KR20130116386A - 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도 - Google Patents

히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도 Download PDF

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그레고리 아이 프로스트
핑 지앙
커티스 비. 톰슨
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할로자임, 아이엔씨
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Abstract

히알루로난-관련 상태, 질환 및 장애의 치료를 위한, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 한 예에서, 제품은 추가 작용제 또는 치료를 포함한다. 이러한 제품은 히알루로난-관련 질환 및 상태, 예를 들어 히알루로난-관련 암, 예를 들어 히알루로난-풍부 종양의 치료를 위한 제품의 투여 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 히알루로난 분해 효소 조성물 단독 또는 다른 치료와의 병용 투여를 포함한다. 또한, 히알루로난-관련 질환 및 상태에서 지속된 치료 효과를 제공하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도{Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions}
히알루로난 관련 상태, 질환 및 장애를 치료하기 위한 히알루로난 분해효소, 특히 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조합물, 조성물 및 키트를 제공한다. 일례에 있어서, 상기 제품은 추가적인 작용제 또는 치료법을 포함한다. 이러한 제품은 히알루로난 관련 질환 및 상태, 예를 들면, 히알루로난 관련 암, 예를 들면 히알루로난 풍부 종양을 치료하기 위한 제품을 투여하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 히알루로니다제 조성물 등의 히알루로난 분해효소 조성물을 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 투여하는 방법을 들 수 있다. 또한, 히알루로난 관련 질환 및 상태의 지속적인 치료효과를 제공하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
히알루로난 (히알루론산: HA)은 동물의 결합조직, 피부, 연골 및 및 골액에 현저하게 존재하는 글리코사미노글리칸이다. 또한, 히알루로난은 눈의 유리체액의 주요한 구성요소이다. 결합조직에서 히알루로난과 관련된 수화반응의 물이 조직 사이의 기질을 수화시킨다. HA는 많은 세포의 세포외 기질, 특히 부드러운 결합조직에서 발견된다. HA는 세포내 기질에서 물과 혈장 단백질의 항상성에서와 같은 각종 생리적인 과정에서 역할을 한다(Laurent TC 등 (1992) FASEB J 6: 2397-2404). 특정 질환은 히알루로난의 발현 및/또는 제조에 관련되어 있다.
히알루로니다제를 포함하는 히알루로난 분해효소는 히알루로난을 분해하는 효소이다. 각종 히알루로난 분해효소는 일반적으로 분산제 및 산포제로서 다른 치료제와 함께 치료에 사용되어 왔다. 특히 히알루로난 관련 질환 및 상태를 치료하기 위한 히알루로난 분해효소를 투여하기 위해 개선된 조성물 및 방법이 필요하다.
관련 출원
우선권의 이익은 Gregory Frost의 "변형된 가용성 히알루로니다제 및 치료제 및 치료를 사용한 병용 치료"라는 제목의 2004.4.14.자 미국 가출원번호 61/124,278호, Gregory Frost의 "가용성 히알루로니다제 및 화학치료제를 사용한 병용 치료"라는 제목의 2008.5.29자 미국 가출원번호 61/130,357호, 및 Gregory Frost의 "히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 용도"라는 제목의 2008.10.8자 미국 가출원번호 61/195,624에 대해 주장된다.
본 출원은 미국 가출원번호 61/124,278호, 미국 가출원번호 61/130,357호 및 미국 가출원번호 61/195,624호에 대해 우선권을 주장하는, "히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 용도"라는 제목으로 동일한 일자에 출원된 미국 특허출원번호(Attorney Dkt. No. 119374-00091/3066)와 관련된다. 상기 주지된 관련출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 포함된다.
상기 언급된 출원의 대상물은 그 전체가 참조로서 삽입된다.
요약
히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 히알루로니다제, 특히 동물성 또는 박테리아 히알루로니다제와 같은 가용성 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 히알루로난 분해효소는 페길화 잔기과 같은 폴리머에 의해 변형되어 있다. 이러한 히알루로난 분해효소로서는 가용성 인간 히알루로니다제를 들 수 있다. 이러한 가용성 히알루로니다제 및 그 제제는, 예를 들면 동시 계속중인 미국 특허출원 번호 10/795,095(공개 번호 US20040268425), 미국 특허출원 번호 11/065,716 (공개 번호 US20050260186), 미국 특허출원 번호 11/238,171(공개 번호 US20060104968)에 기재되어 있다. 이러한 가용성 히알루로니다제는 페길화 잔기과 같은 폴리머에 의해 변형되어 있다. 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소는 폴리머에 의해 변형되어 반감기 및 약동학과 같은 특성을 변경시킨다. 상기 변형은 직접적으로 또는 링커, 예를 들면 공유결합 또는 기타 안정한 결합, 폴리머, 예를 들면 덱스트란, 페길화 또는 시알화 잔기, 또는 다른 폴리머, 예를 들면 천연 또는 당 폴리머를 통해 간접적으로 결합되는 것을 포함한다. 본원의 예시적인 구현예에서, 히알루로난 분해효소는 페길화되어 있다.
본원에서 히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 폴리머의 접합에 의해 변형된 가용성 히알루로니다제를 투여하는 것을 포함한다. 또한, 가용성 히알루로니다제를 혈장 내에 히알루로니다제 효소의 혈장 수준을 적어도 1주일 동안 적어도 3U/mL의 수준으로 유지하는데에 충분한 양으로 함유한 조성물 및 이러한 조성물을 함유하는 조합물을 제공한다. 본원에서 제공된 조성물 및 조합물 내의 가용성 히알루로니다제는 폴리머에 접합되어 있다.
본원에서 히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료 전의 수준으로 기질의 재합성을 예방하기 위해, 가용성 히알루로니다제 효소를 적어도 약 또는 3 U/mL의 혈장 내에 히알루로니다제의 약리학적 활성 수준을 유지하는 데에 충분한 양으로 1주 1회 초과해서, 미리결정된 몇 주 동안 대상체에 투여하는 것을 수반한다. 상기 방법에 사용된 히알루로니다제 효소는 폴리머와의 접합에 의해 변형되고, 미리결정된 몇 주는 1주를 초과한다. 일부 예에서, 미리결정된 몇 주는 적어도 2주, 예를 들면 2주, 3주 또는 4주이다. 상태 또는 질환 치료시, 축적된 히알루로니다제 기질로서는 히알루로난을 포함한다. 일례로, 치료 전에 대상체로부터 시료의 히알루로난 발현이 측정된다.
히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법의 일부 예에서, 미리결정된 몇 주 후, 미리결정된 제1 시간의 기간, 예를 들면 적어도 1주 동안 투여를 중지한 후, 적어도 1주 동안 다시 투여를 재개한다. 예를 들면, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 투여를 중지한 후 적어도 1주 동안 다시 투여를 재개할 수 있다. 또한 예에서, 미리결정된 제1 시간의 기간 후, 치료 전의 수준으로 기질의 재합성을 예방하기 위해, 가용성 히알루로니다제를, 적어도 약 또는 3 U/mL의 혈장 내에 히알루로니다제의 약리학적 활성 수준을 유지하는 데에 충분한 양으로 1주 1회 초과해서, 미리결정된 몇 주 동안 대상체에 더욱 투여한다. 이들 방법 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 투여 및 투여중지 사이클을 수 회 반복한다.
본원에 제공된 방법 중 일부 구현예에서, 상기 히알루로니다제는 적어도 또는 약3U/mL-12U/mL의 혈장 내에 히알루로니다제의 약리적 활성수준을 유지하는데 충분한 양으로 투여한다. 예를 들면, 히알루로니다제는 적어도 또는 약 5U/mL, 6U/mL, 7U/mL, 8U/mL, 9U/mL, 10U/mL, 15U/mL, 20U/mL, 30U/mL, 40U/mL, 45U/mL, 50U/mL 이상의 혈장 내에 히알루로니다제의 약리적 활성 수준을 유지하는데에 충분한 양으로 투여할 수 있다. 상기 방법의 특별한 구현예에서, 히알루로니다제는 적어도 또는 약 10U/mL의 혈장 내에 히알루로니다제의 약리적 활성 수준을 유지하는데에 충분한 양으로 투여한다.
히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 중 하나의 구현예에서, 히알루로니다제는 1주 2회 투여한다. 대상체에 투여된 히알루로니다제의 양은, 예를 들면 0.02mg(대상체의)/kg, 0.03mg/kg, 0.04mg/kg, 0.05mg/kg, 0.06mg/kg, 0.07mg/kg, 0.08mg/kg, 0.09mg/kg, 0.1mg/kg, 0.15mg/kg, 0.2mg/kg, 0.25mg/kg, 0.30mg/kg, 0.35mg/kg, 0.40mg/kg, 0.45mg/kg, 0.5mg/kg, 0.55mg/kg, 0.6mg/kg, 0.7mg/kg, 0.8mg/kg, 0.9mg/kg, 1.0mg/kg, 1.1mg/kg, 1.2mg/kg, 1.3mg/kg, 1.4mg/kg, 1.5mg/kg 이상일 수 있다. 일례에서, 상기 히알루로니다제의 투여량은 0.05mg/kg 내지 0.8mg/kg이다. 또한 예에서, 히알루로니다제의 투여량은 약 50,000 유닛(U); 60,000U; 70,000U; 80,000U; 90,000U; 100,000U; 200,000U; 300,000U; 400,000U; 500,000U; 600,000U; 700,000U; 800,000U; 900,000U; 1,000,000U; 1,500,000U; 2,000,000U; 2,500,000U; 3,000,000U; 3,500,000U; 4,000,000U 이상이다.
본원에서 대상체 내에 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 대상체로부터 시료 내에 히알루로난 발현 또는 히알루론을 측정하는 단계; 및 (b) 대상체로부터 시료 내의 히알루로난 발현 또는 히알루론이 질환 또는 상태를 나타내는 수준으로 상승하면 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법에서 사용된 가용성 히알루로니다제는 폴리머와의 접합에 의해 변형되어 있다. 일부 예에서, 대상체로부터의 시료는 조직 또는 체액, 예를 들면 혈액 시료, 생검(tumor biopsy), 뇌척수액, 오줌, 땀, 정액, 또는 타액 시료이다.
히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법의 특별한 구현예에서, 질환 또는 상태를 치료하기 위한 제 2 작용제 및 다른 작용제를 대상체에게 투여한다. 일부 예에서, 제 2 작용제 및 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물은 단일 조성물로 투여된다. 다른 예에서, 제 2 작용제 및 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물은 별도로, 예를 들면 동시에, 연속적으로 또는 간헐적으로 임의의 순서로 투여된다. 하나의 구현예에서, 제 2 작용제는 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 투여한 후에 투여한다. 예를 들면, 제 2 작용제는 투여 주기에서 가용성 히알루로니다제를 먼저 투여한 후에 투여할 수 있고, 임의로 하나 이상의 가용성 히알루로니다제의 연속적인 투여, 예를 들면 가용성 히알루로니다제의 연속적인 투여 후, 다른 모든 가용성 히알루로니다제를 연속 투여 또는 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 1달 1회 투여할 수 있다.
본원에 제공된 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법의 일부 양상에 있어서, 상기 제 2 작용제는 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 투여한 후 적어도 0.5분, 적어도 1분, 적어도 5분, 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 1 시간 또는 1 시간 초과해서 투여된다. 일부 예에서, 제 2 작용제는 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 투여한 후, 적어도 또는 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간 또는 24 시간에 투여된다. 일례에서, 제 2 작용제는 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물 투여 후 적어도 48 시간에 투여된다. 다른 예에서, 제 2 작용제는 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물 투여 후 적어도 72 시간에 투여된다. 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 본원에서 제공된 방법의 양상에 있어서, 대상체로부터의 시료의 히알루로난의 발현은 대조 시료 또는 표준에서 발현과 비교된다.
히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법에서 사용된 히알루로니다제는 폴리머에 접합되어 있다. 일부 예에서, 폴리머는 시알화 또는 페길화 잔기가 있다. 본원에 제공된 일부의 방법에 있어서, 제 2 작용제는 상기 및 본원에 제공에서 기재된 바와 같이 대상체에게 투여된다. 일부 예에서, 제 2 작용제는 항암제 또는 치료법, 예를 들면 화학치료제, 방사선 치료, 항체, 펩티드, 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 핵산을 들 수 있다. 본원에서 제공된 일부 방법에서 사용된 제 2 작용제로서는 항암제, 예를 들면, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르를 들 수 있다.
히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 본원에 제공된 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 중 어느 하나에 있어서, 가용성 히알루로니다제 및/또는 제 2 작용제는 국소적 또는 전신, 예를 들면, 경구내, 정맥내 (IV), 피하내, 근육내, 종양내, 피부내, 국소, 경피내, 직장내 또는 표피하로 투여될 수 있다. 본원에 제공된 방법 중 특별한 예에 있어서, 가용성 히알루로니다제 및/또는 제 2 작용제가 정맥 내에 투여된다. 다른 예에서, 가용성 히알루로니다제 및/또는 제 2 작용제가 종양 내에 투여된다.
히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법 및 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 예에서, 히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태는 높은 간질액 압력을 수반한다. 또한 예에서, 본원에 제공된 방법에 의해 치료되는 질환 또는 상태는 디스크 압박, 암 또는 부종이다. 부종은, 예를 들면 장기 이식, 뇌졸중, 또는 뇌외상에 의해 발생될 수 있다. 치료될 질환 또는 상태가 암인 예에서, 암이 종양, 예를 들면, 고형 종양일 수 있다. 일부 예에서, 종양은 동일한 조직 유형의 비암성 조직 또는 동일한 종양 유형의 비전이성 종양에 비해 히알루로난의 세포발현 및/또는 간질 발현이 증가한다. 특별한 예에서, 치료될 질환 또는 상태는 말기암, 전이성 암 및/또는 미분화 암이다. 일례에서, 질환 또는 상태가 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 및 대장암이다. 본원에서 제공된 방법의 일부 예에서, 상기 치료는 대상체내에 종양의 크기를 줄이는 데 효과가 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법에서 사용된 가용성 히알루로난은 양, 마우스, 원숭이, 소, 박테리아 또는 인간 PH20를 포함하는 가용성 PH20을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 예에서, PH20의 가용성 형태는 C-말단 GPI를 제거하기 위해 말단 절단된 가용성 PH20이다. 본원에서 제공된 방법의 일부 양상에 있어서, 가용성 히알루로니다제는 서열번호 1에 포함된 아미노산의 서열 또는 서열번호 1에 포함된 아미노산의 서열과 적어도 약 91% 아미노산 상동성을 갖는 서열을 가짐으로써 가용성 히알루로니다제가 가용성, N-글리코실화 및 중성 활성을 갖는다. 다른 예에서, 가용성 히알루로니다제는 아미노산 잔기 467 내지 483 또는 그 사이의 아미노산 잔기에서 말단절단된 서열번호 1에 기재된 아미노산의 서열을 포함한다. 예를 들면, 가용성 히알루로니다제가 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483 중에서 선택된 아미노산 잔기에서 말단절단된 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 가용성 히알루로니다제가 CHO 세포에서 분비된다. 다른 양상에서, 가용성 히알루로니다제가 서열번호 1의 아미노산 36-467, 36-468, 36-469, 36-470, 36-471, 36-472, 36-473, 36-474, 36-475, 36-476, 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 36-467, 36-468, 36-469, 36-470, 36-471, 36-472, 36-473, 36-474, 36-475, 36-476, 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482 또는 36-483으로서 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 91%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 특별한 예에서, 가용성 히알루로니다제가 서열번호 4-9 및 46-48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 및 그의 대립형질 변이체, 종 변이체 및 다른 변이체 중에서 선택된다. 하나의 구현예에서, 가용성 히알루로니다제가 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드이다. 다른 구현예에서, 가용성 히알루로니다제가 서열번호 4-9 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 중에서 선택된다. 이러한 기질에서, 가용성 히알루로니다제가 CHO 세포내에서의 발현에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 가용성 히알루로니다제가 rHuPH20이라고 지칭된다. 또한, 일부 양상에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용된 가용성 히알루로니다제가 글리코실화된다.
상기 기재된 바와 같이, 히알루로니다제 기질이 축적된 질환 또는 상태를 치료하거나 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위해 본원에 제공된 방법에 있어서, 폴리머와의 접합에 의해 변형된 히알루로니다제 효소를 대상체에 투여한다. 일부 예에서, 가용성 히알루로니다제에 접합된 폴리머가 PEG화 잔기 (PEG), 예를 들면 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (5 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-부티르알데히드 (mPEG-부티르알데히드) (30 kDa), 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (30 kDa); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (10 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (20 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (40 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (60 kDa 분지형); 바이오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (바이오틴-PEG-NHS) (5 kDa 바이오티닐화된); 폴리(에틸렌 글리콜)-p-니트로페닐 카르보네이트 (PEG-p-니트로페닐-카르보네이트) (30 kDa); 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-프로피온알데히드 (PEG-프로피온알데히드) (30 kDa)를 포함한다. 일부 양상에서, PEG가 분지형 또는 선형 PEG이다. 특별한 예에서, PEG가 메톡시-PEG (mPEG) 또는 예를 들면 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르이다. 이러한 PEG는 30 또는 약 30 킬로달톤의 분자량을 가질 수 있다.
본원에서 가용성 히알루로니다제를 혈장 내의 히알루로니다제 효소의 혈장 수준을 적어도 3U/mL의 수준으로 적어도 몇 주 동안 유지하는 데에 충분한 양으로 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 가용성 히알루로니다제가 폴리머에 접합되어 있다. 일부 양상에서, 혈장 내의 히알루로니다제의 수준은 적어도 또는 약 3U/mL 내지 12U/mL이다. 히알루로니다제에 접합된 폴리머로서는 시알화 및 페길화 잔기를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 상기 조성물은 적어도 1주 초과 동안 적어도 1주 2 회 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 조성물은 폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제의 적어도 또는 약 2.0 mg-60 mg를 함유하고 상기 폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제는 적어도 또는 약 20,000U/mg, 25,000U/mg, 30,000U/mg, 31,000U/mg, 32,000U/mg, 33,000U/mg, 34,000U/mg, 35,000U/mg, 36,000U/mg, 37,000U/mg, 38,000U/mg, 39,000U/mg, 40,000U/mg, 45,000U/mg, 50,000U/mg, 55,000U/mg, 60,000U/mg 이상의 비활성도(specific activity)를 갖는다. 또한, 일부 양상에서, 상기 조성물은 1회 투여 당 적어도 10mL이다.
본원에 제공된 조성물은 경구내, 정맥내 (IV), 피하내, 근육내, 종양내, 피부내, 국소, 경피내, 직장내 또는 표피하로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 본원에 제공된 조성물은 히스티딘 및/또는 NaCl를 함유할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 약 또는 10 mM 히스티딘 및/또는 130 mM NaCl과 함께 제형화된다. 상기 조성물은 약 또는 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2의 pH를 가질 수 있다. 일례에서, 상기 조성물은 약 또는 6.5의 pH를 갖는다.
본원에서 가용성 히알루로니다제를 혈장 내의 히알루로니다제 효소의 혈장 수준을 적어도 3U/mL의 수준으로 적어도 몇 주 동안 유지하는 데에 충분한 양으로 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 가용성 히알루로니다제가 폴리머에 접합되어 있고, 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 작용제를 함유하는 제 2 조성물을 제공한다. 일부 예에서, 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물은 적어도 1주일 초과 동안 적어도 1주 2회 투여한다. 다른 양상에서, 상기 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물은 폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제의 적어도 또는 약 2.0 mg 내지 60 mg을 함유하고, 상기 폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제는 적어도 또는 약 20,000U/mg, 25,000U/mg, 30,000U/mg, 31,000U/mg, 32,000U/mg, 33,000U/mg, 34,000U/mg, 35,000U/mg, 36,000U/mg, 37,000U/mg, 38,000U/mg, 39,000U/mg, 40,000U/mg, 45,000U/mg, 50,000U/mg, 55,000U/mg, 60,000U/mg 이상의 비활성도를 갖는다.
본원에 제공된 조합물의 제1 및 제 2 조성물은 공동 제형화되거나 별도로 제공된다. 일부 예에서, 본원에 제공된 조합물에서 히알루로니다제에 접합된 폴리머는 시알화 또는 페길화 잔기가 있다. 다른 구현예에서 상기 조성물 중 제 2 작용제는 항암제 또는 치료법, 예를 들면 화학치료, 방사선 치료, 항체, 펩티드, 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 핵산을 들 수 있다. 특별한 예에서, 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르를 들 수 있다.
하나의 방법에 있어서, 변형된 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물을 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 갖는 대상체 또는 이러한 질환 또는 상태를 가질 수 있는 대상체에게 투여한 후 질환 또는 상태를 치료하기 위한 제 2 작용제 및 다른 작용제 또는 치료법을 투여한다. 제 2 작용제 또는 치료법은 히알루로난 분해효소 투여 후 24 시간 초과시에 투여된다. 전신 또는 국소 또는 적당한 임의의 경로, 예를 들면 정맥내, 경구내, 피하내, 또는 근육내에 효과적으로 투여될 수 있다.
대상체내에 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법에 있어서, 변형된 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물은 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 갖는 대상체 또는 이러한 질환 또는 상태를 가질 수 있는 대상체의 전신에 투여된다. 변형된 히알루로난 분해효소는 적어도 간질액 압력을 적어도 24 시간 초과하여 감소하는데 효과적인 양으로 투여된다. 히알루로난 분해효소의 투여는 질환 또는 상태를 치료할 수 있고 제 2 작용제 또는 치료제를 투여한다. 정맥내, 경구내, 피하내 또는 근육내, 예를 들면 종양 내에 투여하는데 효과적이다.
또한, 변형된 히알루로난 분해효소의 유효량을 함유하는 조성물을 대상체에 투여하여 대상체내에 간질액 압력을 저하하는 방법을 제공한다. 히알루로난 분해효소의 양은 24시간 초과 동안 간질액 압력을 저하시키고; 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 10 유닛 내지 1,000,000 히알루로니다제 유닛 사이, 예를 들면 약 또는 10 내지 50,000,000 유닛, 약 또는 10 내지 40,000,000 유닛, 약 또는 10 내지 36,000,000 유닛, 약 또는 10 내지 12,000,000 유닛, 약 또는 10 내지 1,200,000 유닛, 약 또는 10 내지 1,000,000 유닛, 약 또는 10 내지 500,000 유닛, 약 또는 100 내지 100,000 유닛, 약 또는 500 내지 50,000 유닛, 약 또는 1000 내지 10,000 유닛, 약 또는 5000 내지 7500 유닛, 약 또는 5000 내지 50,000 유닛, 약 또는 1,000 내지 10,000 유닛와 기능적으로 동등하다. 유닛은 일반적으로 미변형된 히알루로니나제에 대해 측정된다. 간질성 압력의 저하는 대상체에게 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료하는데 효과적이다.
본원에서 임의의 방법을 실행할 때에, 대상체로부터의 시료 내에 히알루로난의 발현은 치료 전, 치료 중, 치료 후에 측정될 수 있다(또는 평가되거나 모니터링된다). 필요에 따라서, 대상체로부터의 시료 내에 히알루로난의 발현은 대조 시료 또는 표준에서의 발현과 비교될 수 있다. 따라서, 예를 들면 대상체로부터의 시료내에 우선 히알루로난 발현을 측정하고 변형된 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 대상체 내에 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 투여는 국소 및 전신 투여, 예를 들면 경구내, 정맥내 (IV), 피하내, 근육내, 종양내, 피부내, 국소, 경피내, 경구내, 직장내 또는 표피하로의 투여를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 상기 시료, 예를 들면 조직 또는 체액, 예를 들면 혈액 시료, 생검, 뇌척수액, 오줌, 땀, 정액, 또는 타액 시료를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
상기 방법은 제 2 작용제 또는 치료제, 즉 히알루로난 분해효소 이외에 특별한 질환 치료에 사용되는 것을 투여함으로써 실시될 수 있다. 예를 들면, 상기 질환이 종양이면 제 2 작용제는 화학치료 및/또는 방사선 프로토콜/치료를 들 수 있다. 제 2 작용제로서는 항암제를 들 수 있다.
제 2 작용제가 약물 또는 조성물이면, 제 2 작용제 및 히알루로니다제는, 별도로, 단일 조성물로 또는 2개 조성물을 동시에, 또는 간헐적 또는 순차적 또는 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물은 제 2 작용제를 투여하기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 작용제 또는 치료제는 히알루로니다제 함유 조성물을 투여하기 전에 투여하거나 효과를 발휘할 수 있다. 본원에서 시간은 24 시간 이상 필요로 되지 않고 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물 투여와 제 2 작용제 또는 치료제의 투여 사이의 시간은 30초 또는 60초내, 적어도 1분, 적어도 5분, 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 1시간 또는 1시간 초과 전후일 수 있다. 시간차는 제 2 작용제 또는 치료제 투여 전에 적어도 또는 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 48시간, 또는 72 시간일 수 있다.
제 2 작용제 및 치료제로는, 예를 들면 항암제, 화학치료제, 방사선 치료, 항체, 펩티드, 유전자 치료 벡터, 바이러스, 예를 들면, 종양붕괴 바이러스 및 핵산, 예를 들면 항암 단백질 또는 다른 치료 단백질을 전달하는 유전자 치료 벡터를 들 수 있다. 다른 제 2 작용제 또는 치료제는 진통제, 소염제, 항미생물제, 살아메바제, 살트리코모나스제, 파킨슨병 치료제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관절염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린성 효능제, 알파 차단제, 마취제, 기관지확장제, 살생제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린성 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심혈관 약물, 피임약, 미용제 또는 에스테틱제, 충혈완화제, 이뇨제, 우울제, 진단제, 치료항체, 전해질제, 수면제, 호르몬제, 고혈당제, 근육 이완제, 근육 수축제, 안과용제, 부교감신경흥분제, 정신 자극제, 진정제, 수면유도제, 교감신경흥분제, 신경안정제, 비뇨기제, 질제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드계 소염제 및 안지오텐신 전환 효소 억제제를 들 수 있다. 이러한 작용제로서는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르를 들 수 있다.
히알루로난 관련 질환 또는 상태는, 예를 들면 높은 간질성액 압력, 예를 들면 디스크 압박, 암 및 부종에 관련되거나 포함하는 질환 또는 상태를 들 수 있다. 부종은, 예를 들면 장기 이식, 뇌졸증 또는 뇌외상에 기인하거나 그에서 나타날 수 있다. 암은 고형 및 림프관/혈종 및 전이성 질환 및 미분화 종양을 들 수 있다. 일반적으로 치료하기 쉬운 종양은 동일한 조직 유형의 비암성 조직 또는 동일한 종양 유형의 비전이성 종양에 비해 히알루로난의 세포 발현 및/또는 간질 발현을 나타낸다. 암은 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 위암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 및 대장암 중 어느 하나 이상을 포함한다.
기재된 바와 같이, 본원에서 방법, 조성물 및 조합물에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 비인간 동물 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제 및 인간 히알루로니다제를 포함하는 가용성 히알루로니다제를 들 수 있다. 가용성 히알루로니다제로서는 양, 소 및 인간 PH20 등의 PH20의 가용성 활성 부분을 들 수 있다. 이간 PH20과 같은 PH20에 가용성을 부여하기 위해, PH20을 말단절단하여 C-말단 GPI 앵커 부착 신호 서열을 제거한다. 인간 PH20에 대해, 말단절단은 서열번호 1의 잔기 467-482 중 어느 하나 또는 인간, 대립형질 변이체 또는 종 변이체 또는 다른 변이체에서 잔기 467-482 중 어느 하나에 상응하는 것에서 행해진다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소는 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드, 및 그의 대립형질 변이체, 종 변이체 및 다른 변이체 중에서 선택될 수 있다. 히알루로난 분해효소는 서열번호 3 또는 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산의 서열,예를 들면 서열번호 49에 기재된 핵산의 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 이들은 이러한 아미노산의 서열을 갖는 히알루로난 분해효소일 수 있다. 히알루로난 분해효소는 다른 변이체 중에서 선택된다. 다른 변이체는 상기 폴리 펩티드가 가용성이고 히알루로니다제 활성(즉, 히알루로난을 분해할 수 있는 것)을 나타내고, 본원에 제공에 기재된 방법을 포함한, 당업자에게 공지된 방법에 의해 평가될 수 있는 것이면 서열번호 1, 4-9 및 47-48에 기재된 아미노산의 인접한 서열과 총길이에 따라서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 염기 상동성을 갖는 폴리펩티드 중에서 선택된다.
특히, 히알루로난 분해효소는 인간 PH20 가용성 히알루로니다제의 아미노산 1-482 또는 36-482 (즉, 서열번호 1에 기재된) 또는 그 대립형질 변이체 또는 종 또는 다른 변이체를 코딩하는 핵산 분자의 발현에 의해 생산될 폴리펩티드일 수 있다. 발현은 CHO 세포와 같은 세포에서 발현 및 분비를 포함한다. 예를 들면 상기 조성물은 CHO 세포에서 아미노산 1-35과 같은 분비의 신호 서열을 코딩하는 핵산에 결합된, 아미노산 36-482를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생산되는 재조합 인간 PH20(rHuPH20)라고 지칭된다. rHuPH20은 배지로부터 분리된다. 분리 후, 이것은 하나 이상의 페길화 잔기, 예를 들면 (PEG) 또는 다른 폴리머와 반응하여 변형된다. 다른 히알루로난 분해효소는 유사하게 변형될 수 있고 재조합 발현에 의해 제조되거나 천연 자원으로부터 분리될 수 있다. 이러한 방법 및 제품은 당업자에게 공지된 것이다.
히알루로난 분해효소를 변형하기 위한 폴리머로는 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (5 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-부티르알데히드 (mPEG-부티르알데히드) (30 kDa), 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (30 kDa); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (10 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (20 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (40 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (60 kDa 분지형); 바이오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (바이오틴-PEG-NHS) (5 kDa 바이오티닐화된); 폴리(에틸렌 글리콜)-p-니트로페닐 카르보네이트 (PEG-p-니트로페닐-카르보네이트) (30 kDa); 및 폴리(에틸렌 글리콜)-프로피온알데히드 (PEG-프로피온알데히드) (30 kDa)를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
PEG 잔기는 공지되어 있고 시판된 것이나 합성된 것을 들 수 있다. PEG부분은 분지형 또는 선형 PEG이고, 예를 들면, 메톡시-PEG (mPEG), 예를 들면 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르이다. 이러한 PEG는 30 또는 약 30 킬로달톤의 적당한 분자량을 가질 수 있다.
히알루로난 분해효소가 변형되면, 비활성도가 감소될 수 있다. 이를 보상하기 위해, 더 많은 양(중량)의 변형된 종이 사용된다. 예를 들면, 페길화된 rHuPH20의 비활성도는 천연 rHuPH20의 비활성도에 비해 2배, 3배 또는 4배 또는 약 2배, 3배 또는 4배 낮을 수 있다. 투여량을 조절하여 원하는 유닛을 전달한다. 투여량은 질환 또는 상태 및 특별한 히알루로난 분해효소, 예를 들면, 특별한 히알루로니다제 및 그 변형물에 따라 다르다. 일반적인 투여량은 가용성 히알루로니다제의 약 또는 10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛, 10 내지 36,000,000 유닛, 10 내지 12,000,000 유닛, 10 내지 1,200,000 유닛, 10 내지 1,000,000 유닛, 10 내지 500,000 유닛, 100 내지 100,000 유닛, 500 내지 50,000 유닛, 1,000 내지 10,000 유닛, 5000 내지 7500 유닛, 1,000 내지 10,000 유닛이다. 히알루로난 분해효소가 히알루로니다제가 아닌 예에 있어서, 일반적인 투여량은 약 또는 10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛, 10 내지 36,000,000 유닛, 10 내지 12,000,000 유닛, 10 내지 1,200,000 유닛, 10 내지 1,000,000 유닛, 10 내지 500,000 유닛, 100 내지 100,000 유닛, 500 내지 50,000 유닛, 1,000 내지 10,000 유닛, 5000 내지 7500 유닛, 5000 내지 50,000 유닛 또는 1000 내지 10,000 히알로니다제 유닛과 기능적으로 동등하다. 이러한 투여량을 선택하고 사용하여 대상체의 조직내에 간질액 압력의 적어도 25%, 약 25%, 50%, 약50% 감소시킬 수 있고, 이는 투여 후 약 또는 1 시간 또는 2 시간 초과, 또는 적어도 8 시간 또는 적어도 약 8 시간, 적어도 24 시간 또는 적어도 약 24 시간, 적어도 48 시간 또는 적어도 약 48 시간 또는 적어도 72 시간 또는 적어도 약 72 시간 동안 유지될 수 있다.
변형된 히알루로난 분해효소 조성물의 투여, 예를 들면 변형된 히알루로니다제 조성물의 투여는 혈관부피, 예를 들면 종양을 변화시킬 수 있다. 이러한 변화에 의해 대상체내의 조직의 혈관 부피가 적어도 2배 또는 약 2배 또는 적어도 3배 또는 약 3배 증가될 수 있다. 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물의 투여는 대상체의 조직내에 수분함량이 적어도 25% 또는 약25% 또는 적어도 50% 또는 약 50% 감소하시킬 수 있다. 이러한 변화가 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물의 투여 후, 적어도 8 시간 또는 약 8 시간, 적어도 24 시간 또는 약 24 시간, 적어도 48 시간 또는 약 48 시간, 적어도 72 시간 또는 약 72 시간 동안 유지되거나 나타날 수 있다.
히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물의 투여는 대상체의 조직내에 히알루로난 양성 세포의 비율을 감소시킬 수 있다. 히알루로난 양성 세포는 종양, 예를 들면 고형 종양에서 발생할 수 있다. 치료는 대상체내에 종양의 크기의 감소시킬 수 있다.
히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물의 투여에 의해 대상체의 혈액내에 히알루로니다제 활성을 나타내고 및/또는 관찰될 수 있다. 대상체의 혈액내에 히알루로니다제의 반감기는 적어도 1 또는 약 1시간, 5 또는 약 5시간, 8 또는 약 8시간, 10 또는 약 10시간, 15 또는 약 15시간, 24 또는 약 24시간, 48 또는 약 48시간, 72 또는 약 72시간이다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물의 투여에 의해 대상체의 혈액내에 히알루로니다제 활성을 일으킬 수 있고, 대상체로부터 1mL의 혈장내에는 적어도 1 또는 약 1시간, 5 또는 약 5시간, 8 또는 약 8시간, 10 또는 약 10시간, 15 또는 약 15시간, 24 또는 약 24시간, 48 또는 약 48시간, 72 또는 약 72시간 동안 환자에게 투여된 전체 히알루로니다제 활성의 적어도 5% 또는 약 5%을 갖는다.
하기를 함유하는 조합물도 제공된다:
간질액 압력을 저하하는 히알루로난 분해효소의 유효량을 함유하는 제1 조성물, 여기서 상기 양은 24 시간 초과해서 간질액 압력을 감소시키고 히알루로난 분해효소의 양은 약 또는 10 내지 1,00,000 사이, 약10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛 사이, 10 내지 36,000,000 유닛 사이, 10 내지 12,000,000 유닛 사이, 10 내지 1,200,000 유닛 사이, 10 내지 1,000,000 유닛 사이, 10 내지 500,000 유닛 사이, 100 내지 100,000 유닛 사이, 500 내지 50,000 유닛 사이, 1000 내지 10,000 유닛 사이, 5000 내지 7500 유닛 사이, 5000 내지 50,000 유닛 사이 또는 1,000 내지 10,000 히알루로니다제에 기능적으로 동일함; 및 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 작용제를 함유하는 제 2 조성물.
히알루로난 분해효소는 히알루로니다제의 반감기를 증가시킨 폴리머의 접합에 의해 변형된다. 폴리머로서는 덱스트란, 시알화 또는 페길화 잔기 및/또는 그 조합을 포함한다. 히알루로난 분해효소는 가용성 히알루로니다제이고, 상기 기재된 비인간 동물 히알루로니다제, 인간 히알루로니다제 및 박테리아 히알루로니다제 중에서 선택된 것을 포함하고, 이 가용성 히알루로니다제는 상기 방법에 사용하기 위해 상기 기재된 PH20의 가용성 형태이다. 제 2 작용제 또는 치료제로서는 상기 방법에 사용하기 위해서 기재된 임의의 것을 들 수 있다.
