过1%的组合物体积。接种的组合物维持在20和25℃下28天的时期，并且在6小时、24小时、7天、14天和28天时取出样品，取决于上表5中所示的标准。每个样品中的活微生物数目(cfu)通过平板计数或膜过滤进行测定。最后，关于每个样品的cfu与接种物或先前样品比较，并且测定对数减少。
在USP标准下，在用微生物生物体接种的样品中的防腐剂的抗微生物活性比率或水平是在接种后7天时细菌生物体的至少1.0log10单位减少；在接种后14天时细菌生物体的至少3.0log10单位减少；和在用微生物接种物接种组合物后第14天到第28天，细菌生物体中至少无进一步增加，即不超过0.5log10单位增加。对于根据USP标准的真菌生物体，在用微生物接种物接种组合物后7、14和28天后，在用微生物生物体接种的样品中的防腐剂的抗微生物活性比率或水平与起始量至少无增加。在EPB或最低限度EP标准下，在用微生物生物体接种的样品中的防腐剂的抗微生物活性比率或水平是在接种后24小时细菌生物体的至少1log10单位减少；在接种后第7天时细菌生物体的至少3log10单位减少；和在用微生物接种物接种组合物后28天，细菌生物体中至少无进一步增加，即不超过0.5log10单位增加。EPA标准要求在接种后6小时细菌生物体的至少2log10单位减少，伴随在接种后24小时细菌生物体的至少3log10单位减少，和在接种后28天无微生物生物体的恢复。对于根据最低限度EPB标准的真菌生物体，在用微生物生物体接种的样品中的防腐剂的抗微生物活性比率或水平是在接种后14天时真菌生物体的至少1log10单位减少，和在微生物接种后28天时真菌生物体中无增加，并且增加的EPA标准要求在接种后第7天时的至少2log10单位减少，和在组合物接种后28天时无真菌生物体的增加。
可以包括在本文提供的共制剂中的防腐剂的非限制性例子包括但不限于苯酚、间甲酚(间甲酚)、对羟基苯甲酸甲酯、苯甲醇、硫柳汞、苯扎氯铵、4-氯-1-丁醇、盐酸洗必泰、二葡萄糖酸氯己定、L-苯丙氨酸、EDTA、溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、乙酸苯汞、甘油(丙三醇)、咪脲、氯己定、脱氢乙酸钠、邻甲酚(邻甲酚)、对甲酚(对甲酚)、氯甲酚、西曲溴铵、苄索氯铵、羟苯乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯及其任何组合。例如，本文提供的共制剂可以含有单一防腐剂。在其他例子中，共制剂含有至少两种不同的防腐剂或至少三种不同的防腐剂。例如，本文提供的共制剂可以含有两种防腐剂，例如L-苯丙氨酸和间甲酚、L-苯丙氨酸和对羟基苯甲酸甲酯、L-苯丙氨酸和苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯、苯酚和对羟基苯甲酸甲酯、间甲酚和苯酚或其他相似组合。在一个例子中，共制剂中的防腐剂含有至少一种酚防腐剂。例如，共制剂含有苯酚、间甲酚或苯酚和间甲酚。
在本文提供的共制剂中，作为制剂中的质量浓度(w/v)百分比(%)的一种或多种防腐剂总量可以是例如0.1%-0.4%或约0.1%-0.4%，例如0.1%-0.3%、0.15%-0.325%、0.15%-0.25%、0.1%-0.2%、0.2%-0.3%、或0.3%-0.4%。一般地，共制剂含有小于0.4%(w/v)防腐剂。例如，本文提供的共制剂含有至少或约至少0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%0.17%、0.175%、0.18%、0.19%、0.2%、0.25%、0.3%、0.325%、0.35%但小于0.4%总防腐剂。
在一些例子中，本文提供的稳定共制剂含有0.1%-0.25%或约0.1%-0.25%苯酚，和0.05%-0.2%或约0.05%-0.2%间甲酚，例如0.10%-0.2%或约0.10%-0.2%苯酚和0.6%-0.18%或约0.6%-0.18%间甲酚，或0.1%-0.15%或约0.1%-0.15%苯酚和0.8%-0.15%或约0.8%-0.15%间甲酚。例如，本文提供的稳定共制剂含有或含有约0.1%苯酚和0.075%间甲酚；0.1%苯酚和0.15%间甲酚；0.125%苯酚和0.075%间甲酚；0.13%苯酚和0.075%间甲酚；0.13%苯酚和0.08%间甲酚；0.15%苯酚和0.175%间甲酚；或0.17%苯酚和0.13%间甲酚。
e.稳定剂
可以包含在本文提供的制剂中的稳定剂类型中包括的是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲液、表面活性剂及其他试剂。本文提供的共制剂含有至少一种稳定剂。例如，本文提供的共制剂含有至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种稳定剂。因此，氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲液、表面活性剂及其他试剂中的任何一种或多种都可以包括在本文的共制剂中。一般地，本文的共制剂含有至少含有表面活性剂和合适的缓冲剂。任选地，本文提供的共制剂可以含有其他另外的稳定剂。
示例性氨基酸稳定剂、氨基酸衍生物或胺包括但不限于L-精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、Lys-Lys、Gly-Gly、氧化三甲胺(TMAO)或甜菜碱。示例性糖和多元醇包括但不限于甘油、山梨糖醇、甘露醇、肌醇、蔗糖或海藻糖。示例性盐和缓冲液包括但不限于氯化镁、硫酸钠、Tris例如Tris(100mM)、或苯甲酸钠。示例性表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆188(例如
Figure BDA0000465955830000961
F68)、聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)。其他防腐剂包括但不限于玻尿酸(HA)、人血清白蛋白(HSA)、苯基丁酸、牛磺胆酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或锌。
i.表面活性剂
在一些例子中，稳定共制剂含有一种或多种表面活性剂。此类表面活性剂抑制透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的聚集且使吸收丧失降到最低。表面活性剂一般为非离子型表面活性剂。可以包括在本文的共制剂中的表面活性剂包括但不限于多羟基醇例如甘油或山梨糖醇的偏酯和脂肪酸酯和醚、泊洛沙姆和聚山梨醇酯。例如，本文的共制剂中的示例性表面活性剂包括泊洛沙姆188(
Figure BDA0000465955830000971
例如
Figure BDA0000465955830000972
F68)、
Figure BDA0000465955830000973
聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、PEG400、PEG3000、
Figure BDA0000465955830000974
(例如
Figure BDA0000465955830000975
20或
Figure BDA0000465955830000976
80)、
Figure BDA0000465955830000977
X-100、
Figure BDA0000465955830000978
聚丙二醇或聚乙二醇中的任何一种或多种。在一些例子中，本文的共制剂含有泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，一般为泊洛沙姆188(普流尼克F68)。本文提供的共制剂一般含有至少一种表面活性剂，例如1、2或3种表面活性剂。
在稳定共制剂中，作为制剂中的质量浓度(w/v)百分比(%)的一种或多种表面活性剂总量可以是例如0.005%-1.0%或约0.005%-1.0%，例如0.01%-0.5%或约0.01%-0.5%，例如0.01%-0.1%或0.01%-0.02%。一般地，共制剂含有至少0.01%表面活性剂且含有小于1.0%例如小于0.5%或小于0.1%表面活性剂。例如，本文提供的共制剂可以含有以或约0.001%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.08%或0.09%。在特定例子中，本文提供的共制剂含有或含有约0.01%至或至约0.05%表面活性剂。
酶的氧化可以随着表面活性剂水平增加而增加。此外，表面活性剂泊洛沙姆188引起比聚山梨醇酯更少的氧化。因此，本文的共制剂一般含有泊洛沙姆188。因此，尽管表面活性剂能够稳定透明质酸降解酶，但在本文提供的共制剂中表面活性剂的包括可以导致透明质酸降解酶在高浓度下的氧化。因此，一般更低浓度的表面活性剂用于本文的共制剂中，例如作为小于1.0%且一般为0.01%或0.05%或约0.01%或0.05%的质量浓度(w/v)百分比(%)。此外，如本文下文提供的，任选的抗氧化剂可以包括在制剂中以减少或阻止氧化。
本文提供的示例性共制剂含有泊洛沙姆188。泊洛沙姆188具有更高的临界胶束浓度(cmc)。因此，泊洛沙姆188的使用可以减少制剂中的胶束形成，这可以依次减少防腐剂的有效性。因此，在本文提供的共制剂中的是含有或含有约0.01%或0.05%泊洛沙姆188的那些。
ii.其他稳定剂
稳定共制剂任选可以含有其他组分，当与如上文讨论的防腐剂、盐和稳定剂在合适pH下组合时，所述其他组分导致稳定共制剂。其他组分包括例如一种或多种张力调节剂、一种或多种抗氧化剂、锌或其他稳定剂。
例如，张力调节剂可以包括在制剂中以产生具有所需同渗容摩的溶液。稳定共制剂具有245mOsm/kg-305mOsm/kg或约245mOsm/kg-305mOsm/kg的同渗容摩。例如，同渗容摩是或是约245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kg或305mOsm/kg。在一些例子中，胰岛素和透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的共制剂具有275mOsm/kg或约275mOsm/kg的同渗容摩。
张力调节剂包括但不限于丙三醇、NaCl、氨基酸、多元醇、海藻糖及其他盐和/或糖。在其他情况下，丙三醇(甘油)包括在共制剂中。例如，本文提供的共制剂一般含有小于60mM丙三醇，例如小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、小于30mM、小于25mM、小于20mM、小于15mM、10mM或更少。丙三醇的量一般取决于存在的NaCl量：共制剂中存在的NaCl越多，达到所需同渗容摩需要的丙三醇越少。因此，例如，在含有更高NaCl浓度的共制剂中，例如用具有更高表观溶解度的胰岛素(例如谷赖胰岛素)配制的那些，需要在制剂中包括很少的丙三醇或不包括丙三醇。相比之下，在含有轻微降低的NaCl浓度的共制剂中，例如用具有更低表观溶解度的胰岛素(例如门冬胰岛素)配制的那些，可以包括丙三醇。例如，含有门冬胰岛素的共制剂含有以小于50mM例如20mM-50mM，例如以50mM或约50mM浓度的丙三醇。在含有甚至更低NaCl浓度的共制剂中，例如用具有最低表观溶解度的胰岛素(例如赖脯胰岛素或普通胰岛素)配制的那些，丙三醇以例如40mM-60mM或约40mM-60mM的浓度包括。
共制剂还可以含有抗氧化剂以减少或阻止氧化，特别是透明质酸降解酶的氧化。示例性抗氧化剂包括但不限于半胱氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。在特定例子中，抗氧化剂是甲硫氨酸。含有胰岛素和透明质酸降解酶例如透明质酸酶例如PH20(例如rHuPH20)的本文提供的共制剂可以包括以下述浓度的抗氧化剂：5mM-50mM或约5mM–约50mM，例如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM。例如，甲硫氨酸可以以下述浓度在本文的共制剂中提供：5mM-50mM或约5mM–约50mM，例如5mM-40mM、5mM-20mM或10mM-20mM。例如抗氧化剂例如甲硫氨酸可以以这样的浓度包括，所述浓度是或是约5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。在一些例子中，共制剂含有10mM-20mM甲硫氨酸，例如10mM或20mM或约10mM或20mM甲硫氨酸。
在一些情况下，在共制剂中包括锌作为胰岛素六聚体的稳定剂。例如，含有普通胰岛素、赖脯胰岛素或门冬胰岛素的制剂一般含有锌，而含有谷赖胰岛素的制剂不含锌。锌可以例如作为氧化锌、乙酸锌或氯化锌提供。锌可以以下述量存在于本文提供的组合物中：0.001-0.1mg或约0.001-0.1mg/100单位胰岛素(mg/100U)、0.001-0.05mg/100U或0.01-05mg/100U。例如，本文提供的共制剂可以含有以下述量或约下述量的锌：0.002毫克/100单位胰岛素(mg/100U)、0.005mg/100U、0.01mg/100U、0.012mg/100U、0.014mg/100U、0.016mg/100U、0.017mg/100U、0.018mg/100U、0.02mg/100U、0.022mg/100U、0.024mg/100U、0.026mg/100U、0.028mg/100U、0.03mg/100U、0.04mg/100U、0.05mg/100U、0.06mg/100U、0.07mg/100U、0.08mg/100U或0.1mg/100U。
稳定共制剂还可以含有氨基酸稳定剂，其促成制剂的稳定性。稳定剂可以是非极性和碱性氨基酸。示例性非极性和碱性氨基酸包括但不限于丙氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和脯氨酸。例如，氨基酸稳定剂是甘氨酸或脯氨酸，一般为甘氨酸。稳定剂可以是单一氨基酸或它可以是2种或更多种此类氨基酸的组合。氨基酸稳定剂可以是天然氨基酸、氨基酸类似物、经修饰的氨基酸或氨基酸等价物。一般地，氨基酸为L-氨基酸。例如，当脯氨酸用作稳定剂时，它一般为L-脯氨酸。还可以使用氨基酸等价物例如脯氨酸类似物。在共制剂中包括的氨基酸稳定剂例如甘氨酸的浓度范围为0.1M-1M氨基酸，一般为0.1M-0.75M，通常为0.2M-0.5M，例如至少或约0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多。氨基酸例如甘氨酸可以以药学可接受的盐的形式使用，例如盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、乙酸盐等。氨基酸例如甘氨酸的纯度应为至少98%、至少99%或至少99.5%或更多。
2.其他赋形剂或试剂
任选地，稳定共制剂可以包括共制剂与之一起施用的载体，例如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适药学载体的例子由E.W.Martin在"Remington's Pharmaceutical Sciences"中描述。此类组合物将含有治疗有效量的化合物，一般为纯化形式或部分纯化形式，连同合适量的载体，以便提供用于适当施用于患者的形式。此类药学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油。当药物组合物静脉内施用时，水是典型载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别用于可注射溶液。
例如，在肠胃外制剂中使用的药学可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉药、悬浮剂和分散剂、乳化剂、隔离剂或螯合剂及其他药学可接受的物质。水性媒介物的例子包括氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格注射液。非水性肠胃外媒介物包括植物起源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。以抑菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂可以加入在多剂量容器中包装的肠胃外制剂，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(TWEEN80)。金属离子的隔离剂或螯合剂包括EDTA。药学载体还包括用于水能混溶的媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇，和用于pH调整的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
组合物可以含有下述(连同活性成分)：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙或羧甲基纤维素；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；和粘合剂例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯树胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。
例如，赋形剂蛋白质可以加入共制剂中，所述赋形剂蛋白质可以是许多药学可接受的蛋白质或肽中的任何。一般地，选择这样的赋形剂蛋白质，即其具有施用于哺乳动物对象而不引发免疫应答的能力。例如，人血清白蛋白非常适合于在药物制剂中使用。其他已知的药学蛋白质赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和乙醇。赋形剂以足够浓度包括在制剂中，以阻止蛋白质吸附至容纳容器或小瓶。赋形剂的浓度将根据赋形剂的性质和共制剂中的蛋白质浓度而改变。
需要时，组合物还可以含有微量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯及其他此类试剂。
G.产生编码胰岛素或透明质酸降解酶的核酸及其多肽的方法
本文所示的胰岛素和透明质酸降解酶的多肽可以通过本领域众所周知的用于蛋白质纯化和重组蛋白质表达的方法获得。多肽还可以化学合成。例如，胰岛素的A链和B链可以化学合成，并且随后通过例如还原再氧化反应由二硫键交联。当多肽通过重组方法产生时，可以使用本领域技术人员已知的用于鉴定编码所需基因的核酸的任何方法。本领域可获得的任何方法都可以用于例如从细胞或组织来源获得编码透明质酸酶的全长(即包含整个编码区)cDNA或基因组DNA克隆。经修饰的或变体胰岛素或透明质酸降解酶可以例如通过定点诱变由野生型多肽进行改造。
多肽可以使用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法进行克隆或分离。此类方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。
用于核酸扩增的方法可以用于分离编码所需多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含核酸材料可以用作所需多肽编码核酸分子可以由其分离的原材料。例如，DNA和mRNA制剂、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)和来自健康和/或患病对象的样品可以用于扩增方法中。核酸文库也可以用作原材料来源。引物可以设计为扩增所需多肽。例如，引物可以基于由其生成所需多肽的表达序列进行设计。引物可以基于多肽至氨基酸序列的回译进行设计。通过扩增生成的核酸分子可以进行测序，且证实编码所需多肽。
另外的核苷酸序列可以连接至多肽编码核酸分子，包括含有用于将合成基于克隆到载体内的限制性核酸内切酶位点的接头序列，例如蛋白质表达载体或设计用于扩增核心蛋白质编码DNA序列的载体。此外，指定功能DNA元件的另外核苷酸序列可以可操作地连接至多肽编码核酸分子。此类序列的例子包括但不限于设计为促进细胞内蛋白质表达的启动子序列、和设计为促进蛋白质分泌的分泌序列例如异源信号序列。此类序列是本领域技术人员已知的。另外的核苷酸残基序列例如指定蛋白质结合区的碱基序列也可以连接至酶编码核酸分子。此类区域包括但不限于促进或编码蛋白质的残基序列，所述蛋白质促进酶摄取到特定靶细胞内，或另外改变合成基因产物的药物代谢动力学。例如，酶可以连接至PEG部分。
此外，可以加入标签或其他部分，例如以帮助多肽的检测或亲和纯化。例如，另外的核苷酸残基序列例如指定附加表位或其他可检测标记的碱基序列也可以连接至酶编码核酸分子。示例性此类序列包括编码His标签(例如，6xHis，HHHHHH；SEQ ID NO:54)或Flag标签(DYKDDDDK；SEQ IDNO:55)的核酸序列。
随后将鉴定且分离的核酸插入合适的克隆载体内。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能载体包括但不限于质粒或经修饰的病毒，但载体系统必须与使用的宿主细胞相容。此类载体包括但不限于细菌噬菌体例如λ衍生物，或质粒例如pCMV4、pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene，La Jolla，CA)。其他表达载体包括本文例示的HZ24表达载体。进入克隆载体内的插入可以例如通过将DNA片段连接到克隆载体内完成，所述克隆载体具有互补粘性末端。插入可以使用TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)实现。如果用于断裂DNA的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以进行酶促修饰。可替代地，任何所需位点都可以通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端上产生；这些连接的接头可以含有编码限制性核酸内切酶识别序列的特定化学合成的寡核苷酸。在可替代方法中，切割的载体和蛋白质基因可以通过同聚物加尾进行修饰。重组分子可以经由例如转化、转染、感染、电穿孔和声孔效应引入宿主细胞内，从而使得生成基因序列的多个拷贝。
胰岛素可以使用多种技术产生(参见例如Ladisch等人(1992)Biotechnol.Prog.8:469-478)。在一些例子中，将编码前胰岛素原或胰岛素原多肽的核酸插入表达载体内。在表达后，通过酶促或化学方法将前胰岛素原或胰岛素原多肽转换为胰岛素，所述酶促或化学方法切割信号序列和/或C肽，导致通过例如还原再氧化反应由二硫键交联的A和B链(参见例如Cousens等人，(1987)Gene61:265-275，Chance等人，(1993)Diabetes Care4:147-154)。在另一个例子中，将编码胰岛素A链和B链的核酸插入一个或两个表达载体内用于作为单一多肽由一个表达载体共表达，或作为两个多肽由一个或两个表达载体表达。因此，A和B链多肽可以分开表达且随后组合，以生成胰岛素，或可以在不存在C链的情况下共表达。在其中A和B链作为单一多肽共表达的情况下，编码亚基的核酸也可以编码在B链和A链之间的接头或间隔物，例如下文描述的接头或间隔物。插入表达载体内的核酸可以含有例如编码胰岛素B链、接头例如丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸接头和A链的核酸，导致例如“胰岛素B链-Ala-Ala-Lys-胰岛素A链”的表达。
在特定实施方案中，用重组DNA分子转化宿主细胞使基因的多个拷贝能够生成，所述重组DNA分子掺入分离的蛋白质基因、cDNA或合成的DNA序列。因此，基因可以通过下述大量获得：生长转化体，从转化体中分离重组DNA分子，和需要时，从分离的重组DNA中取回插入的基因。
1.载体和细胞
对于一种或多种所需蛋白质例如本文描述的任何的重组表达，可以将含有编码蛋白质的全部或部分核苷酸序列的核酸插入合适的表达载体内，即，含有插入的蛋白质编码序列的转录和翻译必需元件的载体。必需转录和翻译信号也可以通过关于酶基因和/或其侧翼区的天然启动子供应。
还提供的是含有编码酶的核酸的载体。还提供了含有载体的细胞。细胞包括真核和原核细胞，并且载体是在其中使用的任何合适载体。
提供了含有载体的原核和真核细胞包括内皮细胞。此类细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌(原文为Archea，疑为Archaea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。通过在由此编码的蛋白质由细胞表达的条件下生长上述细胞，且回收表达的蛋白质，细胞用于产生其蛋白质。为了本文目的，例如，酶可以分泌到培养基内。
提供的是含有核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列编码与天然或异源信号序列偶联的可溶性透明质酸酶多肽以及其多个拷贝。载体可以就酶蛋白质在细胞中的表达进行选择，或从而使得酶蛋白质作为分泌蛋白质表达。
多种宿主-载体系统可以用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于由病毒(例如牛痘病毒、腺病毒及其他病毒)感染的哺乳动物细胞系统；由病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物例如含酵母的酵母载体；或由细菌噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。取决于使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一种。
本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体内的任何方法都可以用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(基因重组)。编码蛋白质、或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表达可以通过第二种核酸序列进行调节，从而使得基因或其片段在用一种或多种重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以受本领域已知的任何启动子/增强子控制。在特定实施方案中，启动子对于所需蛋白质的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist和Chambon，Nature290:304-310(1981))、在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等人Cell22:787-797(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，Nature296:39-42(1982))；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543)或tac启动子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))；还参见“Useful Proteins fromRecombinant Bacteria”：in Scientific American242:79-94(1980))；含有胭脂碱合成酶启动子(Herrara-Estrella等人，Nature303:209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人，Nucleic Acids Res.9:2871(1981))、和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶(Herrera-Estrella等人，Nature310:115-120(1984))的启动子的植物表达载体；来自酵母和及其他真菌的启动子元件，例如Gal4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子，和显示出组织特异性且已用于转基因动物中的下述动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，Cell38:639-646(1984)；Ornitz等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald，Hepatology7:425-515(1987))；在胰腺β细胞中活性的胰岛素基因控制区(Hanahan等人，Nature315:115-122(1985))，在淋巴样细胞中活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，Cell38:647-658(1984)；Adams等人，Nature318:533-538(1985)；Alexander等人，Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987))，在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等人，Cell45:485-495(1986))，在肝中活性的白蛋白基因控制区(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer等人，Science235:53-581987))，在肝中活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer等人，Science235:53-581987))，在肝中活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，Genes and Devel.1:161-171(1987))，在髓样细胞中活性的β珠蛋白基因控制区(Magram等人，Nature315:338-340(1985)；Kollias等人，Cell46:89-94(1986))，在脑的少突胶质细胞中活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等人，Cell48:703-712(1987))，在骨骼肌中活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，Nature314:283-286(1985))，和在下丘脑的促性腺细胞中活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，Science234:1372-1378(1986))。