상기 기재된 방법에 의해 히알루로난을 함유하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위의 기질을 함유하는 암 및 다른 질환이 치료된다. 이러한 암 및 다른 질환은 변형된 가용성 히알루로니다제 및 본원에 기재된(상술한 및 후술한) 다른 작용제로 치료하기 쉽다. 본원에 상술한 바와 같이, 변형된 히알루로난 분해효소, 이러한 페길화 rHuPH20과의 접촉이 세포주위의 코팅을 붕괴시킨다. 예시된 페길화 rHuPH20 (PEGrHuPH20)이 투여량 의존 유형에서 종양 IFP를 감소시키기 때문에, IV 투여 후 IFP가 85% 초과해서 감소한다. 종양 주위의 HA는 PEGrHuPH20의 1회 투여후 3일에 걸쳐 소모된다. 종양 세포를 둘러싸고 있는 세포주위의 히알루로난의 조직적 붕괴에 따라서, 종양의 수분함량은 3일에 걸쳐 상당히 감소되고, 이것은 현성확산계수 (Apparent Diffusion Coefficient; ADC) MRI 및 IFP 모니터링에 의해 종양내에 소모된 변화와 일치한다. 또한, 예시된 바와 같이, 종양 혈관부피의 3.5배의 선택적 증가는 종양내에 혈관의 감압의 결과로, 투여후 8 시간내에 달성되었다. 이것은 조직구조 및 초음파에 의해 확인되었다. 이러한 종양 미세 환경에서 히알루로난은 변형된 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 페길화 rHuPH20 (PEGrHuPH20)함께 목적으로 될 수 있다. 또한, 예시된 바와 같이, 화학치료제, 예를 들면 도세탁셀 또는 리포좀 독소루비신과 공동 투여된 페길화 rHuPH20은 화학치료제만을 투여한 경우에 비해 동물 모델내에 화학치료제의 항종양 활성을 증가시킬 수 있다.
히알루로난-관련 상태, 질환 및 장애의 치료를 위한, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조합물, 조성물 및 키트가 제공된다. 한 예에서, 제품은 추가 작용제 또는 치료를 포함한다. 이러한 제품은 히알루로난-관련 질환 및 상태, 예를 들어 히알루로난-관련 암, 예를 들어 히알루로난-풍부 종양의 치료를 위한 제품의 투여 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 히알루로난 분해 효소 조성물 단독 또는 다른 치료와의 병용 투여를 포함한다. 또한, 히알루로난-관련 질환 및 상태에서 지속된 치료 효과를 제공하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
도 1은 종양(PC3 Prostate Carcinoma Model)을 제조하기 위해 인간 PC3 전립선암 세포를 근육내에 접종한 누드마우스의 종양부피를 나타낸다. 접종 후, 마우스에게 유효 약리 성분 (API) 버퍼, 30mg/kg의 도세탁셀, 10mg/kg의 도세탁셀, 페길화 rHuPH20(P) 또는 페길화 rHuPH20 + 10mg/kg의 도세탁셀 (T+P)을 투여하는 치료요법을 실시하였다. 각종 시점에서 종양 부피를 측정하여 도세탁셀의 항종양 활성에 대한 페길화 rHuPH20과 도세탁셀의 공동 투여의 효과를 평가하였다.
도 2는 인간 PC3 전립선암 세포를 근육내 주입한 후 버퍼(대조 마우스), 도세탁셀, 페길화 rHuPH20 또는 페길화 rHuPH20/도세탁셀 중 하나로 치료된 각각의 시점에서 종양부피 1500 mm3에 대한 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 3은 종양(PC3 Prostate Carcinoma Model)을 제조하기 위해 인간 PC3 전립선암 세포를 근육내 접종한 누드 마우스의 종양부피를 나타낸다. 접종후, 마우스에게 API 버퍼, 페길화 rHuPH20(P), 리포좀 독소루비신 (D+P) 중 어느 하나를 투여하는 치료요법을 실시하였다. 종양 부피는 각종 시점에서 측정하여 리포좀 독소루비신의 항종양 활성에 대한 리포좀 독소루비신과 페길화 rHuPH20의 공동 투여의 효과를 평가하였다.
도 4는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일에 페길화 rHuPH20(P)의 3000, 7000, 10000 또는 30000 유닛을 투여한 후 체중 변화(율)을 나타낸다.
도 5는 0일, 7일, 14일 및 21일에 누드 마우스에게 페길화 rHuPH20(T+P)의 3000, 7000 또는 10000 유닛 중 어느 하나와 함께 10mg/kg의 도세탁셀을 투여한 후 체중 변화(율)을 나타낸다. 이들 마우스는 3일, 10일, 17일, 및 24일에 페길화 rHuPH20의 3000, 7000, 또는 10000 유닛 중 어느 하나를 주입한다. API 버퍼 또는 10mg/kg 도세탁셀을 주입한 마우스의 체중 변화를 나타낸다.
도 6은 페길화 rHuPH20와 10mg/kg 탁소테레®(도세탁셀), 페길화 rHuPH20 단독, 탁소테레®(도세탁셀) 단독 또는 API 버퍼 단독 중 어느 하나를 각종 투여량으로 투여한 누드 마우스의 혈액내의 과립구의 수를 나타낸다. 그룹 1의 마우스는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일에 API 버퍼를 주입하고; 그룹 2-5에는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일에 3000, 7000, 10000, 또는 30000 유닛/마우스의 투여량으로 페길화 rHuPH20을 주입하고; 그룹 6-8에는 탁소테레®(도세탁셀)와 3000, 7000, 10000 유닛/마우스의 페길화 rHuPH20을 0일, 7일, 14일, 21일 투여한 후 페길화 rHuPH20 만을 3일, 10일, 17일, 24일에 투여하고; 그룹 9 및 10에는 10 mg/kg 탁소테레®(도세탁셀) 또는 30 mg/kg의 탁소테레®(도세탁셀)를 0일, 7일 및 14일에 주입한다. 각종 시점에서 혈액내에 과립구의 수를 평가했다.
도 7은 페길화 rHuPH20과 10mg/kg의 탁소테레®(도세탁셀), 페길화 rHuPH20 단독, 탁소테레®(도세탁셀) 단독 또는 API 버퍼 단독 중 어느 하나를 각종 투여량으로 투여한 누드 마우스의 혈청내에 알부민 수준을 나타낸다. 그룹 1의 마우스는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일에 API 버퍼를 주입하고; 그룹 2-5에는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일에 3000, 7000, 10000, 또는 30000 유닛/마우스 중 하나의 투여량으로 페길화 rHuPH20을 주입하고; 그룹 6-8에는 탁소테레®(도세탁셀)와 3000, 7000, 10000 유닛/마우스의 페길화 rHuPH20을 0일, 7일, 14일, 21일 투여한 후 페길화 rHuPH20 만을 3일, 10일, 17일, 24일에 투여하고; 그룹 9 및 10에는 10 mg/kg 탁소테레®(도세탁셀) 또는 30 mg/kg의 탁소테레®(도세탁셀)를 0일, 7일 및 14일에 주입한다.
도 8은 HA 풍부 인간 전립선암 이종이식 모델, PC3에서 반복적인 페길화 rHuPH20만의 투여 효과를 나타낸다. 실시예 16A에서 기재된 바와 같이, 마우스에게 0일, 3일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일 및 17일에 대조 버퍼와 페길화 HuPH20의 양(효소유닛U)를 주입하였다. 2일, 4일, 7일, 11일, 14일 및 18일에 비주얼 소닉스(Visual Sonics)® 초음파계를 사용하여 촬상하고 초음파 촬상 소프트웨어 프로그램 사용함으로써 각각의 동물군의 연구 과정에서 종양부피(mm3)를 측정하였다. 이러한 결과는 표 29에 기재되어 있다.
도 9 내지 14 는 API 버퍼 또는 3000U 페길화 rHuPH20의 투여 후 히알루로난(HA) 종양 발현(+++, ++ 및 +)의 변화 정도를 갖는 3개의 다른 종양 모델(PC3, 4T1-GEP, Mat LyLu)에서 종양부피 및 생존율을 나타낸다. 이들 결과는 실시예 17C에 기재되어 있고, 표 33-37에 기재되어 있다. 실시예 17에 기재된 바와 같이, 각각의 시점에서 각각의 군에서 "생존한" 동물의 비율을 측정함으로써 각각의 모델에서 효과를 평가하였다. 이 연구에 대해서, 1500mm3 이상의 종양 부피를 종말점으로서 선택하였고, 이것은 빈사(사망) 상태와 유사하다고 고려되고 1500mm3 미만의 종양부피를 갖는 동물은 생존했다고 고려되고, 반면에 1500mm3 이상의 종양부피를 갖는 동물은 병에 걸렸다고 고려되었다.
도 15은 실시예 18에 기재된 바와 같이 PC3 뇌종양 모델에서 페길화 rHuPH20 또는 대조 버퍼로 치료한 후 각종 시점에서 마우스의 생존율을 나타낸다. 생존율은 표시된 시간에 생존한 마우스의 수를 평가하여 결정하였다.
도 16은 실시예 18에 기재된 바와 같이 PC3 뇌종양 모델에서 대조 버퍼, 조사 또는 조사와 페길화 rHuPH20의 병용 치료로 치료한 후 각종 시점에서 마우스의 생존율을 나타낸다. 생존율은 표시된 시간에 생존한 마우스의 수를 평가하여 결정하였다.
도 17은 페길화 rHuPH20을 마우스에게 투여한 후의 PK 회귀 곡선을 나타낸다.
상세한 설명
개요
A. 정의
B. 히알루로난 관련 상태, 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 대한 고찰
1. 히알루로난
2. 히알루로난-관련 질환
3. 치료 방법 및 조성물
4. 그의 조합 및 치료 방법
C. 히알루로난 분해 효소를 함유하는 조성물
1. 히알루로니다제
a. 포유류-계 히알루로니다제
b. 박테리아 히알루로니다제
c. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
2. 기타 히알루로난 분해효소
3. 가용성 히알루로난 분해효소
a. 가용성 인간 PH20
b. rHuPH20
4. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
5. 변형된 (폴리머 접합된) 히알루로난 분해효소
a. 페길화 가용성 히알루로난 분해효소
D. 히알루로난 분해 효소를 코딩하는 핵산 및 이의 폴리펩티드를 제조하는 방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵세포
b. 효모 세포
c. 곤충세포
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제기술
4. 히알루로난 분해효소 폴리펩티드의 페길화
F. 조성물의 제조, 제형화 및 투여
1. 제형화
a. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
b. 동결건조 분말
c. 국소투여
d. 다른 투여경로를 위한 조성물
2. 투여량 및 투여
3. 병용요법
4. 포장 및 제조품
G. 활성, 생체이용율 및 약동학의 평가 방법
1. 히알루로난 분해 효소의 활성의 평가를 위한 검정
2. 약동학 및 관용성
3. 동물 모델
H. 히알루로난-관련 상태, 질환 및 장애의 치료에서 히알루로난 분해 효소의 사용
1. 히알루로난-관련 상태 및 질환
2. 히알루로난-관련 질환 및 상태의 치료에서의 사용
a. 히알루로난-관련 질환 마커의 검출 (치료를 위한 대상체의 선택 및 치료 효과의 평가)
i. 히알루로난-관련 질환 마커를 검출하기 위한 검정
ii. 대조 시료에 대해 상대적인 히알루로난-관련 마커의 검출
b. 암 치료에서의 사용
항암제 및 다른 치료
c. 상승된 간질액 압력과 관련된 다른 질환의 치료에서의 사용
3. 산포제로서의 사용
4. 피하주입에서의 사용
5. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에 대한 적용
6. 유전자 요법 적용
7. 미용적 적용
8. 장기 이식에서의 사용
9. 뇌 내의 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 사용
10. 심혈관 질환에서 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 사용
11. 폐 질환에서의 사용
12. 기타 사용
I. 실시예
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본원에 사용된모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 여기의 참조는 그 이용가능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본원에 사용된 바와 같이, 투약요법(dosing regime)은 투여되는, 작용제, 예컨대 가용성 히알루로니다제 또는 다른 작용제를 포함하는 조성물의 양, 및 투여 빈도를 지칭한다. 투약요법은 치료될 질환 또는 상태의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 빈도는 치료의 연속적 투여 사이의 시간을 지칭한다. 예를 들어, 빈도는 수일, 수주 또는 수개월 일 수 있다. 예를 들어, 빈도는 매주 1회 초과, 예컨대, 일주일 마다 2회, 일주일 마다 3회, 일주일 마다 4회, 일주일 마다 5회, 일주일 마다 6회 또는 매일 일 수 있다. 빈도는 또한 1, 2, 3, 또는 4 주일 수 있다. 특정 빈도는 치료할 특정 질환 또는 상태의 함수이다. 일반적으로, 빈도는 매주 1회 초과이며, 일반적으로 매주 2회이다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여 주기"는 연속적 투여에 대하여 반복되는, 상기 효소 및/또는 제2 작용제의 투여의 투약 요법의 반복된 일정을 지칭한다. 예를 들어, 투여 주기의 예는 3주일 동안 매주 2회 투여에 이어 1-주일의 중단된 투약을 갖는 28일 주기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 수 주일의 투여 또는 중단된 투여와 관련하여 "미리결정된"은 사전에 결정되거나 확립된 기간의 시간을 지칭한다. 상기 기간의 시간은 경험적으로 결정될 수 있거나, 질환 또는 상태, 상태의 중증도, 특정 환자 및 치료 의사의 기술 수준의 범위 내의 다른 요소들의 함수이다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해효소(hyaluronan degrading enzyme)는 히알루로난 폴리머(또한 히알루론산 또는 HA라 언급됨)을 더 작은 분자량의 절편으로 절단하는 것을 촉매하는 효소를 나타낸다. 히알루로난 분해효소의 예는 히알루로니다제, 및 히알루로난을 탈중합하는 능력을 가지는 특정 콘드로이티나제(chondroitinase) 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해효소인 예시적인 콘드로이티나제는 콘드로이틴 ABC 리아제(또한 콘드로이티나제 ABC로 공지), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나제로 공지) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 2개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함한다. 예시적인 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum) (프로테우스 불가리스 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있다; Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46). 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소는 서열번호 99에 기재된 프라보박테리움 헤파리넘 빅티발리스 바덴시스(Flavobacterium heparinum Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 아우레스켄스(Arthrobacter aurescens (Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 C 효소는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) (Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제는 히알루로난 분해 효소의 한 분류이다. 히알루로니다제는 박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리, 다른 기생동물, 및 갑각류 동물 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36), 및 포유류-형 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다제는 또한 쥣과(murine), 개, 고양이과, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아, 및 거머리, 다른 기생동물 및 갑각류 유래의 어느 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-인간 기원의 임의의 것을 포함한다. 비인간 히알루로니다제로서는 젖소 (서열번호 10, 11, 64 및 BH55(미국특허 제5,747,027호, 및 제5,827,721호), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17-19, 31), 돼지(서열번호 20-21), 랫트(서열번호 22-24,30), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 26,27,63 및 65), 침팬지(서열번호 101), 붉은털 원숭이(서열번호 102), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 32)로부터 히알루로니다제, 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp.) (균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73), 스타피로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소 RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Staphylococcus aureus)(서열번호 82); 균주 ACTT BAA255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93-95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri )(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96) 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는 스트렙토마이세스 히알루로니티쿠스 히알루로니다아제 효소 (Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함한다. 인간 히알루로니다제로서는 HYAL1(서열번호 36), HYAL2(서열번호 37), HYAL3(서열번호 38), HYAL4(서열번호 39) 및 PH20(서열번호 1)를 들 수 있다. 또한, 히알로니다제 중에서 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20 등의 가용성 히알로니다제를 들 수 있다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알로니다제로서는 비트라제®(Vitrase) 및 암파다제®(Amphadase)(소 히알로니다제)를 들 수 있다.
히알루로난 분해효소에 대한 언급은 전구체 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 및 성숙한 히알루로난 분해효소 폴리펩티드(예를 들면, 신호 서열이 제거된 것들), 활성을 가지는 이들의 절단된 형태를 포함하며, 서열번호 1 및 10-48, 63-65, 67-102 중 어느 하나에 기재된 전구체 폴리펩티드 또는 이의 성숙한 형태에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 코딩되는 변이체, 및 다른 변이체를 포함한다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소에 대한 언급은 서열번호 50-51에 기재된 인간 PH20 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로난 분해효소는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형은 페길화(pegylation), 알부민화(albumination), 글리코실화(glycosylation), 파르네실화(farnesylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 인산화(phosphorylation) 및 다른 당업계에 알려진 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 가용성 히알루로니다제란 생리학적 조건하에서 그 가용성을 특징으로 갖는 폴리펩티드를 말한다. 가용성 히알루로니다제는, 예를 들면 37℃까지 가온한 수성상의 트리톤(Triton) X-114 용액을 분별함으로써 분리할 수 있다 (Bordier 등 (1981) J.Biol. Chem.,256:1604-7). 막-부착, 예를 들면 지질-부착 히알루로니다제는 계면활성제-풍부 상으로 분리되지만 포스포리파제로 처리한 후의 계면활성제-부족 상 또는 수성상내로 분리된다. 가용성 히알로니다제 중에는 막에 히알로니다제를 고정한 하나 이상의 영역이 제거되거나 변형되고, 가용성 형태가 히알로니다제 활성을 갖는 막-부착 히알로니다제가 포함되어 있다. 가용성 히알로니다제는 재조합 가용성 히알로니다제 및 천연 자원,예를 들면, 양(sheep) 또는 젖소로부터의 고환 추출물에 함유되거나 천연자원으로부터 정제된 것을 들 수 있다. 이러한 가용성 히알로니다제로서는 가용성 인간 PH20을 들 수 있다. 다른 가용성 히알로니다제는 양(ovine)(서열번호 27, 63, 65) 및 소(서열번호 11, 64) PH20을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20는 발현시 상기 폴리펩티드는 가용성이도록 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부를 결여한 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 sHuPH20 폴리펩티드는 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 가지는 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 상기 예시적 sHuPH20 폴리펩티드를 위한 전구체 폴리펩티드는 아미노산 신호 서열을 포함한다. 전구체의 예는 서열번호 3 및 40-46에 기재되어 있으며, 이는 1-35번 아미노산 위치에 35개 아미노산 신호 서열을 포함한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 본원에 기재된 제조 및 정제 방법 동안 또는 이후에 분해될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary(CHO)) 세포에서 재조합적으로 발현된 인간 PH20의 가용성 형태를 나타낸다. 가용성 rHuPH20는 서열번호 49에 기재된 신호 서열을 포함한 핵산에 의해 코딩된다. 또한 이의 대립형질 변이체 및 다른 가용성 변이체인 DNA 분자가 포함된다. 가용성 rHuPH20를 코딩하는 핵산은 성숙한 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포 내에서 발현된다. 배양 배지에서 생산되는 것과 같이, C-말단에 불균일(heterogeneity)이 있기 때문에 산물은 서열번호 4-9 중 어느 하나를 풍부하게 포함할 수 있는 종들의 혼합물을 포함한다. 상응하는 대립형질 변이체 및 다른 변이체가 또한 포함되고, 서열번호 50-51에 기재된 인간 PH20 폴리펩티드 전구체에 상응하는 것을 포함한다. 다른 변이체는 이들이 히알루로니다아제 활성을 유지하고, 가용성인 한 서열번호 4-9 및 47-48 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 기질이란 히알루로니다제 효소에 의해 절단되고 및/또는 탈중합되는 기질 (예를 들면, 단백질 또는 다당류)을 말한다. 일반적으로, 히알루로니다제 기질은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이다. 예시의 히알루로니다제 기질은 히알루로난 (HA)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로난 수준이 질환 또는 상태의 원인, 결과 또는 달리 관찰된 바와 같이 상승된 임의의 질환 또는 상태를 나타낸다. 히알루로난 관련 질환 또는 상태는 조직 또는 세포내에서 히알루로난 발현 증가, 간질액 압력 증가, 혈관 부피 증가 및/또는 조직내의 수분 함량 증가를 수반한다. 히알루로난 관련 질환, 장애 또는 상태는 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 작용제와 함께 병용하여 또는 그에 추가로 투여하여 치료될 수 있다. 질환 및 상태로서는 히알루로난 풍부 암, 예를 들면, 말기암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 상피내암(ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 대장암 및 다른 암 등의 고형 종양을 포함하는 종양을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 히알루로난 관련 질환 및 상태로서는 간질액 압력 증가와 연관된 질환, 예를 들면, 디스크 압박과 연관된 질환 및 부종, 예를 들면 장기 이식, 뇌졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 기인한 부종이다. 히알루로난 관련 질환 및 상태으로서는 간질액 압력 증가, 혈관 부피 감소 및/또는 암, 디스크 압박 및 부종을 포함한 조직내의 수분함량 증가를 포함한다. 일례에서, 히알루로난 관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 간질액 압력(IFP) 증가, 혈관부피 감소 및 조직내의 수분함량 증가 중 하나 이상에 대한 개선, 감소 또는 다른 유익한 효과를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 증가된 히알루로난 수준은 질환에서 결과적으로 또는 달리 관찰된, 질환 또는 상태에 종속하는 특별한 조직, 체액 또는 세포내에 히알루로난의 양을 말한다. 예를 들면, 히알루로난 풍부 종양의 존재의 결과로서, 히알루로난(HA) 수준은 체액, 예를 들면, 혈액, 오줌, 타액 및 혈청, 및/또는 종양성 조직 또는 세포내에서 증가될 수 있다. 상기 수준은 표준시료, 또는 다른 적당한 대조군, 예를 들면 HA 관련 질환을 갖지 않는 대상체로부터의 비교시료와 비교될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소에 접합된 폴리머란 히알루로난 분해효소에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유결합되거나 달리 안정하게 결합된 임의의 폴리머를 말한다. 이러한 폴리머는 일반적으로 혈청 반감기를 증가시키고, 시알산 잔기, 페길화 잔기, 덱스트란 및 당 및 다른 잔기들, 예를 들면 글리코실화를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 히알루로난 분해효소, 예를 들면, 천연 가용성 히알루로니다제는 폴리머, 예를 들면 페길화 잔기(PEG) 또는 시알화 잔기에 의해 변형되어 있지 않은 히알루로난 분해효소이다. 따라서, 천연 히알루로난 분해효소는 변형되지 있지 않다. 일반적으로, 천연 히알루로난 분해효소, 예를 들면 천연 가용성 히알루로니다제는 폴리머, 예를 들면 PEG와의 접합에 의해 변형된 히알루로난 분해효소에 비해 생물학적 환경(예를 들면, 대상체)내의 반감기가 감소한다.
본원에 사용된 바와 같이, 비활성도란 단백질 1 mg 당 활성의 유닛을 말한다. 히알루로니다제 mg은 280 nm에서 용액의 흡수로 정의되고, 몰흡광계수가 약 1.7 유닛M-1cm-1인 것을 가정한다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성이란 전장(완전한) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 그 부분의 기능성 활성 활성을 말한다. 기능성 활성은 생물학적 활성, 촉매 또는 효소 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하거나 폴리펩티드와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력 및 폴리펩티드의 수용체 또는 리간드에 특이하게 결합하는 능력을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제 활성이란 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 능력을 말한다. 히알루로니다제에 대한 미국약전(The United State Pharmacopeia; USA) XXII 분석법은 효소를 HA와 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 더 높은 분자량의 히알루론산 또는 잔류하는 히알루로난(HA) 기질의 양을 측정함으로써 간접적으로 히알루로니다제 활성을 결정한다 (USP XXII-NF XVII(1990), 644-645, United Strate Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 참조 표준용액은 임의의 히알루로니다제의 유닛내에 상대적인 활성을 설명하기 위한 평가에 사용될 수 있다. 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 분석하기 위한 시험관내 분석은 공지되어 본원에 기재되어 있다. 예시의 분석으로는 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때에 형성된 불용성 침전물을 검출함으로써 히알루로니다제에 의한 히알루론산의 절단을 간접적으로 측정한 하기 기재된 미세탁도 분석을 들 수 있다 (예를 들면, 실시예 3 참조). 예를 들면 히알루로니다제의 유닛을 시험할 때에 활성을 결정하기 위한 표준곡선을 만들기 위해 참조표준을 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다제의 활성 유닛이란 예를 들면, 실시예2에 기재된 탁도가 감소된 ELISA계 분석를 사용하고 표준 히알루로니다제 시료(예를 들면, USP 또는 WHO 표준)와 비교하여 결정된, 미국약전 (NF XIII) 유닛(NFU)를 말하며, 이에 의하여 탁도가 감소된 유닛은 미국약전에 의해 표준화된 히알루로니다제 (예를 들면, USP 또는 WHO 표준)의 시료의 표준 곡선을 통한 NFU 및 USP 유닛에 관련되어 있다. 따라서, 실시예 2에서 결정된 효소 활성은 상대적인 TRU 이다(예를 들면, Dorfman 등, 1948, J.Ciol. Chem. 172:367 참조). 히알루로니다제 유닛은 표준 활성으로 정규화된다. 따라서, 예를 들면 페길화 히알루로니다제는 1 mg 당 더 낮은 활성을 나타낼 수 있다. 이와 같은 목적에 대해서, 투여량은 유닛을 언급한다. 특별한 변형된 히알루로니다제의 유닛 유닛/mg (표준 활성)은 필요에 따라서 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해효소에 대해 "기능적으로 동등한 양" 또는 그 문법적인 변형은 참조 효소의 양과 동일한 효과를 달성한 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제의 양을 말한다. 예를 들면, 임의의 히알루로난 분해효소의 활성은 rHuPH20의 활성과 비교하여 공지의 rHuPH20의 양과 동일한 효과를 달성하는 히알루로난 분해효소의 기능적으로 동등한 양을 결정한다. 예를 들면, 산포제 또는 확산제로서 기능하는 히알루로난 분해효소의 능력은 트리판 블루(예를 들면 미국특허 공개 제 20050260186호 참조)를 갖는 마우스의 측면에 효소를 주입함으로써 분석할 수 있고 예를 들면 100 유닛의 히알루로니다제 참조 표준과 동일한 확산량을 달성하는데 필요한 히알루로난 분해효소의 양을 결정할 수 있다. 필요로 되는 히알루로난 분해효소의 양은 100 유닛과 기능적으로 동등하다. 다른 예에서, 공동 투여제의 체내활성 (예를 들면, 화학치료제의 항종양 활성)을 증가시키는 히알루로난 분해효소의 능력은 동물 모델 또는 인간 대상체, 예를 들면 실시예 14에 기재된 것에서 평가될 수 있고 예를 들면 rHuPH20의 투여량과 공동 투여제의 활성에서의 동일한 증가를 필요로 하는 히알루로난 분해효소의 양을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연적으로 발생하는 α-아미노산 잔기들은 인간에서 동질(cognate) mRNA 코돈으로 충전된 tRNA 분자의 특이적 인식에 의해 단백질 내에 삽입되는, 자연계에서 발견되는 20 α-아미노산들 잔기들이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 이들의 유사체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성 동위원소와 같은 검출가능한 표지로 선택적으로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 전형적으로 그들의 표적이 통계적으로 고유한 길이이거나, 라이브러리 탐지 또는 프라이밍을 위하여 낮은 카피수 (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이도록 하는 길이를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 14, 16 또는 30 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 2 내지 40 아미노산 길이인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 절편 내 존재하는 뉴클레오티드들은 당 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에서 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성체 형태로 간주된다. "D" 이성체 형태 내 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol. Chem., 243:3557-3559(1968)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
[표 1] 대응 표
Figure pat00001
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가지는 것을 유의해야 한다. 또한, "아미노산 잔기"라는 어구는 대응 표(표 1)에 기재된 아미노산 및 변형된 아미노산 및 희귀 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 넓게 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타내는 것임을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드 내에 존재하는 20개의 L-아미노산을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지나 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 흉내내도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 예를 들면 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산의 예는 본원에 기재되고, 당업계의 당업자에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절(segment)은 특이한 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 절편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 자연 출처로부터 분리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 본원에서 주어진다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자를 위해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 전체 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이들의 말단이 엇갈려 있을 수 있고, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 것이다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당해 기술분야에 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 상동성을 나타내는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열, 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열에 대한 배열(alignment)시 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보전적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보전적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함하는, 비교되는 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 지역 또는 지역들 만을 포함하는 서열의 부분의 배열)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체로 기술로-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예컨대: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 동일성, 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분률이 특정될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 지시된바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분률 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 최고 수준 매칭이 얻어지도록 서열을 배열한다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 동일성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램에 의하여 결정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalties)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이 전부를 따라 전형적으로 보통의 엄격성(stringency)으로, 또는 높은 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 축퇴성 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, Pearson 등(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 파라미터들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분률 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman (1970) J. Mol. Biol. 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv. Appl. Math. 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0 의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 참조 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분률의 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 시험 및 참조 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 배열된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 배열하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2 이상의 서열을 의미하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열하는 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예컨대, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 평가될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들면, PCR에 의해)증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드)가 표적 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의한 어닐링하는 것을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관내 및 생체내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 시험관내 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄격성(stringency)에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 보통 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위하여 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 상보적인은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분률은 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 이들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, "산물에 실질적으로 동일한"은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체"는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 지시하기 위하여 본원에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 코딩한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 좌우된다. 일반적으로, 이종간 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가진다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립형질"은 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립형질은 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상이 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 대상이 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 가지는 경우 그 대상은 그 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 상이한 종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA 형태를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생성되는 변이체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형은, 아미노산 서열의 변형과 관련하여 사용시, 폴리펩티드, 또는 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 변형을 묘사하기 위하여 사용되며, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자에게 통상적인 일이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-코딩 지역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다.
용어 세포 물질로부터 실질적으로 유리된은 상기 단백질이 그것이 분리되거나 재조합적으로 제조되는 세포의 세포 성분들로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 세포 물질로부터 실질적으로 유리된은 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질로서 언급됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 제조시, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리된 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 다른 화학물질의 실질적 부재는 단백질이 그 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30%(건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종기원 (heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위한 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)이 실행되도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 절편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 지역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 부분은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택마커, 인핸서, 폴리아데닐레이션 서열 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외래 유전자를 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절을 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 분절이 그들의 의도된 목적, 예컨대, 전사가 프로모터에서 개시되어 코딩 분절을 거쳐 터미네이터까지 진행되는 목적으로 일제히 기능하도록 배열된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 평가(assessing)는 시료 내 존재하는 프로테아제 또는 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 예를 들면 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루를 이용한 단백질 염색에 의한 보완 단백질의 절단 산물의 검출.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체내 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 초래되는 생리학적 반응을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물의 치료적 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적을 위하여, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드를 가수분해하는 그의 촉매 활성이다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 "동등한"은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 코딩하는 것을 의미한다. "동등한"이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 변형만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. "동등한"이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예컨대, 2개의 펩티드가 동일한 종류의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 의미한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성의 감소(즉, 하향조절 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 파라미터의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 종류 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합은 2개 이상의 항목 간의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 항목, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2개 이상의 항목의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 임의적으로는 다른 요소, 예컨대, 부가적 작용제, 및 그의 조합 또는 요소의 사용지침서를 포함하는 포장된 조합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 개체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 관심 있는 질환 및 장애는 히알루로난-관련 질환 및 장애이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상을 "치료하는 것"은 대상의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다. 치료는 또한 본원에서 제공되는 변형된 히알루로니다제 및 조성물의 임의의 약학적 이용을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 임의의 치료적 제제 또는 생물활성 제제, 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상에 투여 후 치료 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 포유동물, 예컨대 사람을 포함한 동물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 기인하거나 관련할 수 있는 징후의 영구적 또는 일시적인, 지속적 또는 일시적인, 임의의 경감을 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, "치료적 유효량"은 치료 효과를 생성하기에 최소한 충분한 양으로 화합물을 포함하는 작용제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양을 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, 단위 복용 형태는 인간 및 동물 대상에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, 단일 복용 제형은 직접 투여를 위한 제형을 의미한다.
본원에 사용된바와 같이,"제조품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장된 물품 내 포함된 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다제, 및 제2 작용제 조성물을 포괄하는 의도이다.
본원에 사용된바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트"는 본원에서 제공되는 조성물과, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하나 이에 국한되지 않는 목적의 다른 물품의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에 사용된바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려된 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 효소는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵 및 진균 유래이다. 대부분 효소들은 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다.
본원에 사용된바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 의미하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태로 감염되지 않은 정상적 지원자 유래일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에 사용된바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 의미한다.
본원에 사용된바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환이거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항암 치료는 암을 치료하기 위한 약물 및 다른 작용제의 투여 및 치료 프로토콜, 예를 들면 방사선을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 항체란 치료에 사용하는 임의의 항체를 말하고, 단일클론 항체, 인간 항체, scFv, 디아바디(diabody), Fab 및 항체의 다른 단편을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 단편이란 전장의 항체의 특이적 결합력의 적어도 일부를 유지하는 전장 보다 짧은 항체의 임의의 유도체를 말한다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', F(ab)2, 단일쇄 Fvs(scFv), Fv, dsFv, 디아바디 및 Fd 단편을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 단편은 적어도 이황화 가교와 같은 함께 결합된 다중쇄를 들 수 있다. 일반적으로 항체 단편은 약 50 아미노산 및 일반적으로 적어도 200 아미노산을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이 Fv 항체 단편은 비공유 상호작용에 의해 결합된 하나의 중쇄 가변 영역(VH) 및 하나의 경쇄 가변 영역(VL)으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, dsFv란 VH-VL 쌍을 안정화시키는 조작된 분자간 이황화 결합을 갖는 Fv를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, F(ab)2 단편은 pH 4.0-4.5에서 면역글로불린을 펩신으로 소화하는 데에 기인하는 항체단편이고 재조합으로 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, Fab 단편은 면역글로불린을 파파인으로 소화하는데에 기인하는 항체 단편이고 재조합으로 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, scFvs는 경쇄 가변사슬(VL) 및 중쇄 가변 사슬(VH)을 임의의 순서로 폴리펩티드 링커로 공유결합에 의해 결합된 항체 단편을 말한다. 상기 링커는 2개의 가변 영역이 실질적인 간섭없이 가교되도록 하는 길이의 것이다. 링커로는 일부 Glu 또는 Lys 잔기를 완전히 분산시켜 가용성을 증가시킨 (Gly-Ser)n 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, hsFv란 Fab 단편내에 정상적으로 존재하는 불변영역이 헤테로 이중 코일 영역 (예를 들면, Arndt 등 (2001), J Mol Biol.7:312:221-228)으로 치환된 항체 단편을 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 디아바디는 이량체 scFv이고 이량체는 일반적으로 scFvs 보다 더 짧은 펩티드 링커를 갖고 바람직하게 이량체화 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 인간화 항체란 인간에게 투여하여 면역반응을 일으키지 않게 아미노산의 "인간"서열을 포함도록 변형된 항체를 말한다. 이러한 항체의 제조방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도머는 재조합 DNA 기술에 의해 변경되어 불변영역의 아미노산 조성이 인간항체를 기초로 하는 항체를 발현한다. 컴퓨터 프로그램을 설계하여 이러한 영역을 동정하고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 공지된 약어 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법을 사용한다((1972), Biochem. 11:1726 참조).
B. 히알루로난 관련 상태, 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 대한 고찰
히알루로난 관련 상태, 질환, 및 장애를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 조합물이 제공된다. 본원에 제공된 방법, 조성물, 및 조합물은 세포외 기질의 필수 성분 및 간질성 장벽의 주요한 구성요소인, 히알루론산(히알루로난으로 불림)을 분해할 수 있는 히알루로난 분해효소를 사용한다. 많은 질환 및 상태는 히알루로난과 같은 히알루로니다제 기질의 축적된 발현 또는 과발현을 수반하고, 이는 질환 또는 상태의 진행 및/또는 심각성에 기여한다. 따라서, 기질을 탈중합할 목적으로 이러한 효소를 투여하여 이러한 질환 및 상태를 치료할 수 있다.
상기 효소가 효소활성을 나타내는 것이면 임의의 변이체(예를 들면 말단절단 변이체)를 포함하는 히알루로난 분해효소를 사용할 수 있다. 일반적으로, 히알루로난 분해효소는 폴리머(예를 들면, PEG)와의 접합에 의해 변형되어 효소의 반감기를 증가시킨다. 증가된 반감기는 전신 히알루로니다제 활성 및 히알루로난 분해 작용의 지속기간을 증가시킬 수 있다. 또한, 증가된 반감기는 질환 또는 상태를 수반하는 히알루로니다제 기질의 재합성 및 재발생의 방지에 기여할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리머와의 접합에 의해 반감기가 증가된 변형된 히알루로난 분해효소는 종양내에서 히알루로난의 재발생을 방지할 수 있다. 본원에서 제공된 변형된 히알루로난 분해효소는 히알루로난 관련 상태, 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 제 2 작용제와 공동 투여하고 및/또는 공동 제형화될 수 있다.
1.히알루로난
글리코사미노글리칸(GAG)은 세포외 기질(ECM)의 복잡한 선형 다당류이다. GAG는 N-치환 헥소사민 및 우론산(예를 들면, 히알루로난(HA), 콘드로이틴 술페이트(CS), 콘트로이틴(C), 데르마탄 술페이트(DS), 헤파란 술페이트(HS), 헤파린(H)), 또는 갈락토오스 (예를 들면, 케라탄 술페이트(KS)))의 반복적인 이당류 구조를 특징으로 한다. HA를 제외한 모든 것은 코어 단백질에 공유결합하여 존재한다. 코어 단백질을 갖는 GAG은 구조적으로 프로테오글리칸 (PG)라고 한다.
HA 는 선형인, N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산 이당류 단위체로 만들어진 반복형 다당류이다. HA 의 대사는 동적인 프로세스로, 피부에서 조직 내 정상적인 턴오버 (turnover) 는 수주 내지 1 일 미만의 범위이다. 3 가지 보존성 HA 합성효소 (HAS) 에 의해 원형질막에서 합성되며, 수용체-매개성 엔도싸이토시스 (endocytosis) 에 후속하여 세포-회합성 또는 산성-활성 히알루로니다제에 의해 (Culty 1992; Zhou 2000), 그리고 엑소글리코시다아제 효소에 의해 분해된다.
HA 는 수많은 세포들, 특히 연질 연결 조직에서 세포외 매트릭스에서 나타난다. 히알루로난 (HA) 은 포유류에서 주로 연결 조직, 피부, 연골 및 윤활액에서 나타난다. 히알루로난은 또한 눈의 유리체의 주된 구성성분이다. HA 는 각종 생리학적 기능, 예컨대 세포내 매트릭스에서의 물 및 혈청 단백질 항상성 유지를 담당한다 (Laurent TC 등 (1992) FASEB J 6: 2397-2404). 연결 조직에서, 히알루로난이 연합되어 있는 수화작용에서의 물은 조직들 사이에 공간을 만들어 내며, 따라서 세포 이동 및 증식에 알맞은 환경을 조성한다. 신체에서, 예를 들어 대상체의 조직에서, 히알루로난 (히알루론산) 은 약 5 h 의 반감기로 교체되며, 조직을 통틀어 유체 유동에 대한 저항을 광범위하게 담당하고 있다. 히알루로난은, 신속한 발생, 재생, 리페어 (repair), 태아생성, 태아기의 발생, 상처 치유, 혈관형성 및 종양발생을 포함하는, 세포 자동력과 연관된 생물학적 현상들에서 역할을 담당한다 (참고문헌은, 예를 들어, Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed), Plenum Press, New York, 1384-1386; Bertrand 등. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6; Knudson 등, 1993 FASEB J. 7:1233-1241). HA 생산은 증식 중인 세포에서 증가하며, 체세포분열에서도 역할을 담당할 수 있다. 이는 또한 운동 능력 및 세포 이동 뿐만 아니라, 세포 조절, 발생 및 분화에서의 역할에도 연루되어 있다 (Laurent 등. (1992) FASEB J 6: 2397-2404).
HA 는 임상 의약에도 이용된다. 그의 조직 보호적 및 유변학적 특성은, 백내장 수술 동안 각막 내피를 보호를 위한 안과 수술에서 유용한 것으로 밝혀졌다. 혈청 HA 는 간 질환 및 각종 염증 상태, 예컨대 류마티스성 관절염의 진단 지표이다. HA 의 축적으로 인한 간질 부종은 각종 장기에서 기능부전을 초래할 수 있다 (Laurent 등 (1992) FASEB J 6: 2397-2404). 히알루로난 단백질 상호작용은 또한 세포외 매트릭스 또는 "기저 물질" 의 구조체에도 수반된다.
HA 합성은 발암 바이러스가 섬유모세포를 형질전환할 때 증가하며, HA 의 상승된 수준은 각종 암, 예컨대 흑색종 및 기타 암종에서의 과다증식성 및 악성 표현형과 연계되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Itano 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99;3609-3614.). 추가로, 히알루로난 수준은 종양 공격성과 상관성이 있다 (Ozello 등. 1960 Cancer Res. 20:600-604; Takeuchi 등. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139; Kimata 등. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354). HA 대사의 국지적 이상은 수많은 고형 악성 종양에서 보고된 바 있으며, 여기서 상승된 수준의 HA 는 종종 유방, 위장관, 대장, 난소, 전립선 및 폐 암종과 같은 종양에서의 안좋은 예후와 상관성이 있다. HA 축적은 종양 세포들간의 접촉 저해를 감소시킨다 ((참고문헌은, 예를 들어, Itano 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99;3609-3614.).
2. 히알루로난-연관성 질환들
수많은 질환 및 상태들이 히알루로니다제 기질, 예를 들어 HA 의 과발현 또는 축적된 발현과 연관되어 있는데, 이는 질환 또는 상태의 심각성 또는 예후를 악화시키거나 또는 악화에 기여한다. HA 축적의 숨어있는 원인은 하나 이상의 HA 합성효소의 과발현, 열악한 림프계의 배설, 또는 해당 기질의 합성 및 분해의 불균형에 기인하는 것으로 보인다.
따라서, 본원에서 제공하는 조성물, 화합물 및 방법으로 치료될 수 있는 히알루로난-연관성 질환, 상태, 장애들 중에는, 특히 질환, 상태 또는 장애의 원인으로서 그 결과로서 또는 병후로서 히알루로난을 발현하거나 또는 축적하는 상태, 질환 및 장애가 있다. 상기 질환, 상태 및/또는 장애에는, 예를 들어, 증가된 간질액압, 감소된 혈관 부피, 조직 내 증가된 수분 함량, 디스크 압박 (disc pressure) 및 부종이 포함된다. 히알루로난-연관성 질환, 상태 및/또는 장애에는, 이에 제한되지 않으나, 히알루로난-풍부 암, 예를 들어, 고형 종양을 포함하는 종양, 예를 들어, 말기 암, 전이성 암, 비분화성 암, 난소암, 제자리에서의 암종 (in situ carcinoma) (ISC), 편평 세포 암종 (SCC), 전립선암, 췌장암, 비-소형 세포 폐암, 유방암, 대장암 및 기타 암이 포함된다. 또한, 히알루로난-연관성 질환 및 장애의 예시는 디스크 압박, 암 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 허혈, 뇌외상 또는 기타 손상으로 인한 부종이다.
예를 들어, 히알루로난-연관성 질환 또는 상태에는, 양성 및 악성 종양을 포함하는 고형 종양이 포함된다. 악성 고형 종양의 예시에는, 예를 들어 유방, 위장관, 대장, 난소, 전립선 및 폐 암종과 연관된 것이 포함된다. 종양, 특히 악성 종양에서의 HA 수준의 비정상적 축적은, 간질 또는 세포 구획과 연합시 나쁜 예후의 표식이다.
예를 들어, Auvinen 에 의한, 유방 암종을 가진 환자의 생존 연구 (2000) 에서, 5 년간의 생존은, 증가하는 간질 HA 수준에 따라 악화되었으며; 저수준, 중수준 및 고수준의 HA 수준에 대해 각각, 5-년 전체 생존은 45%, 39% 및 26% (p=0.002) 였으며, 재발이 없는 환자는 66%, 56% 및 40% (p=0.008) 였다. HA-양성 암종 세포의 존재성은 보조적인 림프절 양성 및 열악한 분화와 유의하게 상관관계가 있었다. HA-양성 암종 세포를 나타내는 환자들의 5-년 전체 생존은 HA-양성 암종 세포가 없는 환자에 비해 현저하게 더 낮았다 (각각 54% 대 81%, p=0.01).
위 암종에서, Setala 등 (1999) 는 215 명의 I 내지 IV 기 위 암종 환자에서 HA 프로파일을 검사했다. 높은 비율의 HA 양성 세포들이 발견되었으며, 깊은 종양 침습, 림프절 전이, 양성 림프구 침습, 열악한 분화 수준 및 일변량 생존 분석에서의 그의 열악한 예후와 유의하게 상관있었다. 평가한 종양들의 44% 는 HA 표지 지수가 30 내지 100% HA 양성 세포였다.
대장 암종에서, Ropponen 등 (1998) 은, 평균 14 년 동안 계속하여 202 명의 대장 암종 시료에서 전체 생존 및 재발이 없는 생존에 대한 HA 의 세포 연관성을 시험했다. 187 명의 평가가능한 환자에 대해, 높은 HA 강도 및 표지 지수의 두가지 모두, 더 적은 전체 생존, 더 짧은 재발없는 생존, 및 Duke 분류에서의 상승이 빈번하게 발견되었고, 유의하게 상관있었다.
Anttila 등 (2000) 은 309 명의 상피 난소암 및 45 명의, 맷칭되는 전이성 병소에서의 HA 수준을 연구했다. 73% (309 명 중 227 명) 의 경우에서, 히알루로난-양성 암 세포의 분획은 <10% 였고, 높은 간질 HA 수준은 열악한 분화, 심각한 세포학적 유형, 단계 진행, 및 커다란 본래 잔류 종양과 유의하게 상관성이 있었다.
히알루로난-연관성 질환은 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제, 예를 들어, 가용성 히알루로니다제를, 단독으로 또는 또다른 치료 및/또는 작용제와 병용 또는 추가하여 투여함으로써 치료될 수 있다. 히알루로난-연관성 상태, 질환 또는 장애의 치료는, 하나 이상의 임의의 연관된 신체적 징후 또는 병후, 예컨대 증가된 간질액압 (IFP), 감소된 혈관 부피 및/또는 조직 내 증가된 물 함량의 개선, 감소 또는 기타 이득이 되는 유효성 제공을 포함한다.
한 예시에서, 히알루로난-연관성 상태, 질환 또는 장애의 치료에는, 증가된 간질액압 (IFP), 감소된 혈관 부피 및 조직 내 증가된 물 함량 중 한가지 이상에 대한 개선, 감소 또는 기타 이득이 되는 유효성 제공이 포함된다. 또다른 예시에서, 치료는 대상체의 생존 및/또는 재발없는 생존을 포함하는, 또다른 병후, 예를 들어, 종양 크기 (예를 들어, 질량/부피), 예후에 대한 개선 또는 이득이 되는 유효성 제공을 포함할 수 있다.
3. 치료 방법 및 조성물
따라서, 본원에서는 히알루로난 (HA)-연관성 상태, 질환 및 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법, 예컨대 치료 방법은, 변형된 히알루로난 분해 효소를 단독으로 포함하는 조성물 또는 변형된 히알루로난 분해 효소 및 추가로 히알루로난 연관성 상태, 질환 및/또는 장애 치료를 위한 하나 이상의 추가적인 작용제를 함유하는 조성물 또는 조합물을 이용한다. 상기 방법에 채용되는 조성물 및 조합물에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 예컨대 하나 이상의 폴리머(들)에 접합(콘쥬게이션)시킴으로써 변형하여, 히알루로니다제, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 반감기를 증가시킨다. 본원에서 제공하는 변형된 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 연관성 상태, 질환 및 장애 치료를 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 치료제 (예를 들어, 화학치료제) 와 같은 기타 작용제와 병용하여 사용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소 및 기타 작용제(들)을 함유하는 조성물은 조합하여 따로따로 제공될 수 있거나, 또는 단독 조성물로 제공될 수 있다.
일부 예시에서, 변형된 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 연관성 질환 또는 상태의 치료를 위해 단독으로 투여된다. 따라서, 본원에서는 또한 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물, 및 히알루로난 연관성 질환, 예를 들어 히알루로니다제 기질의 축적된 발현과 연관되어 있는 질환의 치료를 위한, 변형된 히알루로난 분해 효소를 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 치료는 히알루로난-연관성 질환, 예를 들어 히알루로난-풍부 암에서 감소되어 있는 간질액압에 작용하기 위해 이용될 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제를 이용하는 치료는, 히알루로난을 제거하고 간질액압 (IFP) 을 낮출 뿐 아니란, 접촉 저해를 회복시킨다. 따라서, 히알루로난 분해 효소의 투여는 세포들 간의 접촉 회복 덕분에 치료를 유효하게 할 수 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 히알루로난 분해 효소의, 예컨대 PEG 화에 의한 변형은 종양 치료책으로서의 히알루로난 분해 효소의 유효성을 개선시킨다.
특히, 변형된 히알루로난 분해 효소의 전신적 투여는, 뇌종양을 포함하는 종양 치료에 유효하다. 예를 들어, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제의 전신적 투여는, 히알루로난-풍부 종양에서의 간질액압 (IFP) 을 낮춰, IFP 에서의 투여량-의존적인 지속적인 감소, 예를 들어 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 10 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간을 초과하여 지속하는 감소를 유효하게 한다. 히알루로니다제는 히알루로난-특이적 방식으로 그러한 감소를 유효하게 할 수 있다.
추가로, 히알루로난-연관성 종양이 있는 대상체에서의 투여 후 히알루로난 발현을 감소시키는 능력과 일치하여, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제의 전신적 투여는, 종양 내 혈관의 혈관 감압의 결과로 종양 물 함량의, 예를 들어, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 10 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 이상 동안의, 지속적인 감소, 및 히알루로난-연관성 종양에서의 혈관 부피의 감소를 유효하게 할 수 있다. 따라서, 본원에서는, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물, 및 히알루로난-연관성 질환 또는 상태, 예를 들어, 히알루로난-연관성 암이 있는 대상체에서의 혈관 부피의 지속적 증가 및/또는 조직 내 물 함량의 지속적 증가에 유효한 투여 방법이 추가로 제공된다.
비변형 히알루로난-분해 효소는 일반적으로, 혈액 내에서, 수 분, 일반적으로 5 분 미만의 짧은 효소 활성 반감기를 갖는다. 이는, 상기 효소가 일반적으로 정맥내 투여 및 그의 작용 기간이 짧게 끝나는 다른 투여용으로는 적합하지 않음을 의미한다. 본원에서의 조성물 및 방법에 사용되는, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제는, 폴리머, 예를 들어, 시알화 잔기(sialation moiety) 또는 PEG 화 잔기 (PEG) 에 대한 접합에 의해 변형된다. 일반적으로, 상기 폴리머는 대상체에 대한 투여 후 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 반감기를 늘린다. 본원에 제공되는 (예를 들어, 폴리머에 대한 접합을 통해) 변형된 히알루로난-분해 효소의 효소 활성의 혈장 반감기는 일반적으로 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 13 시간, 14 시간, 15 시간, 20 시간, 25 시간, 30 시간, 35 시간, 40 시간, 45 시간, 50 시간, 55 시간, 60 시간 또는 그 이상이다. 한 예시에서, 폴리머에 대한 접합에 의해 변형된 가용성 히알루로니다제는, 비변형 효소에 비해 혈장 반감기에 있어서 100-, 200-, 250-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900-, 1000-, 1500, 2000-배 또는 그 이상 증가를 유효하게 한다. 한 예시에서, 혈장 중 효소의 반감기는 24 시간을 초과한다.
반감기의 상이성으로 인해, 변형된 히알루로니다제의 활성 기간은 본래 (폴리머에 대한 접합에 의한 변형이 없음) 히알루로니다제에 비해 증가된다. 예를 들어, 본래 (비변형) 가용성 히알루로니다제의 투여 후, 예를 들어, 히알루론산은 24 시간 내에 회복될 수 있고, 관찰가능한 변화를 남기지 않는다. 히알루로난 분해 효소의 반감기를 증가시키는 폴리머 (예를 들어, PEG) 에 대한 접합에 의해 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제에서는, 투여 후 히알루로난의 발현이 24 시간, 48 시간, 72 시간 또는 그 이상 감소된 채 있다.
일반적으로, 폴리머에 접합된 변형된 히알루로난-분해 효소는 비변형 히알루로난-분해 효소에 비해 감소된 비활성을 갖는다. 비활성은 일반적으로 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 그 이상 감소된다. 예를 들어, 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같이, rHuPH20 로 정해진 비변형 PH20 의 비활성은 약 120,000 U/mg 이다. PEG 화 rHuPH20 의 비활성은 약 30,000 U/mg 이다. 그럼에도 불구하고, 증가된 반감기로 인해, 변형된 히알루로난-분해 효소는 증가된 활성 기간을 나타낸다. HA 는 재생될 수 있기 때문에, 지속성 작용 기간을 가진 효소는, ECM 에서의 HA 재합성 및 침적에 대응할 수 있다.
따라서, 본원에서 제공하는 방법, 조합물 및 조성물에서, 변형된 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 가용성 히알루로니다제는, 최소 혈장 수준을 3 U/mL 이상으로 유지하기에 충분한 양으로 제공된다. 예를 들어, HA 의 최소 혈장 수준은 약 3 U/mL 내지 12 U/mL 또는 그 이상의 수준, 예를 들어, 약 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 11 U/mL, 12 U/mL, 13 U/mL, 14 U/mL, 15 U/mL, 16 U/mL, 17 U/mL, 18 U/mL, 19 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 45 U/mL, 50 U/mL 또는 그 이상의 수준으로 유지된다. 혈장 내 효소를 3 U/mL 이상 유지함으로써, 효소는 질환 또는 상태와 연관된 HA, 예를 들어 종양성 HA 를 제거할 수 있고, 또한 HA 재합성에 대응할 수 있다. 따라서, 상기 치료에서, 히알루로니다제 기질은 축적되지 않는다. 질환 또는 상태, 예컨대 악성 고형 종양이 있고, 그의 예후가 HA 발현과 연관되어 있는 암에 대해서, 그 상태 (예를 들어, 암 상태) 는 치료 및/또는 완화될 수 있다.
따라서, 제공되는, 폴리머에 접합된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물은, 축적된 히알루로니다제 기질과 연관된 질환 또는 상태의 연장 또는 지속적 치료, 예를 들어, 하나 이상의 병후의 연장 또는 지속적 완화를 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리머를 이용한 접합에 의해 변형된, 변형된 가용성 히알루로니다제의 전신적 (예를 들어, 정맥내) 투여는, 히알루로난-풍부 종양 조직에서의 세포 매트릭스마다의 히알루로난 발현에서 지속적인 (예를 들어, 24, 48 및 72 시간 이상) 감소를 유효하게 할 수 있다.
더 긴 시간 동안 혈장 내 변형된 효소의 유효성을 지속시키기 위해서는, 투여 주기를 유효화할 수 있다. 따라서, 변형된 효소는, 임의의 원하는 길이의 시간 동안 혈장 내 변형된 히알루니다아제를 일정한 수준으로 유지하기 위해, 투약 요법 내내 연속하여 투여될 수 있다. 혈장 내 수준은, 혈장 내 변형된 히알루로니다제의 수준을 측정함으로써 본원에 기재된 치료 과정 동안 모니터링할 수 있다. 이는, 질환 또는 상태와 연관된 HA 를 제거할 뿐만 아니라 HA 재합성에 대응하기에 충분하도록, 치료 과정에 걸쳐 충분하게 최소 수준의 히알루로니다제가 존재한다는 것을 의미한다. 연속적인 투여는 적어도 또는 약 3 U/mL 아래로 떨어질 때마다 주기적으로 할 수 있다. 그러나, 각 투여 전에 혈장 수준을 측정할 필요는 없다. 일반적으로, 혈장 내 히알루로니다제 수준을 3 U/mL 이상으로 유지하려면, 폴리머에 접합된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제를 포함하는 조성물을 매월 수 회, 일반적으로 주 1 회 이상, 일반적으로 주 1 회 초과하여 투여한다. 예를 들어, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예를 들어, 변형된 가용성 히알루로니다제는 주 2 회, 주 3 회, 주 4 회, 주 5 회, 주 6 회 또는 매일 투여한다. 일반적으로 상기 효소는 주 2 회 투여한다.
본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 히알루로니다제의 혈장 수준을 3 U/mL 이상 유지하기 위해 필요한 변형된 히알루로니다제 효소의 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 본원에 예시된 바와 같이, 투여 주기에 걸쳐 혈장 내에서 3 U/mL 이상을 유지하기 위한, 변형된 가용성 히알루로니다제의 단일 투여의 투여량은 약 0.02 mg/kg (대상체의 체중), 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg 또는 그 이상이다. 일반적으로, 상기 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg 이다. 하기에 논의되는 바와 같이, 상기 양은 투여 주기에 걸쳐 정기적으로 (예를 들어, 주 2 회) 투여되어, 원하는 길이의 시간 동안 혈장 수준을 유지하는 것으로 이해된다. 평균 인간 체중을 75 kg 로 가정하면, 약 20,000 U/mg 내지 60,000 U/mg, 일반적으로 약 35,000 U/mg 의 비활성을 가진 변형된 가용성 히알루로니다제는, 약 60,000 U; 70,000 U; 80,000 U; 90,000 U; 100,000 U; 200,000 U; 300,000 U; 400,000 U; 500,000 U; 600,000 U; 700,000 U; 800,000 U; 900,000 U; 1,000,000 U; 1,500,000 U; 2,000,000 U; 2,500,000 U; 3,000,000 U; 3,500,000 U; 4,000,000 U 또는 그 이상 투여된다. 예를 들어, 약 2.0 내지 60 mg 의 변형된 히알루로니다제를 함유하는 변형된 히알루로니다제의 조성물이 투여될 수 있다. 본원에서는 또한 상기 조성물을 제공한다.
투여 주기의 시간 길이는 경험적으로 결정될 수 있고, 치료할 질환, 질환의 심각성, 특별한 환자 및, 치료하는 숙련된 임상의의 재량에 달린 기타 고려사항에 좌우된다. 변형된 히알루로니다제 효소를 이용한 치료 기간의 길이는 1 주, 2 주, 1 개월, 수 개월, 1 년, 수 년 또는 그 이상이 될 수 있다. 예를 들어, 변형된 히알루로니다제 효소는 1 년 이상의 기간에 걸쳐 주 2 회 투여될 수 있다. 질환 병후가 비연속적 치료의 부재 하에 계속된다면, 치료는 추가 길이의 시간 동안 계속할 수 있다. 치료 과정에 걸쳐, 질환의 증거 및/또는 치료 연관 독성 또는 부작용이 모니터링될 수 있다.
추가로, 치료 중단 기간을 추가하는 투여 주기를 맞춰 효소에 대한 노출로부터 자유로운 기간을 제공할 수 있다. 치료 중단 시간의 길이는 예정된 시간 동안일 수 있거나, 또는 환자의 반응에 따라 또는 관찰되는 부작용에 따라 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료는 1 주, 2 주, 1 개월 또는 수개월 중단될 수 있다. 치료 중단 기간 동안, 히알루로니다제의 혈장 수준은 3 U/mL 미만으로 떨어질 것으로 이해 및 예측된다. 일반적으로, 치료 중단 기간은 환자에 대한 투약 요법의 주기 내에 설정된다. 예를 들어, 한가지 예시 투약 요법은, 28 일의 치료 주기의 것으로, 변형된 효소는 처음 3 주 동안 주 2 회 투여 후, 투여없이 1 주를 후속한다. 한 예시에서, 0.05 mg/kg 내지 0.8 mg/kg 의 변형된 효소는 주 2 회로 3 주 동안 투여 후, 투여없이 1 주를 후속할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 환자에게, 28-일 주기의 과정에 걸쳐, 1, 4, 8, 11, 15 및 18 일째에 변형된 효소를 투여하고, 이어서 1 주의 치료 중단을 후속한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 투여 주기는 임의의 원하는 길이의 시간일 수 있다. 따라서, 28-일 투여 주기는 임의의 길이의 시간 동안 반복될 수 있다. 치료할 환자 및 질환에 특이적인 개인적인 고려사항들에 따라 환자의 필요를 맞추는 것을 전제로, 투여 주기 및 투여량 요법의 채택은 치료하고 있는 임상의의 재량에 달려있다.
4. 그의 조합 및 치료 방법
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 히알루론산을 일시적으로 소화한다. 따라서, 예를 들어, 글리코아미도글리간의 분해를 통해 간질 공간에서 오픈 채널을 형성하는 히알루로난 분해 효소의 능력으로 인해, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 투여는 분자들의 확산을 허용하고, 이로써 공동제형화 또는 공동투여된 분자, 또는 히알루로니다제의 투여 후 분자의 생체이용률, 약동학 및/또는 약력학적 특징을 개선한다. 일부 예시에서, 히알루로니다제가 있는 분자의 생체이용률은, 히알루로니다제 투여 부재시 분자의 생체이용률의 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이다. 일반적으로, 생체이용률은 90% 를 초과한다. 추가로, 상기 논의된 바와 같이, 변형된 히알루로난 분해 효소를 포함하는 히알루로난 분해 효소는 기타 메커니즘에 의해 종양을 치료할 수 있다.
따라서, 한 예시에서, 히알루로난-연관성 상태, 질환 또는 장애의 치료는, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제, 및 상기 질환 또는 장애 치료를 위한 하나 이상의 추가적인 작용제 및/또는 치료, 예를 들어, 항암제, 예컨대 화학치료제, 암 치료용 항체, 벡터 또는 핵산을 포함하는 조성물의 투여를 포함한다. 상기 예시에서, 제2 치료 또는 작용제는 히알루로니다제와 따로 또는 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 변형된 히알루로난 분해 효소는 추가적인 작용제 또는 치료의 이전에, 이후에 또는 함께 투여된다. 따라서, 히알루로난 분해 효소, 특히 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 PEG 화 가용성 히알루로니다제는 단독으로 또는 기타 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제 투여는, 예를 들어, 정맥내, 피하 및/또는 종양내 전달을 통해, 특히 세포외 히알루로난의 고발현이 있는 조직, 예를 들어, HALO (히알루로난을 포함하는, 프로테오글리칸이 풍부한 근세포 매트릭스 영역) 형성을 나타내는 조직에 대한 치료 또는 작용제의 전달을 위해, 치료제 전달을 촉진시킬 수 있다. 세포외 기질 내 히알루로난을 파괴하는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 능력으로 인해, 히알루로난 분해 효소는 원하는 위치에 대한 치료제의 투여를 촉진한다.
일반적으로, 제2 작용제 및 변형된 히알루로난 분해 효소, 예를 들어, 변형된 히알루로니다제 효소는 따로 투여된다. 예를 들어, 추가적인 작용제 또는 치료는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 추가적인 작용제 및/또는 치료 전, 예를 들어, 적어도 0.5, 1, 5, 15 또는 30 분 전에, 또는 추가적인 작용제 또는 치료 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 72 이상의 시간 전에 투여된다. 일부 예시에서, 변형된 효소의 긴 반감기 및 그의 작용 시간으로 인해, 변형된 효소는 추가적인 작용제 또는 치료 투여의, 적어도 24 또는 약 24 시간, 적어도 48 또는 약 48 시간, 또는 적어도 72 또는 약 72 시간 또는 그 이상의 시간 전에 투여될 수 있다.
제2 차 작용제의 투여 빈도는 경험적으로 결정될 수 있다. 투여 빈도의 결정은 숙련된 임상의의 재량이며, 치료하고자 하는 특별한 질환 또는 상태, 치료할 환자, 및 변형된 효소의 투여 주기를 포함하는 수많은 요인들에 좌우된다. 일반적으로, 제2 작용제, 예를 들어 항암제 또는 치료 (예를 들어 화학치료) 의 투여 시간은 일반적으로 변형된 효소의 투여 주기의 함수이다. 예를 들어, 제2 작용제는, 투여 주기에서 변형된 효소의 첫번째 투여 후 및/또는 해당 사이클 내 임의의 1 회 이상의 후속 투여 후 투여될 수 있다. 다른 예시에서, 제2 작용제는 주기 내 변형된 효소의 각각의 후속 투여 후, 주기 내 변형된 효소의 후속 투여 2 회 중 1 회마다 이후에 투여되거나, 또는 변형된 효소의 투여 주기 동안 1 주 1 회, 2 주 1 회, 3 주 1 회, 또는 매월 1 회 투여된다. 일부 예시에서, 제2 작용제는 변형된 효소 투여 주기 당 오직 1 회 투여된다. 추가 예시에서, 제2 작용제는 투여 주기 사이에서 간헐적으로 투여된다. 예를 들어, 제2 작용제를 첫번째 투여 주기 동안에는 투여하지 않지만, 두번째 주기 동안에는 투여하고, 이어서 세번째 주기에서는 건너뛰고 네번째 사이클 동안에는 다시 투여하는 등이거나 또는 이들의 임의의 변형이다.
하기의 섹션들은 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제 및/또는 기타 작용제를 포함하는 예시 조성물 및 화합물, 그의 제조 방법, 및 히알루로난-연관성 질환, 장애 및 상태 치료를 위한 그의 용도를 기재한다.
C. 히알루로난 분해 효소를 함유하는 조성물
본원에서는 변형된 히알루로난 분해 효소, 특히 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물, 및 히알루로난-연관성 질환 및 상태 치료를 위한 투여를 위한 상기 조성물의 사용 방법을 제공한다. 본원에서 제공하는 상기 조성물에 포함되는 히알루로난 분해 효소는 폴리머 (예를 들어, PEG) 에 대한 접합에 의해 변형된다. 임의의 상기 변형된 히알루로난 분해 효소가 본원에서 제공되며, 상기 효소는 히알루론산 (예를 들어, 히알루로니다제 활성) 에 대한 효소 활성을 나타낸다. 일부 예시에서, 본원에서의 방법, 조성물 및 조합물에 사용되는 변형된 히알루로난 분해 효소는 비변형 히알루로난 분해 효소 (예를 들어, 폴리머에 접합되지 않은 것)에 비해 증가된 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 일반적으로, 본원의 다른 부분에서 논의된 바와 같이, 변형된 히알루로난-분해 효소는 비변형 히알루로난-분해 효소에 비해 증가된 반감기를 나타낸다.
히알루론산 또는 히알루로네이트로도 불리우는 히알루로난은 결합, 상피 및 신경 조직 전반에 널리 분포하는 비-황산화(non-sulfated) 글리코사미노글리칸이다. 히알루로난은 세포외 기질의 필수요소이자 간질장벽의 주요 구성성분이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해효소는 히알루로난의 점도를 낮추고, 이에 의해 조직 투과성을 증가시키고, 비경구적으로 투여된 유체의 흡수속도를 증가시킨다. 따라서, 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다제는, 예를 들어 다른 제제, 약물 및 단백질과 함께 산포제 또는 분산제로서 사용되고, 이들의 분산 및 전달을 개선한다.
히알루로난 분해효소는 히알루로난 폴리머를 절단함으로써 히알루로난을 분해하고, 상기 폴리머는 교대하는 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통하여 함께 연결된, 반복되는 이당류 단위, D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)으로 구성되어 있다. 히알루로난 사슬은 길이가 약 25,000 이당류 반복(repeats) 이상에 달하고, 히알루로난의 폴리머는 생체내 크기가 약 5,000 내지 20,000,000Da 범위에 이른다. 따라서, 제공되는 용도 및 방법을 위한 히알루로난 분해효소는 히알루로난 이당류 사슬 또는 폴리머의 절단 촉매능을 가지는 임의의 효소를 포함한다. 어떤 예에서 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 히알루로난 사슬 또는 폴리머에서 β-1→3 글리코시드 결합을 절단한다.
따라서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 세포외 매트릭스의 핵심적인 성분이며, 간질 장벽의 주된 구성성분인 히알루론산을 분해하는 효소들의 패밀리이다. 간질 장벽의 주된 구성성분인 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해 효소는 히알루론산의 점도를 낮추고, 이로써 조직 침투성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 예를 들어, 기타 작용제, 약물 및 단백질의 분산성 및 전달을 증강시키기 위해 그들과 함께 산포제 또는 분산제로서 사용된다. 히알루로난-분해 효소는 또한 대량피하주사 (hypodermoclysis) (피하 액체 투여) 를 위한 기타 주입된 약물의 흡수 및 분산을 증가시키기 위한 보조제로서, 및 방사요법제의 재흡수 개선을 위한 피하 요로조영술에서의 보조제로서 사용된다. 히알루로난-분해 효소, 예를 들어, 히알루로니다제는 안과적 과정, 예를 들어, 안과 수술 전 국소 마취에서의 안구주위 및 테논하 차단의 적용에 이용될 수 있다. 히알루로니다제는 또한, 성형수술, 예컨대 안검미용성형 및 페이스 리프트에서의 운동불능 촉진에 의한 기타 치료 및 미용 용도에서 이용될 수 있다.
히알루로니다제를 포함하는 여러가지 형태의 히알루로난 분해 효소가, 인간을 포함하는 대상체에서의 치료 용도를 위해 제조 및 승인되었다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은, 상기 및 치료 용도를 위해 히알루로난-연관성 질환 및 상태의 치료에 이용될 수 있다. 예를 들어, 동물-유도성 히알루로니다제 제제에는, 정제된 양 고환 히알루로니다제인 Vitrase® (ISTA Pharmaceuticals), 및 소 고환 히알루로니다제 Amphadase® (Amphastar Pharmaceuticals)가 포함된다. Hylenex®(Halozyme Therapeutics) 은 가용성 rHuPH20 를 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자적으로 조작된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 제조된 인간 재조합 히알루로니다제이다.
본원에 제공된 조성물 및 방법에서의 예시 히알루로난 분해 효소는 가용성 히알루로니다제이다. 기타 예시 히알루로난 분해 효소에는, 이에 제한되지 않으나, 특히 콘드로이티나아제 및, 히알루로난을 절단하는 능력을 가진 리아제(lyase)가 포함된다.
하기에 기재된 바와 같이, 히알루로난-분해 효소는 막-결합 또는 가용성 형태로 존재한다. 본원에서의 목적을 위해, 가용성 히알루로난-분해 효소가 본원에서의 방법, 용도, 조성물 또는 조합물을 위해 제공된다. 따라서, 히알루로난-분해 효소에는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 가 포함되고/되거나 그렇지 않으면 막-고정 또는 불용성인데, 히알루로난-분해 효소는 본원에서 가용성 형태로 제공된다. 따라서, 히알루로난-분해 효소에는 절단된 변이체, 예를 들어, GPI 앵커의 전부 또는 일부가 제거된 변이체가 포함된다. 히알루로난-분해 효소는 본원에서 또한 가용성 히알루로난-분해 효소의 대립유전자성 또는 종 변이체 또는 기타 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 그의 1 차 서열에 하나 이상의 변이, 예컨대 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 히알루로난-분해 효소의 변이체는 일반적으로, 해당 변이를 포함하지 않는 히알루로난-분해 효소에 대해 적어도 또는 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 본원에서의 목적을 위해 임의의 변이가 히알루로난 분해 효소에 포함될 수 있고, 상기 효소는, 히알루로니다제 활성, 예컨대 해당 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소의 활성의, 예컨대 적어도 또는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성을 보유한다 (당업계에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있는 시험관내 및/또는 생체내 검정으로 측정).
본원에 제공된 방법 및 용도는 가용성 히알루로니다제의 용도를 설명하고, 따라서 임의의 히알루로난 분해 효소, 일반적으로 가용성 히알루로난 분해 효소가 사용될 수 있다.
1. 히알루로니다제
히알루로니다제는 히알루로난 분해효소의 거대 패밀리의 구성원이다. 히알루로니다제는 세가지의 클래스: 포유류-계 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제, 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제가 있다. 상기 효소는 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 이용될 수 있다.
a. 포유류-계 히알루로니다제
포유류-계 히알루로니다제(EC 3.2.1.35)는 히알루로난의 β1→4 글리코시드 결합을 다양한 길이의 올리고당류, 예컨대, 테트라사카리드 및 헥사사카리드로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다제이다. 상기 효소는 가수분해 및 트랜스글리코시다제 활성을 모두 가지며, 히알루로난 및 콘드로이틴 술페이트(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 상기 유형의 히알루로니다제는 암소(소의) 히알루로니다제(서열번호 10, 11 및 64 및 BH55 (미국특허번호 5,747,027 및 5,827,721), 양(면양)(서열번호 26, 27, 63 및 64), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 말벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(paper wasp)(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19, 31), 돼지(서열번호 20 내지 21), 랫트(서열번호 22 내지 24, 30), 토끼(서열번호 25), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 32) 및 인간 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다제의 예는 가용성 히알루로니다제이다.
포유류 히알루로니다제는 고환 추출물에서 우세하게 발견되는, 중성 활성인 것들 및 간 등의 기관에서 우세하게 발견되는 산성 활성인 것들로 추가로 하위분류될 수 있다. 중성 활성인 히알루로니다제의 예는 양(서열번호 27), 소(서열번호 11) 및 인간(서열번호 1)과 같은 다른 종 유래 PH20 을 포함하나 이에 국한되지 않는 PH20 을 포함한다. 인간 PH20 (SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20로도 공지)은 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 원형질 막에 부착된다. 이는 정자-난자 부착에 자연적으로 관여하고, 히알루론산을 소화하여 정자의 난구세포 층의 침투를 돕는다.
인간 PH20 (SPAM1 로도 지칭됨) 이외에도, 5 가지 히알루로니다제-형 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1 가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 는 슈도유전자 (pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호 38) 은 임의의 공지된 기질에 대한 활성을 보유하는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호 39 에 기재된 전구체 폴리펩티드) 는 콘드로티나아제이고, 히알루로난에 대한 활성은 거의 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호 36 에 기재된 전구체 폴리펩티드)은 프로토타입 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 프로토타입 중성-활성 효소이다. 산성-활성 히알루로니다제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호 37 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결여되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 를 초과해서는 시험관내에서 촉매 활성의 거의 없다 (Frost 등 (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 는 시험관내에서 매우 낮은 비활성도를 가진 산성-활성 효소이다. 히알루로니다제-형 효소는 또한, 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 형질막에 결합되어 있는 것, 예컨대 인간 HYAL2 및 인간 PH20 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), 및 일반적으로 가용성인 것, 예컨대 인간 HYAL1 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 할 수 있다.