在特定实施方案中，使用这样的载体，其含有可操作地连接至编码核酸(所述核酸编码所需蛋白质、或其结构域、片段、衍生物或同源物)的启动子、一种或多种复制起点和任选的一种或多种可选标记(例如抗生素抗性基因)。用于转化大肠杆菌细胞的示例性质粒载体包括例如pQE表达载体(可得自Qiagen，Valencia，CA；还参见由Qiagen公开的描述该系统的文献)。pQE载体具有提供重组蛋白质在大肠杆菌中的紧密调节的高水平表达的噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和双重lac操纵子阻遏模块、用于有效翻译的合成核糖体结合位点(RBS II)、6XHis标签编码序列、t0和T1转录终止子、ColE1复制起点、和用于赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体使6xHis标签能够置于重组蛋白质的N或C末端处。此类质粒包括pQE32、pQE30和pQE31，其提供用于所有三个读码框的多克隆位点且提供N末端加上6xHis标签的蛋白质的表达。用于转化大肠杆菌细胞的其他示例性质粒载体包括例如pET表达载体(参见美国专利4,952,496；可得自Novagen，Madison，WI；还参见由Novagen公开的描述该系统的文献)。此类质粒包括pET11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、诱导型大肠杆菌lac操纵子和lac阻遏基因；pET12a-c，其含有T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET15b和pET19b(Novagen，Madison，WI)，其含有在用His柱纯化中使用的His-TagTM前导序列和在经过柱纯化后允许切割的凝血酶切割位点、T7-lac启动子区和T7终止子。
用于哺乳动物细胞表达的示例性载体是HZ24表达载体。HZ24表达载体衍生自pCI载体主链(Promega)。它含有编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、F1复制起点、巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)和SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。表达载体还具有来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
2.接头部分
在一些例子中，通过生成具有接头的A链和B链多肽制备胰岛素，从而使得例如B链的C末端通过短接头连接至A链的N末端。A链和B链可以由含有接头的单一多肽表达，或可以分开表达且由接头连接。接头部分可以取决于所需性质而选择。接头部分应足够长和足够弹性，以允许A链和B链模拟胰岛素的天然构象。
接头可以是适合于胰岛素A链和B链的任何部分。此类部分包括但不限于肽键；氨基酸和肽键，一般含有一到约60个氨基酸；化学接头例如异双功能可切割交联剂、光可切割的接头和酸可切割的接头。
接头部分可以是肽。肽一般具有约2–约60个氨基酸残基，例如约5-约40、或约10-约30个氨基酸残基。肽接头可以由核酸共价编码且在宿主细胞例如大肠杆菌中表达后掺入融合蛋白内。在一个例子中，在编码胰岛素B链的核酸和编码A链的核酸之间的核酸中编码丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸(AAK)(SEQ ID NO:178)接头，从而使得在表达后，产生“胰岛素B链-AAK-胰岛素A链”多肽。肽接头可以是柔性间隔物氨基酸序列，例如单链抗体研究中已知的那些。此类已知接头部分的例子包括但不限于RPPPPC(SEQ ID NO:166)或SSPPPPC(SEQ ID NO:167)、GGGGS(SEQ ID NO:168)、(GGGGS)n(SEQ.ID NO:169)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:170)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ.ID NO:171)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQID NO:172)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:173)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:174)、EGKSSGSGSESKEF(SEQID NO:175)、SRSSG(SEQ.ID NO:176)和SGSSC(SEQ ID NO:177)。
可替代地，肽接头部分可以是VM(SEQ ID NO：179)或AM(SEQ ID NO：180)，或具有由下式描述的结构：AM(G2至4S)xAM，其中A为1–11的整数(SEQ ID NO：181)。另外的连接部分例如在下述中描述：Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883；Whitlow，M.,等人(1993)Protein Engineering6:989-995；Newton等人(1996)Biochemistry35:545-553；A.J.Cumber等人(1992)Bioconj.Chem.3:397-401；Ladurner等人(1997)J.Mol.Biol.273:330-337；和美国专利号4,894,443。
在一些例子中，肽接头由核酸编码且在宿主细胞例如大肠杆菌或酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达后掺入B链和A链之间。在其他例子中，肽接头通过化学方法合成。这可以在与A和B链中的一条或多条合成分开的方案中进行，这之后例如使用异双功能接头连接组分。可替代地，肽接头可以在胰岛素链之一的N或C末端处合成，其随后经由肽接头例如用异双功能接头连接至另一条链。
本领域技术人员已知的任何接头都可以在本文中用于连接胰岛素A链和B链。适合于化学连接链的接头和键包括但不限于二硫键、硫醚键、受阻二硫键和游离反应基团例如胺基和硫醇基之间的共价键。这些键使用异双功能试剂产生，以产生在多肽中的一个或两个上的反应性硫醇基，并且随后使一个多肽上的硫醇基与反应性马来酰亚胺基或硫醇基可以与其在另一个上附着的反应性硫醇基或胺基反应。其他接头包括酸可切割的接头例如双马来酰亚胺乙氧基丙烷、酸不稳定的转铁蛋白缀合物和肥酸二酰肼，其在更酸性的细胞内区室中切割；在暴露于UV或可见光后切割的交联接头，和来自人IgG1的恒定区的接头例如多个结构域例如CH1、CH2和CH3(参见Batra等人(1993)Molecular Immunol.30:379-386)。在一些实施方案中，可以包括几个接头，以便利用每个接头的所需性质。化学接头和肽接头可以通过使接头与胰岛素A链和B链共价偶联而插入。下文描述的异双功能试剂可以用于实现此类共价偶联。肽接头还可以通过表达编码在B链和A链之间的接头的DNA进行连接。
可以用于连接胰岛素的A链和B链的其他接头包括：酶底物，例如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、因子Xa底物和肠激酶底物；增加溶解度、弹性和/或细胞内可切割性的接头包括接头例如(glymser)n和(sermgly)n，其中m为1–6，优选1–4，更优选2–4，并且n为1–30，优选1–10，更优选1–4(参见例如提供示例性接头的国际PCT申请号WO96/06641)。在一些实施方案中，可以包括几个接头，以便利用每个接头的所需性质。
3.表达
胰岛素和透明质酸降解酶多肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括体内和体外方法)产生。所需蛋白质可以在适合于产生例如施用和治疗所需的蛋白质的所需量和形式的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体例如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞包括人细胞系和转基因动物。表达宿主可以在其蛋白质生产水平以及在表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型方面不同。可以基于这些及其他因素例如管理和安全考虑、生产成本以及纯化需要和方法，作出表达宿主的选择。
许多表达载体是可获得的且是本领域技术人员已知的，并且可以用于蛋白质表达。表达载体的选择将受选择的宿主表达系统影响。一般而言，表达载体可以包括转录启动子和任选的增强子、翻译信号、以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体一般具有允许选择和维持转化细胞的可选标记。在一些情况下，复制起点可以用于扩增载体拷贝数。
合适的透明质酸酶多肽还可作为蛋白质融合物使用或表达。例如，可生成酶融合物，以对酶添加另外功能性。酶融合蛋白的例子包括但不限于信号序列、例如用于定位的标签如his6标签或myc标签、或用于纯化的标签例如GST融合物、和用于指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列的融合物。
a.原核细胞
原核生物尤其是大肠杆菌提供了用于生产大量蛋白质的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员众所周知的简单快速技术。用于大肠杆菌的表达载体可以含有诱导型启动子，其包括用于诱导高水平的蛋白质表达和用于表达蛋白质的启动子，所述蛋白质显示出对宿主细胞的一些毒性。诱导型启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子和温度调节型λPL启动子。
蛋白质例如本文提供的任何都可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。细胞质是还原环境，并且对于一些分子，这可以导致不溶性包含体的形成。还原剂例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇和变性剂例如HCl胍和尿素可以用于再溶解蛋白质。可替代方法是在细菌的周质空间中表达蛋白质，所述周质空间含有氧化环境和伴侣蛋白样和二硫键异构酶，并且可以导致可溶蛋白质的产生。一般地，前导序列融合至待表达的蛋白质，这将蛋白质导向周质。前导区随后通过周质内的信号肽酶去除。周质靶向前导序列的例子包括来自果胶酸裂解酶基因的pelB前导区和衍生自碱性磷酸酶基因的前导区。在一些情况下，周质表达允许表达蛋白质渗漏到培养基内。蛋白质的分泌允许来自培养上清液的快速简单纯化。不分泌的蛋白质可以通过渗透性裂解得自周质。类似于细胞质表达，在一些情况下，蛋白质可以变得可溶，并且变性剂和还原剂可以用于促进增溶和重折叠。诱导和生长的温度还可以影响表达水平和溶解度，一般使用25℃-37℃的温度。一般地，细菌产生去糖基化蛋白质。因此，如果蛋白质需要糖基化用于功能，则糖基化可以在由宿主细胞纯化后在体外添加。
b.酵母细胞
酵母例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是众所周知的酵母表达宿主，其可以用于生产蛋白质例如本文描述的任何。酵母可以用附加型复制载体或通过经由同源重组的稳定染色体整合进行转化。一般地，诱导型启动子用于调节基因表达。此类启动子的例子包括GAL1、GAL7和GAL5，和金属硫蛋白启动子例如CUP1、AOX1或其他毕赤酵母属或其他酵母启动子。表达载体通常包括用于选择和维持转化DNA的可选标记，例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3。在酵母中表达的蛋白质通常是可溶的。与伴侣蛋白例如Bip和蛋白质二硫键异构酶的共表达可以改善表达水平和溶解度。另外，使用分泌信号肽融合物，例如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号、和与酵母细胞表面蛋白质例如Aga2p交配粘着受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶的融合物，可以指导在酵母中表达的蛋白质用于分泌。蛋白酶切割位点例如Kex-2蛋白酶的可以进行改造，以在表达多肽离开分泌途径时，去除来自其的融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序处糖基化。
c.昆虫细胞
特别使用杆状病毒表达的昆虫细胞用于表达多肽例如透明质酸酶多肽。昆虫细胞表达高水平的蛋白质且能够具有由高等真核生物使用的大多数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，其改善真核表达的安全且减少管理关注。一般的表达载体使用启动子例如杆状病毒的多角体蛋白启动子用于高水平表达。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)，和昆虫细胞系例如衍生自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9、粘虫(Pseudaletia unipuncta)(A7S)和大斑蝶(Danausplexippus)(DpN1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列立即融合至病毒的多角体蛋白起始密码子的下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确地加工，并且可以用于将表达的蛋白质分泌到培养基内。此外，细胞系粘虫(A7S)和大斑蝶(DpN1)产生具有类似于哺乳动物细胞系统的糖基化模式的蛋白质。
昆虫细胞中的可替代表达系统是稳定转化细胞的使用。细胞系例如Schneider2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞(白纹伊蚊(Aedes albopictus))可以用于表达。果蝇属(Drosophila)金属硫蛋白启动子可以在用镉或铜的重金属诱导的存在下用于诱导高水平表达。表达载体一般通过使用可选标记例如新霉素和潮霉素进行维持。
d.哺乳动物细胞
哺乳动物表达系统可以用于表达蛋白质包括可溶性透明质酸酶多肽。通过病毒感染例如腺病毒或通过直接DNA转移例如脂质体、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐和通过物理方法例如电穿孔和显微注射，可以将表达构建体转移到哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞的表达载体一般包括mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多腺苷酸化元件。还可以加入IRES元件，以允许与另一种基因例如可选标记的双顺反子表达。此类载体通常包括转录启动子-增强子用于高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性启动子/增强子区包括但不限于来自下述基因的那些：弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳房肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺激素释放激素基因控制。可选标记可以用于选择且维持具有表达构建体的细胞。可选标记基因的例子包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，表达可以在氨甲蝶呤的存在下进行，以仅选择表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面发信号分子例如TCR-ζ和FcεRI-γ的融合可以指导蛋白质以活性状态在细胞表面上表达。