PH20
PH20 는, 기타 포유류 히알루로니다제와 마찬가지로, 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 각종 길이의 다당류, 예컨대 사탄당 및 육탄당으로 가수분해하는엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 활성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. PH20 는 본래 정자-난자 결합에 수반되고, 히알루론산 소화에 의해, 정자에 의한 난구세포층의 침투를 보조한다. PH20 는 정자 표면 및 라이소좀-유도성 첨체에 위치해 있으며, 여기서 내첨체막에 결합되어 있다. 형질막 PH20 는 중성 pH 에서만 히알루로니다제 활성을 갖는 반면, 내첨체막 PH20 는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다제에 추가하여, PH20 도 또한 HA-유도성 세포 신호전달에 대한 수용체, 및 난자를 둘러싼 투명층에 대한 수용체인 것으로 나타난다.
예시 PH20 단백질에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 (서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드), 침팬지 (서열번호 101), 붉은털원숭이 (서열번호 102), 소 (서열번호 11 및 64), 토끼 (서열번호 25), 양 PH20 (서열번호 27, 63 및 65), 사이노몰거스 원숭이 (서열번호 29), 기니피그 (서열번호 32), 랫트 (서열번호 30) 및 마우스 (서열번호 31) PH20 폴리펩티드가 포함된다.
소 PH20 는 553 개 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호 11) 이다. 소 PH20 와 인간 PH20 의 정렬은 오직 약한 상동성만을 보여주는데, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카르복시 말단까지에는 다중적인 갭들이 존재한다 (참고문헌은, 예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). 사실, 명백한 GPI 앵커는 인간을 제외한 다수의 기타 PH20 종들에서는 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 생산된 PH20 폴리펩티드는 본래 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20 는 전체적으로, 형질막에는 매우 느슨하게 결합되어 존재하는데, 이는 포스포리파아제 감수성 앵커를 통해 고정되어 있지 않다 (Lalancette 등 (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). 소 히알루로니다제의 이러한 독특한 특성은, 가용성 소 고환 히알루로니다제 효소의 임상 용도를 위한 추출물로서의 이용을 가능케 한다 (Wydase®, Hyalase®).
인간 PH20 mRNA 전사물은 번역되어 일반적으로, N-말단에 35 개의 아미노산 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 및 C-말단에 19 개의 아미노산 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 결합 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509) 를 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호 1) 를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 은 서열번호 2 에 기재된 474 아미노산 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 ER 로의 수송 및 신호 펩티드의 제거 후, C-말단 GPI-결합 신호 펩티드는 절단되어, 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 490 에 해당하는 아미노산 위치에서 새롭게 형성된 C-말단 아미노산에 대한 GPR 앵커의 공유결합성 결합을 촉진한다. 따라서, 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 GPI-고정 성숙형 폴리펩티드가 생산된다.
인간 PH20 은 중성 및 산성 pH 의 모두에서 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 한 국면에서, 인간 PH20 는 일반적으로 GPI 앵커를 통해 형질막에 고정되어 있는 프로토타입 중성-활성 히알루로니다제이다. 또다른 국면에서, PH20 은 중성 및 산성 pH 의 두가지 모두에서 히알루로니다제 활성을 갖는 내첨체막 상에 발현된다. PH20이 폴리펩티드의 서로 떨어진 영역에 2 개의 촉매 부위를 포함하는 것으로 보인다: 펩티드 1 및 펩티드 3 영역 (Cherr 등, (2001) Matrix Biology 20:515-525). 증거는, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 107 내지 137 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 142 내지 172 에 해당하는데, 펩티드 1 영역이 중성 pH 에서의 효소 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 상기 영역 내 위치 111 및 113 의 아미노산 (서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당)은 활성에 중요한 것으로 나타나는데, 이는 그의 아미노산 치환에 의한 돌연변이가, 야생형 PH20 에 비해, 각각 3% 히알루로니다제 활성을 갖거나 히알루로니다제가 검출되지 않는 PH20 폴리펩티드를 제공한다는 것으로 뒷받침된다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
펩티드 3 영역은, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 242 내지 262, 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 277 내지 297 에 해당하는데, 산성 pH 에서의 효소 활성에 중요한 것으로 나타난다. 상기 영역 내에서, 성숙형 PH20 폴리펩티드의 위치 249 및 252 에서의 아미노산은 활성에 핵심적인 것으로 나타나고, 이들 중 하나에서라도 돌연변이가 발생하면 활성이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 제공한다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
촉매 부위에 추가하여, PH20 은 또한 히알루로난-결합 부위를 포함한다. 실험적인 증거는, 상기 부위가 펩티드 2 영역에 위치하고 있음을 시사하며, 이는 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 205 내지 235 및, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 위치 170 내지 200 에 해당한다. 상기 영역은 히알루로니다제에서 고도로 보존성이고, 헤파린 결합 모티프와 유사하다. 위치 176 (서열번호 2 에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 해당) 에서의 아르기닌 잔기의 글리신으로의 돌연변이는, 야생형 폴리펩티드에 비해 히알루로니다제 활성이 오직 약 1% 만 있는 폴리펩티드를 제공한다 (Arming 등, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
서열번호 1 로 예시되는 인간 PH20 의 폴리펩티드의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 에는 7 개의 잠재적인 N-연결형 글리코실화 부위가 있다. 서열번호 1 의 아미노산 36 내지 464 는 최소 활성 인간 PH20 히알루로니다제 도메인을 포함하는 것으로 나타나기 때문에, N-연결형 글리코실화 부위 N-490 는 적절한 히알루로니다제 활성에는 필요하지 않다. 인간 PH20 에는 6 개의 디설파이드 결합이 있다. 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C60 및 C351 사이, C224 및 C238 사이에 2 개의 디설파이드 결합이 있다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C25 및 C316, 및 C189 및 C203 에 해당됨). 서열번호 1 로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376 및 C387 사이; C381 및 C435 사이; C437 및 C443 사이; 및 C458 및 C464 사이에는 추가로 4 개의 디설파이드 결합이 형성된다 (각각, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C341 및 C352 사이; C346 및 C400 사이; C402 및 C408 사이; 및, C423 및 C429 사이에 해당됨).
b. 박테리아 히알루로니다제
박테리아 히알루로니다제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 술페이트 및 데르마탄 술페이트를 분해한다. 박테리아에서 분리된 히알루로난 리아제는 작용방식에 의해 히알루로니다제(다른 출처 유래, 예컨대, 히알루로노글루코사미니다제, EC 3.2.1.35)와 다르다. 이들은 히알루로난 내의 N-아세틸-베타-D-글루코사민과 D-글루쿠론산 잔기 사이의 β1→4-글리코시드결합의, 가수분해보다는, 제거반응을 촉매하여, 3-(4-디옥시-β-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민 테트라- 및 헥사사카리드, 및 이당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다제이다. 상기 반응으로 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기를 가지는 올리고당이 형성된다.
제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 아르쓰로박터(Arthrobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 클로스트리듐(Clostridium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이드(Bacteroides) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 균주를 포함한, 미생물 내 히알루로난 분해효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효소의 특정 예는 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp.)(균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 III(서열번호 73), 스트렙토코커스 아우레우스(Streptococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 보바인 RF122(서열번호 79 및 80); 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호 83); 혈청형 2, 균주 D39/NCTC 7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96)), 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는, 스트렙토마이세스 히알루로노리티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
c. 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제
거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다제(EC 3.2.1.36)는 테트라- 및 헥사사카리드 최종산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다제이다. 상기 효소는 히알루로네이트 내 β-D-글루쿠로네이트와 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이에 β1→3-결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리 유래 히알루로니다제의 예는 거머리과(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis)), 돌거머리과(Erpobdellidae)(예를 들어, 네펠롭시스 옵스쿠라(Nephelopsis obscura) 및 에르포브델라 펀타타(Erpobdella punctata)), 넙적거머리과(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데쎄로브델라 픽타(Desserobdella picta), 헤로브델라 스타그날리스(Helobdella stagnalis), 그로씨포니아 콤플란타(Glossiphonia complanata), 플라코브델라 오르나타(Placobdella ornata) 및 테로마이존속(Theromyzon sp.)) 및 말거머리과(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Hovingh 등(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). 거머리 히알루로니다제와 동일한 작용기전을 가지는 박테리아 유래 히알루로니다제의 예는 시아노박테리아(cyanobacteria), 시네코코커스속(Synechococcus sp.)의 히알루로니다제(균주RCC307, 서열번호 97)이다.
2. 기타 히알루로난 분해효소
제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다제 패밀리 뿐만 아니라 다른 히알루로난 분해효소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 콘드로이티나제 및 리아제를 포함한, 히알루로난 절단능을 가지는 효소가 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해할 수 있는 콘드로이티나제의 예는 콘드로이틴 ABC 리아제 (또한 콘드로이티나제 ABC로서 알려짐), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나제로서 알려짐) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 상기 효소의 생산 및 정제 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국특허번호 6,054,569; Yamagata, 등(1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang 등(1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857).
콘드로이틴 ABC 리아제는 두개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함하고(Hamai 등(1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30), 이들은 콘드로이틴-술페이트 및 데르마탄-술페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해한다. 콘드로이틴 술페이트, 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 및 데르마탄 술페이트는 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제의 바람직한 기질이나, 상기 효소는 더 낮은 속도로 히알루로난에 작용할 수도 있다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-술페이트- 및 데르마탄-술페이트 유형의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해하여, 궁극적으로 Δ4-불포화 테트라- 및 이당류로 분해되는 다른 크기의 Δ4-불포화 올리고당의 혼합물을 생성한다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질특이성을 가지나, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 폴리머 콘드로이틴-술페이트 및 이들의 올리고당 절편, 모두의 비-환원 말단으로부터 이당류 잔기를 제거한다(Hamai, A. 등(1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제의 예는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 황산-콘드로이틴-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있음(Sato 등(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46).
콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 콘드로이틴 술페이트 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이나, 데르마탄 술페이트(콘드로이틴 술페이트 B)에 대해 불활성이다. 박테리아 유래 콘드로이티나제 AC 효소의 예는 서열번호 99 및 100에 각각 기재된, 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 및 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 이리시스(Arthrobacter aurescens) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Tkalec 등(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 등(1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
콘드로이티나제 C 는 콘드로이틴 술페이트 C를 절단하여, 테트라사카리드와 불포화 6-황산화 이당류(delta Di-6S)를 생성한다. 이는 또한 히알루론산을 절단하여 불포화 비-황산화 이당류(delta Di-OS)를 생성한다. 박테리아의 콘드로이티나제 C 효소의 예는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium)의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hibi 등(1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 등(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda 등(1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
3. 가용성 히알루로난 분해효소
변형된 가용성 히알루로니다제를 포함한, 변형된 가용성 히알루로난 분해효소가 본원의 상기 조성물, 조합물 또는 방법에서 제공된다. 가용성 히알루로난 분해효소는 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해효소를 포함하고, 가용성 히알루난 분해효소, 예컨대, 비-인간 동물 가용성 히알루로니다제, 박테리아 히알루로니다제 및 인간 히알루로니다제, Hyal1, 소의 PH20 및 양의 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 다른 변이체를 포함한 비-인간 가용성 히알루로니다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가용성 히알루로난 분해효소 중에서, 예를 들어, 가용성으로 변형된 임의의 히알루로난 분해효소가 포함된다. 예를 들어, GPI 앵커를 포함하는 히알루로난 분해효소는 GPI 앵커의 모두 또는 일부를 절단(truncation)하거나 제거하여 가용성으로 만들어질 수 있다. 하나의 예에서, GPI 앵커를 통해 정상적으로 막에 고정된, 인간 히알루로니다제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 모두 또는 일부의 절단(truncation) 및 제거에 의해 가용성으로 만들어질 수 있다.
가용성 히알루로난 분해효소는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제를 포함한다. 투여후 효소활성의 원하는 수준 및/또는 투여부위와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 요인들에 따라, 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다제가 선택될 수 있다. 특정 예에서, 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해효소는 가용성 중성 활성 히알루로니다제이다.
그 히알루로니다제가 가용성이고 히알루로니다제 활성을 유지하는 한, 가용성 히알루로니다제의 예는 임의의 종 유래 PH20, 예컨대 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 101 내지 102 중 어느 하나에 기재된 임의의 것, 또는 C-말단 GPI 앵커의 모두 또는 일부가 손실된 이들의 절단된 형태이다. 가용성 히알루로니다제 중에는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 101 내지 102 중의 어느 하나의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 또한 포함된다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 알려져 있으며, 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 63 내지 65, 및 101 내지 102 중 어느 하나 또는 이들의 절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 변형은 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 히알루로니다제의 활성을 위하여 중요하거나, 그렇지 않으면 요구되는 잔기들, 예컨대 상기 기재되거나 당 분야의 기술에서 알려진 임의의 것들이 일반적으로 불변이며, 변형될 수 없는 것으로 이해된다. 이들은 예를 들면 활성 부위 잔기들을 포함한다. 따라서, 예를 들어 인간 PH20 폴리펩티드 또는 이의 가용성 형태의 아미노산 잔기 111, 113 및 176 (서열번호 2에 기재된 성숙한 PH20 폴리펩티드 내 잔기들에 상응)가 일반적으로 불변이고, 변경되지 않는다. 글리코실화 및 적절한 폴딩을 위하여 요구되는 이황화결합의 형성을 제공하는 다른 잔기들이 또한 불변일 수 있다.
일부 예에서, 가용성 히알루로난 분해효소는 정상적으로 GPI 앵커 (예를 들면, 인간 PH20)이고 C 말단절단에 의해 가용성을 제공한다. 이러한 말단 절단은 GPI 앵커 부착 신호 서열의 모두를 제거하거나 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부만을 제거할 수 있지만, 얻어진 폴리펩티드는 가용성을 갖는다. 가용성 히알루로난 분해효소가 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 예에서, 폴리펩티드가 가용성이면 GPI 앵커 부착 신호 서열내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상의 아미노산 잔기를 유지할 수 있다. GPI 앵커의 하나 이상의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소라고 한다. 당업자는 폴리펩티드가 당업계에 알려진 방법을 사용한 GPI-앵커인지를 결정할 수 있다. 이러한 방법은 공지의 알고리즘을 사용하여 GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω-부위의 존재 및 위치를 예상하고 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파제 C(PI-PLC) 또는 D(PI-PLD)로 소화 전후의 가용성 분석을 실시하는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
연장된 가용성 히알루로난 분해효소는 얻어진 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하도록 천연 GPI 앵커 히알루로난 분해효소에 C-말단 절단함으로써 제조될 수 있다. C-말단절단되지만 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소로는 영장류 기원인 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드, 예를 들면 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, esPH20 폴리펩티드는 활성 단편을 포함하는, 서열번호 1, 2 또는 101에 기재된 성숙 또는 전구체 폴리펩티드 또는 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중 어느 하나의 C-단말 절단에 의해 행해질 수 있는데, 얻어진 폴리펩티드는 가용성이고 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 유지한다. 대립형질 변이체 및 다른 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1 또는 2 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 얻어진 esPH20 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 유지하는 것이면, 본원에서 제공된 esPH20 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1,2, 또는 101에 기재된 서열을 갖는 폴리펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 아미노산에 의해 C-말단 절단될 수 있다.
전형적으로, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위하여, 가용성 인간 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 인간 PH20이 사용된다. 다른 동물 유래 히알루로난 분해효소, 예를 들면 PH20이 이용될 수 있으나, 그러한 제제는 동물 단백질이므로, 잠재적으로 면역원성이 있다. 예를 들어, 현저한 비율의 환자가 사전에 섭취된 음식물에 대해 이차적인 민감화(sensitization)를 보여주고, 이들은 동물 단백질이기 때문에, 모든 환자는 차후에 민감화의 위험을 가진다. 따라서, 비-인간 제제는 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제를 원한다면, 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 가지도록 조제될 수 있음이 본원에서 고려된다. 그러한 변형은 당업자의 수준내에 있으며, 예를 들어 분자에서 하나 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
본원의 방법에서 사용된, 히알루로니다아제(예를 들면, PH20)를 포함한, 히알루로난 분해효소는 재조합적으로 생산되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 출처로부터 정제되거나 부분적으로-정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해효소를 포함한, 재조합 단백질의 생산방법은 본원의 다른 곳에서 제공되며, 당업자에게 잘 알려져 있다.
a.가용성 인간 PH20
가용성 히알루로니다제로는 가용성 인간 PH20을 들 수 있다. 재조합 인간 PH20의 가용성 형태가 제조되어 왔고 본원에 기재된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 PH20의 가용성 형태의 제조는 미국특허 출원 공개 제 20040268425호; 제 20050260186호 및 제 20060104968호, 및 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들면, 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1에서 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 포함된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% 서열 동일성을 갖고 히알루로니다제 활성을 유지하고 가용성을 갖는다. 이들 폴리펩티드중에, GPI-앵커 부착 신호 서열의 전부 또는 일부가 완전히 결실된 가용성 PH20 폴리펩티드가 포함되어 있다. 또한, GPI 앵커의 적어도 하나의 아미노산을 함유하는 연장된 가용성 PH20(esPH20) 폴리펩티드가 포함되어 있다. 따라서, ER내에 단백질의 C-단말에 GPI 앵커가 공유결합되고 혈장 막의 세포외 소엽(leaflet)에 고정되는 것 대신에, 이들 폴리펩티드는 분비되고 가용성을 갖는다. C-말단 절단된 PH20 폴리펩티드는 전장의 야생형 폴리펩티드, 예를 들면 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열을 갖는 전장의 야생형 폴리펩티드 또는 대립형질 변이체 또는 종변이체 또는 다른 변이체에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5, 60 이상의 아미노산에 의해 C-말단 절단될 수 있다.
본원에 제공된 C-말단절단된 인간 PH20 폴리펩티드로는 서열번호 1에 기재된 아미노산의 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 또는 그의 대립형질 변이체 또는 종 변이체에서 상응하는 위치를 함유하는 폴리펩티드를 생생하기 위해 C-말단 절단된 것을 포함한다. 상기 35 아미노산 N 말단 신호 서열이 포유류 세포내에서 발현되면, 그 서열은 프로세싱 중에 절단되고 성숙한 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 예시의 성숙한 C-단말 절단된 가용성 PH20 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497 또는 그의 대립형질 변이체 또는 종 변이체에서 상응하는 위치를 함유한다. 표 2는 C-말단절단 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하는 예시의 C-단말 절단 PH20 폴리펩티드의 비제한적 예를 제공한다. 하기 표 2에서 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 길이(아미노산내의) 및 C-말단 절단된 PH20 단백질의 전구체 및 성숙한 폴리펩티드의 예시의 아미노산 서열이 기재된 서열 식별기호(서열번호)를 제공한다. 또한, 야생형 PH20 폴리펩티드가 비교를 표2에 포함되어 있다.
표 2. 예시의 C-말단절단된 PH20 폴리펩티드
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가용성 형태는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 함유하는 폴리펩티드를 생성시키기 위해 C-말단 절단된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 포유류 세포에서 발현되는 경우, 35 아미노산 N-말단 신호 서열이 프로세싱 중에 절단되고, 성숙한 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 성숙한 가용성 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 36 내지 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 함유한다. 아미노산 위치 477 내지 483에서 결실 변이체 말단 (서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드에 상응)은 전장 GPI 앵커 형태 보다 높은 분비된 히알루로니다제 활성을 나타낸다. 따라서, 가용성 히알루로니다제로는, 예를 들면 서열번호 4 내지 9에 기재된 것과 같은 길이에서 442, 443, 444, 445, 446 또는 447 아미노산 길이인 가용성 인간 PH20 폴리펩티드 또는 그의 대립형질 변이체 또는 종변이체 또는 다른 변이체를 들 수 있다.
촉매활성 및 히알루로니다제의 안정성을 위해 글리코실화가 중요하기 때문에 일반적으로 PH20의 가용성 형태는 폴리펩티드가 활성 유지를 보장하도록 정확한 N-글리코실화를 용이하게 하는 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 이러한 세포는, 예를 들면 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한다(예를 들면, DG44 CHO 세포).
b.rHuPH20
인간 PH20의 재조합 가용성 형태가 만들어지고, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 상기 재조합 인간 PH20의 가용성 형태의 생성은 미국출원 공개공보 제 20040268425호; 제 20050260186호 및 제 20060104968호 및 하기 실시예 2-6에 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 서열번호 3에 기재된 아미노산 1 내지 482를 코딩하는 핵산분자로부터 생성되는 것들이다. 이러한 핵산 분자는 서열번호 49에 기재되어 있다. 포스트 전사처리는 35 아미노산 신호 서열을 제거하고 447 아미노산 가용성 재조합 인간 PH20(서열번호 4)를 남긴다. 배양배지에서 생산되기 때문에, C-말단에서 불균일(heterogeneity)이 있으며, 따라서 rHuPH20으로 불리는 산물은 다양하고 풍부하게 서열번호 4-9 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 종의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, rHuPH20은 활성을 유지하기 위해 정확한 N-글리코실화를 용이하케 하는 세포, 예를 들면 CHO 세포(예를 들면 DG44 CHO 세포)내에서 생성된다.
4. 히알루로난 분해효소의 글리코실화
촉매활성 및 안정성을 위해, 히알루로니다제를 포함하는 일부의 히알루로난 분해효소의 N-결합 및 O-결합 글리코실화를 포함하는 글리코실화가 중요할 수 있다. 대부분의 효소가 당단백질을 변형한 글리칸의 형태를 변경하여 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 가용성 및 안정성에 대한 현저한 효과를 가지면, 대부분의 효소는 최적의 효소활성에 대한 글리코실화가 필요하다고 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다제에 대해, N-결합 글리코실화를 제거하여 히알루로니다제 활성의 거의 완전한 비활성을 일으킬 수 있다. 따라서, 이러한 히알루로니다제에 대해, 활성 효소를 발생시키기 위해 N-결합 글리칸의 존재가 중요하다.
N-결합 올리고당류는 여러 주요한 형태(올리고만노스, 복합체, 하이브리드, 술페이트 형태)로 분류되고, 모두 Asn-Xaa-Thr/Ser 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아니다)내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc 코어를 갖는다. Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화가 응고단백질 C에 대해 보고되었다. 일부 예에서, 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해효소는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합을 함유할 수 있다. 예를 들면, PH20은 O-결합 올리고당류 뿐만 아니라 N-결합 올리고당류를 갖는다. 서열번호 1에서 열거된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490에서 7개의 잠재 N-결합 글리코실화 부위가 있다. 기재된 바와 같이, 히알루로니다제 활성을 위해서 N490에서 N-결합 글리코실화가 필요하지 않다.
일부 예에서, 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 글리코실화의 한 부위 또는 전체 부위에서 글리코실화된다. 예를 들면, 인간 PH20 또는 가용성 형태에 대해, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393에 상응하는 2, 3, 4, 5 또는 6의 N 글리코실화 부위가 글리코실화된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 천연 글리코실화 부위에서 글리코실화된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소는 하나 이상의 비천연 글리코실화 부위에서 변형되어 하나 이상의 부가적인 부위에서 폴리펩티드의 글리코실화를 제공한다. 이러한 예에서, 부가적인 당 부분의 부착은 분자의 약동학 특성, 예를 들면 향상된 반감기 및/또는 향상된 활성을 향상시킬 수 있다.
다른 예에서, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해효소는 부분적으로 탈글리코실화(또는 N-부분적으로 글리코실화 폴리펩티드)된다. 예를 들면, 부분적으로 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드는 충분히 글리코실화 히알루로니다제의 히알루로니다제 활성의 전부 또는 일부를 유지하고 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용될 수 있다. 부분적으로 탈글리코실화 히알루로니다제로는 임의의 종으로부터 부분적으로 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드의 가용성 형태, 예를 들면 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 101 및 102에 기재된 것 또는 대립형질 변이체, 말단절단된 변이체, 또는 다른 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 63, 65, 101 및 102의 어느 하나 또는 그 말단절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 부분적으로 탈글리코실화 히알루로니다제는 하이브리드, 융합 및 키메릭 부분적 탈글리코실화 히알루로니다제 및 부분적으로 탈글리코실화 히알루로니다제 접합체를 포함한다.
글리코시다제 또는 글리코시드 가수분해효소는 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매작용하여 2개의 작은 당을 생성하는 효소이다. 척추동물에서 N-글리칸의 주요한 형태는 높은 만노스 글리칸, 하이브리드 글리칸 및 복합체의 글리칸을 포함한다. 높은 만노스 글리칸, 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 2분기(biantennary) 복합체형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 2분기 이상의 분지쇄 복합체 글리칸을 절단하는 EndoF3; 및 높은 만노스 글리칸 및 하이브리드형 글리칸을 절단하는 EndoH를 포함하는 부분적인 단백질 탈글리코실화를 일으키는 여러개의 글리코시다제가 있다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 가용성 PH20의 하나 또는 모든 글리코시다제로의 처리는 부분적인 탈글리코실화를 일으키고, 따라서 히알루로니다제 활성을 유지한다.
부분적으로 탈글리코실화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 부분적으로 탈글리코실화 가용성 히알루로니다제는 하나 이상의 글리코시다제, 일반적으로 모든 N-글리칸을 제거할 뿐만 아니라 부분적으로 단백질을 탈글리코실화하는 글리코시다제로의 소화에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, PH20(예를 들면, rHuPH20라고 명명되는 재조합 PH20)을 하나 또는 모든 글리코시다제(예를 들면, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3)로 처리는 부분 탈글리코실화를 일으킨다. 이들 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드는 충분히 글리코실화된 폴리펩티드와 동등한 히알루로니다제 효소 활성을 나타낼 수 있다. 반면, PH20을 PNGaseF, 모든 N-글리칸을 절단한 글리코시다제로의 처리에 의해 모든 N-글리칸을 완전히 제거하여 PH20 효소적인 비활성을 제공할 수 있다. 따라서, 모든 N-결합 글리코실화 부위 (예를 들면, 서열번호 1에서 열거된 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393에서의 것)가 글리코실화될 수 있지만, 하나 이상의 글리코시다제로의 처리는 하나 이상의 글리코시다제에 의해 소화되지 않은 히알루로니다제에 비해 감소된 글리코실화의 정도를 제공할 수 있다.
부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적으로 탈글리코실화 히알루로난 분해효소는 충분히 글리코실화된 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%를 가질 수 있다. 일반적으로, 부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적으로 탈글리코실화된 히알루로난 분해효소는 충분히 글리코실화된 폴리펩티드에 의해 나타낸 히알루로니다제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 이상인 히알루로니다제 활성을 나타낸다.
5. 변형된 (폴리머-접합된) 히알루로난 분해효소
일례에서, 상기 제공된 조성물 및 조합물은 하나 이상의 중합성 분자(폴리머)와의 접합에 의해 변형된 히알루로난 분해효소, 특히 가용성 히알루로니다제를 함유하며 이는 일반적으로 히알루로난 분해효소의 반감기가 증가되고, 예를 들면, 대상체내에 연장된/지속된 처리 효과가 촉진된다.
중합성 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(페길화 잔기(PEG))이 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제와의 공유결합 또는 다른 안정한 결합(접합)은 얻어진 히알루로난 분해효소-폴리머 조성물에 유익한 특성을 부여한다. 이러한 특성은 대상체내의 혈액, 세포 및/또는 다른 조직내에 향상된 생체적합성, 단백질(및 효소활성) 반감기의 연장, 프로테아제 및 가수분해로부터 단백질의 효율적인 차단, 향상된 생체내분포, 향상된 약동학 및/또는 약력학 및 증가된 수용성을 포함한다.
히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제에 접합될 수 있는 폴리머로는 천연 및 합성 호모폴리머, 예를 들면 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, poly-COOH), 및 추가의 헤테로폴리머, 즉 하나 이상의 다른 커플링기, 예를 들면 하이드록실기 및 아민기를 포함하는 폴리머를 포함한다. 적당한 중합성 분자로는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG), 카르복시메틸-덱스트란, 헤파린, 동종 알부민을 포함하는 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스 카르복시에틸셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산 가수분해산물, 전분, 예를 들면 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알기닌산 가수분해물 및 생폴리머를 포함한다.
일반적으로, 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드, 예를 들면 PEG, 일반적으로 mPEG이고 이것은 덱스트란 및 풀루란과 같은 다당류에 비해 가교결합할 수 있는 반응성기를 거의 갖고 있지 않다. 일반적으로, 폴리머는 비독성 중합성 분자, 예를 들면 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이고, 이것은 상대적으로 단순화학을 이용하여 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제(예를 들면 단백질 표면에 부착된 기에 대한)에 공유결합될 수 있다.
치료제의 페길화는 단백질 분해에 대한 저항을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것에 대해 보고되어 있다(예를 들면, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993 ; Felix 등. , Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar 등. , J. Biol. Chem., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 등, J Immunol., 154: 3088-95, 1995 참조; Caliceti 등. (2003) Adv. DrugDeliv. Rev. 55(10):\26\-ll and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-SS) 참조). 페길화는 생체내 핵산분자의 전달에 사용될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (예를 들면, Cheng 등. (2003) Pharm. Res. 20(9): 1444-51 참조).
히알루로니다제를 포함한 히알루로난 분해효소에 부착하기 위한 적당한 중합성 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들면 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEGs 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다(Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004 참조). 중합성 분자는 일반적으로 약 3kDa 내지 약 60kDa의 범위의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질, 예를 들면 rHuPH20에 접합된 중합성 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
a. 페길화 가용성 히알루로난 분해효소
본원에서 방법, 조성물 및 조합물에서 사용된 히알루로난 분해효소는 페길화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 페길화 가용성 히알루로난 분해효소일 수 있다. 일례에서, 페길화 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 페길화 rHuPH20이다. PEG 또는 PEG 유도체를 공유결합(접합)함으로써 폴리펩티드를 변형하는 각종 방법(즉, "페길화")이 당업계에 알려져 있다 (예를 들면, 미국 특허 제 2006/0104968호; 미국 특허 제5,672,662호; 미국 특허 제6,737,505호; 및 미국 특허 제 2004/0235734호). 페길화하는 기술은 특별한 링커 및 커플링 약물(Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 분지 PEG를 통해 단일 접합부위에 다중 PEG 잔기의 접착(Veronese 등., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002 참조), 부위 특이적 페길화 및/또는 모노페길화 (Chapman 등., Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조) 및 부위 방향성 효소 페길화(예를 들면, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 종래에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 접착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생성할 수 있다(미국 공개 제 2006/0104968호 참조).
페길화용 수많은 시약은 종래에 기재되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐 카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 특허 제5,672,662호; 미국 특허 제5,932,462호; 미국 특허 제6,495,659호; 미국 특허 제6,737,505호; 미국 특허 제4,002,531호; 미국 특허 제4,179,337호; 미국 특허 제5,122,614호; 미국 특허 제5,183,550호; 미국 특허 제5,324, 844호; 미국 특허 제5,446,090호; 미국 특허 제5,612,460호; 미국 특허 제5,643,575호; 미국 특허 제5,766,581호; 미국 특허 제5,795, 569호; 미국 특허 제5,808,096호; 미국 특허 제5,900,461호; 미국 특허 제5,919,455호; 미국 특허 제5,985,263호; 미국 특허 제5,990, 237호; 미국 특허 제6,113,906호; 미국 특허 제6,214,966호; 미국 특허 제6,258,351호; 미국 특허 제6,340,742호; 미국 특허 제6,413,507호; 미국 특허 제6,420,339호; 미국 특허 제6,437,025호; 미국 특허 제6,448,369호; 미국 특허 제6,461,802호; 미국 특허 제6,828,401호; 미국 특허 제6,858,736호; 미국 공개 제 2001/0021763호; 미국 공개 제 2001/0044526호; 미국 공개 제 2001/0046481 호; 미국 공개 제 2002/0052430호; 미국 공개 제 2002/0072573호; 미국 공개 제 2002/0156047호; 미국 공개 제 2003/0114647호; 미국 공개 제 2003/0143596호; 미국 공개 제 2003/0158333호; 미국 공개 제 2003/0220447호; 미국 공개 제 2004/0013637호; 미국 공개 제 2004/0235734호; 미국 공개 제 2005/000360호; 미국 공개 제 2005/0114037호; 미국 공개 제 2005/0171328호; 미국 공개 제 2005/0209416호; 유럽특허 제01064951 호; 유럽특허 제0822199호; WO 00176640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
D. 히알루로난 분해 효소를 코딩하는 핵산 및 이의 폴리펩티드를 제조하는 방법
본원에 기재된 히알루로난 분해효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대한 해당 기술분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 획득될 수 있다. 원하는 유전자를 코딩하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법들이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예컨대 세포 또는 조직 원료로부터, 히알루로니다제를 코딩하는, 전장(즉, 전체코딩부위를 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 획득할 수 있다. 변형된 또는 변이체 가용성 히알루로니다제는, 예컨대 위치-지정 돌연변이생성법(site-directed mutagenesis)에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 제작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업자에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 그러한 방법들은 핵산분자의 PCR 증폭, 및 핵산분자 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 핵산 함유 재료는 원하는 폴리펩티드-코딩 핵산분자가 분리될 수 있는 출발재료로써 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 조직추출물, 조직추출물, 체액시료(예컨대, 혈액, 혈청, 침), 건강한 대상 및/또는 병에 걸린 대상의 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발재료의 원료로써 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현된 서열을 기초로 설계된다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기초로 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산분자를 서열분석하여 원하는 폴리펩티드를 코딩하는지 확인할 수 있다.
벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터, 또는 DNA 서열을 코딩하는 핵심 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 링커서열을 포함하는, 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정화하는 추가 뉴클로오티드 서열이 폴리펩티드-코딩 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 고안된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하는 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 서열은 당업자에 알려져 있다. 추가 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합지역을 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 상기 지역은 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 촉진하거나 코딩하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변화시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효소는 PEG 잔기(moiety)에 연결될 수 있다.
또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위한 태그 또는 다른 잔기가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가 핵산 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열이 또한 효소-코딩 핵산분자에 연결될 수 있다. 그러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 54) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호 55)를 코딩하는 핵산서열을 포함한다.
그다음 확인되고 분리된 핵산이 적당한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 아니하나, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포에 적합(compatible)해야만 한다. 그러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현벡터를 포함한다. 클로닝 벡터 내 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 절편을 연결함으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(INVITROGEN, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다. 만약 절편 DNA에 사용된 상보적 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결함으로써 원하는 임의의 부위가 제조될 수 있다; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 코딩하는, 특정한, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 단일폴리머 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입되어, 많은 카피의 유전자 서열을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 도입한 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 형질전환하는 것은 상기 유전자의 복수카피의 생성을 가능케 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 상기 유전자가 다량으로 획득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부를 함유하는 핵산이 적당한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수 전사 및 번역 신호가 또한 효소 유전자용 본래 프로모터, 및/또는 이들의 인접부위에 의해 제공될 수 있다.
또한 효소를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 벡터는 그안에 사용하기 적합한 임의의 것이다.
상기 벡터를 함유하는, 내피세포를 포함하는 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 그러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 코딩된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 상기 세포를 이용하여 이들의 단백질을 생산한다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 효소가 배지 내로 분비될 수 있다.
고유의 또는 이종의 신호 서열에 연결된, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드, 일부 경우 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 복수카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 세포 내 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 다른 바이러스)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 함유하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다르다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.
DNA 절편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적당한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 함유하는 키메릭 유전자를 함유하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산서열, 또는 도메인, 유도체, 절편, 또는 이들의 동족체(homologs)의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절됨으로써, 이들의 유전자 및 절편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 함유된 프로모터(Yamamoto 등 Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 등, Nature 296:39-42(1982)); 원핵생물 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 등,(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 [Scientific American 242:79-94(1980)] 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 함유하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 등, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 등, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 리불로스이인산 카르복실라제(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알콜탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 트랜스제닉 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절부위: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift 등, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan 등, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절부위(Grosschedl 등, Cell 38:647-658(1984); Adams 등, Nature 318:533-538(1985); Alexander 등, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절부위(Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절부위(Pinckert 등, Genes 및 Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절부위(Krumlauf 등, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer 등, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절부위(Kelsey 등, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로불린 유전자 조절부위(Magram 등, Nature 315:338-340(1985); Kollias 등, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절부위(Readhead 등, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절부위(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 등, Science 234:1372-1378(1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질 또는 도메인, 이들의 절편, 유도체 또는 동족체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 임의적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS II), 6XHis 태그 코딩서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 상기 플라스미드는 세개의 판독프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E. coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허 4,952,496 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 상기 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-TagTM 리더서열, 및 컬럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 부위 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
포유류 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.
2. 발현
가용성 히알루로니다제를 포함한, 히알루로난 분해효소는 생체내 및 시험관내 방법을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 원하는 단백질은 예컨대 투여 및 치료에 필요한, 상기 단백질의 요구되는 양 및 형태를 생산하기에 적당한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현숙주는 진핵생물 및 원핵생물 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충세포, 사람 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함한 포유류 세포를 포함한다. 발현숙주는 그 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역-후 변형의 형태에서 상이하다. 발현숙주는 상기 및 기타 요인들, 예컨대 규제 및 안전성 고려사항, 생산비용 및 정제 필요성과 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
많은 발현벡터들이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현벡터의 선택은 숙주발현시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 일반적으로, 발현벡터는 전사 프로모터와 임의적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케하는 선별마커를 전형적으로 가진다. 일부 경우, 벡터의 카피수를 증폭시키기 위해 복제기점이 이용될 수 있다.