许多细胞系可用于哺乳动物表达包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和HKB细胞。适合于无血清培养基的细胞系也是可获得的，所述无血清培养基促进从细胞培养基中纯化分泌的蛋白质。例子包括CHO-S细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录#11619-012)和无血清EBNA-1细胞系(Pham等人，(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42.)。适合于在对于最大表达最佳化的专门培养基中生长的细胞系也是可获得的。例如，DG44CHO细胞适合于在化学成分限定的无动物产品培养基中的悬浮培养中生长。
e.植物
转基因植物细胞和植物可以用于表达蛋白质例如本文描述的任何。一般使用直接DNA转移例如微粒轰击和PEG介导的转移到原生质体内，和使用土壤杆菌介导的转化，将表达构建体转移到植物。表达载体可以包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主例如拟南芥属(Arabidopsis)和烟草与单子叶植物宿主例如玉米和稻之间分开。用于表达的植物启动子的例子包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子和遍在蛋白和UBQ3启动子。可选标记例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶通常用于促进转化细胞的选择和维持。转化的植物细胞可以在培养中作为细胞维持，聚集(愈伤组织)或再生成全植物。转基因植物细胞也可以包括改造为产生透明质酸酶多肽的藻类。因为植物具有与哺乳动物细胞不同的糖基化模式，所以这可以影响在这些宿主中产生的蛋白质的选择。
4.纯化技术
用于从宿主细胞中纯化多肽包括胰岛素和透明质酸降解酶多肽或其他蛋白质的方法将取决于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白质一般在去除细胞后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以将细胞裂解，并且从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体例如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可以用作原材料以制备裂解的细胞提取物。另外，转基因动物生产可以包括在可以收集的乳或蛋中生产多肽，并且需要时，可以使用本领域的标准方法提取蛋白质且进一步纯化。
蛋白质例如胰岛素多肽或透明质酸降解酶多肽可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术进行纯化，所述纯化技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级和尺寸排阻色谱法、硫酸铵沉淀和离子交换色谱法例如阴离子交换色谱法。亲和纯化技术也可以用于改善制剂的效率和纯度。例如，结合透明质酸酶的抗体、受体及其他分子可以用于亲和纯化中。表达构建体还可以进行改造，以将亲和标签例如myc表位、GST融合物或His6加入蛋白质中，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法进行评估，所述方法包括凝胶电泳、正交HPLC法、染色和分光光度计测量技术。
H.治疗用途
本文提供的CSII方法包括透明质酸降解酶前沿CSII方法可以用于治疗速效胰岛素用于其的任何状况。这个部分提供了速效胰岛素的示例性治疗用途。下文描述的治疗用途是示例性的并且不限制本文描述的方法的应用。治疗用途包括但不限于用于1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病的治疗，和用于危重患者中的血糖控制。鉴定此类疾病或状况在治疗医生的技术内。
如上文讨论的，特定剂量和治疗方案一般对于每个对象个别化。需要时，特定剂量和持续时间以及治疗方案可以凭经验确定或推断。例如，不含透明质酸降解酶的速效胰岛素的示例性剂量可以用作起点，以确定在本文提供的方法中的合适剂量。剂量水平可以基于多种因素进行确定，所述因素例如个体的体重、一般健康、年龄、采用的具体化合物的活性、性别、饮食、代谢活性、血液葡萄糖浓度、施用时间、排泄率、药物组合、疾病的严重性和过程、和患者对疾病的处置和治疗医生的判断。特别地，可以测量例如通过血液葡萄糖传感器测量的血液葡萄糖水平，并且用于测定待施用以达到血糖控制的胰岛素和透明质酸降解酶的量。基于本文提供的速效胰岛素和透明质酸降解酶共制剂的吸收率和吸收水平以及基于血液葡萄糖水平，可以用于测定剂量的算法是本领域已知的。例如通过测定一餐的碳水化合物含量，也可以计算或调整用于餐后血糖控制的胰岛素剂量(参见例如Bergenstal等人，(2008)Diabetes Care31:1305-1310，Lowe等人，(2008)Diabetes Res.Clin.Pract.80:439-443，Chiesa等人(2005)Acta Biomed.76:44-48)。
1.糖尿病
糖尿病(或糖尿病)特征在于受损的葡萄糖代谢。血液葡萄糖衍生自在肠中吸收和在肝中产生的碳水化合物。增加的血液葡萄糖水平刺激胰岛素释放。餐后葡萄糖流入可以是在两餐之间观察到的葡萄糖肝生产的20–30倍。持续10分钟左右的早期胰岛素释放抑制肝葡萄糖生产，并且在持续两小时或更久且覆盖进餐时间碳水化合物流入的更长释放期(晚期)之前。在两餐之间，低持续胰岛素水平，基础胰岛素，覆盖进行中的代谢需求，特别是调节肝葡萄糖输出以及通过脂肪组织、肌肉组织及其他靶组织的葡萄糖利用。具有糖尿病的患者呈现升高的血液葡萄糖水平(高血糖)。糖尿病可以分类成两个主要类型：1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)特征在于胰腺胰岛的胰岛素生产β-细胞的丧失，导致胰岛素的缺乏。β-细胞缺乏的主因是T细胞介导的自身免疫。2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)在具有受损β-细胞功能的患者中发生。这些患者具有与减少的胰岛素分泌组合的胰岛素抗性或减少的胰岛素敏感性。2型糖尿病可以最终发展成1型糖尿病。在糖尿病中还包括的是妊娠糖尿病。具有糖尿病的患者可以施用胰岛素，以维持基础胰岛素水平且阻止例如用餐后的血糖波动。
a.1型糖尿病
1型糖尿病是T细胞依赖性自身免疫疾病，特征在于胰腺的内分泌单位胰岛的渗入和β-细胞的破坏，导致胰岛素生产缺陷和高血糖。1型糖尿病最通常在儿童和年轻人中诊断，但可以在任何年龄时诊断。除了低胰岛素水平和高血液葡萄糖水平外，具有1型糖尿病的患者还可以呈现多尿、多饮、多食、视力模糊和疲劳。可以通过呈现以或高于126mg/dL(7.0mmol/l)的空腹血糖水平，例如在葡萄糖耐量测试中的75g口服葡萄糖负荷后两小时以或高于200mg/dL(11.1mmol/l)的血浆葡萄糖水平，和/或以或超过200mg/dL(11.1mmol/l)的随机血浆葡萄糖水平来诊断患者。
关于具有1型糖尿病的患者的一级治疗是施用胰岛素作为替代疗法，其一般与血液葡萄糖监测结合进行。如果没有足够的替代胰岛素，可以发展糖尿病酮症酸中毒，这可以导致昏迷或死亡。患者可以使用例如注射器或胰岛素笔或胰岛素泵施用速效胰岛素的皮下注射，以全天维持合适的血液葡萄糖水平以及控制餐后葡萄糖水平。在一些情况下，在闭环系统的背景下包括的胰岛素泵可以用于腹膜内递送胰岛素。因此，可以经由注射器、胰岛素笔、或胰岛素泵、或用于递送胰岛素的任何其他工具，给具有1型糖尿病的患者皮下或腹膜内施用本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂，以更快速控制血液葡萄糖和胰岛素水平。
b.2型糖尿病
2型糖尿病与胰岛素抗性相关，并且在一些群体中，还伴随胰岛素贫乏症(β-细胞功能的丧失)。在2型糖尿病中，胰岛素的1期释放不存在，并且2期释放是延迟和不足够的。在用餐过程中和用餐后在健康对象中发生的胰岛素释放的尖峰在具有2型糖尿病的患者中是延迟、延长和量不足的，导致高血糖。具有2型糖尿病的患者可以施用胰岛素，以控制血液葡萄糖水平(Mayfield等人(2004)Am Fam Physican70:489-500)。这可以与其他治疗和治疗方案组合完成，包括饮食、锻炼及其他抗糖尿病疗法(例如磺脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑啉二酮和α-葡糖苷酶抑制剂)。因此，可以经由注射器、胰岛素笔、或胰岛素泵、或用于递送胰岛素的任何其他工具，给具有2型糖尿病的患者皮下或腹膜内施用本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂，以更快速控制血液葡萄糖和胰岛素水平。
c.妊娠糖尿病
之前从未具有糖尿病但在妊娠过程中具有高血液葡萄糖水平的孕妇诊断具有妊娠糖尿病。这类糖尿病影响所有孕妇的约1-14%，取决于研究的群体(Carr等人，(1998)Clinical Diabetes16)。虽然潜在原因仍不明了，但看起来可能在妊娠过程中产生的激素减少孕妇对胰岛素的敏感性。胰岛素抗性机制可能是受体后缺陷，因为通过胰岛素敏感细胞的正常胰岛素结合已得到证实。胰腺释放1.5–2.5倍的胰岛素，以便响应所得到的胰岛素抗性增加。具有正常胰腺功能的患者能够满足这些需求。具有边缘胰腺功能的患者难以增加胰岛素分泌且随后产生不足够水平的胰岛素。当在渐增的外周胰岛素抗性的存在下存在延迟或不足够的胰岛素分泌时，妊娠糖尿病因此产生。
具有妊娠糖尿病的患者可以施用胰岛素以控制血液葡萄糖水平。因此，可以经由注射器、胰岛素笔、胰岛素泵或人工胰腺、或任何其他工具，给具有妊娠糖尿病的患者皮下施用本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂，以更快速控制血液葡萄糖和胰岛素水平。
2.用于危重患者的胰岛素疗法
高血糖和胰岛素抗性在医学和/或手术危重患者中频繁发生，并且已与糖尿病和非糖尿病患者以及具有创伤性损伤、中风、缺氧性脑损伤、急性心肌梗塞、心脏手术后和危重病的其他原因的患者中增加的发病率和死亡率相关(McCowen等人(2001)Crit.Clin.Care17:107-124)。具有高血糖的危重患者已用胰岛素治疗，以控制血液葡萄糖水平。此类治疗可以减少这个组中的发病率和死亡率(Van den Berghe等人(2006)N.Eng.J Med.354:449-461)。胰岛素一般静脉内施用于患者，例如通过医学从业者用注射器注射或通过使用胰岛素泵输注。在一些例子中，算法和软件用于计算剂量。因此，具有高血糖的危重患者可以施用本文描述的速效胰岛素和透明质酸降解酶的共制剂，以控制血液葡萄糖水平，从而减轻高血糖且减少发病率和死亡率。
J.组合疗法
本文描述的方法可以进一步包括之前、间歇地或之后施用其他治疗剂的步骤，所述其他治疗剂包括但不限于其他生物制品和小分子化合物。对于速效胰岛素指示用于其或已用于其并且对于其可获得其他试剂和治疗的任何疾病或状况，包括所有上文例示的那些，它们可以进一步用于本文的方法中。取决于待治疗的疾病或状况，示例性其他治疗剂包括但不限于其他抗糖尿病药，包括但不限于磺脲、双胍、氯茴苯酸、噻唑啉二酮、α-葡糖苷酶抑制剂、肽类似物包括胰高血糖素样肽(GLP)类似物和抑胃肽(GIP)类似物和DPP-4抑制剂。在另一个例子中，该方法可以进一步包括与一种或多种其他胰岛素组合、之前、间歇地或之后施用，所述其他胰岛素包括速效胰岛素和基础作用胰岛素。
K.实施例
下述实施例仅为了举例说明性目的而包括，并且不预期限制本发明的范围。
实施例1
胰岛素和胰岛素-PH20制剂
A.门冬胰岛素
在这些研究中使用的门冬胰岛素是商业产品门冬胰岛素：NovoNordisk、
Figure BDA0000465955830001161
(在美国指名
Figure BDA0000465955830001162
的门冬胰岛素；批号XS60195)。这个产品含有100U/mL门冬胰岛素、0.1096mg/mL锌、1.25mg/mL(7mM)磷酸氢二钠二水合物、0.58mg/mL(10mM)NaCl、16mg/mL(170mM)丙三醇、1.5mg/mL(0.15%)苯酚和1.72mg/mL(0.172%)间甲酚。
B.门冬胰岛素-PH20制剂
药物产品门冬-PH20是在中性pH、缓冲等渗水溶液中具有重组人透明质酸酶(rHuPH20，参见实施例5-7)的活性药物成分重组门冬胰岛素的无菌、多剂量防腐制剂。每mL水溶液含有门冬胰岛素(重组门冬胰岛素)3.50mg；rHuPH20(重组人透明质酸酶)5.0ug；氨基丁三醇(Tris碱)3.63mg；氯化钠2.92mg；甲硫氨酸14.9mg；泊洛沙姆188(普流尼克F68)0.10mg；间甲酚0.78mg；苯酚1.34mg；和用于将pH调整至pH7.4的氢氧化钠和/或盐酸。在一些制剂中，每mL水溶液含有门冬胰岛素(重组门冬胰岛素)3.50mg；rHuPH20(重组人透明质酸酶)5.0ug；氨基丁三醇(Tris碱)3.63mg；氯化钠2.92mg；甲硫氨酸14.9mg；泊洛沙姆188(普流尼克F68)0.10mg；间甲酚0.75mg；苯酚1.25mg；和用于将pH调整至pH7.4的氢氧化钠和/或盐酸。
实施例2
门冬胰岛素和PH20制剂通过持续皮下胰岛素输注(CSII)的药物代谢动力学(PK)和糖动态
当通过持续皮下输注在入院患者设置中递送时，实施例1中所述的具有人透明质酸酶(rHuPH20)的门冬胰岛素制剂(门冬-PH20)与商业门冬胰岛素制剂
Figure BDA0000465955830001172
就三天糖尿病治疗进行比较。已使用持续皮下胰岛素输注(CSII)的具有1型糖尿病的十六个对象在两次就诊的任一次时以随机次序通过CSII接受每种研究药物。对象对于研究的三天局限于入院患者设置。
A.研究方案
在使用Medtronic Paradigm泵系统的第一天(第1天)下午，对象具有放置的新输注装置并且储库充满门冬-PH20或
Figure BDA0000465955830001171
研究设计允许经过约72小时的观察期比较输注装置性能。
在新胰岛素输注导管装置插入后十二到十四(12-14)小时，进行正常血糖葡萄糖钳夹实验(第1钳夹；输注放置后1/2天)。正常血糖葡萄糖钳夹用Biostator进行，以提供持续葡萄糖测量和维持恒定血液葡萄糖水平的20%葡萄糖水溶液的可变速率静脉内输注的调整(Heinemann L，Anderson JH，Jr.Measurement of insulin absorption and insulin action.Diabetes TechnolTher2004；6:698-718)；基础静脉内胰岛素输注不用于这个研究中。血液葡萄糖在90%禁食水平时进行钳夹，以抑制研究过程中的内源胰岛素释放。0.15U/kg推注通过胰岛素泵施用；并且通常个体基础速率在钳夹过程中继续，并且PK结果因此是基线扣除的。