가용성 히알루로니다제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해효소는 또한 단백질 융합으로써 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소융합은 효소에 추가 기능성을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국재화용 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합, 그리고 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하는 서열의 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E. coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기법이다. E. coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 함유할 수 있고, 그러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사의 다이설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 지시하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자의 pelB 리더 및 알카라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우 단백질은 불용성이 되며, 재용해 및 리폴딩(refolding)을 촉진하기 위해 변성화제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 아글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코시화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 그러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 대개 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 대개 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 다이설파이드 이소머라제와 공동-발현은 발현수준 및 용해도를 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단부위는 분비경로를 탈출시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로난 분해효소의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 규제 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.
곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드를 포함하는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(constructs)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포솜, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 전달할 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(Kozak 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터 및 인핸서 부위가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 부위의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유모세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 등,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특정배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물-부재 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물
트랜스제닉 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적 DNA 이동을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기법은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 사이에서 나뉜다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스이인산 카르복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 트랜스제닉 식물세포는 또한 히알루로니다제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제기술
숙주세포로부터, 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드) 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자를 위하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물 생산은 우유 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 술페이트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 향상시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 히알루로니다제 효소에 결합하는 다른 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔전기영동 및 염색 및 분광광도기법을 포함한, 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다. 본원에 제공된, 정제된 rHuPH20 조성물은 일반적으로 실시예 2에서 측정된 약 120,000 유닛/mg의 비활성도를 갖는다.
4. 히알루로난 분해효소 폴리펩티드의 페길화
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 PEG가 생체적합성, 무독성, 비면역원성 및 수용성 폴리머이기 때문에 생체적합재료, 생명공학 및 약물에서 널리 사용되어 왔다 (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). 약물 전달 영역에서 PEG 유도체는 단백질과의 공유결합(즉, 페길화)에 널리 사용되어 면역원성, 단백질분해 및 신장제거를 감소시키고 가용성을 향상시킨다(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). 마찬가지로, PEG는 저분자량, 비교적 소수성 약물에 부착되어 독성을 감소시키고 생체내분포를 변경시킨다. 일반적으로 페길화 약물은 용액으로서 주입된다.
분해성 및 가용성 약물 캐리어의 설계에서 사용된 많은 동일한 약물이 분해성 겔의 설계에서 사용될 수 있기 때문에 약물전달에 사용하기 위한 가교 분해성 PEG망의 합성 또는 제형화에 밀접하게 관련된다(Sawhney 등., Macromolecules 26: 581-87, 1993). 고분자간 복합체는 2개의 상보적 폴리머의 용액을 혼합함으로써 형성될 수 있다. 이러한 복합체는 일반적으로 관련 폴리머 사이에 정전기 상호작용(다가음이온-다가양이온) 및/또는 수소결합(다가산-다가염기) 및/또는 수성 환경에서 폴리머 사이에 소수성 상호작용에 의해 안정화된다(Krupers 등., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). 예를 들면, 적당한 조건하에서 다가아크릴산(PAAc)과 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)의 혼합용액은 대부분 수소결합에 기초한 복합체를 형성시킨다. 생리적 조건에서 이들 복합체의 해리는 유리 약물(즉, 비페길화된 약물)의 전달을 위해 사용되고 있다. 또한, 상보적인 폴리머의 복합체는 호모폴리머와 코폴리머로부터 형성되었다.
페길화용 수많은 시약은 기술적으로 기재되어 있다. 이러한 시약은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐 카르보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카르보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분기 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 술폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 이황화, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐술폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 등, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese 등., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; 미국 특허 제5,672,662호; 미국 특허 제5,932,462호; 미국 특허 제6,495,659호; 미국 특허 제6,737,505호; 미국 특허 제4,002,531호; 미국 특허 제4,179,337호; 미국 특허 제5,122,614호; 미국 특허 제5,183,550호; 미국 특허 제5,324, 844호; 미국 특허 제5,446,090호; 미국 특허 제5,612,460호; 미국 특허 제5,643,575호; 미국 특허 제5,766,581호; 미국 특허 제5,795, 569호; 미국 특허 제5,808,096호; 미국 특허 제5,900,461호; 미국 특허 제5,919,455호; 미국 특허 제5,985,263호; 미국 특허 제5,990, 237호; 미국 특허 제6,113,906호; 미국 특허 제6,214,966호; 미국 특허 제6,258,351호; 미국 특허 제6,340,742호; 미국 특허 제6,413,507호; 미국 특허 제6,420,339호; 미국 특허 제6,437,025호; 미국 특허 제6,448,369호; 미국 특허 제6,461,802호; 미국 특허 제6,828,401호; 미국 특허 제6,858,736호; 미국 특허 제 2001/0021763호; 미국 특허 제 2001/0044526호; 미국 특허 제 2001/0046481 호; 미국 공개 제 2002/0052430호; 미국 공개 제 2002/0072573호; 미국 공개 제 2002/0156047호; 미국 공개 제 2003/0114647호; 미국 공개 제 2003/0143596호; 미국 공개 제 2003/0158333호; 미국 공개 제 2003/0220447호; 미국 공개 제 2004/0013637호; 미국 공개 제 2004/0235734호; 미국 공개 제 2005/000360호; 미국 공개 제 2005/0114037호; 미국 공개 제 2005/0171328호; 미국 공개 제 2005/0209416호; 유럽특허 제01064951 호; 유럽특허 제0822199호; WO 00176640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; and WO 0187925)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
일례에서, 폴리에틸렌글리콜은 약3kD 내지 약50kD, 바람직하게는 약5kD 내지 약30kD의 범위의 분자량을 갖는다. 약물에 PEG의 공유결합(페길화라고 알려진)은 공지의 약물합성기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 페길화는 적당한 반응조건하에서 NHS-활성화된 PEG와 단백질을 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
수많은 반응은 페길화에 대해 기재되어 있지만, 일반적으로 적용할 수 있는 것은 방향성을 제공하고 온화한 반응조건을 이용하고 독성 촉매 또는 부산물을 제거하기 위한 광범위한 하류처리는 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 모노메톡시 PEG(mPEG)는 단지 하나의 반응성 말단 히드록실을 가지므로 그 이용은 얻어진 PEG 단백질 생성 혼합물의 일부의 불균질물을 한정한다. 친핵성 공격에 민감한 다양한 PEG를 만들 목적으로 말단 메톡시기와 반대의 폴리머의 말단에서 히드록실기의 활성은 유효한 단백질을 페길화하는 것이 필요하다. 공격성 친핵제는 보통 라이실잔기의 엡실론-아미노기이지만 국소조건이 바람직하다면 다른 아민이 반응할 수 있다(예를 들면, 히스티딘의 N-말단 알파 아민 또는 환상 아민). 더욱 직접적인 부착은 단일 라이신 또는 시스테인을 함유하는 단백질에서 가능하다. 후자의 잔기는 티올 특이적 변형에 대한 PEG-말레이미드를 목적으로 한다. 또한, PEG 히드라지드는 과요오드산 산화된 히알루로난 분해효소와 반응하고 NaCNBH3의 존재하에서 환원된다. 보다 구체적으로, 페길화 CMP 당은 충분한 글리코실 전이효소의 존재하에서 히알루로난 분해효소와 반응할 수 있다. 하나의 기술은 문제의 폴리펩티드에 많은 중합성 분자가 결합된 "페길화" 기술이다. 이 기술을 사용하면 면역 시스템은 항체의 형성을 담당하는 기인한 폴리펩티드 표면에 에피토프를 인지하는 데에 어려움을 가지며 이에 의해 면역반응을 감소시킨다. 특별한 생리적 효과를 제공하기 위해 인체의 순환계에 직접적으로 도입된 폴리펩티드(즉 작용제)에 대해, 일반적인 가능한 면역반응은 IgG 및/또는 IgM 반응이지만 호흡계를 통해 흡입된 폴리펩티드(즉, 산업용 폴리펩티드)는 IgE 반응(즉 알러지)을 일으킬 수 있다. 감소된 면역반응을 설명하는 이론 중 하나는 중합성 분자가 항체 형성을 야기하는 면역반응을 담당하는 폴리펩티드의 표면의 에피토프를 차폐하는 것이다. 다른 이론 또는 적어도 부분적인 인자는 접합체가 무거울수록 감소된 면역반응이 얻어진다는 것이다.
일반적으로, 페길화 히알루로니다제를 포함하는 본원에서 제공된 페길화 히알루로난 분해효소를 제조하기 위해, 페길화 잔기는 폴리펩티드에 공유결합을 통해 접합된다. 페길화 기술은 특별한 링커 및 커플링 약물(예를 들면 Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 접합부위에 다중 PEG 잔기를 결합(예를 들면 분지 PEG를 사용하여; Veronese 등., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), 부위 특이적 페길화 및/또는 모노페길화(Chapman 등, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 및 부위-직접적 효소 페길화 (Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 종래에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 접착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10초과 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생성할 수 있다(미국 특허 제 2006/0104968호 참조).
페길화 히알루로난 분해효소, 예를 들면 페길화 히알루로니다제를 제조하기 위한 페길화 방법의 예시로서, PEG 알데히드, 숙신이미드 및 카르보네이트는 PEG 잔기, 일반적으로 숙신이미딜 PEG를 rHuPH20에 접합하는데 적용되어 왔다. 예를 들면, rHuPH20은 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), 및 ("분지"PEG 접착용)mPEG-N-히드록시숙신이미드를 포함하는 예시의 숙신이미딜 모노PEG(mPEG) 시약과 접합되어 있다. 이들 페길화 숙신이미딜 에스테르는 PEG기와 활성화 크로스 링커 사이에 다른 길이의 탄소골격, 및 단일 또는 분지 PEG기 중의 어느 하나를 함유한다. 이들 차는, 예를 들면 접합처리 중 다른 반응속도론에 제공하고 rHuPH20에 PEG 접착에 이용가능한 부위를 제한하는데 사용될 수 있다.
(상기 기재된)선형 또는 분지 PEG 중 어느 하나를 포함하는 숙신이미딜 PEG은 rHuPH20에 접합될 수 있다. PEG는 히알루로니다제 당 3개 내지 6개의 PEG 분자를 갖는 분자의 조합물을 포함하는 재생산적으로 rHuPH20을 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 페길화 rHuPH20 조성물은 용이하게 정제되어 대략 25,000 또는 30,000 유닛/mg 단백질 히알루로니다제 활성의 비활성도를 갖고 실질적으로 비페길화 rHuPH20을 갖지 않는(5% 비페길화 미만) 조성물을 생산할 수 있다.
각종 PEG 시약을 사용하여, 히알루로난 분해효소의 예시 버전, 특히 가용성 인간 재조합 히알루로니다제(예를 들면, rHuPH20)는 예를 들면 mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), 및 mPEG2-NHS (40 kD), mPEG2-NHS (60 kD)에 기초한 분지형을 사용하여 제조할 수 있다. rHuPH20의 페길화 형태는 NHS 약물 또한 카르보네이트 및 알데히드를 사용하고 하기의 각각의 시약을 사용하여 제조되고 있다: mPEG2-NHS-40K 분지형, mPEG-NHS-lOK 분지형, mPEG-NHS-20K 분지형, mPEG-NHS-40K 분지형, mPEG2-NHS-60K 분지형; mPEG-SBA-5K; mPEG-SBA-20K; mPEG- SBA-30K; mPEG-SMB-20K; mPEG-SMB-30K; mPEG-부티르알데히드; mPEG-SPA- 2OK; mPEG-SPA-30K; 및 PEG-NHS-5K-바이오틴. 페길화 히알루로니다제는 Dowpharma의 p-니트로페닐 카르보네이트 PEG(30kDa) 및 프로피온알데히드 PEG(30kDa)로 페길화된 히알루로니다제를 포함하는 Dow Chemical Corporation의 사업부인 Dowpharma로부터 시판된 페길화 시약을 사용하여 제조되었다.
일례에서, 페길화는 mPEG-SBA, 예를 들면 mPEG-SBA-30K(약 30Kda의 분자량을 갖는) 또는 다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르의 가용성 히알루로니다제에 접합을 포함한다. PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K를 단백질의 아미노기와 결합하는 것이 용이하다. 예를 들면, m-PEG-SBA-30K 및 rHuPH20의 공유결합 (이것은 크기가 대략 60KDa임)은 하기 반응식 1에서 나타낸 rHuPH20와 mPEG 사이의 안정한 아미드 결합을 제공한다.
반응식 1:
Figure pat00003

일반적으로 mPEG-SBA-30K 또는 다른 PEG를 히알루로난 분해효소, 일부 예에서, 히알루로니다제, pH 6.8에서 적당한 버퍼, 예를 들면 130 mM NaCl/10mM HEPES 중에서 10:1의 PEG:폴리펩티드 몰비로 첨가하고, 이어서 멸균화, 예를 들면 멸균여과를 실시하고, 예를 들면 밤새동안 4℃에서 냉각실에서 교반하면서 계속된 접합화를 실시한다. 일례에서, 접합화된 PEG-히알루로난 분해효소는 농축되고 버퍼-교환된다.
다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K를 결합하는 방법은 당업계에 알려져 있다(미국특허 제5,672,662호; 미국특허 제6,737,505호; 및 미국특허 제 2004/0235734호). 예를 들면, 폴리펩티드, 예를 들면 히알루로난 분해효소(예를 들면, 히알루로니다제)는 붕산 버퍼(0.1M, pH 8.0) 중에서 4℃에서 1시간 동안 반응하여 NHS 활성화된 PEG 유도체에 결합될 수 있다. 얻어진 페길화된 단백질은 초여과에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 소 알칼리성 포스페이스트의 페길화는 0.2M 소디움 포스페이트와 0.5M NaCl(pH 7.5)를 4℃에서 30분간 함유하는 버퍼중에서 포스파타제를 mPEG-SBA와 혼합함으로써 달성될 수 있다. 미반응된 PEG는 초여과에 의해 제거될 수 있다. 다른 방법은 폴리펩티드를, 트리에틸아민을 첨가하여 pH를 7.2-9로 상승한 탈이온수 중에서 mPEG-SBA와 반응시킨다. 얻어진 혼합물은 수시간동안 실온에서 교반하여 페길화를 종결한다.
F. 조성물의 제조, 제형화 및 투여
변형된 히알루로난 분해효소, 예를 들면 변형된 가용성 히알루로니다제의 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 또한, 히알루로난 관련 질환 또는 상태에 연관된 질병 또는 장애를 치료하는데 사용된 제 2 작용제를 함유하는 약학적 조성물이 제공된다. 이러한 작용제로는 약물, 폴리펩티드, 핵산, 항체, 펩티드, 저분자, 유전자치료 벡터, 바이러스 및 다른 치료법를 포함하는 항암제를 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 변형된 가용성 히알루로니다제를 포함하는 변형된 히알루로난 분해효소는 이러한 제 2 작용제의 약학적 제형과 함께 공동-제형화 또는 공동-투여되어 과잉의 또는 축적된 히알루로난에 관련된 신체내에서 소망의 부위 또는 조직에의 전달을 향상시킨다. 예를 들면, 종양은 축적된 히알루로난을 수반한다. 이러한 과잉의 히알루로난은 유압전도도를 방해하는데 기여할 수 있다. 가용성 히알루로니다제, 특히 폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소의 도입은 이러한 조직내에 히알루로난의 축적을 방해하여 부위 또는 조직내에서 유압전도도를 향상시켜서 국소 또는 전신 전달에 의한 제 2 작용제 또는 작용제들의 전달에 민감한 부위 또는 조직을 제공한다. 예를 들면, 페길화 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 항암제를 함유하는 조성물과 함께 또는 별도로(간헐적으로, 동시에 또는 연속적으로) 종양에 투여하여 이러한 항종양제에 민감한 종양을 제공할 수 있는 rHuPH20 조성물이 본원에서 제공된다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 페길화 가용성 히알루로니다제의 조성물은 단독으로 투여하여 축적된 히알루로니다제 기질 발현에 따른 질환 또는 상태를 치료할 수 있다.
상기 화합물은 적절한 약학적 제제, 예컨대, 경구 투여를 위한, 용액, 현탁액, 정제, 분산정(dispersible tablets), 알약(pills), 캡슐, 분말, 지속방출 제형 또는 엘릭시르(elixirs) 뿐만 아니라, 경피전달 패치 제제 및 건조분말 흡입기로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 상기 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기법 및 절차를 이용하여 약학적 조성물로 제형화될 수 있다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조). 일반적으로, 제형화 방식은 투여 경로의 함수이다. 상기 조성물은 공동-제형화되거나, 별개의 조성물로써 제공될 수 있다.
일반적으로, 상기 조성물은 동결건조 또는 액체 형태로 제형화된다. 조성물이 동결건조된 형태로 제공되는 경우, 이들은 사용 직전에 적당한 완충액, 예를 들어 멸균 식염수에 재구성될 수 있다. 상기 조성물은 함께 또는 따로 제공될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 상기 조성물들은 일반적으로 별개로 제공된다. 히알루로난 분해효소, 예컨대, 가용성 히알루로니다제 및 제2 작용제를 함께, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여하기 위한 별개의 조성물로써 포장할 수 있다. 조합물은 키트로써 포장될 수 있다.
조성물은 근육내, 정맥내, 진피내, 병변내, 복강내 주사, 피하, 종양내, 경막외(epidural), 비강, 경구, 질, 직장, 국소(topical), 국부(local), 귀, 흡입, 구강(예컨대, 설하), 및 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함한, 당업자에게 알려진 임의의 경로로 투여하기 위하여 제형화될 수 있다. 투여는 치료 위치에 따라 국부, 국소 또는 전신일 수 있다. 치료가 필요한 지역에 국부투여는 예컨대, 수술중 국부주입, 국소적용, 예를 들어, 수술후 상처드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물내에 투여될 수 있다. 투여는 또한 제어방출 제형 및 방출조절 장치를 포함한, 예컨대 펌프에 의한, 제어방출 시스템을 포함할 수 있다.
임의의 주어진 경우의 가장 적절한 경로는 다양한 요인, 예컨대 질환의 성질, 질환의 진행, 질환의 중증도, 사용되는 특정 조성물에 좌우된다. 본원의 목적을 위하여, 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다제 및/또는 제2 작용제는 약학적으로 이용가능한 양 또는 수준이 혈장 내에 존재하도록 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 조성물은 예컨대 정맥내 투여를 통해 전신으로 투여될 수 있다. 일부 경우, 상기 조성물은 그것이 히알루로난이 축적된 피부 또는 조직의 간질에 도달하도록 투여된다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다제의 종양 간질로의 도입은 국소적으로 전달될 뿐만 아니라 전신으로 이용가능한 항암제의 전달을 향상시키며, 상기 항암제는, 간질 유체 압력이 감소되어, 확산 및/또는 연합 수송이 증가되는 때, 종양을 더 쉽게 관통할 수 있다. 따라서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대, 가용성 히알루로니다제 및 제2 작용제 또는 작용제들이 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다. 따라서, 한 예에서, 가용성 히알루로니다제는 축적된 히알루로난과 연합된 위치 또는 조직으로, 국소적으로, 예컨대, 종양내로 투여되고, 제2 작용제는 예컨대 정맥내 투여에 의하여 전신 투여된다. 다른 투여 방식이 또한 고려된다. 약학적 조성물은 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제형화될 수 있다.
투여 방법은 히알루로난 분해효소, 예컨대, 히알루로니다제 및 다른 분자의 분해적 과정, 예컨대 단백질분해적 소화, 및 항원성 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 개입에의 노출을 감소시키기 위하여 채택될 수 있다. 상기 방법의 예는 치료 부위에 국소 투여를 포함한다.
1. 제형화
약학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관에 대한 승인을 고려하여 제조된다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말 및 지속방출 제형을 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 가지는 좌약으로써 제형화될 수 있다. 경구제형은 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 및 다른 기타 제제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 투여방식에 적절해야 한다.
약학적 조성물은 효소 또는 활성화제와 같이 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 그러한 약학적 담체는 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 물 및 오일과 같은 무균액체일 수 있다. 물은 상기 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체담체로써 활용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 함께 다음을 함유할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 인산이칼슘, 또는 카르복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검(gums), 예컨대 검 아카시아젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 알려진 다른 그와 같은 결합제. 적절한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크(chalk), 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 소디움 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소디움 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 다른 그와 같은 제제를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 약학적 제제는 액체형태, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 그러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 현탁화제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가 식용지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수용성 비히클(예컨대, 아몬드유, 유성 에스테르 또는 분별(fractionated) 식물성 기름); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 또다른 예에서, 약학적 제제는 사용전 물 또는 다른 적절한 비히클과 재구성하기 위한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.
약학적 치료용 활성 화합물 및 그의 유도체는 일반적으로 단위 제형(unit dosage form) 또는 다중 제형(multiple dosage form)으로 제형화 및 투여된다. 각각의 단위 투여량은, 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 예정된 양의 치료용 활성 화합물을 포함한다. 단위 제형은 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구용 용액 또는 현탁액, 및 적당량의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 유도체를 포함하는 유수 에멀션을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단위 제형은 앰플 및 주사기 또는 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위 제형은 분획으로 또는 그의 복수로 투여될 수 있다. 다중 제형은, 분리된 단위 제형으로 투여될 단일 용기에 포장되어 있는 여러개의 동일한 단위 제형이다. 다중 제형의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병, 또는 파인트(pint) 또는 갤론(gallon) 의 병이 포함된다. 이에 따라, 다중 제형은 포장에서 분리되어 있지 않은 여러개의 단위 투여량이다. 일반적으로, 무독성 담체로 나머지를 채워, 0.005% 내지 100% 범위의 활성 성분을 포함하는 제형 또는 조성물이 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 각 투여 경로에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다.
a. 주사가능물질, 용액 및 에멀젼
일반적으로 주사를 특징으로 하는, 피하, 근육내, 종양내, 정맥내 또는 진피내(intradermally) 중 어느 하나의 비경구 투여가 본원에서 고려된다. 주사가능물질(injectables)은 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체내 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로써, 또는 에멀젼으로써 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤 또는 에탄올이다. 추가로, 원한다면, 투여되는 약학적 조성물은 또한 용매, 예컨대 pH 완충제, 금속이온염 또는 다른 그와 같은 완충액의 형태로 활성화제를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 또한 다른 소량의 비-독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해증진제, 및 다른 그와 같은 제제, 예컨대 소디움 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로 덱스트린을 함유할 수 있다. 일정수준의 복용량이 유지되는, 서방(slow-release) 또는 지속-방출(sustained-release) 시스템(예컨대, 미국특허번호 3,710,795 참조)의 이식이 또한 본원에서 고려된다. 상기 비경구 조성물에 함유된 활성 화합물의 백분률은 이들의 특정 성질뿐만 아니라 화합물의 활성 및 대상의 요구에 크게 좌우된다.
예를 들면, 본원에 제공된 변형된 가용성 히알루로니다제의 표준 가용화 제형은 EDTA, NaCl, CaCl2, 히스티딘, 락토오스, 알부민, 플루로닉(Pluronic)® F68, 트윈(TWEEN)® 및/또는 다른 계면활성제 또는 다른 유사한 작용제 중 어느 하나로 제형화된다. 예를 들면, 본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 pH 버퍼(예를 들면, 히스티딘, 포스페이트 또는 다른 버퍼) 또는 산성 버퍼(예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 피루베이트, Gly-HCl, 숙시네이트, 락테이트, 말레이트 또는 다른 버퍼), 탄성조절제(예를 들면, 아미노산, 폴리알콜, NaCl, 트레할로스, 다른 염 및/또는 당), 안정화제, 킬레이트제, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세테이트, 또는 칼슘 EDTA; 탈산소제, 예를 들면 메티오닌, 아스코르브산/아스코베이트, 시트르산/시트레이트 또는 알부민; 및/또는 방부제, 예를 들면 방향족 고리(예를 들면 페놀 또는 크레졸)을 함유하는 방부제 중 하나 이상을 함유한다. 히알루로난 분해효소를 함유하는 조성물에 유용한 안정화제로는 폴리소르베이트 등의 계면활성제 및 인간 혈청 알부민 등의 단백질을 포함한다. 본원에서 조성물에 사용할 수 있는 혈청 알부민의 농도로는 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL 또는 1 mg/mL를 포함하지만, 그 이상 또는 미만일 수 있다. 폴리소르베이트는, 예를 들면 약 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 00.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1%의 농도에서 상기 조성물에 존재할 수 있다. 칼슘 EDTA(CaEDTA) 등의 금속 킬레이트제는, 예를 들면 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 이상과 같은 대략 0.02M 내지 20mM의 농도로 존재할 수 있다. 상기 조성물의 pH 및 오스몰 농도는 당업자에 의해 조절하여 상기 조성물의 원하는 활성 및 안정성에 대한 조건을 최적화할 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공된 조성물은 약 또는 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 mOsm/kg 이상의 오스몰 농도 및 약 또는 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8의 pH를 갖는다.
일반적으로 NaCl은 본원의 제형에서, 예를 들면 약 또는 100 mM-150mM 이상인 양으로 제공된다. 예를 들면, 예시의 제형은 약 또는 10mM 히스티딘 및/또는 약 또는 130mM NaCl을 함유할 수 있다. 다른 제형은 부가적으로 또는 대안적으로 에락토오스를, 예를 들면 약 또는 13 mg/ml로 함유할 수 있다. 또한, 티오머살을 포함하나 이에 제한되지 않는 항균제 또는 항진균제가 제형에 존재할 수 있다. 제형은 알부민, Pluronic® F68, TWEEN® 및/또는 다른 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다. 제형은 약 또는 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 , 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH, 일반적으로 약 또는 6.5의 pH에서 제공된다. 본원에서 사용하는 변형된 가용성 히알루로니다제의 농축된 제형은 적정한 염농도를 유지하기 위해 투여전에 일반적으로 식염수 용액 또는 다른 염 버퍼용액에서 희석된다.
주사가능물질은 국소 및 전신투여를 위하여 설계된다. 본원의 목적을 위해, 국소투여는 히알루로난 축적 또는 과잉의, 병에 걸린 간질의 직접 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액; 주사정(hypodermic tablets)을 포함한, 사용직전 용매와 결합되도록 준비된 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조 분말; 주사용으로 준비된 멸균 현탁액; 사용직전에 비히클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품; 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산완충식염수(PBS), 및 가용화제와 증점제(thickening agents), 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한 용액을 포함한다.
비경구 제제에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충액, 항산화제, 국소마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제(sequestering agents) 또는 킬레이트제, 및 다른 약학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로즈 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로즈 및 락테이티드(Lactated) 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 채소 기원의 고정유(fixed oils), 면실유, 옥수수기름, 참기름 및 낙화생유를 포함한다. 항미생물제는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도로 복수-투여 용기로 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있고, 페놀 또는 크레솔, 수은제(mercurials), 벤질알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함한다. 등장화제는 염화나트륨 및 덱스트로즈를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨(sodium bisulfate)을 포함한다. 국소마취제는 염산프로카인을 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리솔베이트 80(TWEEN 80)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체는 또한 수-혼화성(water miscible) 비히클로 에틸알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과, pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.
정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리 식염수 또는 인산 완충 식염수 (PBS), 및 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 증점화제 및 가용화제, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
주사가 원하는 약리학적인 효과를 나타내는 유효량을 제공하도록 약학적으로 활성인 화합물의 농도가 조정된다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 변형된 가용성 히알루로니다제는 혈장에서 약 또는 3 U/mL 의 히알루로니다제를 유지하기에 충분한 양으로 제공된다. 정확한 투여량은 당업자에게 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 좌우된다. 단위-용량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기 내에 포장된다. 약리학적으로 활성인 화합물을 함유하는, 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는 치료할 질환과 포장을 위해 선택된 특정 제조품의 함수이다. 당업계에 알려지고 실행되는 바와 같이, 비경구 투여를 위한 모든 제제는 멸균되어야 한다.
b. 동결건조 분말
용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로써 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조 분말이 본원의 관심이 된다. 이들은 또한 고체 또는 겔로써 재구성되고 제형화될 수 있다.
멸균되고 동결건조된 분말은 완충용액 내에 가용성 히알루로니다제 및/또는 제2 작용제인 화합물을 용해시켜 조제될 수 있다. 완충용액은 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말로부터 조제된, 분말 또는 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 그다음 용액의 멸균여과후, 당업자에게 알려진 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 요약하면, 동결건조된 분말은 적절한 완충액, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 당업자에게 알려진 기타 상기 완충액에 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 또는 기타 적절한 제제를 용해시켜 조제된다. 그다음, 선택된 효소를 생성된 혼합물에 첨가하고, 용해될까지 교반한다. 생성된 혼합물을 멸균여과하거나, 미립자를 제거하고 무균성을 보장하기 위해 처리하여, 동결건조를 위한 바이알 내로 배분한다. 각각의 바이알은 화합물의 단일용량(1mg 내지 1g, 일반적으로 1 내지 100mg, 예를 들어 1 내지 5mg) 또는 복수용량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다.
완충용액과 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여로 사용하기 위한 제형을 제공한다. 정확한 양은 치료되는 적응증 및 선택된 화합물에 좌우된다. 상기 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
c. 국소투여
국소 혼합물은 상기 국소 및 전신투여를 위해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르(elixirs), 로션, 현탁액, 틴크제, 페이스트, 폼(foams), 에어로졸, 관주액(irrigations), 스프레이, 좌약, 붕대, 피부 패치 또는 국소투여에 적절한 임의의 다른 제형으로서 제형화된다.
화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체는 흡입과 같은, 국소적용을 위한 에어로졸로써 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 4,044,126; 4,414,209; 및 4,364,923 참조, 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달을 위한 에어로졸을 기술하고 있음). 기도(respiratory tract)로 투여를 위한 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액의 형태, 또는 흡입(insufflation)을 위한 초미립자(microfine) 분말로, 단독 또는 락토오스와 같은 불활성 담체와 조합될 수 있다. 그와 같은 경우에, 제형의 입자는 전형적으로 50 미크론 미만, 바람직하게는 10 미크론 미만의 직경일 것이다.
화합물은 국부(local) 또는 국소(topical) 적용을 위하여, 예컨대 피부 및 안내와 같은 점막으로의 국소적용을 위하여, 겔, 크림 및 로션의 형태로, 그리고 눈으로의 적용을 위하여, 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위하여 제형화될 수 있다. 경피전달용, 및 또한 눈 또는 점막 투여용, 또는 흡입요법용 국소투여가 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 비강용액이 또한 투여될 수 있다.
경피투여에 적절한 제형이 제공된다. 이들은 임의의 적절한 포맷, 예컨대 장기간의 시간 동안 수용자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 적응된 별개의 패치로써 제공될 수 있다. 상기 패치는 활성 화합물과 관련하여, 예를 들어 0.1 내지 0.2M 농도의 임의적으로 완충화된 수성용액 내에 활성 화합물을 함유한다. 경피투여에 적절한 제형은 또한 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Pharmaceutical Research 3(6),318(1986) 참조), 일반적으로 활성 화합물의 임의적으로 완충화된 수성용액의 형태를 취한다.
d. 다른 투여경로를 위한 조성물
치료되는 상태에 따라, 다른 투여경로, 예컨대 국소적용, 경피패치, 경구 및 직장투여가 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어 직장투여를 위한 약학적 제형(dosage forms)은 전신작용을 위한 직장좌제, 캡슐 및 정제이다. 직장좌제는 체온에서 녹거나 부드러워지면서 하나 이상의 약리학적 또는 치료적 활성성분을 방출하는, 직장내로 삽입을 위한 고체 바디(body)를 포함한다. 직장좌제에 이용되는 약학적으로 허용가능한 물질은 기제(bases) 또는 비히클 및 녹는점을 높이는 제제이다. 기제의 예는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, 카르보왁스(폴리옥시에틸렌 글리콜) 그리고 지방산의 모노-, 다이- 및 트리글리세리드의 적당한 혼합물을 포함한다. 다양한 기제의 조합물이 사용될 수 있다. 좌제의 녹는점을 높이는 제제는 경랍(spermaceti) 및 왁스를 포함한다. 직장좌제는 압축법 또는 몰딩 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 직장좌제의 일반적인 중량은 약 2 내지 3mg이다. 직장투여를 위한 정제 및 캡슐은 동일한 약학적으로 허용가능한 물질을 이용하여, 경구투여를 위한 제형화와 동일한 방법에 의해 제조된다.
직장투여에 적절한 제형은 단위 투여량 좌제로써 제공될 수 있다. 이들 제형은 활성 화합물을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
경구투여를 위하여, 약학적 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 결합제(예를 들어, 전젤라틴화된 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐 피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충진제(예를 들어, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자전분 또는 전분글리콘산나트륨); 또는 습윤제(예를 들어, 소디움 라우릴 술페이트)를 이용하여 통상적인 수단으로 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업자에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다.
구강(설하)투여에 적절한 제형은, 예를 들어 맛이 나는 기제, 보통 수크로스와 아카시아 또는 트래거캔스(tragacanth) 내에 활성 화합물을 함유한 로젠지(lozenges); 및 불활성 기제, 예컨대 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아 내에 화합물을 함유하는 캔디(pastilles)를 포함한다.
약학적 조성물은 또한 제어방출 제형 및/또는 전달장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어 미국특허번호 3,536,809; 3,598,123; 3,630,200; 3,845,770; 3,847,770; 3,916,899; 4,008,719; 4,687,610; 4,769,027; 5,059,595; 5,073,543; 5,120,548; 5,354,566; 5,591,767; 5,639,476; 5,674,533 및 5,733,566).
리포솜 내 캡슐화(encapsulation), 미립자, 미소캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스, 및 레트로바이러스 전달시스템과 같은 가용성 히알루로니다제 또는 다른 작용제를 코딩하는 핵산분자의 전달과 같은, 그러나 여기에 제한되지 않는, 다양한 전달시스템이 알려져 있으며, 선택된 조성물을 투여하는데 이용될 수 있다.
따라서, 어떤 구현예에서, 리포솜 및/또는 나노입자가 또한 본원의 조성물의 투여와 함께 이용될 수 있다. 리포솜은 수성 매질 내 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)(다층소포(MLV)로도 불림)를 형성한다. MLV 는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 가진다. MLV 의 초음파처리는 중심에 수성용액을 함유하는 200 내지 500옹스트롬 범위의 직경을 갖는 작은 단층소포(SUV) 형성을 유발한다.
인지질은, 물에 분산됐을 때, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포솜 외에 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서, 리포솜이 형성된다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온강도 및 이가(divalent) 양이온의 존재에 좌우된다. 리포솜은 이온 및 극성 물질에 낮은 투과성을 보일 수 있으나, 상승된 온도에서 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 알려진 가깝게 뭉쳐진 정돈된(ordered) 구조로부터 유체(fluid) 상태로 알려진 느슨하게 뭉쳐진 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특유의 상-전이 온도에서 일어나고, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성 증가를 유발한다.
리포솜은 상이한 기전들: 세망내피계(reticuloendothelial system)의 포식세포(phagocytic cells), 예를 들어 대식세포 및 호중구에 의한 엔도시토시스; 비특이적이고 약한 소수성 또는 정전기적 힘, 또는 세포-표면 성분과의 특이적인 상호작용 중 어느 하나에 의한 세포표면에 흡착; 세포질 내 리포솜 내용물의 동시 방출을 수반하는, 원형질막 내로 리포솜의 지질이중층 삽입에 의한 원형질막과의 융합; 및 리포솜 내용물의 연계없이, 리포솜 지질의 세포 또는 세포하(subcellular) 막으로 이동, 또는 그 반대에 의하여 세포와 상호작용한다. 리포솜 제형을 달리함으로써 작동하는 기전을 바꿀 수 있으나, 하나 초과가 동시에 작동할 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방법으로 화합물을 포집할 수 있다. 세포내 폴리머의 과부하(overloading)로 인한 부작용을 피하기 위하여, 상기 초미립자(약 0.1μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계되어야 한다. 본원의 용도로 상기 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려되며, 상기 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
2. 투여량 및 투여
활성 작용제, 예를 들면 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소 및/또는 제 2 작용제는 치료될 환자에 대한 바람직하지 않는 부작용 없이 치료적으로 유용한 효과를 발휘하는데 충분한 양으로 포함된다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 변형된 가용성 히알루로니다제는 혈장 중 적어도 또는 약 3U/mL, 일반적으로 3 U/mL- 12 U/mL 이상, 예를 들면 약 또는 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mL, 9 U/mL, 10 U/mL, 11 U/mL, 12 U/mL, 13 U/mL, 14 U/mL, 15 U/mL, 16 U/mL, 17 U/mL, 18 U/mL, 19 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL, 45 U/mL, 50 U/mL 이상의 수준을 유지하는데 충분한 양으로 전신투여용으로 제형화된다.