在正常血糖葡萄糖钳夹实验过程中，对象跟踪六(6)小时，在这过程中抽血且测定维持血糖正常所需的游离胰岛素水平和葡萄糖输注率。经验证的常规竞争放射性免疫测定(RIA)方法用于测定人血清样品中的门冬胰岛素浓度。在RIA中使用的示踪剂和一抗是[125I]-胰岛素示踪剂(Millipore，目录#9011)和豚鼠抗胰岛素(Millipore，目录#1013-K)抗血清(其与人胰岛素、大鼠胰岛素、犬胰岛素和赖脯胰岛素100%交叉反应)。通过由浓度范围为10-5,000pM的门冬胰岛素的标准曲线的内插法估计测试样品中的IRI浓度。
在第4天时输注装置放置后约60小时和第1钳夹后约48小时，重复正常血糖葡萄糖钳夹实验(第2钳夹；输注放置后21/2天)。如上所述，对象跟踪六(6)小时，在这过程中抽血且测定维持血糖正常所需的游离胰岛素水平和葡萄糖输注率。
B.结果
1.胰岛素的药物代谢动力学
关于第1和第2钳夹研究的结果描述为表6中的血清免疫反应性胰岛素(以pmol/L表示的IRI)浓度相对于时间。表7描述了血清免疫反应性胰岛素结果(平均值+/-SD)。结果也在图1中描绘。
Figure BDA0000465955830001181
Figure BDA0000465955830001191
在rHuPH20的存在下，在1/2天CSII(第1钳夹)和21/2天CSII(第2钳夹)后，与单独的门冬相比较，门冬吸收是加速的(参见图1)。例如，1/2天CSII结果显示对于门冬胰岛素-PH20制剂，在第一小时内的胰岛素暴露是总AUC的35%，并且对于单独的门冬是总AUC的21%，而超过2小时的暴露分别为总AUC的29和48%。21/2天CSII结果对于门冬胰岛素-PH20制剂，在第一小时内的胰岛素暴露是总AUC的51%，并且对于单独的门冬是总AUC的33%，而超过2小时的暴露分别为总AUC的17和34%。这与显示rHuPH20加速胰岛素暴露的先前研究一致。
对于商业门冬
Figure BDA0000465955830001192
相对于1/2天CSII，胰岛素吸收在21/2天后是加速的，其中在第一小时内的胰岛素暴露从总AUC的21%增加到33%，并且超过2小时的暴露从48降低到34%。对于门冬胰岛素-PH20制剂，与1/2天相比较，在21/2天CSII后，胰岛素暴露也是增加的，其中在第一小时内的胰岛素暴露从总AUC的35%增加到51%，并且超过2小时的暴露从29降低到17%。对于门冬胰岛素，在第一小时内的绝对胰岛素暴露也从第1/2天时的11.4nM*分钟增加到第21/2天时的21.4nM*分钟。这对应于几何平均比中的67%增加。除了在第21/2天时第一小时内暴露中的增加外，暴露中的患者间可变性也是增加的，因为变异系数(CV)从33%增加到63%。对于门冬胰岛素-PH20制剂，在第一小时内的胰岛素暴露增加较少，从第1/2天时的22.4nM*分钟到第21/2天时的30.0nM*分钟。这对应于几何平均比中的39%增加。门冬胰岛素-PH20制剂也显示出在患者间可变性无增加，其中CV实际上从35%轻微降低到28%。
对于单独或与rHuPH20一起配制的门冬胰岛素，当比较输注装置耗损1/2天与21/2天时，总胰岛素暴露(从0到6小时)一般是相同的(无统计上的显著差异)。
2.糖动态
通过测定在推注胰岛素施用后维持血糖正常所需的葡萄糖输注率测量糖动态。关于治疗组各自的糖动态结果概括于表8中。GIR输注率也在图2中描绘。结果与上文描述的药物代谢动力学中的加速一致。
GIRmax：葡萄糖峰输注率；G(0-1、0-2、0-3、0-4)：在时间间隔中输注的总葡萄糖(g/kg)
除了在输注装置寿命期内可见的更快速的作用开始和更短的作用持续时间(第1钳夹与第2钳夹相比较)，结果还显示如通过正常血糖钳夹法测定的，总胰岛素作用(Gtot；经过实验过程输注的累积葡萄糖)在输注装置寿命内下降。例如，单独的商业门冬
Figure BDA0000465955830001202
和门冬胰岛素-rHuPH20制剂都显示出在第1钳夹时相同的总胰岛素作用，2.0g/kg。然而，两天后在第2钳夹时，总胰岛素作用对于两种研究药物都是减少的，尽管对于门冬胰岛素-rHuPH20制剂至更大程度(参见图3)。两种治疗(单独的商业门冬或门冬胰岛素-rHuPH20制剂)从第1钳夹到第2钳夹加速，并且在两个时间点，与单独的商业门冬胰岛素相比较，rHuPH20对门冬胰岛素的添加导致更快速的时间作用概况(参见图4)。
3.对用餐的血液葡萄糖应答
对用餐的血液葡萄糖应答在表9中描述。
Figure BDA0000465955830001211
对于门冬-rHuPH20，用餐波动一致地良好受控，并且餐后高血糖比没有更好。
4.不利事件
在输注治疗过程期间评估不利事件。表10显示观察到的不利事件。结果显示没有中度或重度不利事件与rHuPH20暴露相关。
Figure BDA0000465955830001212
5.概括
结果显示当与胰岛素共施用时，相对于1/2天CSII，在21/2天后，rHuPH20减少但不消除在一段时间内的胰岛素吸收加速。这与根据输注装置寿命的胰岛素暴露和作用中的每天可变性中的减少相关。伴随rHuPH20存在，数据显示时间暴露和总胰岛素作用标准化的时间作用概况中的更大一致性。
实施例3
通过持续皮下胰岛素输注(CSII)的连同和不连同PH20预治疗的门冬胰岛素施用
在入院患者设置中通过持续皮下输注递送商业门冬胰岛素制剂
Figure BDA0000465955830001221
用于三天糖尿病治疗。最初，已使用持续皮下胰岛素输注(CSII)的具有1型糖尿病的四个对象在两次就诊的任一次时以随机次序通过CSII接受
Figure BDA0000465955830001222
连同或不连同使用150单位(U)rHuPH20(如实施例5-7中所述制备)的预治疗。该研究继续以包括完成研究方案的15个对象，并且进一步继续以包括完成研究方案的17个对象。对象对于研究的三天局限于入院患者设置。
A.研究方案
在第一天早晨，对象具有放置的新输注装置插管(Medtronic Quick-set)，并且通过输注装置和插管接受假注射或1mL rHuPH20(在具有1mg/mL人血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中配制的150U/mL重组人透明质酸酶)的注射。在rHuPH20施用后立即(例如在数分钟内)使储库充满
Figure BDA0000465955830001223
并且患者经过约3天的观察期通过CSII(Medtronic Paradigm泵系统)接受胰岛素。
在新胰岛素输注导管装置插入后约2小时，进行正常血糖葡萄糖钳夹实验(第1钳夹)。正常血糖葡萄糖钳夹用Biostator进行，以提供持续葡萄糖测量和维持恒定血液葡萄糖水平的20%葡萄糖水溶液的可变速率静脉内输注的调整(Heinemann L，Anderson JH，Jr.Measurement of insulin absorptionand insulin action.Diabetes Technol Ther2004；6:698-718)；基础静脉内胰岛素输注不用于这个研究中。血液葡萄糖在90%禁食水平时进行钳夹，以抑制研究过程中的内源胰岛素释放。0.15U/kg推注通过胰岛素泵施用；并且通常个体基础速率在钳夹过程中继续，并且PK结果因此是基线扣除的。
在正常血糖葡萄糖钳夹实验过程中，对象跟踪六(6)小时，在这过程中抽血且测定维持血糖正常所需的游离胰岛素水平和葡萄糖输注率。经验证的常规竞争放射性免疫测定(RIA)方法用于测定人血清样品中的门冬胰岛素浓度。在RIA中使用的示踪剂和一抗是[125I]-胰岛素示踪剂(Millipore，目录#9011)和豚鼠抗胰岛素(Millipore，目录#1013-K)抗血清(其与人胰岛素、大鼠胰岛素、犬胰岛素和赖脯胰岛素100%交叉反应)。通过由浓度范围为10-5,000pM的门冬胰岛素的标准曲线的内插法估计测试样品中的IRI浓度。
在输注装置放置后约26小时和第1钳夹后约24小时，重复正常血糖葡萄糖钳夹实验(第2钳夹)。在输注装置放置后约74小时和第2钳夹后约48小时，再次重复正常血糖葡萄糖钳夹实验(第3钳夹)。在每个实验中，如上所述，对象跟踪六(6)小时，在这过程中抽血且测定维持血糖正常所需的游离胰岛素水平和葡萄糖输注率。
患者还在连续四天各自时接受标准化固体晚餐(45-50%CHO、18-22%蛋白质、30-34%脂肪)(在不含rHuPH20的新输注装置后约2小时，以及在连同或不连同rHuPH20的输注装置使用约1/2、11/2和21/2天后)。患者在每餐前立即接受患者餐和经由胰岛素泵的
Figure BDA0000465955830001231
的特异性推注输注，并且测定对用餐的血液葡萄糖应答。
B.结果
1.胰岛素的药物代谢动力学
来自每次钳夹实验的结果在表11中呈现，其中结果对于15个完成者(表11a)和全部17个完成者(表11b)概括。结果也在图5中描绘。
Figure BDA0000465955830001232
b描述为几何平均值
Figure BDA0000465955830001241
伴随rHuPH20预治疗，输注装置寿命自始至终胰岛素快速吸收。相对于不含rHuPH20的第1钳夹，具有rHuPH20的所有钳夹都具有特征性超快速概况，具有在第1小时内的更大暴露、更大和更早的峰暴露、和超过2小时的更少暴露。
在rHuPH20预治疗后的钳夹各自具有相似的超快速概况，而不含rHuPH20的钳夹各自证实随着输注装置老化在胰岛素吸收中的全身变动。
2.糖动态
通过测定在推注胰岛素输注后维持血糖正常所需的葡萄糖输注率，测量根据时间的胰岛素作用概况或糖动态。来自每次钳夹实验的结果在表12中呈现，其中结果对于15个完成者(表12a)和全部17个完成者(表12b)概括。图6也描绘了结果。
Figure BDA0000465955830001242
Figure BDA0000465955830001251
伴随rHuPH20预治疗，快速胰岛素吸收反映在输注装置寿命自始至终的超快速胰岛素作用概况。相对于不含rHuPH20的第1钳夹，具有rHuPH20的所有钳夹都具有特征性超快速概况，具有在第1个1-2小时内的更大作用、和更早的作用开始(早期t50%)、更短的作用持续时间和超过4小时的更少作用。
在rHuPH20预治疗后的钳夹各自具有相似的超快速概况，而不含rHuPH20的钳夹各自证实随着输注装置老化在胰岛素吸收作用中的全身变动。
3.对用餐的血液葡萄糖应答
对用餐的血液葡萄糖应答在表13中描述，其中结果对于15个完成者(表13a)和全部17个完成者(表13b)概括。
Figure BDA0000465955830001252
Figure BDA0000465955830001253
Figure BDA0000465955830001261
伴随rHuPH20预治疗，用餐波动一致地良好受控，并且餐后高血糖比没有更好。
4.不利事件
在输注治疗过程期间评估不利事件。表14显示观察到的不利事件，其中结果对于15个完成者(表14a)和全部17个完成者(表14b)概括。结果显示与CSII输注部位相关的不利事件，两个对象具有与rHuPH20暴露相关的事件(输注部位疼痛和输注部位出血)，并且一个对象具有与单独的门冬胰岛素相关的事件(输注部位疼痛)。
Figure BDA0000465955830001262
1CSII输注部位疼痛(n=2)；CSII输注部位出血(n=1)；外周性水肿(n=2)；其他事件都与用于正常血糖钳夹操作的IV输注部位相关
2主要是头痛；头晕(n=1)，颤栗(n=1)
3IV输注部位感染(n=1)，真菌感染(n=1)，麦粒肿(n=1)，IV输注部位蜂窝织炎(n=1)
4恶心(n=2)，消化不良(n=1)
5颈痛(n=1)，四肢疼痛(n=1)
6干燥皮肤(n=1)，多汗(n=1)
7贫血(n=1)
8低钾血症(n=1)
Figure BDA0000465955830001271
1CSII输注部位疼痛(n=2)；CSII输注部位出血(n=1)；外周性水肿(n=2)；其他事件都与用于正常血糖钳夹操作的IV输注部位相关
2头痛(n=8)，头晕(n=1)，颤栗(n=1)
3IV输注部位感染(n=2)，真菌感染(n=1)，麦粒肿(n=1)，IV输注部位蜂窝织炎(n=1)，阴道感染(n=8)
4恶心(n=2)，消化不良(n=1)
5颈痛(n=1)，四肢疼痛(n=2)
6干燥皮肤(n=1)，瘀斑(n=1)，多汗(n=1)
7贫血(n=2)
8烧伤，1度(n=1)
9低钾血症(n=1)
5.结果概括
与先前报道一致，胰岛素吸收和作用经过输注装置使用三天显著改变。例如，对于不含rHuPH20治疗的患者，从输注三天开始到结束，来自15个完成者的结果显示早期胰岛素暴露从15变化为27%(p=.0004)，作用开始从60分钟变化为30分钟(p<.0001)，并且作用持续时间从180变化为156分钟(p=.0005)。来自17个完成者的结果显示从输注三天开始到结束，早期胰岛素暴露从16变化为27%(p<.0001)，作用开始从59分钟变化为27分钟(p<.0001)，并且作用持续时间从180变化为156分钟(p=.0001)。
用rHuPH20预治疗消除这个可变性，因为经过三天持续输注，在早期胰岛素暴露、作用开始或持续时间方面不存在显著差异。rHuPH20预治疗还加速胰岛素吸收。例如，来自15个完成者的结果概括显示rHuPH20导致56%更多的早期胰岛素暴露(P<.0001)、9分钟更快速的作用开始(p=.037)、和27分钟更短的作用持续时间(p<.0001)，并且对于17个完成者，导致55%更多的早期胰岛素暴露(P<.0001)、9分钟更快速的作用开始(p=.018)、和27分钟更短的作用持续时间(p<.0001)。这个一致和超快速的概况转化为一致减少的餐后波动。例如，来自15个完成者的结果概括显示2小时餐后葡萄糖(PPG)为117mg/dL，并且不连同rHuPH20为133mg/dL(p=.073)，并且对于17个完成者，连同rHuPH20为112mg/dL，并且不连同rHuPH20为126mg/dL(p=.098)。此外，在2小时血糖波动中21mg/dL的减少对于15个完成者是显著的(p=.017)。类似地，对于全部17个完成者在2小时血糖波动中19mg/dL的减少也是显著的(p=.020)。连同和不连同rHuPH20的门冬胰岛素输注是类似地良好耐受的。
因此，结果显示使用150U rHuPH20的预施用对于31/2天的持续输注产生一致的超快速概况，这提供混合晚餐的一致餐后控制且允许更多患者一致地达到靶水平的PPG控制。
实施例4
通过持续皮下胰岛素输注(CSII)的连同和不连同PH20预治疗的门冬胰岛素施用
具有1型糖尿病的患者参与随机化、双盲、双向交叉设计临床研究，比较在CSII疗法中每次输注装置更换时的单一透明质酸酶注射与假注射的施用。该研究比较在3天持续输注开始和结束时的正常血糖钳夹终末点，和对一系列四次早餐固体餐攻击的血糖应答。下文结果描述完成该研究的前三个对象。此外，评估三个对象的持续葡萄糖监测，以比较常规门诊糖尿病患者护理中的葡萄糖控制。
A.研究方案
将患者随机化，以接受假注射或rHuPH20透明质酸酶注射(如实施例5-7中所述制备)共两个约16天治疗期。在每个时期，对象首先出现在临床研究单位(CRU)，以如实施例3中所述接受新输注装置。简言之，对象具有放置的新输注装置插管，并且接受假注射或1mL rHuPH20(
Figure BDA0000465955830001281