당업자는 혈액에서 적어도 3U/mL의 히알루로니다제를 유지하기 위해 변형된 히알루론 분해효소, 예를 들면 변형된 가용성 히알루로니다제의 양을 결정하는 것이다. 혈액에서 히알루로니다제의 수준은 충분한 양의 히알루로니다제가 혈액내에서 존재하는 것을 보장하기 위해 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 혈장중 히알루니다제를 측정하기 위해 당업자에게 공지된 분석이 실시될 수 있다. 예를 들면, 본원의 실시예내에서 기재된 미세탁도 분석 또는 효소 분석은 혈장내의 단백질에 대해 실시될 수 있다. 혈장은 정상적으로 히알루로니다제 효소를 함유하는 것으로 이해된다. 이러한 혈장 히알루로니다제 효소는 일반적으로 산성 pH에서 활성을 갖는다(미국특허 제7,105,330호). 따라서, 변형된 효소로의 치료전에, 히알루로니다제의 혈장 수준을 결정하여 기준으로 사용할 필요가 있다. 다음의 치료후 혈장 히알루로니다제 수준의 측정은 치료전 수준과 비교할 수 있다. 대안적으로, 분석은 혈장내에 리소좀 히알루로니다제 활성을 억제하는 pH 조건하에서 실시될 수 있고 이것은 산성 pH에서 활성을 정상적으로 나타낸다. 따라서, 변형된 가용성 히알루로니다제가 중성 pH(예를 들면, 인간 PH20)에서 활성인 경우, 변형된 중성-활성 가용성 히알루로니다제의 수준을 측정한다.
활성 작용제를 함유하는 조성물은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 치료적 유효한 농도는 공지된 시험관내 및 생체내 계에서 화합물을 시험함으로써, 예를 들면 본원에서 제공된 분석에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 조성물 중에 가용성 히알루로니다제 등의 히알루로난 분해효소 또는 제 2 작용제의 농도는 상기 복합체의 흡수, 불활성화 및 배출율, 복합체의 생리화학적 특성, 투여 스케쥴 및 투여량 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 인자에 따라 달라진다. 예를 들면, 정확한 투여량 및 치료기간은 치료될 조직의 함수이고 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽에 의해 또는 공지된 시험 프로토콜을 사용하여 경험적으로 측정될 수 있고 및/또는 특별한 작용제의 공지의 투약 요법로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 히알루로난 관련 질환 및 상태의 치료용 작용제 및 치료법, 예를 들면 항암제가 널리 당업계에 알려져 있다. 따라서 조성물 내의 제 2 작용제의 투여량은 지정된 투여경로 하에서 그 작용제에 대한 표준 투약요법에 기초하여 선택될 수 있다.
농도 및 투여량값은 치료될 개개인의 나이에 따라 변경시킬 수 있다는 것을 유의한다. 임의의 특별한 대상체에 대해, 특정 투약요법은 제형의 투여량을 투여 또는 관리하는 사람의 전문적인 판단 및 개개인의 필요에 따라서 시간 경과에 따라서 조절될 필요가 있고 본원에 기재된 농도 범위가 예시되어 있지만 그 범위로 한정되지 않는 것으로 이해될 수 있다. 상기 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매달, 매년 또는 1회 투여될 수 있다. 일반적으로 투약요법은 독성을 제한하도록 선택한다. 주치의는 골수, 간 또는 신장 또는 다른 조직 기능장애 때문에 투여량을 낮추기 위하여, 치료를 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 때를 알 것이다. 반면, 주치의는 임상 반응이 부적절하다면 더 높은 수준으로 치료를 조절하는 방법 및 때를 알수 있다(독성 부작용 제외).
질환 또는 상태, 예를 들면 히알루로난 관련 질환 또는 상태, 예를 들면 HA 풍부 종양을 치료하기 위한 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제의 투여량은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관내 분석 및 동물모델이 사용되어 최적의 투여량의 범위를 확인하는 것을 돕는다. 정확한 투여량은 경험적으로 결정될 수 있고, 특별한 효소, 투여경로, 치료될 질환 형태 및 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 투여량 범위는 폴리머에 접합된 가용성 히알로니다제의 약 또는 50 유닛 내지 50,000,000 유닛이거나 폴리머에 접합된 다른 히알루로난 분해효소와 기능적으로 동등한 양이다. 활성 유닛은 표준활성, 예를 들면 히알루로니다제 활성을 분석하는 미세탁도 분석에서 측정된 활성으로 정규화되는 것으로 이해된다.
폴리머에 접합된 가용성 히알루로니다제, 예를 들면 페길화 가용성 히알루로니다제는 이와같이 접합되지 않는 천연 가용성 히알루로니다제에 비해, 전체 단백질 1 mg 당 더 낮은 활성을 나타낼 수 있고, 즉 더 낮은 비활성도를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 예시의 rHuPH20 제제는 120,000유닛/mg의 비활성도를 나타내지만, rHuPH20의 페길화 형태는 30,000유닛/mg의 비활성도를 나타낸다. 일반적으로, rHuPH20의 페길화 형태는 약 또는 26,000 내지 약 또는 38,000U/mg의 범위내에서 비활성도를 나타낸다. 따라서, 활성의 동등 유닛을 달성하기 위해 더 많은 총단백질량이 필요하다. 예를 들면, 폴리머에 접합된 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 총단백질(mg)의 1.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상을 필요로 하고, 이와 같이 접합되지 않은, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제와 동일한 활성유닛을 달성할 수 있다. 그러나, 이와 같은 목적을 위해, 투여량은 유닛을 기초로 한다.
따라서, 예를 들면, 폴리머, 예를 들면 PEG에 접합된 본원에서 제공된 가용성 히알루로니다제는 약 또는 10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛, 10 내지 36,000,000 유닛, 10 내지 12,000,000 유닛, 10 내지 1,200,000 유닛, 10 내지 1,000,000 유닛, 10 내지 500,000 유닛, 100 내지 100,000 유닛, 500 내지 50,000 유닛, 1000 내지 10,000 유닛, 5000 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 내지 10,000 유닛으로 투여될 수 있다. 히알루로니다제가 아닌 히알루로난 분해효소가 폴리머에 접합된 예에서, 약 또는 10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛, 10 내지 36,000,000 유닛, 10 내지 12,000,000 유닛, 10 내지 1,200,000 유닛, 10 내지 1,000,000 유닛, 10 내지 500,000 유닛, 100 내지 100,000 유닛, 500 내지 50,000 유닛, 1000 내지 10,000 유닛, 5000 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 내지 10,000 유닛과 기능적으로 동등한 양으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 혈장내에서 적어도 3U/mL의 히알루로니다제를 유지하기 위해서 약 또는 0.02mg/kg(대상체 내의), 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg 이상이 투여된다. 일반적으로, 변형된 히알루로니다제의 비활성도가 약 또는 20,000 U/mg 내지 60,000 U/mg이고, 일반적으로 약 또는 35,000 U/mg, 60,000 U; 70,000 U; 80,000 U; 90,000 U; 100,000 U; 200,000 U; 300,000 U; 400,000 U; 500,000 U; 600,000 U; 700,000 U; 800,000 U; 900,000 U; 1,000,000 U; 1,500,000 U; 2,000,000 U; 2,500,000 U; 3,000,000 U; 3,500,000 U; 4,000,000 U 이상이 투여된다.
일반적으로, 본원에서 고려된 히알루로니다제의 주사 또는 주입 부피는 약 또는 0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml 이상이다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제는 약 또는 50 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 400 U/ml 또는 500 U/ml(기능적으로 동등한 양)에서 원액용액으로서 제공되거나 직접적으로 사용되거나 사용전에 유효한 농도로 희석하여 약 또는 1000 U/ml, 1500 유닛/ml, 2000 U/ml, 4000 U/ml 또는 5000 U/ml으로 농축된 형태로 제공될 수 있다. 투여된 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제의 부피는 필요로 되는 투여량의 함수이지만, 이용가능한 원액 제형인, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제의 농도에 따라서 변경될 수 있다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 약 50 mL 초과된 부피로 투여되지 않고 일반적으로 5-30 mL의 부피로 투여되고, 일반적으로 약 10mL 이하의 부피로 투여되는 것으로 생각된다. 주사기 펌프는 의사의 재량에 따라 더 큰 부피를 위하여 사용될 수 있다. 투여기간은 치료하는 의사에 따라 조절될 수 있다. 예를 들면, 주사기 펌프를 정맥내에 투여하는 경우, 주사기 펌프를 사용하여 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 20분, 25분, 30분 이상, 일반적으로 약 또는 15분의 시간 경과에 걸쳐 조성물을 투여한다. 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 액체 또는 동결건조된 제형으로서 제공될 수 있다. 동결건조된 제형은 더 많은 유닛양의 히알루로난 분해효소를 저장하는데에 이상적이다.
일례에서, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 상기 질환 또는 상태의 치료를 위하여 히알루로난 분해효소 및 제 2 작용제 또는 치료를 투여함으로써 병용 요법의 일부로서 투여된다. 일례에서, 히알루로난 분해효소 및 제 2 작용제 또는 치료는 공동 제형화되어 함께 투여될 수 있다. 다른 예에서, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 제 2 작용제 또는 치료제제와 연속적으로, 간헐적으로 또는 동시에 투여된다. 일반적으로, 히알루로난 분해효소를 제 2 작용제 또는 치료제제를 투여하기 전에 투여하여 히알루로난 분해효소가 대상체내의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 간질조직 공간, 세포외 기질, 종양 조직, 혈액 또는 다른 조직내에서 히알루론산을 분해시키도록 한다. 예를 들면, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다제는 제 2 작용제 제제 투여 0.5분 전, 1 분 전, 2 분 전, 3 분 전, 4 분 전, 5 분 전, 6 분 전, 7 분 전, 8 분 전, 9 분 전, 10 분 전, 20 분 전, 30 분 전, 1 시간 이상 전에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 히알루로난 분해효소는 제 2 작용제 제제와 함께 투여된다. 다업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 공동-투여의 바람직한 근접성은 특별한 조직 환경 및 치료될 특정 질환에서 작용제의 실효반감기에 상당한 부분 의존하고 적당한 모델, 예를 들면, 적당 동물 모델에서 시간을 변화시키면서 작용제의 투여효과를 시험함으로써 용이하게 최적화될 수 있다. 일부 상황에서, 히알루로난 분해효소, 예를 들면 히알루로니다제의 최적 투여시간은 60분을 초과할 것이다.
제 2 작용제 또는 작용제들 또는 치료 또는 치료들의 제제는 한번에 투여되거나 더 적은 용량을 수 회로 나누어 시간 간격을 두고 투여할 수 있다. 작용제/치료제제는 치료시간, 예를 들면 몇시간, 몇일, 몇주 또는 몇달의 과정에 걸쳐서 1회 이상 투여량으로 투여할 수 있다. 일부 경우에 연속 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여과정은 적응증 및 환자의 허용성에 따라서 다르다고 이해된다. 일반적으로, 본원에서 제 2 작용제/치료의 투약요법은 당업자에게 알려져 있다.
3. 병용요법
본원에 기재된 임의의 조성물 또는 조합물은, 다른 치료적 또는 약리학적 작용제, 또는 수술과 같은 치료, 예컨대, 히알루로난-관련 암을 치료하기 위한 작용제 또는 치료와 함께, 사전에, 그와 함께 간헐적으로, 또는 그에 이어 추가로 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다.
상기 작용제는 다른 생물제제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제, 혈관수축제 및 수술, 그리고 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질환 또는 상태의 치료를 위하여 이용가능한 상기 기타 작용제 및 치료는, 본원에 예시된 것들 모두를 포함하며, 당업자에게 알려져 있거나, 경험적으로 결정될 수 있다. 다른 예에서, 국소마취제, 예를 들어 리도카인이 통증경감을 제공하기 위해 투여될 수 있다. 일부 예에서, 마취제는 혈관수축제와 병용으로 제공되어 마취효과의 지속시간을 늘릴 수 있다.
따라서, 한 예에서, 본원에서 제공되는 조성물은 국소마취제와 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 마취제는 속효성 및 지속성 국소마취 약물제형을 포함한다. 속효성 국소마취제 약물제형은 식염수 또는 기타 적절한 주사 비히클에 용해된 리도카인 또는 관련된 국소마취제 약물을 포함한다. 일반적으로, 속효성 국소마취제를 가진 국소마취제는 약 20 내지 30분 지속된다. 마취제의 예로는, 암부카인; 아목세카인; 아밀로카인; 아프토카인; 알티카인; 베녹시네이트; 벤질알콜; 벤조카인; 베톡시카인; 비페나민; 부크리카인; 부메카인; 부피바카인; 부타카인; 부탐벤; 부타닐리카인; 카르비조카인; 클로로프로카인; 클리부카인; 클로다카인; 코카인; 덱시바카인; 디아모카인; 디부카인; 디클로닌; 엘루카인; 에티도카인; 유프로신; 펙시카인; 포모카인; 헵타카인; 헥실카인; 히드록시프로카인; 히드록시테트라카인; 이소부탐벤; 케토카인; 루시노카인; 리도카인; 메피바카인; 메프릴카인; 옥토카인; 오르토카인; 옥세타카인; 옥시부프로카인; 페나카인; 피놀카인; 피페로카인; 피리도카인; 폴리도카인; 프라모카인; 프릴로카인; 프로카인; 프로파노카인; 프로피노카인; 프로폭시카인; 프록시메타카인; 피로카인; 쿼터카인; 퀴니소카인; 리소카인; 로도카인; 로피바키인; 살리실 알콜; 수이카인; 테트라카인; 트라펜카인; 및 트리메카인과 같은 비-흡입 국소마취제 뿐만 아니라 알팍살론; 아몰라논; 에톡사드롤; 펜타닐; 케타민; 레복사드롤; 메티투랄; 메토헥시탈; 미다졸람; 미나솔론; 프로파니디드; 프로폭사트; 프라목신; 프로포폴; 레미펜타닐; 수페타닐; 틸레타민; 및 졸라민과 같은 다양한 다른 비-흡입 마취제를 포함한다. 상기 제형에서 유효량은 특정 환자, 치료되는 질환, 투여경로 및 기타 고려사항에 따라 달라질 것이다. 상기 용량은 경험적으로 결정될 수 있다.
국소마취제의 짧은 반감기 때문에, 상기 마취제를 혈관수축제와 함께 공동-투여하거나 공동-제형화하는 것이 종종 바람직하다. 혈관수축제의 예는 카테콜아민 및 카테콜아민 유도체를 포함한 알파 아드레날린성 수용체 작용제를 포함한다. 특정 예는 레보노르데프린, 에피네프린 및 노르에피네프린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 국소마취제 제형, 예컨대 리도카인은 저농도의 에피네프린 또는 또다른 아드레날린성 수용체 작용제, 예컨대 레보노르데프린을 함유하도록 제형화될 수 있다. 국소마취제를 아드레날린성 수용체 작용제와 병용하는 것은 약학적 제제에서 일반적이다(예컨대, 미국특허번호 7,261,889 및 5,976,556 참조). 혈관수축제는 국소마취제의 반감기를 증가시키기 위해 필수적이다. 혈관수축제, 예컨대 에피네프린은 주입된 조직에서 혈관의 알파 아드레날린성 수용체를 자극한다. 이는 조직에서 혈관수축 효과를 가진다. 혈관수축으로 국소마취제가 조직에 훨씬 더 오래 유지되고, 그 결과 마취제 작용 지속시간이 크게 증가된다.
일반적으로, 혈관수축제는 마취제와 병용으로 본원에서 사용된다. 마취제가 투여되어 마취의 연장을 초래하는 부근에서 혈관수축제가 혈관을 수축하도록 작용하는 한, 마취제 및 혈관수축제는 단일 약학적 조성물의 일부로써 또는 별개의 약학적 조성물의 일부로써 함께 투여될 수 있다. 하나의 예에서, 마취제 및 혈관수축제는 용액으로 함께 투여된다. 또한, 마취제 및 혈관수축제는 본원에서 제공되는 조성물과 함께 또는 별개로 제형화될 수 있다. 단일제형이 바람직하다. 마취제 및 혈관수축제는 주사, 침윤 또는 국소투여로, 예를 들어 겔 또는 페이스트의 일부로써 투여될 수 있다. 전형적으로, 마취제 및 혈관수축제는 마취되는 부위 내로 직접 주사, 예를 들어 피하투여로 투여된다. 상기 제형에서 유효량은 특정 환자, 치료되는 질환, 투여경로 및 기타 고려사항에 따라 달라질 것이다. 그러한 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 리도카인 양의 예는 약 또는 10mg 내지 1000mg, 100mg 내지 500mg, 200mg 내지 400mg, 20mg 내지 60mg, 또는 30mg 내지 50mg이다. 투여되는 리도카인의 투여량은 개체 및 투여경로에 따라 달라질 것이다. 에피네프린은, 예를 들어 10μg 내지 5mg, 50μg 내지 1mg, 50μg 내지 500μg, 50μg 내지 250μg, 100μg 내지 500μg, 200μg 내지 400μg, 1mg 내지 5mg 또는 2mg 내지 4mg와 같은 양으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 에피네프린은 1:100,000 내지 1:200,000 희석으로 리도카인과 병용될 수 있으며, 이는 마취제100ml이 에피네프린 0.5 내지 1mg을 함유함을 의미한다. 투여되는 부피는 치료되는 질환 및 투여경로에 따라 조정될 수 있다. 부피의 예는 마취제/혈관수축제 제형의 1 내지 100ml, 1 내지 50ml, 10 내지 50ml, 10 내지 30ml, 1 내지 20ml 또는 1 내지 10ml, 전형적으로 10 내지 50ml 을 포함한다. 상기 투여는 본원에서 제공되는 가용성 히알루로니다제 및 기타 작용제의 조성물의 투여 이후에, 동시에 또는 간헐적일 수 있다.
4. 포장 및 제조품
또한, 포장 재료, 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료에 유효한 약학적 조성물, 및 조성물 및 조합물이 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료에 사용되기 위한 것임을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품이 제공된다. 한 예에서, 약학적 조성물은 제2 작용제 또는 치료 없이 히알루로난-분해 효소를 포함한다. 다른 예에서, 제조품은 히알루로난-분해 효소와 제2 작용제 또는 작용제들 또는 치료 또는 치료들을 포함한다. 상기 예에서, 제2 작용제와 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 약학적 조성물은 제조품으로써 포장을 위하여 함께 또는 별도로 제공될 수 있다. 제조품의 예는 단일 챔버 및 이중 챔버 용기를 포함하는 용기이다. 용기는 튜브, 병 및 주사기를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 용기는 추가로 피하 투여용 바늘을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 본원에서 전체로 통합되는 미국특허번호 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,252 참조. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 병, 그리고 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료방식에 적절한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 상기 화합물 및 조성물 제형의 광범위한 집합체가 임의의 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 다양한 치료인 것으로 고려된다.
히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료에 유효한 조성물 (예컨대, 가용성 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소 및/또는 함께 또는 별개로 제공되는 제2 작용제 또는 치료를 포함하는 조성물(들))은 또한 키트로써 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기재된 약학적 조성물 및 투여용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 투여용 장치, 예컨대, 주사기, 흡입기, 복용컵, 점적기, 또는 도포용 도구와 함께 제공될 수 있다. 임의적으로, 키트는 투여량, 투약요법 및 투여방식에 대한 지침서를 포함한 적용 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 약학적 조성물 및 진단용품을 포함할 수 있다. 예들 들어, 상기 키트는 농도, 히알루로난의 양 또는 활성을 측정하기 위한 물품을 포함할 수 있다.
G. 활성, 생체이용율 및 약동학의 평가 방법
대상체가 히알루로난-관련 질환, 상태 또는 장애와 관련된 마커를 갖고 있으며 그러므로 본원에 제공된 방법을 사용한 치료에 대해 잘 듣는가를 평가하기 위해 검정이 사용될 수 있다. 이러한 검정은 히알루로난 양의 측정, 간질액 압력, 혈관 부피 및 물 함량의 측정을 포함할 수 있다. 또한, 검정은 가용성 히알루로니다제를 포함하는 히알루로난 분해 효소의 시험관내 및 생체내 활성, 뿐만 아니라 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 변형된 히알루로니다제의 존재 및/또는 부재하에 예를 들어, 화학요법제와 같은 다른 작용제의 시험관내 및 생체내 활성의 평가를 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정 중에서 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 PEG화된 히알루로난 분해 효소 (예를 들어, PEG화된 가용성 히알루로니다제)와 공동투여되는 작용제의 약동학 특성, 예를 들어 생체이용율 및 관용성을 평가하는 검정이 포함된다. 이러한 검정은 예를 들어, 치료를 위한 변형된 히알루로난 분해 효소 및 임의로 공동투여되는 작용제, 예컨대 화학요법제의 적절한 투여량 및 투여 빈도를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
1. 히알루로난 분해 효소의 활성의 평가를 위한 검정
히알루로난 분해 효소의 활성은 당분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제에 대한 USP XXII 검정은 효소를 30분 동안 37℃에서 HA와 반응시킨 후 남은 분해되지 않은 히알루론산 (또는 히알루로난) (HA) 기질의 양을 측정함으로써 활성을 간접적으로 결정한다 (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 미국 약전 협회(United States Pharmacopeia Convention, Inc), 미국 메릴랜드주 락빌 소재). 히알루로니다제 표준품 (USP) 또는 국가 의약품집 (NF) 표준 히알루로니다제 용액이 임의의 히알루로니다제의 활성 (단위)을 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 활성은 미세탁도 검정을 사용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물의 형성을 기초로 한다. 상기 활성은 히알루로니다제를 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산)와 설정된 기간 동안 (예를 들어, 10분) 인큐베이션한 후 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 침전시켜 측정된다. 생성된 시료의 탁도는 추가 현상 기간 후 640 nm에서 측정된다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다제 활성으로부터 생성된 탁도의 감소는 히알루로니다제 효소 활성의 척도이다. 다른 예에서, 히알루로니다제 활성은 히알루로니다제와의 인큐베이션 후 잔류 바이오티닐화된 히알루론산을 측정하는 마이크로타이터 검정을 이용하여 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269], 미국 특허 공개 제20050260186호 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리 카르복실기를 바이오티닐화시키고, 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 마이크로타이터 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 히알루로니다제와의 인큐베이션 후, 잔류 바이오티닐화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다제 반응을 이용하여 검출하고, 공지된 활성의 히알루로니다제 표준과의 반응 후 얻어지는 것과 비교한다. 히알루로니다제 활성을 측정하기 위한 다른 검정이 또한 당분야에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41]; [Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263] 참조).
산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제 (예를 들어, PEG화된 rHuPH20)의 능력을 또한 평가할 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 염료를 히알루로난 분해 효소와 함께 또는 없이 예컨대 피하로 또는 피부내로 누드 마우스의 각 측면 상의 가측 피부로 주사할 수 있다. 그 후, 염료 면적을 예컨대 마이크로캘리퍼스로 측정하여, 산포제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력을 결정한다 (예를 들어, 미국 공개 특허 제20060104968호 참조). 작용제의 약동학 및 약력학 특성에 대한 화학요법제와 같은 다른 작용제와 히알루로니다제와 같은 히알루로난 분해 효소의 공동투여의 효과는 또한 동물 모델 및/또는 인간 대상체를 사용하여, 예컨대 상기 논의되고 하기 실시예 1에 나타낸 바와 같은 임상 시험의 세팅에서 생체내에서 평가될 수 있다. 히알루로니다제가 아닌 히알루로난 분해 효소의 기능적 활성은 임의의 이들 검정을 이용하여 히알루로니다제와 비교될 수 있다. 이는 히알루로난 분해 효소의 기능적 등가량이 얼마인가를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 능력은 이를 트립판 블루와 함께 마우스의 가측 피부로 (예를 들어, 피하로 또는 피부내로) 주사하여 평가할 수 있고, 예를 들어 히알루로니다제 표준품 100 단위와 동일량의 확산을 달성하는데 필요한 양을 결정할 수 있다. 그러므로, 필요한 히알루로난 분해 효소의 양은 100 히알루로니다제 단위와 기능적으로 등가이다. 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제에 의한 치료전 및 치료후 유압 전도도 (K) (예컨대 종양에서)가 또한 변형된 히알루로난 분해 효소 제제의 활성을 평가하기 위해 측정될 수 있다.
상기 기재된 히알루로난-관련 질환 및 장애와 관련된 임의의 1종 이상의 마커, 또는 임의의 다른 관련된 마커 또는 표현형에 영향을 미치는 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제 (PEG화된 히알루로니다제 포함)의 능력은 임의의 하나 이상의 상기 기재된 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 수준 또는 함량, HALO의 형성 또는 크기, 간질액 압력, 물 함량 및/또는 혈관 부피를 감소시키는 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제의 능력은 임의의 하나 이상의 상기 검정을 이용하여 시험관내에서, 생체외에서 및/또는 생체내에서 평가될 수 있다. 한 예에서, 변형된 히알루로니다제를 종양을 갖는 대상체 또는 적절한 동물 모델에 투여하고, 히알루로난 수준, HALO의 형성 또는 크기, 간질액 압력, 물 함량 및/또는 혈관 부피에 대한 효과를 평가하고, 변형된 히알루로니다제가 투여되지 않은 대상체 또는 동물 모델과 비교할 수 있다. 몇몇 예에서, 변형된 히알루로니다제를 화학요법제와 같은 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다.
2. 약동학 및 관용성
약동학 및 관용성 연구는 동물 모델을 사용하여 수행될 수 있거나, 또는 화학요법제와 같은 작용제의 특성에 대한 변형된 히알루로니다제와 같은 변형된 히알루로난 분해 효소와의 공동투여의 효과를 평가하기 위해 환자에서 임상 연구 동안 수행될 수 있다. 동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 필리핀 원숭이 또는 히말라야 원숭이가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 약동학 및 관용성 연구는 건강한 동물을 사용하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 연구는 히알루로난에 의한 치료요법이 고려되는 질환의 동물 모델, 예컨대 임의의 히알루로난-관련 질환 및 장애를 갖는 동물 모델을 사용하여 수행된다.
약동학 특성, 예를 들어 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제와 함께 공동투여되는 화학요법제의 약동학 특성은 투여 후 최대 (피크) 화학요법제 농도 (Cmax), 피크 시간 (즉, 최대 화학요법제 농도가 발생한 시간; Tmax), 최소 화학요법제 농도 (즉, 화학요법제의 용량 사이의 최소 농도; Cmin), 소실 반감기 (T1/2) 및 곡선하면적 (즉, 시간 대 농도를 플롯팅하여 생성된 곡선하면적; AUC)과 같은 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다. 화학요법제가 피하로 투여되는 경우에, 화학요법제의 절대 생체이용율은 피하 전달 후 화학요법제의 곡선하면적 (AUCsc)을 정맥내 전달 후 화학요법제의 AUC (AUCiv)와 비교하여 결정된다. 절대 생체이용율 (F)은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다: F = ([AUC]sc × 용량sc) / ([AUC]iv × 용량iv). 피하 투여 후 혈장 중 화학요법제의 농도는 혈액 시료 중 화학요법제의 농도를 평가하기에 적합한 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
용량 중 공동투여되는 작용제, 예컨대 화학요법제 및/또는 변형된 히알루로난 분해 효소 (예를 들어, PEG화된 rHuPH20)의 증가하는 또는 감소하는 농도의 효과를 평가하기 위한 약동학 연구에서 일정 범위의 용량 및 투여의 상이한 투여 빈도가 투여될 수 있다. 피하로 투여되는 화학요법제의 약동학 특성, 예컨대 생체이용율은 또한 변형된 히알루로니다제의 공동투여와 함께 또는 공동투여 없이 평가될 수 있다. 예를 들어, 비글과 같은 개에게 하나 이상의 투여 경로를 사용하여 화학요법제를 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제와 조합하여 또는 단독으로 투여할 수 있다. 이러한 연구는 화학요법제의 약동학 특성, 예컨대 생체이용율에 대한 히알루로니다제와의 공동투여의 효과를 평가하기 위해 수행될 수 있다.
안전성 및 관용성을 평가하기 위한 연구는 또한 당분야에 공지되어 있고, 본원에서 사용될 수 있다. 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제의 공동투여와 함께 또는 공동투여 없이, 공동투여되는 화학요법제와 같은 작용제의 투여 후, 임의의 유해 반응의 발생을 모니터링할 수 있다. 유해 반응에는 주사 부위 반응, 예컨대 부종 또는 종창, 두통, 열, 피로, 오한, 홍조, 현기증, 두드러기, 천명 또는 가슴압박, 오심, 구토, 경직, 요통, 흉통, 근경련, 발작 또는 경련, 혈압의 변화 및 아나필락시성 또는 중증 과민성 반응이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 용량 중 화학요법제 및/또는 변형된 히알루로난 분해 효소 (예를 들어, 변형된 히알루로니다제)의 증가하는 또는 감소하는 농도의 효과를 평가하기 위한 안전성 및 관용성 연구에서 일정 범위의 용량 및 상이한 투여 빈도가 투여된다.
3. 동물 모델
화학요법제와 같은 다른 작용제의 공동투여와 함께 또는 공동투여 없이 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제의 투여의 생체내 효과를 평가하기 위해 히알루로난-관련 질환, 장애 또는 상태의 동물 모델이 사용될 수 있다. 적절한 동물 모델이 사용될 수 있는 히알루로난-관련 질환의 예로는 고형 종양, 예를 들어 후기 암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 상피내 암종 (ISC), 편평 세포 암종 (SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 다른 암이 포함된다. 또한, 히알루로난-관련 질환 및 장애의 예는 추간판 압력, 암 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 의해 유발된 부종이다.
동물 모델로는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 필리핀 원숭이 또는 히말라야 원숭이가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 면역결핍 마우스, 예컨대 누드 마우스 또는 SCID 마우스에게 히알루로난-관련 암으로부터의 종양 세포주를 이식하여, 상기 암의 동물 모델을 확립한다. 히알루로난-관련 암으로부터의 세포주의 예로는 PC3 전립선 암종 세포, BxPC-3 췌장 선암종 세포, MDA-MB-231 유방 암종 세포, MCF-7 유방 종양 세포, BT474 유방 종양 세포, Tramp C2 전립선 종양 세포 및 Mat-LyLu 전립선암 세포, 및 히알루로난 관련된, 예를 들어 상승된 수준의 히알루로난을 함유하는 본원에 기재된 다른 세포주가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 예를 들어 히알루로난 수준 또는 함량, HALO의 형성 또는 크기, 간질액 압력, 물 함량 및/또는 혈관 부피에 대한 효과를 평가하기 위해 변형된 히알루로니다제를 마우스에게 투여할 수 있다. 몇몇 예에서, 화학요법제를 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제와 공동투여하고, 예를 들어 약동학, 종양 크기 또는 이환율에 대한 효과를 평가한다.
H. 히알루로난-관련 상태, 질환 및 장애의 치료에서 히알루로난 분해 효소의 사용
본원에 기재된 방법은 히알루로난 분해 효소의 치료학적 사용을 위한 방법을 포함한다. 하기 기재된 치료학적 사용은 예시적이며, 본원에 기재된 방법의 적용을 제한하지 않는다.
제공된 방법은 히알루로난-풍부 암 및 히알루로난과 관련된 다른 질환, 예컨대 상승된 간질액 압력과 관련된 다른 질환, 예컨대 추간판 압력과 관련된 질환, 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 의해 유발된 부종 또는 다른 부종 및 다른 히알루로난 관련 질환 및 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 히알루로난-분해 효소의 사용 방법을 포함한다.
히알루로난-풍부 암에는 상승된 간질액 압력과 관련된 암, 고형 종양, 후기 암, 전이성 암, 미분화 암 (예컨대, 난소암, 상피내 암종 (ISC), 편평 세포 암종 (SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암, 뇌암 및 다른 암에 제한되지 않음)이 포함된다.
치료학적 사용은 조성물의 단독 투여, 또는 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 다른 치료 또는 작용제 (암 치료, 종양 부피의 감소, 화학요법 또는 다른 암 치료에 대한 증가된 민감성, 암 치료제 또는 다른 치료제의 생체이용율 또는 전달의 향상, 간질액 압력의 감소, 혈관 부피의 증가, 대상체의 조직 내의 물 함량의 감소, 및 다른 치료)와 조합된 투여를 포함한다.
상기 방법은 또한 치료를 위한 대상체의 선택, 예를 들어 대상체의 치료 전에, 예를 들어 대상체가 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 갖는가를 결정하기 위한 치료를 위한 대상체의 선택, 예를 들어 히알루로난 또는 관련 분자의 발현을 검정하기 위한 방법의 사용에 의한, 예를 들어 하기 실시예 3(a)에 기재된 방법의 사용에 의한, 예컨대 대조, 예컨대 대조 조직, 세포, 유체 또는 다른 시료, 예를 들어 정상적인 대상체 (예를 들어, 히알루로난-관련 질환을 갖지 않은 대상체)로부터의 조직, 세포, 유체, 낮은 수준의 히알루로난을 발현하는 것으로 공지된 시료 (예를 들어, 세포주), 예컨대 본원에 기재된 예시적 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양 (예를 들어, 실시예 17A 참조)과 비교하여 HA의 발현의 결정에 의한, 치료를 위한 대상체의 선택을 포함한다.
이 예에서, 하나 이상의 마커, 예를 들어 히알루로난 또는 HAS2의 발현을 대상체로부터의 시료에서 측정하고, 임의로 다른 시료 또는 표준과 비교한다. 측정 후, 질환 또는 상태가 히알루로난-관련 질환 또는 상태인가를 결정한다. 한 예에서, 상기 방법은 치료, 예를 들어 가용성 히알루로니다제-함유 조성물 단독의 투여 또는 하나 이상의 다른 치료와 조합된 투여를 추가로 포함한다. 상기 방법은 치료의 평가, 예컨대 대상체의 세포, 조직 또는 유체 중 히알루로난의 수준의 측정에 의한 치료의 평가를 추가로 포함한다.
1. 히알루로난-관련 상태 및 질환
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제, 예를 들어 가용성 히알루로니다제, 전형적으로 폴리머로의 접합에 의해 변형된 가용성 히알루로니다제 (예를 들어, 반감기를 증가시키기 위함)를 함유하는 조성물을 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 작용제와 조합하여 또는 이에 더하여 투여함으로써 히알루로난-관련 질환 및 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
히알루로난-관련 상태 및 질환은 히알루로난 수준이 원인, 결과로서 상승되거나 다르게는 질환 또는 상태에서 관찰되는 질환 및 상태이고, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제, 예를 들어 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물을 단독으로 또는 다른 치료 및/또는 작용제와 조합하여 또는 이에 더하여 투여함으로써 치료될 수 있다.
전형적으로, 히알루로난-관련 질환 및 상태는 대조, 예를 들어 다른 조직, 세포 또는 체액과 비교하여 조직, 세포 또는 체액 (예를 들어, 종양 조직 또는 종양-관련 조직, 혈액 또는 간질 공간)에서의 상승된 히알루로난 발현과 관련된다. 상승된 히알루론 발현은 정상적인 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 시험될 시료과 유사하나 상이한 대상체, 예컨대 정상적인 대상체 (즉, 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체, 또는 시험될 대상체가 갖는 유형의 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체), 예를 들어 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 또는 체액과 비교하여 상승될 수 있다. 상승된 히알루로난 발현은 유사한 질환 또는 상태를 갖고 있으나 그 질환이 중증은 아니고/거나, 히알루로난-관련이 아니거나, 또는 상대적으로 더 적은 히알루로난을 발현하여 더 적은 정도로 히알루로난-관련된 다른 대상체로부터의 유사한 조직과 비교하여 상승될 수 있다. 예를 들어, 치료될 대상체는 조직, 세포 또는 유체 내의 HA 양이 덜 중증인 암, 예컨대 조기 암, 분화 또는 다른 유형의 암을 갖는 대상체와 비교하여 상대적으로 상승된, 히알루로난-관련 암을 갖는 대상체일 수 있다. 다른 예에서, 세포, 조직 또는 유체는 공지된 양 또는 상대적 양의 HA를 갖는 대조 시료, 예컨대 유체, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료, 예컨대 상대적으로 낮은 수준의 HA를 발현하는 것으로 공지된 시료, 예를 들어 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA를 발현하는 본원에 기재된 예시적 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양 (예를 들어, 실시예 17A 참조)과 비교하여 상승된 수준의 히알루로난을 함유한다.
몇몇 경우에, 히알루로난-관련 질환 및 상태는 조직, 예컨대 종양 내의 증가된 간질액 압력, 감소된 혈관 부피 및/또는 증가된 물 함량과 관련된다. 한 예에서, 본원에 제공된 조성물 및 화합물에 의한 치료는 이들 증상 또는 질환 또는 상태와 관련된 다른 증상 중 하나 이상을 완화시키며, 예를 들어 시간이 지남에 따른 대상체의 생존 또는 삶의 질을 개선시키거나 종양 성장을 억제한다.