与8.5mg氯化钠、1.4mg磷酸氢二钠、1.0mg人白蛋白、0.9mg依地酸二钠、0.3mg氯化钙，pH7.4一起配制的150USP单位的重组人透明质酸酶)的注射。在rHuPH20施用后立即(例如在数分钟内)使患者通过CSII接受胰岛素用于经过3天的输注。在输注导管装置插入后4小时内，如实施例3中所述进行正常血糖钳夹实验。对象同一天离开CRU。
在3天持续输注后，对象3天后回来用于第二次正常血糖钳夹。在钳夹实验后，更换输注装置并且患者出院。经过接下来的12天，对象通过各自覆盖4个输注装置周期的传感器增强CSII正常治疗其糖尿病，伴随暴露的持续葡萄糖监测。对象约每3天回到CRU，以接受新输注装置且接受患者特异性标准化早餐和胰岛素推注。在每次输注装置更换时施用1mL150单位rHuPH20(Hylenex)的单一施用。为了维持双盲研究设计，在患者把脸转过去时，在其他方面不涉及该研究的受过训练的专业人士施用rHuPH20或假注射。在第1期完成后，患者在21天内回到CRU，以重复这些步骤伴随交替治疗。在研究过程中，患者使用其常规胰岛素泵、输注装置和速效胰岛素类似物，除非与透明质酸酶施用程序不相容(例如Omnipod泵，Sure-T输注装置)，在所述情况下它们对于研究持续时间转变为相容的替代物。
B.结果
1.糖动态
通过测定在推注胰岛素输注后维持血糖正常所需的葡萄糖输注率，测量根据时间的胰岛素作用概况或糖动态。来自每次钳夹实验的结果在表15中呈现。
Figure BDA0000465955830001291
伴随rHuPH20预治疗，输注装置寿命自始至终存在超快速胰岛素作用概况。相对于不含rHuPH20的第1钳夹，具有rHuPH20的所有钳夹都具有特征性超快速概况，具有在第1个1-2小时内的更大作用、和更早的作用开始(早期t50%)、更短的作用持续时间和超过4小时的更少作用。
在rHuPH20预治疗后的钳夹各自具有相似的超快速概况，而不含rHuPH20的钳夹各自证实随着输注装置老化在胰岛素吸收作用中的全身变动。
2.对用餐的血液葡萄糖应答
对用餐的血液葡萄糖应答在表16中描述。
伴随rHuPH20预治疗，用餐波动一致地良好受控，并且餐后高血糖比不含rHuPH20预治疗更好。
3.常规糖尿病管理终末点
完成该研究的前三个对象代表通过各自覆盖4个输注装置周期的约2周治疗，使用rHuPH20预施用用于门诊患者的血液葡萄糖控制的最初临床经验。所有三个患者都能够达到更紧密的葡萄糖控制，降低其平均CGM葡萄糖和主要通过降低高血糖的葡萄糖可变性。低血糖事件(由症状和具有值≤70mg/dL的SMBG记录测定)是轻度的并且具有相似频率，其中在单独的类似物过程中6次发作和rHuPH20预治疗后7次发作。这些结果在表17中概括。
Figure BDA0000465955830001302
4.不利事件
在输注治疗过程期间评估不利事件。在十一个可估计对象的六个中观察到十八(18)个不利事件。全部都是轻度和消退的，无后遗症。最常见事件是头痛(n=4)。潜在局部部位反应包括两个瘙痒(假)情况、腹部瘀伤(rHuPH20)、在输注部位处的疼痛(rHuPH20)和在输注过程中的刺痛感(rHuPH20)。
5.结果概括
与先前报道和上文实施例3一致，在不存在rHuPH20预治疗的情况下，胰岛素作用经过输注装置使用三天显著改变。例如，从输注三天开始到结束，作用开始从66分钟变化为41分钟(p=.01)，并且作用持续时间从160变化为132分钟(p=.002)。
用rHuPH20预治疗消除这个可变性，因为经过三天持续输注，在作用开始或持续时间方面不存在显著差异。rHuPH20预治疗还加速胰岛素作用，导致21分钟更快速的作用开始(p=.005)、和30分钟更短的作用持续时间(p<.0001)。这个一致和超快速的概况转化为一致减少的餐后波动。例如，2小时餐后葡萄糖(PPG)连同rHuPH20为131mg/dL，并且不连同rHuPH20为162mg/dL(p=.001)。
因此，结果显示使用150U rHuPH20的预施用对于3天的持续输注产生一致的超快速概况，这提供混合早餐的一致餐后控制。对于最初三个对象还观察到常规糖尿病护理参数中的改善。
实施例5
可溶性rHuPH20表达细胞系的生成
HZ24质粒(SEQ ID NO：52中所示)用于转染中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(参见例如美国专利号7,76,429和7,871,607以及美国公开号2006-0104968)。用于表达可溶性rHuPH20的HZ24质粒载体含有pCI载体主链(Promega)、编码人PH20透明质酸酶的氨基酸1-482的DNA(SEQ IDNO:49)、来自ECMV病毒的内部核糖体进入位点(IRES)(Clontech)和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。pCI载体主链还包括编码β-内酰胺酶抗性基因(AmpR)的DNA、f1复制起点、巨细胞病毒立即早期增强子/启动子区(CMV)、嵌合内含子和SV40晚期多腺苷酸化信号(SV40)。编码可溶性rHuPH20构建体的DNA含有在编码人PH20的天然35氨基酸信号序列的氨基酸位置1处的甲硫氨酸的DNA之前的NheI位点和Kozak共有序列，和在编码对应于SEQ ID NO:1中所示的人PH20透明质酸酶的氨基酸位置482的酪氨酸的DNA后的终止密码子，随后为BamHI限制位点。因此，构建体pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)导致由CMV启动子驱动的单一mRNA种类，其编码由内部核糖体进入位点(IRES)分开的人PH20的氨基酸1-482(SEQ ID NO:3中所示)和小鼠二氢叶酸还原酶的氨基酸1-186(SEQ ID NO:53中所示)。
在补充有4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)，用于DHFR(-)细胞的GIBCO Modified CD-CHO培养基中生长的未经转染的DG44CHO细胞以0.5x106细胞/ml种植到摇瓶中制备用于转染。细胞在37℃下在5%CO2中在加湿培养箱中生长，以120rpm振荡。指数生长的未经转染的DG44CHO细胞在转染前就活力进行测试。
将未经转染的DG44CHO细胞培养的60,000,000活细胞形成团块，并且在0.7mL2x转染缓冲液(2x HeBS：40mM Hepes，pH7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中重悬浮至2×107细胞的密度。向重悬浮细胞的每个等分试样中，加入0.09mL(250μg)线性0.09mL(250μg)质粒(通过用Cla I(New England Biolabs)过夜消化线性化)，并且在室温下将细胞/DNA溶液转移到0.4cm间隙BTX(Gentronics)电穿孔小杯内。用不与细胞混合的质粒DNA进行阴性对照电穿孔。细胞/质粒混合物用330V和960μF或以350V和960μF的电容放电进行电穿孔。
在电穿孔后从小杯中取出细胞且转移到补充有4mM谷氨酰胺和18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)，用于DHFR(-)细胞的5mL Modified CD-CHO培养基内，并且允许在6孔组织培养板的孔中生长，无需在37℃下在5%CO2中在加湿培养箱中选择2天。
电穿孔后两天，从每个孔中取出0.5mL组织培养基，并且使用实施例8中所述的微浊度测定法测试透明质酸酶活性的存在。
Figure BDA0000465955830001331
从组织培养孔中收集来自转染2(350V)的细胞，计数且稀释至1×104-2×104活细胞/mL。将0.1mL细胞悬液等分试样转移到五块96孔圆底组织培养板的每个孔内。将含有4mM GlutaMAXTM-1补充物(GIBCOTM，InvitrogenCorporation)且不含次黄嘌呤和胸苷补充物的一百微升CD-CHO培养基(GIBCO)加入含有细胞的孔中(终体积0.2mL)。
由不含氨甲蝶呤生长的5块平板鉴定十个克隆。
Figure BDA0000465955830001332
六个HZ24克隆在培养中扩增且作为单细胞悬液转移到摇瓶内。使用二维无限稀释策略，将克隆3D3、3E5、2G8、2D9、1E11和4D10铺平板到96孔圆底组织培养板内，其中细胞沿着平板1:2稀释，并且跨越平板1:3稀释，以在左上角孔中的5000个细胞开始。稀释的克隆在500个未经转染的DG44CHO细胞/孔的背景下生长，以提供培养中的最初日子的必需生长因子。每个亚克隆制备十块平板，其中5块平板含有50nM氨甲蝶呤，并且5块平板不含氨甲蝶呤。
克隆3D3产生24个可见亚克隆(13个来自无氨甲蝶呤处理，并且11个来自50nM氨甲蝶呤处理。在来自24个亚克隆的8个的上清液中测量显著透明质酸酶活性(>50单位/mL)，并且这8个亚克隆扩增到T-25组织培养瓶内。从氨甲蝶呤处理方案分离的克隆在50nM氨甲蝶呤的存在下扩增。克隆3D35M在500nM氨甲蝶呤中进一步扩增，产生在摇瓶中以1,000单位/ml过量产生的克隆(克隆3D35M；或Gen13D35M)。随后制备3D35M细胞的主细胞库(MCB)。
实施例6
含有可溶性人PH20(rHuPH20)的Gen2细胞的产生
使实施例5中所述的Gen13D35M细胞系适应更高的氨甲蝶呤水平，以产生2代(Gen2)克隆。3D35M细胞由建立的含氨甲蝶呤培养物种植到含有4mM GlutaMAX-1TM和1.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基内。通过使细胞在37℃、7%CO2加湿培养基中经过46天的时期生长且传代9次，使细胞适合更高的氨甲蝶呤水平。扩增的细胞群体通过在96孔组织培养板中的有限稀释克隆出来，所述组织培养板具有含2.0μM氨甲蝶呤的培养基。在约4周后，鉴定克隆并且选择克隆3E10B用于扩增。3E10B细胞在含有4mM GlutaMAX-1TM和2.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基中生长20代。制备3E10B细胞系的主细胞库(MCB)并且冷冻并用于后续研究。
通过在含有4mM GlutaMAX-1TM和4.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基中培养3E10B细胞，继续细胞系的扩增。在第12次传代后，将细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。将一个RCB小瓶解冻且在含有8.0μM氨甲蝶呤的培养基中培养。在5天后，将培养基中的氨甲蝶呤浓度增至16.0μM，随后18天后增至20.0μM。来自在含有20.0μM氨甲蝶呤的培养基中的第8次传代的细胞通过在96孔组织培养板中的有限稀释克隆出来，所述组织培养板具有含4mM GlutaMAX-1TM和20.0μM氨甲蝶呤的CD CHO培养基。5-6周后鉴定克隆，并且选择克隆2B2用于在含有20.0μM氨甲蝶呤的培养基中扩增。在第11次传代后，将细胞在小瓶中冷冻作为研究细胞库(RCB)。
所得到的2B2细胞是二氢叶酸还原酶缺陷型(dhfr-)DG44CHO细胞，其表达可溶性重组人PH20(rHuPH20)。可溶性PH20以约206个拷贝/细胞的拷贝数存在于2B2细胞中。使用2B2特异性探针的Spe I-、Xba I-和BamHI/Hind III消化的基因组2B2细胞DNA的DNA印迹分析揭示下述限制性消化概况：～7.7kb的一个主要杂交条带和四个次要杂交条带(～13.9、～6.6、～5.7和～4.6kb)，其中DNA用Spe I消化；～5.0kb的一个主要杂交条带和两个次要杂交条带(～13.9和～6.5kb)，其中DNA用Xba I消化；和使用由BamHI/Hind III消化的2B2DNA观察到的～1.4kb的一个单一杂交条带。mRNA转录物的序列分析指出衍生的cDNA(SEQ ID NO:56)等同于参考序列(SEQID NO:49)，除了在第1131处的一个碱基对差异外，这观察为胸苷(T)而不是预期的胞嘧啶(C)。这是沉默突变，对氨基酸序列没有作用。
实施例7
A.在300L生物反应器细胞培养中的Gen2可溶性rHuPH20的产生
将HZ24-2B2小瓶解冻，并且在补充有20μM氨甲蝶呤和GlutaMAX-1TM(Invitrogen)的CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，由摇瓶扩增通过36L旋转瓶。简言之，将细胞小瓶在37℃水浴中解冻，加入培养基且将细胞离心。将细胞重悬浮于具有20mL新鲜培养基的125mL摇瓶中，并且置于37℃、7%CO2培养箱中。细胞在125mL摇瓶中扩增直到40mL。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以100mL培养体积的125mL旋转瓶内。烧瓶在37℃、7%CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以200mL培养体积的250mL旋转瓶内，并且将烧瓶在37℃、7%CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以800mL培养体积的1L旋转瓶内，并且在37℃、7%CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以5000mL培养体积的6L旋转瓶内，并且在37℃、7%CO2下温育。当细胞密度达到大于1.5x106细胞/mL时，将培养物扩增到以32L培养体积的36L旋转瓶内，并且在37℃、7%CO2下温育。
将400L反应器灭菌，并且加入230mL CD-CHO培养基。在使用前，就污染检查反应器。以4.0×105活细胞/ml的接种密度和260L的总体积，将约30L细胞从36L旋转瓶转移到400L生物反应器(Braun)。参数为温度设定点：37℃；叶轮速度40-55RPM；器皿压力：3psi；空气喷洒0.5-1.5L/分钟；空气覆盖：3L/分钟。反应器每天取样用于细胞计数、pH验证、培养基分析、蛋白质生产和保留。此外，在运行过程中加入营养素补料。在120小时(第5天)，加入10.4L补料#1培养基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1TM+83mL/L酵母自溶液+33mg/L rHuInsulin)。在168小时(第7天)，加入10.8L补料#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1TM+167mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36.5℃。在216小时(第9天)，加入10.8L补料#3(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+1.80g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为36℃。在264小时(第11天)，加入10.8L补料#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸钠)，并且将培养温度变为35.5℃。观察到补料培养基的添加显著增强生产终末期中的可溶性rHuPH20生产。在14或15天时，或当细胞生存下降至40%时，收获反应器。该过程导致17,000单位/ml的最终生产力，具有12,000,000细胞/mL的最大细胞密度。在收获时，将培养物取样用于支原体、生物负荷量、内毒素和体外和体内病毒、透射电子显微镜(TEM)和酶活性。