제공된 효소, 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예로는 히알루로난-풍부 암, 예를 들어 종양, 예를 들어 고형 종양, 예컨대 후기 암, 전이성 암, 미분화 암, 난소암, 상피내 암종 (ISC), 편평 세포 암종 (SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 다른 암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
또한, 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예는 상승된 간질액 압력과 관련된 질환, 예컨대 추간판 압력과 관련된 질환, 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 졸중, 뇌외상 또는 다른 손상에 의해 유발된 부종이다. 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예로는 암을 포함하는 조직 내의 상승된 간질액 압력, 감소된 혈관 부피 및/또는 증가된 물 함량, 추간판 압력 및 부종과 관련된 질환 및 상태가 포함된다. 한 예에서, 히알루로난-관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 조직 내의 증가된 간질액 압력 (IFP), 감소된 혈관 부피 및 증가된 물 함량 중 하나 이상의 완화, 감소 또는 이에 대한 다른 유익한 효과를 포함한다.
전형적으로, 히알루로난-관련 질환 또는 상태는 예를 들어, 병든 조직, 예를 들어 종양 내의 증가된 HA 발현과 관련된다. 한 예에서, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 매트릭스 영역)는 대상체의 조직, 예를 들어 병든 조직에서 형성된다. 다른 예에서, HALO의 존재는 대상체의 조직, 예를 들어 병든 조직으로부터의 세포의 시험관내 배양에서 검출된다.
한 예에서, 히알루로난-관련 상태, 질환 또는 장애는 조직 내의 증가된 간질액 압력, 감소된 혈관 부피 또는 증가된 물 함량과 관련된다. 한 예에서, 히알루로난-관련 상태, 질환 또는 장애의 치료는 조직 내의 증가된 간질액 압력 (IFP), 감소된 혈관 부피 및 증가된 물 함량 중 하나 이상의 완화, 감소 또는 이에 대한 다른 유익한 효과를 포함한다.
히알루로난-풍부 암을 포함한 암
히알루로난은 세포 운동성과 관련된 프로세스, 예를 들어 발달, 재생, 복구, 배아형성, 발생학적 발달, 창상 치유, 혈관형성 및 종양형성에서 역할을 한다 (문헌 [Toole 1991 Cell Biol. Extracell. Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, New York, 1384-1386]; [Bertrand et al. 1992 Int. J. Cancer 52:1-6]; [Knudson et al, 1993 FASEB J. 7:1233-1241]). 또한, 히알루로난 수준은 종양 공격성과 상관관계가 있고 (문헌 [Ozello et al. 1960 Cancer Res. 20:600-604]; [Takeuchi et al. 1976, Cancer Res. 36:2133-2139]; [Kimata et al. 1983 Cancer Res. 43:1347-1354]); 히알루로난은 여러 암 프로세스 (종양 성장, 생존, 전이 및 간질액 압력을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 촉진한다. 가용성 히알루로니다제를 함유하는 제공된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 히알루로난-관련 질환 및 상태의 예는 암, 특히 히알루로난-풍부 암, 예를 들어 상승된 간질액 압력과 관련된 히알루로난-풍부 암이다.
히알루로난-관련 암은 히알루로난-발현, 전형적으로 상승된 히알루로난 발현과 관련된 암이며, 히알루로난 발현은 예를 들어 치료 전에 하기 섹션에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
예를 들어, 히알루로난-풍부 암은 암 세포가 실시예 6A에 기재된 바와 같은 시험관내 입자 배제 검정에서 HALO를 생성하는 암, 히알루로난의 상승된 발현을 갖는 암 (종양으로부터의 섹션의 면역염색, 예를 들어 조직학적 염색에 의해 결정됨), 상승된 HAS2 (히알루로난 신타제 2)를 갖는 암, 히알루로니다제 (HYAL1)를 시험관내에서 생성하지 않는 암 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 효소적 검정을 사용하여 결정됨)일 수 있다. 히알루로난-풍부 암은 히알루로난 발현을 평가하기 위한 임의의 방법, 예를 들어 하기 섹션 3(a)에 제공된 바와 같은 검정, 및 단백질/mRNA 발현을 검정하기 위한 다른 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.
여러 히알루로난-풍부 암이 확인되었다. 몇몇 경우에, 히알루로난 발현은 불량한 예후, 예를 들어 감소된 생존율 및/또는 재발-없는 생존율, 전이, 혈관형성, 다른 조직/구역으로의 암 세포 침윤, 및 불량한 예후의 다른 표시자와 상관관계가 있다. 이러한 상관관계는 예를 들어, 히알루로난-풍부 종양, 예를 들어 난소암, SCC, ISC, 전립선암, 폐암, 예를 들어 비소세포 폐암 (NSCLC), 유방암, 결장암 및 췌장암에서 관찰되었다 (예를 들어, 문헌 [Maarit et al., Cancer Research, 60:150-155 (2000)]; [Karvinen et al., British Journal of Dermatology, 148:86-94 (2003)]; [Lipponen et al., Eur. Journal of Cancer, 849-856 (2001)]; [Pirinen et al., Int. J. Cancer: 95: 12-17 (2001)]; [Auvinen et al., American Journal of Pathology, 156(2):529-536 (2000)]; [Ropponen et al., Cancer Research, 58: 342-347 (1998)] 참조). 그러므로, 히알루로난-풍부 암은 암의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여에 의해 치료될 수 있다. 히알루로난-풍부 종양에는 전립선, 유방, 결장, 난소, 위, 두경부 및 다른 종양 및 암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 히알루로니다제는 종양에 주사되는 경우 직접적 항발암 효과를 갖는다. 히알루로니다제는 마우스로 이식된 종양의 성장을 방지하고 (문헌 [De Maeyer et al., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660]), 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다 (문헌 [Pawlowski et al. (1979) Int. J. Cancer 23:105-109]). 히알루로니다제는 뇌암 (신경교종)의 치료에서 단독 치료제로서 효과적이다 (제WO 198802261호).
그러므로, 암, 전형적으로 히알루로난-관련 암의 치료를 위한 히알루로난-분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다제를 함유하는 효소, 조성물 및 조합물이 제공된다.
2. 히알루로난-관련 질환 및 상태의 치료에서의 사용
히알루로난-관련 질환 및 상태의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 조성물의 단독 투여, 또는 히알루로난-관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 다른 치료 또는 작용제 (암 치료, 종양 부피의 감소, 화학요법 또는 다른 암 치료에 대한 증가된 민감성, 암 치료제 또는 다른 치료제의 생체이용율 또는 전달의 향상, 간질액 압력의 감소, 혈관 부피의 증가, 대상체의 조직 내의 물 함량의 감소, 및 다른 치료 포함)와 조합된 투여를 포함한다.
상기 방법은 또한 치료를 위한 대상체의 선택, 예를 들어 대상체의 치료 전에, 예를 들어 대상체가 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 갖는가를 결정하기 위한 치료를 위한 대상체의 선택, 예를 들어 히알루로난 또는 관련 분자의 발현을 검정하기 위한 방법의 사용에 의한, 예를 들어 하기 실시예 b에 기재된 방법의 사용에 의한 치료를 위한 대상체의 선택을 포함한다. 이 예에서, 하나 이상의 마커, 예를 들어 히알루로난 또는 HAS2의 발현을 대상체로부터의 시료에서 측정하고, 임의로 다른 시료 또는 표준과 비교한다. 측정 후, 질환 또는 상태가 히알루로난-관련 질환 또는 상태인가를 결정한다. 한 예에서, 상기 방법은 치료, 예를 들어 가용성 히알루로니다제-함유 조성물 단독의 투여 또는 하나 이상의 다른 치료와 조합된 투여를 추가로 포함한다.
특히, 가용성 히알루로니다제를 함유하는 조성물의 투여에 의해, 히알루로난-관련 질환 또는 장애, 예를 들어 히알루로난-관련 암을 갖는 대상체의 조직 내의 간질액 압력을 감소시키는 방법이 제공된다. 전형적으로, IFP의 감소는 예를 들어, 24, 48 또는 72시간 동안 지속된다. 또한, 조성물, 전형적으로 예를 들어 적어도 24, 48 또는 72 또는 그 이상의 시간 동안 혈관 부피의 지속된 감소를 위한 조성물의 투여에 의해 대상체의 조직 내의 혈관 부피를 증가시키는 방법이 제공된다. 또한, 조성물, 전형적으로 예를 들어 적어도 24, 48 또는 72 또는 그 이상의 시간 동안 효과가 지속되는 조성물을 사용하여, 대상체의 조직 내의 물 함량을 감소시키는 방법이 제공된다. 또한, 조성물, 예를 들어 대상체의 조직 내의 세포주위 매트릭스 HALO를 감소시키기 위한 조성물을 사용하여, 대상체에서 히알루로난 발현을 감소시키는 방법이 제공된다. 전형적으로, 상기 감소는 투여 후 예를 들어 적어도 24, 48 또는 72 또는 그 이상의 시간 동안 지속된다.
a. 히알루로난-관련 질환 마커의 검출 (치료를 위한 대상체의 선택 및 치료 효과의 평가)
상기 방법은 히알루로난 분해 효소에 의한 치료를 위한 대상체를 선택하는 단계 및 치료 효과, 예컨대 치료의 효능을 평가하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 대상체가 히알루로난-관련 질환을 갖고 있는가, 대상체가 히알루로난 분해 효소에 의한 치료에 반응할 가능성이 있는가, 및/또는 대상체로부터의 시료, 예컨대 조직, 세포 또는 유체가 상승된 히알루로난 발현을 함유하는가를 나타내는 임의의 표시를 포함하는, 히알루로난-관련 질환 마커를 검출하는 방법을 포함한다. 마커를 검출하기 위한 검정의 예는 하기 기재되어 있으며, 대상체로부터의 시료에서 HA 발현 및/또는 상대적 HA 발현을 측정하기 위한 검정, 대상체로부터의 시료에 대한 히알루로난-분해 효소의 효과를 분석하기 위한 검정, 및 특정 히알루로난-관련 질환/상태와 전형적으로 관련된 판독, 예컨대 낮은 히알루로니다제 발현 또는 활성, 높은 간질액 압력, 혈관 부피 및 물 함량을 측정하기 위한 검정이 포함된다. 일반적으로, 대상체로부터의 시료에서 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한, 또는 세포/조직에 대한 치료의 효과를 시험관내에서 평가하기 위한 임의의 공지된 검정이 사용될 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 치료를 위한 선택된 대상체는 질환 또는 상태를 갖지 않는 대상체와 비교하여, 또는 HA의 상승된, 비정상적인 또는 축적된 발현을 갖지 않는 정상적인 조직 또는 시료과 비교하여, 히알루로난의 상승된, 비정상적인 또는 축적된 발현을 갖는 대상체를 포함한다. 대상체로부터의 임의의 시료 또는 조직을 시험하고, 정상적인 시료 또는 조직과 비교할 수 있다. 히알루로난 수준은 임의의 공급원으로부터, 예컨대 조직 (예를 들어, 생검에 의한 조직), 종양, 세포로부터, 또는 혈액, 혈청, 뇨 또는 다른 체액으로부터 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 고형 종양 내의 HA 침착의 프로파일은 일반적으로 세포주위 또는 기질로서 분류되었다. HA의 상승된 혈장 수준은 빌름스 종양, 중피종 및 간 전이를 갖는 환자에서 가장 현저하게 관찰되었다. 그러므로, 질환 또는 상태에 따라, 상이한 시료를 히알루로난 수준에 대해 측정할 수 있다. 시료의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
히알루로니다제 기질 수준을 측정하는데 사용되는 검정은 질환 또는 상태의 함수이고, 특정 질환 또는 상태를 기초로 하여 선택될 수 있다. 당업자는 히알루로난을 검출하는 방법에 친숙하며, 상기 방법에는 하기 섹션 (i)에 기재된 바와 같은 면역조직화학 방법, ELISA 방법이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 마커를 검출하는 단계는 대상체를 치료하기 전에, 예를 들어 대상체가 히알루로난-분해 효소에 의한 치료에 잘 듣는 히알루로난-관련 상태 또는 질환을 갖는가를 결정하기 위해 수행된다. 이 예에서, 마커가 검출된 경우 (예를 들어, 환자로부터의 세포, 조직 또는 유체가 상승된 히알루로난 발현을 함유하거나 또는 히알루로난 분해 효소에 대해 반응성인 것으로 결정된 경우), 히알루로난-분해 효소를 대상체에게 투여하는 치료 단계가 수행된다. 한 예에서, 마커가 검출되지 않은 경우 (예를 들어, 환자로부터의 세포, 조직 또는 유체가 정상적인 또는 상승되지 않은 히알루로난 발현을 함유하거나 또는 히알루로난 분해 효소에 대해 반응성이 아닌 것으로 결정된 경우), 다른 치료 옵션이 선택될 수 있다.
다른 예에서, 마커를 검출하는 단계는 대상체의 치료 후 또는 대상체의 치료 과정 동안 (예를 들어, 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 가용성 변형된 히알루로니다제) (공동투여되는 작용제와 함께 또는 없이)에 의한 치료), 예를 들어 히알루로난 분해 효소에 의한 치료가 질환 또는 상태의 치료에 대한 효과를 갖는가를 결정하기 위해 수행된다. 이러한 한 예에서, 마커가 검출되지 않거나, 또는 치료전 양/수준과 비교하여 또는 다른 시료과 비교하여 감소된 양 또는 상대적 수준에서 검출되면, 치료를 계속하거나, 치료의 다른 순환을 수행하거나, 또는 다른 치료, 예컨대 조합 치료요법을 개시한다. 이러한 다른 예에서, 마커가 치료전 수준 또는 다른 시료과 동일한 수준에서 검출된 경우, 다른 치료 옵션을 선택할 수 있다.
i. 히알루로난-관련 질환 마커를 검출하기 위한 검정
히알루로난-관련 질환 및 상태의 마커를 검출하기 위한 검정은 대상체의 조직, 세포 및/또는 체액, 예를 들어 종양 내의 히알루로난 및/또는 히알루로니다제 발현의 양 (예를 들어, 상대적 양)을 측정하기 위한 검정을 포함한다. 이러한 검정 중에서 특히, HA 발현, 히알루로난 신타제 2 (HAS2) 발현, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 매트릭스 영역)의 존재, 및 히알루로난-분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 존재 (예를 들어, 대상체로부터의 시료 내)를 검출할 수 있는 검정이 포함된다.
단백질 및 핵산 수준을 검출하기 위한 검정은 당분야에 익히 공지되어 있고, 본원의 방법에서 히알루로난, 히알루로난 신타제 또는 다른 단백질 및/또는 핵산 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정에는 ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 및 유동세포계측법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상체로부터의 시료, 예컨대 조직 시료 (예를 들어, 환자 또는 동물 모델로부터의 종양의 생검, 기질 시료), 유체 (예를 들어, 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 다른 시료), 세포 또는 세포의 시료, 또는 추출물, 또는 다른 시료는 항-HA 항체로 염색될 수 있으며, 예를 들어 조직 또는 시료 내의 히알루로난의 존재 및 정도를 결정하기 위한 고정된 또는 동결된 조직 섹션의 조직학적 염색, 예컨대 면역조직화학 (IHC)(예를 들어, 실시예 8.B.2. 참조), 또는 면역형광 세포 염색, 풀-다운(pull-down) 검정 및 유동세포계측법을 사용하여, 항-HA 항체로 염색될 수 있다. 다른 예에서, 시료, 예를 들어 생검은 HA mRNA의 양을 평가하기 위해 RT-PCR에 의해 검정될 수 있다.
암 내의 히알루로난-발현을 검출하기 위한 공지된 방법에는 방광암을 갖는 대상체의 뇨 또는 방광 조직 추출물 내의 HA 수준을 측정하기 위한, 문헌 [Lokeshwar et al., Cancer Res. 57: 773-777 (1997)]에 기재된 ELISA-유사 검정이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 검정을 위해, 뇨 또는 추출물을 마이크로웰 플레이트 (표준으로서 사용된 제대 HA가 또한 코팅됨) 상에 코팅한 후, 본원에 기재된 바와 같은 표지된 (예를 들어, 바이오티닐화된) HA 결합 단백질과 함께 인큐베이션하고 (예를 들어, 16시간, 실온), 세척하고, 웰에 결합된 HA-결합 단백질을 아비딘-바이오틴 검출제 기질을 사용하여 정량한다. 이러한 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 한 예에서, HA-관련 방광암을 갖는 대상체로부터의 뇨는 정상적인 환자 (건강한 대상체 또는 다른 위-비뇨기 질환 또는 상태를 갖는 대상체)로부터의 뇨/추출물과 비교하여 2 내지 9배 상승된 HA 수준을 함유하였으며; 그러므로, 마커는 뇨 내의 HA 수준이 정상적인 대상체와 비교하여 상승된 경우, 예를 들어 정상적인 대상체와 비교하여 2배 또는 약 2배 내지 9배 또는 약 9배, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 상승으로 상승된 경우 검출될 것이다.
추가 예에서, 종양 세포 내의 시험관내 히알루로난 발현 및 생성은 임의의 한 상기 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 유사하게, 세포에 의한 시험관내, 생체외 또는 생체내 히알루로난 신타제 2 (HAS2) 생성 및/또는 발현은 또한 예를 들어, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 또는 유동세포계측법에 의해 검정될 수 있다.
다른 예에서, 대상체로부터의 시료, 예컨대 혈액 또는 혈장 내의 히알루로니다제 활성의 양은 예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 예컨대 탁도 검정에 의해 결정된다.
다른 예에서, 환자로부터의 세포 또는 다른 조직, 예를 들어 종양 세포를 단리하고, 예를 들어 치료에 반응한 세포 또는 조직, 예컨대 종양 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 측정하기 위한 클론원성 검정 또는 임의의 다른 검정을 사용하여 세포 또는 조직이 시험관내 히알루로난 분해 효소에 의한 처리에 대해 반응성인가를 결정하기 위한 연구에서 사용한다. 한 예에서, 하기 실시예 7D에 기재된 바와 같은 연구는 대상체로부터의 암 세포를 표면, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 단백질 혼합물, 예컨대 상표명 마트리겔(Matrigel)® (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 시판되는 혼합물 상에 시딩함으로써 사용한다. 이 예에서, 히알루로난-관련 마커는 히알루로난 분해 효소의 투여에 대한 상기 세포 또는 조직의 민감성이다. 이 예에서, 세포의 임의의 특성, 예컨대 증식, 성장 또는 생존이 히알루로난 분해 효소의 첨가에 의해 억제되거나 차단되는 경우, 대상체는 히알루로난 분해 효소 함유 조성물에 의한 치료에 잘 들을 수 있는 것으로 결정된다.
히알루로난 발현 수준을 결정하기 위한 검정 이외에, 치료를 위한 대상체를 선택하기 위해 및/또는 치료 효능 및/또는 지속시간을 평가하기 위해 다른 검정이 사용될 수 있다. 간질액 압력 (IFP)은 적절한 프로브 또는 기구를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 조직 또는 관심있는 다른 조직 내의 IFP를 측정하기 위해 변환기-장착된 카테터가 사용될 수 있다. 카테터를 수술용 바늘의 내부 구멍을 통해 통과시킨 다음, 이를 종양의 중심에 삽입한다. 카테터를 제자리에서 유지시키면서 바늘을 회수한다. 그 후, IFP (mmHg)를 적절한 데이터 획득 장치 (예를 들어, 실시예 6B, 문헌 [Ozerdem et al. (2005) Microvasc. Res. 70:116-120] 참조)를 사용하여 측정할 수 있다. IFP를 측정하기 위한 다른 방법에는 바늘-중-심지(wick-in-needle) 방법 (문헌 [Fadnes et al (1977) Microvasc. Res. 14:27-36])이 포함된다.
혈관 부피는 예를 들어, 하기 실시예 10에 기재된 바와 같은 초음파 영상화에 의해 측정될 수 있다. 이 방법은 검출되는 강한 초음파 반사율을 제공하는 과다에코 마이크로버블을 사용한다. 마이크로버블은 예컨대 정맥내로 대상체 또는 동물 모델에 주사되는 경우 그의 크기로 인해 혈관 공간 내에 포획된다. 조직 물 함량, 예컨대 종양 조직 물 함량을 평가하기 위한 검정은 또한 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 종양으로부터의 시료를 수확하고, 블럿팅하고, 중량측정하고, 동결건조 전에 순간 동결할 수 있다. 그 후, 물 중량을 조직 습윤 중량 대 건조 (즉, 동결건조된) 중량 비율로서 보고한다.
세포주위 매트릭스 (HALO)를 형성하는 종양 세포의 능력은 입자 배제 검정 (예를 들어, 실시예 6 참조)을 사용하여 시험관내에서 평가될 수 있다. 작은 입자 (포르말린-고정된 적혈구)를 예를 들어, 큰 응집 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸인 어그리칸(aggrecan)의 존재하에 종양 세포의 저밀도 배양물에 첨가할 수 있다. 입자가 침강한 후, 배양물을 400x 확대로 관찰하여, 임의의 HALO가 종양 세포에 의해 형성되었는가를 결정할 수 있다. 이는 입자가 배제된 세포 주변의 구역으로서 시각화될 수 있다.
ii. 대조 시료에 대해 상대적인 히알루로난-관련 마커의 검출
임의의 검출 방법을 위해, 마커의 검출이 전형적으로 판독이 대조 시료과 비교하여 상승되었는가 또는 감소되었는가를 결정하는 것을 포함하도록, 마커 (예를 들어, HA 발현, 히알루로난 분해 효소에 대한 반응성, HA-신타제 발현 또는 히알루로니다제 활성)를 전형적으로 대조 시료과 비교한다.
예를 들어, 대조 시료는 다른 조직, 세포 또는 체액, 예컨대 정상적인 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 시험될 시료과 유사하나 상이한 대상체, 예컨대 정상적인 대상체 (즉, 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체, 또는 시험될 대상체가 갖는 유형의 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체), 예를 들어 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 또는 체액, 또는 유사한 질환 또는 상태를 갖고 있으나 그 질환이 중증은 아니고/거나, 히알루로난-관련이 아니거나, 또는 상대적으로 더 적은 히알루로난을 발현하여 더 적은 정도로 히알루로난-관련된 다른 대상체로부터의 유사한 조직일 수 있다. 예를 들어, 시험될 세포, 조직 또는 유체가 암을 갖는 대상체인 경우, 이는 덜 중증인 암, 예컨대 조기 암, 분화 또는 다른 유형의 암을 갖는 대상체로부터의 조직, 세포 또는 유체와 비교될 수 있다. 다른 예에서, 대조 시료는 공지된 양 또는 상대적 양의 HA를 갖는 유체, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료, 예컨대 상대적으로 낮은 수준의 HA를 발현하는 것으로 공지된 시료, 예를 들어 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA를 발현하는 본원에 기재된 예시적 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양 (예를 들어, 실시예 17A 참조)이다.
HA의 특정 변화, 예를 들어 증가 또는 감소는 사용된 검정에 의존한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, ELISA에서, 단백질의 특정 파장에서의 흡광도 또는 양의 배가 증가 또는 감소 (예를 들어, 표준 곡선을 사용하여 결정됨)는 대조에 대해 상대적인 것으로 표시될 수 있다. PCR 검정, 예컨대 RT-PCR에서, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 표준을 사용하여 대조 발현 수준과 비교될 수 있다 (예를 들어, 배가 변화로서 표시됨).
예를 들어, 대상체로부터의 시료 내의 히알루로난의 양을 시험하는 경우, 마커의 검출은 대상체로부터의 시료 (예를 들어, 암성 세포, 조직 또는 유체) 내의 HA의 양이 대조 시료, 예컨대 이전 단락에 기재된 대조 시료과 비교하여 상승되었는가를 결정할 수 있다. 한 예에서, 암은 조직, 세포 또는 유체 내의 HA의 양이 대조 시료과 비교하여 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배 또는 그 이상, 또는 약 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 20배 또는 그 이상으로 상승된 경우 히알루로난-풍부 암인 것으로 결정되며, 여기서 대조 시료는 예를 들어 공지된 양 또는 상대적 양의 HA를 갖는 유체, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제제, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료, 예컨대 상대적으로 낮은 수준의 HA를 발현하는 것으로 공지된 시료, 예를 들어 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA를 발현하는 본원에 기재된 예시적 종양 세포주, 예를 들어 HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양 (예를 들어, 실시예 17A 참조)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본원의 목적을 위해, 히알루로난-풍부 종양을 갖는 환자는 히알루로니다제 단독에 의한 치료 또는 제2 작용제와 조합된 히알루로니다제에 의한 치료를 위해 선택될 수 있다. 이러한 예에서, 종양을 직접 생검하고, HA의 발현에 대해 염색할 수 있다. 다른 예에서, 특정 종양과 관련된 시료, 예컨대 혈액 또는 뇨 시료 또는 다른 체액 시료를 HA에 대해 검정할 수 있다. 검정의 유형은 종양-유형에 의존하여 달라질 것이나, HA를 검출하기 위해 하나 초과의 검정을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 특정 종양을 위한 이러한 검정에 대한 본원의 언급은 단지 예시를 위한 것이다. 예를 들어, 방광암의 경우, 뇨 시료가 표준 ELISA 절차에 의해 히알루로난에 대해 검정될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 정상적인 환자 대조로부터의 뇨와 비교하여 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상의 HA를 나타내는 대상체 (예를 들어, 문헌 [Lokeshwar et al. (2000) J. Urol., 163:348-56] 참조)가 선택될 수 있다. 다른 예에서, 종양 세포를 생검하고, 예컨대 면역조직화학에 의해 HA에 대해 염색할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Anttila et al. (2000) Cancer Research, 60:150-156]; [Karvinen et al. (2003) British J of Dermatology, 148:86-94]; [Lipponen et al. (2001) Euro J Can. 37: 849-856]; [Auvinen et al. (2000) American J of Pathology, 156:529] 참조). 일반적으로, 이러한 예에서, 임의의 암-세포 관련된 HA 신호가 관찰된 경우 종양 시료 또는 종양 세포는 HA에 대해 양성이라고 고려된다. 배경 염색을 위한 음성 대조로서, 모든 세포-관련 HA를 절단하기 위해, 세포를 히알루로니다제로 예비소화시킬 수 있다. 또한, 시료를 동일한 대상체로부터의 정상적인 세포 또는 조직과 비교할 수 있다. 또한, 이러한 방법에서, 세포-관련 히알루로난의 수준을 낮음, 중간 또는 높음으로서 점수화할 수 있다. 예를 들어, 종양 면적의 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상이 지속된 HA 신호를 나타낸 경우, HA 발현은 높음 또는 중간으로 고려된다. 전형적으로, 중간 내지 높은 HA를 갖는 대상체의 치료가 본원에서 고려된다.
b. 암 치료에서의 사용
상기 주목된 바와 같이, 히알루로난은 암과 관련된 프로세스에서 역할을 하고, 히알루로난 수준은 종양 공격성, 및 종양 공격성 및 불량한 예후에 대한 다양한 마커와 상관관계가 있다. 그러므로, 히알루로난 분해 효소, 및 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제를 함유하는 조성물 및 조합물에 의해 히알루로난-관련 암을 치료하는 방법이 제공된다. 암에는 히알루로난-풍부 암, 및 상승된 간질액 압력과 관련된 암이 포함된다.
히알루로난-관련 암은 히알루로난-발현, 전형적으로 상승된 히알루로난 발현과 관련된 암이다. 한 예에서, 히알루로난의 발현은 병들지 않은 조직, 세포, 기질, 혈장, 혈액, 또는 다른 시료, 또는 덜 중증인 암, 예를 들어 조기, 분화 또는 다른 유형의 암으로부터의 시료과 비교하여 암을 갖는 대상체, 예를 들어 상승된 발현을 갖는 대상체로부터의 시료, 예를 들어 세포 시료, 조직, 종양 기질, 혈장, 혈액 또는 다른 시료에서 상승된다. 히알루로난의 수준은 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, 예를 들어 상기 섹션 3(a)에 기재된 바와 같이 대상체를 치료하기 전에 폴리펩티드 또는 mRNA의 발현을 평가하기 위한 조직학적 또는 다른 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
한 예에서, 히알루로난 분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다제)는 전신으로, 예를 들어 정맥내로 (IV), 근육내로 또는 임의의 다른 전신 경로에 의해 투여된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해 효소 조성물은 국부적으로, 예를 들어 종양내로 투여된다.
치료 방법은 히알루로난 분해 효소의 반복된 투여, 예를 들어 1시간마다, 수시간마다, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다, 3일마다, 1주마다, 2주마다, 3주마다, 1개월마다 투여 또는 다른 반복된 투여를 포함하고, 또한 일정 기간에 걸친 연속적 투여 방법을 포함한다.
한 예에서, 히알루로난-관련 암의 치료는 히알루로난 의존적 방식으로 간질액 압력을 강하시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 정맥내 투여, 특히 변형된 가용성 히알루로니다제 (예를 들어, PEG화된 rHuPH20)의 투여는 히알루로난-풍부 (PC3)이나 히알루로난 결핍이 아닌 (NCI H460) 인간 암종 이종이식편 모델에서 상승된 간질액 압력을 감소시킨다 (하기 실시예 6 및 8 내지 9 참조). 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 간질액 압력은 히알루로난-풍부 동물 모델에서 종양 크기와 상관관계가 있다. 그러므로, 암을 치료하는 방법, 예를 들어 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제 (예를 들어, 전신 투여, 예를 들어 정맥내 투여에 의해), 전형적으로 폴리머-접합된 히알루로니다제를 투여하여, 이에 의해 히알루로난-관련 암을 갖는 대상체에서 상승된 간질액 압력을 감소시킴으로써 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제에 의한 치료는 또한 종양 내의 혈관 부피의 증가 및/또는 물 함량의 감소, 예를 들어 히알루로니다제의 정맥내 투여에 의한 종양 내의 혈관 부피의 증가 및/또는 물 함량의 감소를 포함할 수 있다.
히알루로난 분해 효소 단독, 예컨대 히알루로니다제 단독에 의한 질환의 치료 이외에, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 또한 히알루로난 분해 효소를 화학요법제 또는 다른 항암제 또는 항암치료와 조합하여, 예를 들어 동시에 또는 화학요법제 또는 다른 항암제 또는 항암치료 전에 투여함으로써 히알루로난-관련 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 전형적으로 화학요법제 또는 다른 항암제의 고형 종양으로의 침투를 향상시켜, 이에 의해 질환을 치료한다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 항암제와 함께 종양내로 또는 파종성 암의 경우 또는 종양에 도달하기 어려운 경우 정맥내로 주사될 수 있다.
항암제 및 다른 치료
항암제는 화학요법제, 항체, 펩티드, 또는 유전자 요법 벡터, 바이러스 또는 DNA일 수 있다. 또한, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 후천성 다제내성을 갖는 이전에 화학요법불응성인 종양에서 감작화를 위해 순환 풀로 종양 세포를 동원하는데 사용될 수 있다 (문헌 [St Croix et al., (1998) Cancer Lett September 131(1): 35-44]). 또한, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제, 예컨대, rHuPH20은 글리코사미노글리칸을 축적하는 종양으로의 생물학적 제제, 예컨대 모노클로날 항체, 사이토카인 및 다른 약물의 전달을 향상시킬 수 있다.