培养物通过蠕动泵抽泵通过四个平行的Millistak过滤系统模块(Millipore)，其各自含有分级至4-8μm的硅藻土层和分级至1.4-1.1μm的硅藻土层，随后为纤维素膜，随后通过第二个单一Millistak过滤系统(Millipore)，其含有分级至0.4-0.11μm的硅藻土层和分级至<0.1μm的硅藻土层，随后为纤维素膜，并且随后通过0.22μm最终滤器进入具有350L容量的无菌单次使用的弹性袋。收获的细胞培养流体补充有10mM EDTA和10mM Tris至pH7.5。将培养物用切向流过滤(TFF)仪器浓缩10×，使用四个Sartoslice TFF30kDa分子量截断(MWCO)聚醚砜(PES)滤器(Sartorius)，随后为用10mM Tris、20mM Na2SO4，pH7.5的10×缓冲液更换到0.22μm最终滤器内进入50L无菌贮存袋。
浓缩的渗滤收获物就病毒进行灭活。在病毒灭活前，制备10%TritonX-100、3%三(正丁基)磷酸盐(TNBP)溶液。在Q柱上纯化前立即使浓缩的渗滤收获物暴露于在36L玻璃反应器中的1%Triton X-100、0.3%TNBP共1小时。
B.Gen2可溶性rHuPH20的纯化
制备Q琼脂糖(Pharmacia)离子交换柱(9L树脂、H=29cm、D=20cm)。收集洗涤摇瓶用于测定pH、传导性和内毒素(LAL)测定法。将柱用5柱体积的10mM Tris、20mM Na2SO4，pH7.5平衡。在病毒灭活后，将浓缩的渗滤收获物以100cm/小时的流速装载到Q柱上。将柱用5柱体积的10mMTris、20mM Na2SO4，pH7.5和10mM Hepes、50mM NaCl，pH7.0.洗涤。蛋白质用10mM Hepes、400mM NaCl，pH7.0洗脱到0.22μm最终滤器内进入无菌袋。洗脱物样品就生物负荷量、蛋白质浓度和透明质酸酶活性进行测试。在更换开始和结束时获得A280吸光度读数。
接下来进行苯基-琼脂糖(Pharmacia)疏水作用色谱法。制备苯基-琼脂糖(PS)柱(19-21L树脂，H=29cm，D=30cm)。收集洗涤液且取样用于pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵、0.1mM CaCl2，pH7.0平衡。来自Q琼脂糖柱的蛋白质洗脱物补充有2M硫酸铵、1M磷酸钾和1M CaCl2原液，以分别获得5mM、0.5M和0.1mM的终浓度。将蛋白质以100cm/小时的流速装载到PS柱上，并且收集柱流通物。将柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵和0.1mM CaCl2pH7.0以100cm/小时洗涤，并且将洗涤液加入收集的流通物。与柱洗涤合并，使流通物流经0.22μm最终滤器进入无菌袋内。将流通物取样用于生物负荷量、蛋白质浓度和酶活性。
制备氨基苯基硼酸盐柱(ProMedics)。收集洗涤液且取样用于pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5柱体积的5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵平衡。将含有纯化蛋白质的PS流通物以100cm/小时的流速装载到氨基苯基硼酸盐柱上。将柱用5mM磷酸钾、0.5M硫酸铵，pH7.0洗涤。将柱用20mM N-二羟乙基甘氨酸、0.5M硫酸铵，pH9.0洗涤。将柱用20mM N-二羟乙基甘氨酸、100mM氯化钠，pH9.0洗涤。将蛋白质用50mM Hepes、100mM NaCl，pH6.9洗脱，并且流经无菌滤器进入无菌袋内。洗脱样品就生物负荷量、蛋白质浓度和酶活性进行测试。
制备羟磷灰石(HAP)柱(Biorad)。收集洗涤液且测试pH、传导性和内毒素(LAL测定法)。将柱用5mM磷酸钾、100mM NaCl、0.1mM CaCl2，pH7.0平衡。将氨基苯基硼酸盐纯化的蛋白质补充至5mM磷酸钾和0.1mMCaCl2的终浓度，并且以100cm/小时的流速装载到HAP柱上。将柱用5mM磷酸钾，pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤。接下来将柱用10mM磷酸钾，pH7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗涤。将蛋白质用70mM磷酸钾，pH7.0洗脱且流经0.22μm无菌滤器进入无菌袋。洗脱样品就生物负荷量、蛋白质浓度和酶活性进行测试。
HAP纯化的蛋白质随后流经病毒去除滤器。首先通过用2L70mM磷酸钾，pH7.0洗涤制备无菌Viosart滤器(Sartorius)。在使用前，将过滤缓冲液取样用于pH和传导性。HAP纯化的蛋白质随后经由蠕动泵抽泵通过20nM病毒去除滤器。在70mM磷酸钾，pH7.0中的过滤蛋白质流经0.22μm最终滤器进入无菌袋。病毒过滤的样品就蛋白质浓度、酶活性、寡糖、单糖和唾液酸概况分析进行测试。样品还就过程相关杂质进行测试。
随后使用10kD分子量截断(MWCO)Sartocon Slice切向流过滤(TFF)系统(Sartorius)，将滤液中的蛋白质浓缩至10mg/mL。首先通过用10mM组氨酸、130mM NaCl，pH6.0洗涤制备滤器，并且将渗透物取样用于pH和传导性。在浓缩后，将浓缩蛋白质取样且测试蛋白质浓度和酶活性。对进入最终缓冲液内的浓缩蛋白质进行6×缓冲液更换：10mM组氨酸、130mMNaCl，pH6.0。在缓冲液更换后，使浓缩蛋白质流经0.22μm滤器进入20L无菌贮存袋。将蛋白质取样且测试蛋白质浓度、酶活性、游离巯基、寡糖概况分析和同渗容摩。
无菌过滤的大量蛋白质随后以20mL无菌分配到30mL无菌Teflon小瓶(Nalgene)内。随后将小瓶速冻且贮存于-20±5℃。
实施例8
rHuPH20的透明质酸酶活性的测定
使用比浊测定法来测定rHuPH20(通过在CHO细胞中表达和分泌编码SEQ ID NO:1的氨基酸36-482的核酸获得)的透明质酸酶活性。在前两种测定法(A和B)中，通过使可溶性rHuPH20与透明质酸钠(玻尿酸)一起温育且通过添加酸化血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠，测量rHuPH20的透明质酸酶活性。在第三种测定法(C)中，基于当玻尿酸(HA)与西吡氯铵(CPC)结合时不溶性沉淀物的形成，测量rHuPH20的透明质酸酶活性。在含有600U/mL rHuPH20(5μg/mL)的所有测定法中，验收标准是超过375U/mL的酶促活性。
A.微浊度测定法
在这种测定法中，通过使可溶性rHuPH20与透明质酸钠(玻尿酸)一起温育设定时间段(10分钟)且随后通过添加酸化血清白蛋白沉淀未消化的透明质酸钠，测量rHuPH20的透明质酸酶活性。在30分钟发展期后，在640nm处测量所得到的样品的浊度。起因于对透明质酸钠底物的酶活性的浊度降低是可溶性rHuPH20透明质酸酶活性的量度。该方法使用由可溶性rHuPH20测定法工作参考标准的稀释度生成的校准曲线执行，并且相对于这个校准曲线作出样品活性测量。样品的稀释在酶稀释溶液中制备。酶稀释溶液通过下述进行制备：将33.0±0.05mg水解明胶溶解于25.0mL50mM PIPES反应缓冲液(140mM NaCl、50mM PIPES，pH5.5)和25.0mL无菌注射用水(SWFI；Braun，产品编号R5000-1)，并且将0.2mL25%人血清白蛋白(USBiologicals)溶液稀释到混合物内且涡旋30秒。这在使用2小时内执行且贮存在冰上直至需要时。将样品稀释至估计的1-2U/mL。一般地，每个步骤最大稀释度不超过1:100，并且关于第一个稀释度的最初样品大小不小于20μL。执行测定法所需的最小样品体积为：过程中样品，FPLC馏分：80μL；组织培养上清液：1mL；浓缩材料80μL；纯化或最终步骤材料：80μL。稀释在低蛋白质结合96孔板中一式三份进行，并且将30μL每个稀释度转移到Optilux黑色/透明底部平板(BD BioSciences)。
在酶稀释溶液中制备具有2.5U/mL浓度的已知可溶性rHuPH20稀释度，以生成标准曲线，且一式三份加入Optilux平板。稀释度包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL和2.5U/mL。在平板中包括含有60μL酶稀释溶液的“试剂空白”孔作为阴性对照。随后将平板覆盖且在加热块上在37℃下加温5分钟。去除覆盖且将平板振荡10秒。在振荡后，将平板送回加热块，并且用加温的0.25mg/mL透明质酸钠溶液(通过将100mg透明质酸钠(LifeCore Biomedical)溶解于20.0mL SWFI中制备。通过在2-8℃下轻轻转动和/或振动2-4小时或直至完全溶解，将这混合)引发MULTIDROP384液体处理设备。将反应板转移到MULTIDROP384，并且通过按压起始键将30μL透明质酸钠分配到每个孔内来开始反应。随后从MULTIDROP384中取出平板且在转移到加热块前振荡10秒，其中平板覆盖放置。将平板在37℃下温育10分钟。
通过用血清工作溶液引发机器，并且将体积设置变为240μL，制备MULTIDROP384以停止反应。(在75mL500mM乙酸盐缓冲溶液中的25mL血清原液[1体积马血清(Sigma)用9体积500mM乙酸盐缓冲溶液稀释，并且用盐酸将pH调整至3.1])。从加热块中取出平板并且置于MULTIDROP384上，并且将240μL血清工作溶液分配到孔内。将平板取出且在板阅读器上振荡10秒。在进一步的15分钟后，在640nm处测量样品的浊度，并且通过与标准曲线拟合测定每种样品的透明质酸酶活性(以U/mL表示)。
通过将透明质酸酶活性(U/mL)除以蛋白质浓度(mg/mL)计算比活性(单位/mg)。
B.关于rHuPH20酶促活性的浊度测定法
将样品用酶稀释剂[溶解于50mL磷酸盐缓冲液(25mM磷酸盐，pH6.3、140mM NaCl)和50mL去离子(DI)水中的66mg明胶水解产物(Sigma#G0262)]稀释，以达到0.3-1.5U/mL的预期酶浓度。
将标记为标准1、2、3、4、5或6的两个试管各自和对于待分析的每种样品的一式两份试管(相应标记)置于在37℃下的块状加热器中。将下表中所示的酶稀释剂体积一式两份加入标准试管。将0.50mL HA底物溶液[在DI水、9mL DI水、10mL磷酸盐缓冲液中的1.0mL5mg/mL玻尿酸(ICN#362421)]分配到所有标准和样品试管内。如下表12中所示，将在酶稀释剂中的1.5U/mL USP透明质酸酶标准(USP#31200)体积分配到一式两份的标准试管内。当所有标准试管已完成时，将0.50mL每种样品分配到一式两份样品试管各自内。在37℃下的30分钟温育后，将4.0mL血清工作溶液{50mL血清原液[1体积马血清(供体兽群、测试的细胞培养、测试的杂交瘤培养，USA起源)、9体积500mM乙酸盐缓冲液，调整至pH3.1，允许在室温下静置18-24小时，贮存于4℃下]加上150mL500mM乙酸盐缓冲液}加入标准试管，随后从块状加热器中取出所述标准试管，混合且置于室温下。样品试管以这种方式加工，直至所有标准和样品试管都被加工。
通过组合0.5mL酶稀释剂、0.25mL DI水、0.25mL磷酸盐缓冲液和4.0mL酶工作溶液制备“空白”溶液。将溶液混合且将等分试样转移到一次性使用的小杯。这个样品用于在640nm处将分光光度计调零。
在室温下的30分钟温育后，依次将来自每个标准试管的等分试样转移到一次性使用的小杯，并且测量在640nm处的吸光度。对于一式两份的样品试管重复这个程序。
通过标绘透明质酸酶浓度(U/mL)相对于观察到的吸光度构建线性校准曲线。线性回归分析用于拟合数据(排除关于0.0U/mL校准标准的数据)且测定斜率、截距和关联系数(r2)。标准曲线回归方程和观察到的样品吸光度用于测定样品浓度。
C.用于rHuPH20酶促活性的浊度测定法
用于测定透明质酸酶活性和酶浓度的比浊法基于当玻尿酸(HA)与西吡氯铵(CPC)结合时不溶性沉淀物的形成。通过使透明质酸酶与透明质酸一起温育设定时间段(30分钟)且随后通过添加CPC沉淀未消化的透明质酸，来测量活性。在640nm处测量所得到的样品的浊度，并且起因于对HA底物的酶活性的浊度降低是透明质酸酶效力的量度。该方法使用由rHuPH20测定法工作参考标准的稀释度生成的校准曲线运行，并且相对于校准曲线作出样品活性测量。该方法预期用于分析在稀释至～2U/mL的浓度后，溶液中的rHuPH20活性。定量范围为0.3-3U/mL，尽管对于常规测试，在1-3U/mL范围内获得最佳性能。
通过将100mg±10mg明胶水解产物(Sigma#G0262)溶解于75mL反应缓冲溶液(140mM NaCl、50mM PIPES(1,4哌嗪双(2-乙磺酸))，pH5.3)游离酸(Mallinckrodt#V249)和74.4mL无菌冲洗用水(SWFI)，并且添加0.6mL25%人血清白蛋白(HSA)，新鲜制备酶稀释剂。通过将1.0mL酶稀释剂加入试管且将其置于预热至37℃的加热块，制备分光光度计空白。通过将120μL测定法工作参考标准加入29.880mL酶稀释剂，一式三份制备rHuPH20测定法工作参考标准的1:25稀释度，来制备稀释的参考标准。每种样品的合适稀释度一式三份制备，以获得～2U/mL溶液。
根据表13将酶稀释剂的体积一式三份分配到标准试管内。将在SWFI中的500μL1.0mg/mL透明质酸钠(Lifecore，#81，具有20-50kDa的平均分子量)溶液分配到除了空白外的所有试管内，并且将管置于37℃的加热块中5分钟。将表13中所示的稀释参考标准数量加入合适标准试管，混合且送回加热块。将500μL每种样品一式三份加入合适管。在起始第一个标准管后30分钟，将4.0mL停止溶液(将5.0mg/mL西吡氯铵(Sigma，目录#C-5460)溶解于SWFI中，并且流经0.22微米滤器)加入所有管(包括空白)，随后将所述管混合且置于室温下。
分光光度计在640nm固定波长处“形成空白”。在室温下的30分钟温育后，将约1mL标准或样品转移到一次性使用的小杯并且在640nm处阅读吸光度。使用在完全衰变后局限于0的指数式衰变函数，采用
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计算机软件(Hearne Scientific Software)分析参考标准和样品原始数据值。测定最佳拟合标准曲线且用于计算相应样品浓度。
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因为修饰对于本领域技术人员将是显而易见的，所以预期本发明仅受附加权利要求的范围限制。
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Claims (69)

1.一种通过持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法控制对象中的血液葡萄糖的方法，其包括：
a)给所述对象施用包含透明质酸降解酶的组合物；和随后
b)通过CSII给所述对象持续输注速效胰岛素，
其中与在不存在所述透明质酸降解酶的情况下进行的CSII相比较，在输注装置寿命期内胰岛素吸收的差异降到最低或得到减少。
2.权利要求1的方法，其中：
所述透明质酸降解酶的量在输注装置寿命开始时在所述对象中实现超快速胰岛素应答；或
所述透明质酸降解酶的量足够催化透明质酸水解以增加组织穿透性。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤b)中，持续输注通过持续输注设备实现，所述持续输注设备包括胰岛素泵、含有速效胰岛素的储库、任选的葡萄糖监测仪和用于所述组合物的皮下输注的输注装置。
4.权利要求3的方法，其中所述持续输注设备包括胰岛素泵、含有速效胰岛素的储库、葡萄糖监测仪和用于所述组合物的皮下输注的输注装置。
5.权利要求3或4的方法，其中所述持续输注设备提供开环或闭环系统。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中：
通过CSII持续输注速效胰岛素的所述步骤b)持续预定间隔；和
在每个间隔结束时，重复步骤a)和b)。
7.权利要求6的方法，其中在每个间隔结束后，替换所述输注装置。
8.权利要求6或7的方法，其中每个预定间隔是超过一天或是几天。
9.权利要求8的方法，其中几天是2天到4天。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中在步骤a)中的所述透明质酸降解酶在步骤b)中的所述组合物的输注部位处或附近施用。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤a)中的所述透明质酸降解酶和步骤b)中的所述速效胰岛素组合物通过相同注射部位施用。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤a)中的所述透明质酸降解酶和步骤b)中的所述速效胰岛素组合物通过不同注射部位施用。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶在所述速效胰岛素输注前1分钟到12小时、5分钟到6小时、30分钟到3小时、1小时到2小时、15秒到1小时、30秒到30分钟或1分钟到15分钟施用。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤a)中的所述透明质酸降解酶在所述速效胰岛素施用前不超过2小时施用。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是在中性pH下具有活性的透明质酸酶。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中：
所述透明质酸降解酶缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当通过细胞表达时不是膜结合的；或
所述透明质酸酶降解酶含有一个或多个氨基酸残基的C末端截短，以去除所有或部分GPI锚。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶，其为PH20或其C末端截短的片段。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是PH20多肽，其具有SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中任一显示出至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的氨基酸序列。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述透明质酸降解酶是C末端截短的PH20，其包含SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中：
步骤a)中的所述透明质酸降解酶以这样的量施用，所述量在功能上等于在下述之间或大约在下述之间：1单位-200单位、5单位-150单位、10单位-150单位、50单位-150单位或1单位-50单位；或
步骤a)中的所述透明质酸降解酶以这样的量施用，所述量是或是约8ng-2μg、20ng-1.6μg、80ng-1.25μg或200ng-1μg。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素。
23.权利要求22的方法，其中所述普通胰岛素是人胰岛素或猪胰岛素。
24.权利要求22或23的方法，其中所述普通胰岛素是具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列，所述B链具有SEQ ID NO:104中所示的氨基酸序列，或者所述普通胰岛素是具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置88-108所示的氨基酸序列，所述B链具有SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置25-54所示的氨基酸序列。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述速效胰岛素是胰岛素类似物。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述速效胰岛素类似物是选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素或谷赖胰岛素的胰岛素类似物。
27.权利要求25或26的方法，其中所述胰岛素类似物选自具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列，且所述B链具有SEQ ID NO:147-149中任一所示的氨基酸序列。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中：
所述胰岛素组合物包含量是或是约10U/mL-1000U/mL的胰岛素；或
所述胰岛素组合物包含量是或是约0.35mg/mL-35mg/mL的胰岛素。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述组合物中的所述胰岛素是至少或约至少或100U/mL。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中步骤b)中的所述组合物包含速效胰岛素类似物和透明质酸降解酶。
31.权利要求30的方法，其中：
所述组合物的速效胰岛素类似物的量是或是约10U/mL-1000U/mL；和
所述组合物中的透明质酸降解酶的量在功能上等于1U/mL-10,000U/mL或约1U/mL-10,000U/mL。
32.一种用于控制对象中的血液葡萄糖的持续皮下胰岛素输注(CSII)给药方案法，其包括：
a)依照设定的胰岛素的基本速率和推注剂量，进行CSII以将含有超速效胰岛素组合物的组合物递送给对象；和
b)与在不存在透明质酸降解酶的情况下施用的设定的胰岛素基础速率和推注剂量相比较，在疗程期间至少一次使所述施用的基础胰岛素和/或推注胰岛素的量增加至少1%，从而增加胰岛素作用。
33.权利要求32的方法，其中所述施用的基础胰岛素和/或推注胰岛素每天增加至少一次。
34.权利要求32或33的方法，其中所述超速效胰岛素组合物包含：
用于控制血液葡萄糖水平的治疗有效量的速效胰岛素类似物；和
足以使所述组合物成为超速效胰岛素组合物的量的透明质酸降解酶。
35.权利要求34的方法，其中：
所述速效胰岛素的量是或是约10U/mL-1000U/mL；并且足以使所述组合物成为超速效的所述透明质酸降解酶的量在功能上等于1U/mL-10,000U/mL；或
所述速效胰岛素的量是或是约0.35mg/mL-35mg/mL；并且足以使所述组合物成为超速效的所述透明质酸降解酶的量在功能上等于8ng/mL-80μg/mL。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中所述对象具有糖尿病。
37.权利要求36的方法，其中所述糖尿病选自1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。
38.一种组合物，其包含用于使胰岛素吸收中的变化降到最低的透明质酸降解酶，所述胰岛素吸收中的变化发生在用于治疗糖尿病的持续皮下胰岛素输注(CSII)的过程中。
39.透明质酸降解酶组合物用于使胰岛素吸收中的变化降到最低的用途，所述胰岛素吸收中的变化发生在用于治疗糖尿病的持续皮下胰岛素输注的过程中。
40.一种用作用于治疗糖尿病的持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法中的前沿的组合物，其中：
用于胰岛素疗法的前沿治疗剂是在通过CSII输注胰岛素组合物前施用的组合物；和
所述组合物包含配制用于以这样的量直接施用的透明质酸降解酶，所述量使在持续皮下胰岛素输注(CSII)的过程中发生的胰岛素吸收中的变化降到最低。
41.组合物作为用于治疗糖尿病的持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法中的前沿的用途，其中：
用于胰岛素疗法的前沿治疗剂是在通过CSII输注胰岛素组合物前施用的组合物；和
所述组合物包含配制用于以这样的量直接施用的透明质酸降解酶，所述量使在持续皮下胰岛素输注(CSII)的过程中发生的胰岛素吸收中的变化降到最低。
42.权利要求38-41中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶具有足够催化透明质酸水解以增加组织穿透性的治疗有效量。
43.权利要求38-42中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶。
44.权利要求38-43中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶是在中性pH下具有活性的透明质酸酶。
45.权利要求38-44中任一项的组合物或用途，其中：
所述透明质酸降解酶缺乏糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，或当通过细胞表达时不是膜结合的；或
所述透明质酸酶降解酶含有一个或多个氨基酸残基的C末端截短，且缺乏所有或部分GPI锚。
46.权利要求38-45中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶是透明质酸酶，其为PH20或其C末端截短的片段。
47.权利要求38-46中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶是PH20多肽，其具有SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4-9、47-48、234-254和267-273中任一显示出至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的氨基酸序列。
48.权利要求38-47中任一项的组合物或用途，其中所述透明质酸降解酶是C末端截短的PH20多肽，其包含SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列显示出至少85%序列同一性的氨基酸序列。
49.权利要求38-48中任一项的组合物或用途，其中所述PH20具有SEQ ID NO：4-9中任一所示的氨基酸序列。
50.权利要求38-49中任一项的组合物或用途，其中：
所述组合物中的所述透明质酸降解酶具有在功能上等于在下述之间或大约在下述之间的量：1单位-200单位、5单位-150单位、10单位-150单位、50单位-150单位或1单位-50单位；或
所述组合物中的所述透明质酸降解酶的量是或是约8ng-2μg、20ng-1.6μg、80ng-1.25μg或200ng-1μg。
51.权利要求38-50中任一项的组合物或用途，其中所述组合物中的所述透明质酸降解酶具有在下述之间或大约在下述之间的量：10单位/mL-20,000单位/mL、30单位/mL-3000U/mL、100U/mL-1000U/mL、300U/mL-2000U/mL、600U/mL-2000U/mL或600U/mL-1000U/mL。
52.权利要求38-51中任一项的用途或组合物，其中用于在持续皮下胰岛素输注(CSII)疗法中使用的所述胰岛素组合物包含速效胰岛素。
53.权利要求52的用途或组合物，其中所述速效胰岛素是普通胰岛素。
54.权利要求53的用途或组合物，其中所述普通胰岛素是人胰岛素或猪胰岛素。
55.权利要求53或权利要求54的用途或组合物，其中所述普通胰岛素是具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列，所述B链具有SEQ ID NO:104中所示的氨基酸序列，或者所述普通胰岛素是具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:123的氨基酸残基位置88-108所示的氨基酸序列，所述B链具有SEQ IDNO:123的氨基酸残基位置25-54所示的氨基酸序列。
56.权利要求52的用途或组合物，其中所述速效胰岛素是胰岛素类似物。
57.权利要求56的用途或组合物，其中所述速效胰岛素类似物是门冬胰岛素、赖脯胰岛素或谷赖胰岛素。
58.权利要求57的用途或组合物，其中所述胰岛素类似物选自具有A链和B链的胰岛素，所述A链具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列，且所述B链具有SEQ ID NO:147-149中任一所示的氨基酸序列。
59.权利要求52-58中任一项的用途或组合物，其中所述速效胰岛素以是或是约10U/mL-1000U/mL或500U/mL-1000U/mL的量配制于所述组合物中。
60.权利要求38-59中任一项的组合物或用途，其用于在所述胰岛素组合物输注前15秒到1小时、30秒到30分钟、1分钟到15分钟、1分钟到12小时、5分钟到6小时、30分钟到3小时或1小时到2小时使用。
61.权利要求38-60中任一项的用途或组合物，其用于在所述胰岛素组合物输注前不超过2小时使用。
62.一种组合物，其包含用于在改善总胰岛素作用降低中使用的推注胰岛素，所述总胰岛素作用降低由超速效胰岛素组合物的持续皮下胰岛素输注引起。
63.推注胰岛素用于改善由超速效胰岛素组合物的持续皮下胰岛素输注引起的总胰岛素作用降低的用途。
64.权利要求62或63的组合物或用途，其中所述超速效胰岛素组合物包含：
用于控制血液葡萄糖水平的治疗有效量的速效胰岛素类似物；和
足以使所述组合物成为超速效胰岛素组合物的量的透明质酸降解酶。
65.权利要求64的用途或组合物，其中：
所述速效胰岛素类似物的量是或是约10U/mL-1000U/mL；和
足以使所述组合物成为超速效的所述透明质酸降解酶的量在功能上等于1U/mL-10,000U/mL。
66.权利要求62-65中任一项的用途或组合物，其中：
所述速效胰岛素的量是或是约0.35mg/mL-35mg/mL；和
足以使所述组合物成为超速效的所述透明质酸降解酶的量在功能上等于8ng/mL-80μg/mL。
67.权利要求62-66中任一项的用途或组合物，其中所述速效胰岛素推注是速效胰岛素。
68.权利要求67的用途或组合物，其中所述速效胰岛素推注是普通胰岛素或胰岛素类似物。
69.权利要求62-68中任一项的用途或组合物，其中与在不存在透明质酸降解酶的情况下，在相同餐后条件和/或用于高血糖事件校正而施用的胰岛素的设定胰岛素剂量相比较，所述组合物中的所述推注胰岛素的量增加至少1%。
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