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 투여될 수 있는 항암제의 예로는 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알렘투주맙; 알리트레티노인 (9-시스-레티노산); 알로퓨리놀; 알트레타민; 알보시딥; 암바존; 암보마이신; 아메탄트론; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 아낙시론; 안시타빈; 안트라마이신; 아파지퀀; 아르기메스나; 삼산화비소; 아스파라기나제; 아스페를린; 아트리무스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바녹산트론; 바타불린; 바티마스타트; BCG 라이브; 베낙시빈; 벤다무스틴; 벤조데파; 벡사로텐; 베바시주맙; 비칼루타미드; 비에타세르핀; 비리코다르; 비산트렌; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신; 보르테조밉; 브레퀴나르; 브로피리민; 부도티탄; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카네르티닙; 카페시타빈; 카라세미드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르보퀀; 카르모푸르; 폴리페프로산과의 카르무스틴; 카르무스틴; 카루비신; 카르젤레신; 세데핑골; 셀레콕시브; 세마도틴; 클로람부실; 시오테로넬; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 클란페누르; 클로파라빈; 크리스나톨; 시클로포스파미드; 리포좀 시타라빈; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 리포좀 다우노루비신; 다우노루비신/다우노마이신; 다우노루비신; 데시타빈; 데니류킨 디프티톡스; 덱스니굴디핀; 덱소나플라틴; 덱스라족산; 데자구아닌; 디아지퀀; 디브로스피듐; 디에노게스트; 디날린; 디세르몰리드; 도세탁셀; 도페퀴다르; 독시플루리딘; 리포좀 독소루비신; 독소루비신 HCL; 독소루비신 HCL 리포좀 주사; 독소루비신; 드롤록시펜; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에코무스틴; 에다트렉세이트; 에도테카린; 에플로르니틴; 엘라크리다르; 엘리나피드; 엘리엇 B 용액; 엘사미트루신; 에미테푸르; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 엔자스타우린; 에피프로피딘; 에피루비신; 에포에틴 알파; 엡탈로프로스트; 에르불로졸; 에소루비신; 에스트라무스틴; 에타니다졸; 에토글루시드; 에토포시드 포스페이트; 에토포시드 VP-16; 에토포시드; 에토프린; 엑세메스탄; 엑시술린드; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 플록수리딘; 플루다라빈; 플루오로우라실; 5-플루오로우라실; 플루옥시메스테론; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신; 포트레타민; 풀베스트란트; 갈라루비신; 갈로시타빈; 겜시타빈; 겜투주맙/오조가미신; 게로퀴놀; 기마테칸; 기메라실; 글록사존; 글루포스파미드; 고세렐린 아세테이트; 히드록시우레아; 이브리투모맙/티욱세탄; 이다루비신; 이포스파미드; 일모포신; 일로마스타트; 이매티닙 메실레이트; 이멕손; 임프로술판; 인디술람; 인프로퀀; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파; 인터페론 베타; 인터페론 감마; 인터페론; 인터류킨-2 및 다른 인터류킨 (재조합 인터류킨 포함); 인토플리신; 이오벤구안 [131-I]; 이프로플라틴; 이리노테칸; 이르소글라딘; 익사베필론; 케토트렉세이트; L-알라노신; 란레오티드; 라파티닙; 레독산트론; 레트로졸; 류코보린; 류프롤리드; 류프로렐린 (류프로렐리드); 레바미솔; 렉사칼시톨; 리아로졸; 로바플라틴; 로메트렉솔; 로무스틴/CCNU; 로무스틴; 로나파르닙; 로속산트론; 루르토테칸; 마포스파미드; 만노술판; 마리마스타트; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민; 메클로레타민/질소 머스타드; 메게스트롤 아세테이트; 메게스트롤; 멜렌게스트롤; 멜팔란; 멜팔란/L-PAM; 메노가릴; 메피티오스탄; 머캅토퓨린; 6-머캅토퓨린; 메스나; 메테신드; 메토트렉세이트; 메톡살렌; 메토미데이트; 메토프린; 메투레데파; 미보플라틴; 미프록시펜; 미소니다졸; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토플락손; 미토길린; 미토구아존; 미토말신; 미토마이신 C; 미토마이신; 미토나피드; 미토퀴돈; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론; 미토졸로미드; 미보불린; 미조리빈; 모파로텐; 모피다몰; 무브리티닙; 미코페놀산; 난드롤론 펜프로피오네이트; 네다플라틴; 넬자라빈; 네모루비신; 니트라크린; 노코다졸; 노페투모맙; 노갈라마이신; 놀라트렉세드; 노르토픽산트론; 옥트레오티드; 오프렐베킨; 오르마플라틴; 오르타탁셀; 오테라실; 옥살리플라틴; 옥시수란; 옥소페나르신; 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파투빌론; 페가데마제; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; 펠데신; 펠리오마이신; 펠리트렉솔; 페메트렉세드; 펜타무스틴; 펜토스타틴; 페플로마이신; 페르포스파미드; 페리포신; 피코플라틴; 피나피드; 피포브로만; 피포술판; 피르페니돈; 피록산트론; 픽산트론; 플레비트렉세드; 플리카마이신 미트라마이신; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피머; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진; 프로파미딘; 프로스피듐; 퓨미테파; 퓨로마이신; 피라조푸린; 퀴나크린; 라니무스틴; 라스부리카제; 리보프린; 리트로술판; 리툭시맙; 로글레티미드; 로퀴니멕스; 루포크로모마이신; 사바루비신; 사핑골; 사르그라모스팀; 사트라플라틴; 세브리플라틴; 세무스틴; 심트라젠; 시조피란; 소부족산; 소라페닙; 스파르포세이트; 스파르포스산; 스파르소마이신; 스피로게르마늄; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스쿠알라민; 스트렙토니그린; 스트렙토바리신; 스트렙토조신; 수포스파미드; 술로페누르; 수니티닙 말레이트; 6-티오구아닌 (6-TG); 타세디날린; 탈크; 탈이소마이신; 탈리무스틴; 타목시펜; 타리퀴다르; 타우로무스틴; 테코갈란; 테가푸르; 텔록산트론; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드/VM-26; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아미프린; 티아조푸린; 틸로미솔; 틸로론; 팀코다르; 티모나시크; 티라파자민; 토픽산트론; 토포테칸; 토레미펜; 토시투모맙; 트라벡테딘 (엑테이나시딘 743); 트라스투주맙; 트레스톨론; 트레티노인/ATRA; 트리시리빈; 트릴로스탄; 트리메트렉세이트; 트리플라틴 테트라니트레이트; 트립토렐린; 트로포스파미드; 투불로졸; 우베니멕스; 우라실 머스타드; 우레데파; 발루비신; 발스포다르; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 비네피딘; 빈플루닌; 빈포르미드; 빈글리시네이트; 빈류시놀; 빈류로신; 비노렐빈; 빈로시딘; 빈트립톨; 빈졸리딘; 보로졸; 크산토마이신 A (구아메사이클린); 제니플라틴; 질라스코르브 [2-H]; 지노스타틴; 졸레드로네이트; 조루비신 및 조수퀴다르, 예를 들어:
알데스류킨 (예를 들어, 프로류킨(PROLEUKIN)®); 알렘투주맙 (예를 들어, 캠패스(CAMPATH)®); 알리트레티노인 (예를 들어, 판레틴(PANRETIN)®); 알로퓨리놀 (예를 들어, 질로프림(ZYLOPRIM)®); 알트레타민 (예를 들어, 헥살렌(HEXALEN)®); 아미포스틴 (예를 들어, 에티올(ETHYOL)®); 아나스트로졸 (예를 들어, 아리미덱스(ARIMIDEX)®); 삼산화비소 (예를 들어, 트리세녹스(TRISENOX)®); 아스파라기나제 (예를 들어, 엘스파르(ELSPAR)®); BCG 라이브 (예를 들어, 타이스(TICE)® BCG); 벡사로텐 (예를 들어, 타그레틴(TARGRETIN)®); 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®); 블레오마이신 (예를 들어, 블레녹산(BLENOXANE)®); 부술판 정맥내 (예를 들어, 부술펙스(BUSULFEX)®); 부술판 경구 (예를 들어, 밀레란(MYLERAN)®); 칼루스테론 (예를 들어, 메토사르브(METHOSARB)®); 카페시타빈 (예를 들어, 젤로다(XELODA)®); 카보플라틴 (예를 들어, 파라플라틴(PARAPLATIN)®); 카르무스틴 (예를 들어, BCNU®, BiCNU®); 폴리페프로산과의 카르무스틴 (예를 들어, 글리아델(GLIADEL)® 웨이퍼); 셀레콕시브 (예를 들어, 셀레브렉스(CELEBREX)®); 클로람부실 (예를 들어, 류케란(LEUKERAN)®); 시스플라틴 (예를 들어, 플라티놀(PLATINOL)®); 클라드리빈 (예를 들어, 류스타틴(LEUSTATIN)®, 2-CdA®); 시클로포스파미드 (예를 들어, 사이톡산(CYTOXAN)®, 네오사르(NEOSAR)®); 시타라빈 (예를 들어, 사이토사르-U(CYTOSAR-U)®); 리포좀 시타라빈 (예를 들어, 디포사이트(DepoCyt)®); 다카르바진 (예를 들어, DTIC-Dome): 닥티노마이신 (예를 들어, 코스메겐(COSMEGEN)®); 다르베포에틴 알파 (예를 들어, 아라네스프(ARANESP)®); 리포좀 다우노루비신 (예를 들어, 다누옥솜(DANUOXOME)®); 다우노루비신/다우노마이신 (예를 들어, 세루비딘(CERUBIDINE)®); 데니류킨 디프티톡스 (예를 들어, 온타크(ONTAK)®); 덱스라족산 (예를 들어, 지네카드(ZINECARD)®); 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레(TAXOTERE)®); 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 루벡스(RUBEX)®); 리포좀 독소루비신, 예를 들어 독소루비신 HCL 리포좀 주사 (예를 들어, 독실(DOXIL)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (예를 들어, 드로모스타놀론(DROMOSTANOLONE)® 및 마스터론(MASTERONE)® 주사); 엘리엇 B 용액 (예를 들어, 엘리엇 B 용액(Elliott's B Solution)®); 에피루비신 (예를 들어, 엘렌스(ELLENCE)®); 에포에틴 알파 (예를 들어, 에포겐(EPOGEN)®); 에스트라무스틴 (예를 들어, 엠사이트(EMCYT)®); 에토포시드 포스페이트 (예를 들어, 에토포포스(ETOPOPHOS)®); 에토포시드 VP-16 (예를 들어, 베페시드(VEPESID)®); 엑세메스탄 (예를 들어, 아로마신(AROMASIN)®); 필그라스팀 (예를 들어, 뉴포겐(NEUPOGEN)®); 플록수리딘 (예를 들어, 푸드르(FUDR)®); 플루다라빈 (예를 들어, 플루다라(FLUDARA)®); 플루오로우라실, 예를 들어 5-FU (예를 들어, 아드루실(ADRUCIL)®); 풀베스트란트 (예를 들어, 파슬로덱스(FASLODEX)®); 겜시타빈 (예를 들어, 젬자(GEMZAR)®); 겜투주맙/오조가미신 (예를 들어, 밀로타르그(MYLOTARG)®); 고세렐린 아세테이트 (예를 들어, 졸라덱스(ZOLADEX)®); 히드록시우레아 (예를 들어, 하이드레아(HYDREA)®); 이브리투모맙/티욱세탄 (예를 들어, 제발린(ZEVALIN)®); 이다루비신 (예를 들어, 이다마이신(IDAMYCIN)®); 이포스파미드 (예를 들어, 이펙스(IFEX)®); 이매티닙 메실레이트 (예를 들어, 글리벡(GLEEVEC)®); 인터페론 알파-2a (예를 들어, 로페론-A(ROFERON-A)®); 인터페론 알파-2b (예를 들어, 인트론 A(INTRON A)®); 이리노테칸 (예를 들어, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®); 레트로졸 (예를 들어, 페마라(FEMARA)®); 류코보린 (예를 들어, 웰코보린(WELLCOVORIN)®, 류코보린(LEUCOVORIN)®); 레바미솔 (예를 들어, 에르가미솔(ERGAMISOL)®); 로무스틴/CCNU (예를 들어, CeeBU®); 메클로레타민/질소 머스타드 (예를 들어, 머스타겐(MUSTARGEN)®); 메게스트롤 아세테이트 (예를 들어, 메가스(MEGACE)®); 멜팔란/L-PAM (예를 들어, 알케란(ALKERAN)®); 머캅토퓨린, 예를 들어 6-머캅토퓨린 (6-MP; 예를 들어 퓨리네톨(PURINETHOL)®); 메스나 (예를 들어, 메스넥스(MESNEX)®); 메토트렉세이트; 메톡살렌 (예를 들어, 우바덱스(UVADEX)®); 미토마이신 C (예를 들어, 뮤타마이신(MUTAMYCIN)®, 미토지트렉스(MITOZYTREX)®); 미토탄 (예를 들어, 리소드렌(LYSODREN)®); 미톡산트론 (예를 들어, 노반트론(NOVANTRONE)®); 난드롤론 펜프로피오네이트 (예를 들어, 듀라볼린-50(DURABOLIN-50)®); 노페투모맙 (예를 들어, 베르루마(VERLUMA)®); 오프렐베킨 (예를 들어, 뉴메가(NEUMEGA)®); 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®); 파클리탁셀 (예를 들어, 팍센(PAXENE)®, 탁솔(TAXOL)®); 파미드로네이트 (예를 들어, 아레디아(AREDIA)®); 페가데마제 (예를 들어, 아다겐(ADAGEN)®); 페가스파르가제 (예를 들어, 온카스파르(ONCASPAR)®); 페그필그라스팀 (예를 들어, 뉴라스타(NEULASTA)®); 펜토스타틴 (예를 들어, 니펜트(NIPENT)®); 피포브로만 (예를 들어, 베르사이트(VERCYTE)®); 플리카마이신/미트라마이신 (예를 들어, 미트라신(MITHRACIN)®); 포르피머 나트륨 (예를 들어, 포토프린(PHOTOFRIN)®); 프로카르바진 (예를 들어, 마튤란(MATULANE)®); 퀴나크린 (예를 들어, 아타브린(ATABRINE)®); 라스부리카제 (예를 들어, 엘리테크(ELITEK)®); 리툭시맙 (예를 들어, 리툭산(RITUXAN)®); 사르그라모스팀 (예를 들어, 프로카인(PROKINE)®); 스트렙토조신 (예를 들어, 자노사르(ZANOSAR)®); 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트(SUTENT)®); 탈크 (예를 들어, 스클레로솔(SCLEROSOL)®); 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)®); 테모졸로미드 (예를 들어, 테모다르(TEMODAR)®); 테니포시드/VM-26 (예를 들어, 부몬(VUMON)®); 테스토락톤 (예를 들어, 테슬락(TESLAC)®); 티오구아닌, 예를 들어 6-티오구아닌 (6-TG); 티오테파 (예를 들어, 티오플렉스(THIOPLEX)®); 토포테칸 (예를 들어, 하이캄틴(HYCAMTIN)®); 토레미펜 (예를 들어, 파레스톤(FARESTON)®); 토시투모맙 (예를 들어, 벡사르(BEXXAR)®); 트라스투주맙 (예를 들어, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®); 트레티노인/ATRA (예를 들어, 베사노이드(VESANOID)®); 우라실 머스타드; 발루비신 (예를 들어, 발스타르(VALSTAR)®); 빈블라스틴 (예를 들어, 벨반(VELBAN)®); 빈크리스틴 (예를 들어, 온코빈(ONCOVIN)®); 비노렐빈 (예를 들어, 나벨빈(NAVELBINE)®); 및 졸레드로네이트 (예를 들어, 조메타(ZOMETA)®)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
한 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다제, 예를 들어 PEG화된 rHuPH20은 도세탁셀 (예를 들어, 탁소테레®), 리포좀 독소루비신 (예를 들어, 독실®), 수니티닙 말레이트 (예를 들어, 수텐트®) 또는 베바시주맙 (아바스틴®) 중 하나 이상의 투여후, 투여와 동시에 또는 투여전 대상체에게 투여된다.
히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 또한 통상적인 화학요법에 대해 내성인 종양의 민감성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제, 예컨대 rHuPH20은 종양 부위 주변으로 확산을 증가시키고/거나 (예를 들어, 종양 부위 내 및 주변의 화학요법제의 순환 및/또는 농축을 용이하게 하고/거나), 종양 세포 운동성을 예컨대 히알루론산 분해에 의해 억제시키고/거나, 종양 세포 자멸(apoptosis) 역치를 저하시키는데 효과적인 양으로 HYAL1 결핍과 관련된 종양을 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 이는 종양 세포(들)를 아노이키스(anoikis) 상태로 만들 수 있으며, 이는 종양 세포를 화학요법제의 작용에 대해 더 감수성으로 만든다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여는 췌장, 위, 결장, 난소 및 유방의 기존 화학요법-내성 종양의 반응성을 유도할 수 있다 (문헌 [Baumgartner et al. (1988) Reg. Cancer Treat. 1:55-58]; [Zanker et al. (1986) Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 27:390]).
한 예에서, 히알루로난 분해 효소, 특히 히알루로니다제는 전이성 및 비전이성 암, 예를 들어 비암성 세포에 비해 상대적으로 감소된 내인성 히알루로니다제 활성을 갖는 암의 치료에서 사용된다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 화학요법제로서 단독으로 또는 다른 화학요법제와 조합되어 사용될 수 있다. 암의 예로는 소세포 폐 암종, 편평 세포 폐 암종, 및 유방, 난소, 두경부의 암, 또는 히알루로니다제 활성의 감소된 수준 또는 감소된 히알루론산 이화작용과 관련된 임의의 다른 암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
c. 상승된 간질액 압력과 관련된 다른 질환의 치료에서의 사용
제공된 조성물 및 방법은 또한 높은 간질액 압력과 관련된 다른 히알루로난-관련 질환 (추간판 압력 및 부종, 예를 들어 장기 이식, 졸중, 뇌외상 또는 본원에 기재된 다른 상태에 의해 유발된 부종을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
3. 산포제로서의 사용
한 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rHuPH20은 임의의 다양한 포유동물 조직으로의 작용제(들) 및/또는 분자의 생체내 전달을 촉진하거나 향상시킴으로써 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 치료하기 위해 투여된다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 확산을 용이하게 하며, 그러므로 작은 분자 약리학제 뿐만 아니라 더 큰 분자 약리학제, 예컨대 단백질, 핵산 및 리보핵산, 및 구성성분들 (핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 지질-기재 분자 및 약물을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 조합물을 함유할 수 있는 거대분자 조성물의 전달을 촉진하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분자 및 거대분자 복합체 (직경이 약 10 nm 내지 약 500 nm 범위임)는 간질 공간이 히알루로니다제에 이전에 노출되었거나 또는 동시에 노출되는 경우 간질 공간을 통한 전달의 극적 개선을 나타낼 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 제10/795,095호, 제11/065,716호 및 제11/238,171호 참조).
히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 투여와 함께 또는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제의 투여후 투여될 수 있는 작용제, 치료제, 치료 및 미용제, 분자 및 치료의 예로는 마취제; 항대사물질, 항신생물제, 화학요법제, 및 다른 항암제 및 항암 치료; 항바이러스제; 항감염제, 예를 들어 항박테리아제 및 다른 항생제, 항진균제 및 다른 항감염제; 면역조정제; 스테로이드계 및 비스테로이드계 소염제; 베타 차단제; 교감신경흥분제; 듀코사노이드(ducosanoid), 프로스타글란딘 및 프로스타글란딘 유사체; 동공축소제, 콜린효능제 및 항콜린에스테라제; 항알레르기제 및 충혈완화제; 호르몬제; 성장 인자; 면역억제제; 백신 및 톡소이드; 면역 혈청; 항체; 진통제, 소염제, 항미생물제, 살아메바제, 살트리코모나스제, 파킨슨병 치료제, 항말라리아제, 항경련제, 항우울제, 항관절염제, 항진균제, 항고혈압제, 해열제, 항기생충제, 항히스타민제, 알파-아드레날린성 효능제, 알파 차단제, 마취제, 기관지확장제, 살생제, 살균제, 정균제, 베타 아드레날린성 차단제, 칼슘 채널 차단제, 심혈관 약물, 피임약, 미용제 또는 에스테틱제, 충혈완화제, 이뇨제, 우울제, 진단제, 전해질제, 수면제, 호르몬제, 고혈당제, 근육 이완제, 근육 수축제, 안과용제, 부교감신경흥분제, 정신 자극제, 진정제, 수면유도제, 교감신경흥분제, 신경안정제, 비뇨기제, 질제, 살바이러스제, 비타민제, 비스테로이드계 소염제 및 안지오텐신 전환 효소 억제제 및 이들의 조합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
4. 피하주입에서의 사용
피부의 피하조직으로의 유체 및 전해질의 주입인 피하주입은 경증 내지 중간 탈수 성인 환자, 특히 노인에게 적합한 유용하고 간단한 수분공급 기술이다. 안전하고 효과적인 것으로 고려되나, 가장 빈번한 유해 효과는 국부 마사지 또는 전신 이뇨제에 의해 치료될 수 있는 경증 피하 부종이다. 대략 3 L를 24-시간 기간 내에 2개의 별개 부위에서 제공할 수 있다. 보통의 주입 부위에는 가슴, 복부, 대퇴부 및 상완이 포함된다. 피하주입에서 사용되는 용액에는 예를 들어, 생리식염수, 1/2-생리식염수, 염수와 글루코스 및 5% 글루코스가 포함된다. 염화칼륨이 또한 용액에 첨가될 수 있다. 하나 이상의 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 용액으로의 첨가는 유체 흡수를 향상시키고 전체 투여 속도를 증가시킬 수 있다. 그러므로, 제공된 조성물 및 방법이 대상체에게 투여에 의해 피하주입 치료에 사용될 수 있다.
5. 유리체절제술 및 안과 장애 및 상태에 대한 적용
히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다제를 함유하는 제공된 조성물은 유리체절제술 동안 망막의 박리 또는 열상을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 열상은 예를 들어, 유리체의 제거전 유리체가 망막으로부터 분리되거나 해리되도록 야기할 수 있다. 유리체의 이러한 해리 또는 분리는 유리체가 제거될 때 망막의 추가 열상 또는 박리가 일어날 가능성을 최소화할 수 있다.
제공된 히알루로난 분해 효소 조성물, 예를 들어 히알루로니다제 조성물 및 방법은 다양한 안과 적용, 예를 들어 미국 특허 제5,292,509호에 기재된 유리체절제술 보조 적용을 위해 사용될 수 있다. 고도로 정제된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제, 예컨대, 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고 정제된 rHuPH20의 사용은 안구내 절차에서 면역원성 및 독성을 최소화하기에 바람직하다. 몇몇 예에서, PEG화된 히알루로니다제는 유리체 내의 체류를 연장시키고 국부화된 흡수를 방지하기 위해 사용될 수 있다.
히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제, 예를 들어 가용성 히알루로니다제를 함유하는 제공된 조성물은 예를 들어, 혈관신생을 예방하고 망막에 대해 독성인 물질의 유리체로부터의 청소율을 증가시킴으로써 안과 장애를 치료하고/거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 눈에 독성 손상을 유발하지 않으면서 눈의 유리액을 액화시키는데 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 유리액의 액화는 유리체방으로부터의 액체 교환 속도를 증가시킨다. 이러한 교환 증가는 그 존재가 안과적 및 망막 손상을 유발할 수 있는 오염 물질을 제거한다.
제공된 히알루로난 분해 효소 조성물, 예를 들어 히알루로니다제 조성물 및 방법은 또한 수술후 압력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 히알루론산은 백내장 및 안구내 렌즈 외과적 처치 동안 주로 스페이서로서 눈에서 사용되어 왔다. 또한, 이는 다른 안구 외과적 처치, 예컨대 녹내장, 유리체 및 망막 수술 및 각막 이식에서 사용된다. 수술후 백내장 환자에서 발생하는 흔한 부작용은 안압의 유의한 조기 (및 가끔) 연장된 상승이다. 이러한 상태는 때로는 심각하며, 특히 녹내장성 시신경 유두 변화를 갖는 환자에서 심각하다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 수술후 안압을 감소시키기 위해 수술 전에 히알루론산과 함께 눈에 공동투여될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다제는 수술 동안 히알루론산의 유효성을 감소시키기 않고 환자에서 부작용을 발생시키지 않으면서 히알루론산을 분해시킴으로써 안압을 수술전 수준으로 감소시키기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다 (미국 특허 제6,745,776호).
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 또한 윤상 섬유주로부터 글리코사미노글리칸을 제거하고 안압을 감소시키기 위해 녹내장을 갖는 환자에게 투여될 수 있고, 당뇨성 망막병증, 망막 혈관신생, 망막 정맥 폐색, 후유리체 박리, 망막 열상 및 안구 외상과 같은 상태와 관련되어 발생할 수 있는 유리체 출혈 (즉, 유리체로의 혈액의 혈관외유출)의 용해를 촉진하기 위해 유리체에 적용될 수 있다. 전형적으로 느리게 용해하는 유리체 출혈의 존재는 진단 절차 및/또는 치료 절차를 위해 유리체를 통해 망막을 시각화하는 것을 필요로 하는 절차 (예컨대, 종종 증식성 당뇨성 망막병증과 같은 상태를 위한 일차 치료인 레이져 광응고 (이에 제한되지 않음))를 지연시키거나 복잡하게 하거나 방해할 수 있다.
6. 유전자 요법 적용
대부분의 유전자 전달 비히클의 생체내 효능은 시험관내에서 관찰된 발견된 효능에 상응하지 않는다. 글리코사미노글리칸은 많은 세포 유형으로의 DNA 및 바이러스 벡터의 전이 및 확산을 방해할 수 있다. 이러한 세포외 매트릭스 물질의 수준은 프로세스를 상당히 방해할 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여는 세포외 매트릭스 내의 채널을 개방시키며, 그러므로 유전자 요법의 전달을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 DNA의 생체내 형질도입을 용이하게 하기 위해 콜라게나제와 함께 투여될 수 있다 (문헌 [Dubinsky et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81(23):7529-33]). 또한, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 아데노-관련 바이러스를 사용하는 유전자 요법을 향상시킬 수 있다 (문헌 [Favre et al, (2000) Gene Therapy 7(16):1417-20]). 예를 들어, 히알루로니다제의 투여 후 개방된 채널은 전형적으로 더 작은 분자, 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 DNA 복합체 (뿐만 아니라 관심있는 다른 치료제 및 약리학제)의 확산을 향상시키는 크기를 갖는다. 그러나, 구멍은 세포의 전위 및 이동을 촉진할 만큼 크지 않다.
몇몇 예에서, 바이러스는 표적 조직 내에서 그의 복제 및 산포를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제를 발현하도록 조작될 수 있다. 표적 조직은 예를 들어, 암성 조직일 수 있으며, 이에 의해 바이러스는 종양 내에서 선택적으로 복제할 수 있다. 바이러스는 또한 비용균 바이러스일 수 있으며, 여기서 바이러스는 조직 특이적 프로모터 하에 선택적으로 복제한다. 바이러스가 복제할 때, 바이러스 유전자와 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 공동발현은 생체내에서 바이러스의 산포를 용이하게 할 수 있다.
7. 미용적 적용
히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 셀룰라이트의 축적에 관여되는 글리코사미노글리칸을 제거하고 림프 흐름을 촉진하기 위해 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 인간 히알루로니다제, 예컨대 rHuPH20은 셀룰라이트의 치료에서 사용된다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 글리코사미노글리칸의 끊임없는 분해를 촉진하고 그의 복귀를 방지하기 위해 반복된 피하 주사를 통해, 연고 또는 크림 형태로 경피 전달을 통해, 또는 주사가능한 서방형 제형의 사용을 통해 투여될 수 있다.
히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 또한 "돼지피부" 부종 또는 "오렌지 껍질" 부종과 같은 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는, 진피에 축적할 수 있고, 결합된 물의 체류 및 대사 노폐물을 제거하는 유기 액체의 확산의 모세관 압축에 의한 지체의 원인인 장쇄 무코다당류의 해중합을 수행할 수 있다. 지방세포의 지방 과부하와 관련된 물 및 노폐물의 이러한 체류는 전형적 "돼지피부" 부종 또는 "오렌지 껍질" 부종을 구성한다. 해중합은 무코다당류의 장쇄를 단쇄로 절단하여, 결합된 물 및 노폐물의 소실 및 정맥 및 림프 순환의 회복을 초래하며, 국소 부종의 소멸을 달성할 수 있다.
8. 장기 이식에서의 사용
장기 내 히알루론산의 함량은 염증과 함께 증가할 수 있다. 히알루론산의 증가된 농도는 폐포염 (문헌 [Nettelbladt et al. (1991) Am. Rev. Resp. Dis. 139: 759-762]) 및 심근 경색 (문헌 [Waldenstrom et al. (1991) J. Clin. Invest. 88(5): 1622-1628])과 같은 염증-면역 손상을 특징으로 하는 상이한 장기로부터의 조직에서 관찰되었다. 다른 예로는 신장 (문헌 [Haellgren et al. (1990) J. Exp. Med. 171: 2063-2076]; [Wells et al. (1990) Transplantation 50: 240-243]), 소장 (문헌 [Wallander et al. (1993) Transplant. Int. 6: 133-137]) 또는 심장 (문헌 [Haellgren et al. (1990) J Clin Invest 185:668-673]) 이식 후 동종이계이식 거부반응; 또는 바이러스 기원의 심근 염증 (문헌 [Waldenstrom et al. (1993) Eur. J. Clin. Invest. 23: 277-282])이 포함된다. 장기 이식과 관련된 간질성 부종의 발생은 이식 수술 분야에서 심각한 문제점을 구성한다. 간질성 부종을 갖는 이식편은 기능이 일시적으로 상실될 정도로 팽윤할 수 있다. 몇몇 예에서, 종창은 신장의 파괴를 유발하여, 대량 출혈을 초래할 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 장기 이식에서 축적된 글리코사미노글리칸을 분해하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 글리코사미노글리칸의 제거는 이식편으로부터의 물의 제거를 촉진하고, 그러므로 장기 기능을 향상시킨다.
9. 뇌 내의 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 사용
히알루론산 수준은 수많은 뇌척수 병리적 상태에서 상승된다. 뇌척수 히알루론산의 수준은 정상적으로는 성인에서 200 ㎍/L 미만이나 (문헌 [Laurent et al. (1996) Acta Neurol Scand September 94(3):194-206]), 수막염, 척추관 협착증, 두부 손상 및 뇌경색과 같은 질병에서 8000 ㎍/L 초과의 수준으로 상승할 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제, 예컨대, rHuPH20은 임계적으로 상승된 수준의 기질을 분해하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 뇌에서 효과적인 림프의 부족은 두부 외상 후 생명을 위협하는 부종을 초래할 수 있다. 히알루론산 축적은 히알루론산 신타제에 의한 증가된 합성 및 감소된 분해의 결과이다. 히알루론산의 축적은 초기에는 백혈구 혈관외유출을 용이하게 하기 위해 손상된 조직 내의 물 함량을 증가시키는 유익한 목적으로 기능할 수 있으나, 계속된 축적은 치명적일 수 있다. 두부 외상을 앓는 환자에게 예컨대 경막내로 또는 정맥내로 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제를 투여하는 것은 조직 히알루론산 축적 및 이와 관련된 물을 제거하는 기능을 할 수 있다.
또한, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 뇌 종양과 관련된 부종, 특히 다형성 교모세포종과 관련된 부종의 치료에서 사용될 수 있다. 뇌 종양과 관련된 부종은 종양에 인접한 뇌의 비암성 부분 내의 히알루론산의 축적으로부터 야기된다. 히알루론산 축적 부위로 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제를 (예를 들어, 정맥내 주사에 의해 또는 단락을 통해) 투여하는 것은 이들 부위에서 과량의 히알루론산을 분해함으로써 이러한 악성종양과 관련된 부종을 완화시킬 수 있다.
10. 심혈관 질병에서 글리코사미노글리칸 축적의 치료에서의 사용
히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 몇몇 심혈관 질병의 치료에서 사용될 수 있다. 동물 모델에서 실험적 심근 경색 후 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제의 투여는 경색 크기를 감소시킬 수 있다 (문헌 [Maclean, et al (1976) Science 194(4261):199-200]). 이를 발생시킬 수 있는 제안된 메카니즘 중 하나는 허혈 재관류 후 발생하는 히알루론산 축적의 감소에 의한 것이다. 경색 크기의 감소는 증가된 림프 배액 및 증가된 조직 산소첨가 및 심근 물 함량의 감소로부터 발생하는 것이라고 믿어진다.
또한, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 동맥경화증으로부터 관상동맥 판을 제한하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 판은 글리코사미노글리칸을 축적시키고, 대식세포 및 포말 세포 접착을 매개한다 (문헌 [Kolodgie et al. (2002) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22(10):1642-8]).
11. 폐 질병에서의 사용
정상적인 개인으로부터 기관지폐포 세척액 (BAL) 내의 히알루론산의 수준은 일반적으로 15 ng/ml 미만이다. 그러나, BAL 내의 히알루론산 수준은 호흡 곤란의 상태에서 극적으로 상승한다 (문헌 [Bjermer et al. (1987) Br Med J (Clin Res Ed) 295(6602):803-6]). 폐 내의 증가된 히알루론산은 산소 확산 및 기체 교환 뿐만 아니라 중성구 및 대식세포 반응의 활성화를 방지할 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 rHuPH20, 예컨대 본원에 제공된 방법을 사용하여 생성된 rHuPH20의 정제된 제제는 히알루로난 수준을 감소시키기 위해 이러한 상태를 나타내는 환자에게 폐 또는 정맥내 전달에 의해 전달될 수 있다. 또한, 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 상승된 글리코사미노글리칸과 관련된 다른 폐 합병증을 앓는 환자에게 투여되거나, 또는 다른 공동전달된 분자의 폐로의 전달을 향상시키기 위해 투여될 수 있다.
12. 기타 사용
그의 치료학적 사용의 추가 예에서, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 빈카 알칼로이드와 같은 괴사성 물질의 정맥주위 주사로부터의 국소 괴사에 대한 해독제와 같은 목적을 위해 (문헌 [Few et al. (1987) Amer. J. Matern. Child Nurs. 12, 23-26]), 결절종의 치료 (문헌 [Paul et al. (1997) J Hand Surg. 22 (2): 219-21]) 및 정맥 부전으로 인한 조직 괴사의 치료 (문헌 [Elder et al. (1980) Lancet 648-649])를 위해 사용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 히알루로니다제는 또한 결절종 (또한, 손목종, 성경책종 또는 배후 힘줄종이라고 공지됨)을 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 결절종은 손의 가장 흔한 연질 조직 덩어리이고 피부 아래에서 느껴질 수 있는 유체 충전된 낭이다.
히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다제는 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (CSPG)을 분해함으로써 척수 손상의 치료에서 사용될 수 있다. 척수 손상 후, CSPG를 함유하는 신경교 상흔이 성상세포에 의해 생성된다. CSPG는 축삭 성장의 억제에서 중요한 역할을 한다. 또한, CSPG의 발현은 중추 신경계 (CNS)의 손상 후 증가하는 것으로 나타났다. 히알루로난 분해 효소는 또한 화학적 수핵용해술이라고 공지된 방법에서 추간판 탈출증의 치료를 위해 사용될 수 있다. 히알루로니다제와 유사한 기질을 절단하는 효소인 콘드로이티나제 ABC는 요추 내의 추간판내 압력의 감소를 유도할 수 있다. 추간판 손상의 세가지 유형이 존재한다. 돌출된 추간판은 무손상이나 불룩한 추간판이다. 탈출된 추간판에서, 섬유성 싸개는 찢어지고 수핵 (NP)은 새어나왔으나 여전히 추간판에 연결되어 있다. 격리된 추간판에서, NP의 단편은 일부분 추간판으로부터 빠져나와 있고, 척추관에서 자유롭다. 화학적 수핵용해술은 전형적으로 돌출된 추간판 및 탈출된 추간판에 대해 효과적이나, 격리된 추간판 손상에 대해서는 효과적이 아니다.
I. 실시예
다음의 예들은 예증 목적만을 위하여 포함된 것으로 발명의 범위를 제한하고자 함은 아니다.
실시예 1
가용성 rHuPH20 발현 세포 라인의 제조
HZ 플라스미드 (서열번호 52에 기재)는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들면, 출원번호 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171 참조)에 효소를 도입하기 위해 사용되었다. 가용성 rHuPH20을 발현하기 위한 HZ24 플라스미드는 pCI 백터 골격(Promega), 인간 PH20 히알루로니다제(서열번호 49)의 아미노산 1-482를 코딩하는 DNA, ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜성 부착부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 함유한다. 또한, pCI 벡터 골격은 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 즉시-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV), 키메라 인트론(chimeric intron) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐레이션 신호(SV40)을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물을 코딩하는 DNA는 인간 PH20 히알루로니다제의 고유의 35 아미노산 신호 서열의 아미노산 위치 1의 메치오닌을 코딩하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 공통서열, 및 인간 PH20 히알루로니다제(서열번호 1에 기재)의 아미노산 위치 482에 상응하는 타이로신을 코딩하는 DNA 뒤에 정지코돈(stop codon), 이어서 BamHI 제한부위를 함유한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)는 내부 리보솜성 부착부위(IRES)에 의해 분리된, 인간 PH20의 아마노산 1-482(서열번호 3에 기재) 및 디하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)의 아마노산 1-186(서열번호 53에 기재)를 코딩하는, CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종(species)을 결과로 한다.
4mM 글루타민 및 18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장시킨 비-형질감염된 DG44 CHO 세포를 형질감염을 위해 준비된 진탕 플라스크에 0.5x106 세포/ml로 접종하였다. 세포들을 120rpm으로 진탕하면서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 대수적으로(exponentially) 성장한 비-형질감염된 DG44 CHO 세포의 생존력을 형질감염 이전에 측정하였다.
비-형질감염된 DG44 CHO 세포배양물의 6천만개 생존세포를 펠렛화하고, 2x 형질감염 완충액(2x HeBS: 40mM pH 7.0 Hepes, 274mM NaCl, 10mM KCl, 1.4mM Na2HPO4, 12mM 덱스트로즈) 0.7mL에 2×107 세포의 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)으로 하룻밤 동안 소화시켜 선형화됨) 0.09mL(250μg)을 첨가하고, 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 옮겼다. 음성대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 수행하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 또는 350V 및 960μF에서 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 세포를 제거하고, 4mM 글루타민 및 18ml Plurionic F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포를 위한 변형 CD-CHO 배지 5mL 내로 옮겨서, 습식배양기에서 37℃, 5% CO2에서 2일 동안 선별하지 않고 6-웰 조직배양 플레이트의 웰에서 성장하도록 하였다.
전기천공 후 2일에, 조직배양 배지 0.5 mL을 각 웰로부터 제거하여, 실시예 2에 기재된 미세탁도 분석법을 이용하여 히알루로니다제 활성이 있는지를 측정하였다.
[표 3]
Figure pat00004

형질감염 2(350V)로부터 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1mL 분액을 5개의 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 하이포크산틴 및 티미딘 보충물 부재의 4mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함한 CD-CHO 배지(GIBCO) 100마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL).
10개의 클론이 메토트렉세이트 부재에서 성장된 5개의 플레이트로부터 확인되었다(표 4).
[표 4] 확인된 클론의 히알루로니다제 활성
Figure pat00005
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-형질감염형질감염O 세포들의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내 초기 몇일 동안 필수적인 성장인자들을 제공하였다. 서브클론당 50nM 메토트렉세이트를 함유하는 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트의 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론(메토트렉세이트 미처리의 13개 및 50nM 메토트렉세이트 처리의 11개)을 생산하였다. 24개의 서브클론 중 8개의 상청액에서 유의적인 히알루로니다제 활성이 측정되었고(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리한 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재 하에서 확장시켰다. 클론 3D35M 을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 진탕 플라스크에서 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생산하였다(클론 3D35M; Gen1 3D35M). 이어서, 3D35M 세포의 마스터 세포 은행(MCB)을 제조하였다.
실시예 2
가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성 측정
세포배양물, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 시료내 가용성 rHuPH20의 히알루로니다제 활성을 탁도 분석을 이용하여 측정하였고, 상기 분석은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한다. 가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10분) 동안 히알루로네이트(히알루론산) 나트륨과 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루로네이트 나트륨을 침전시킴으로써 활성을 측정하였다. 생성된 시료의 탁도를 30분의 발달(development)기간 후에 640nm에서 측정하였다. 히알루로네이트 나트륨 기질에 대한 효소활성에서 유래된 탁도감소는 가용성 rHuPH20 효소활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 분석 작용참조표준(working reference standard)의 희석물로 만들어진 검정곡선을 이용하여 수행하고, 검정곡선과 비교하여 시료활성을 측정하였다.
효소희석용액으로 시료 희석물을 조제하였다. 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05mg을 50mM PIPES 반응 완충액(140mM NaCl, 50mM PIPES, pH 5.5) 25.0mL 및 SWFI 25.0mL에 용해하고, 25% 부미네이트 용액 0.2mL을 상기 혼합물 내로 희석하고 30초간 볼텍싱(vortexing)하여 효소희석용액을 준비하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 수행하고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관하였다. 시료를 평가된 1-2U/mL로 희석하였다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20μL 이상이었다. 분석을 수행하는데 필요한 최소 시료부피는: 공정 중 시료, FPLC 분획: 80μL; 조직배양 상청액: 1mL; 농축된 재료 80μL; 정제된 또는 최종단계의 재료: 80μL이었다. 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 3반복적으로(triplicate)로 희석하고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5U/mL 농도의 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액으로 준비하여 검정곡선을 작성하고, Optilux 플레이트에 3반복적으로 첨가하였다. 희석물은 0U/mL, 0.25U/mL, 0.5U/mL, 1.0U/mL, 1.5U/mL, 2.0U/mL 및 2.5U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60μL를 포함한“공시약(Reagent blank)”웰을 음성대조군으로서 플레이트에 포함시켰다. 그리고 나서 플레이트를 덮고, 37℃에서 5분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕후, 플레이트를 열블록에 되돌려 두고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장비를 SWFI 20.0mL내 가온한 0.25mg/mL 히알루로네이트 나트륨 용액(100mg 히알루로네이트 나트륨(LifeCore Biomedical)을 용해함으로써 제조됨) 2 내지 4시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합하였다)으로 프라이밍하였다. 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 옮기고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루로네이트 나트륨 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그 다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고, 열블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다.
혈청 작용용액(serum working solution)으로 기계를 프라이밍하고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다(혈청 저장용액 25mL[1부피의 말 혈청(Sigma)을 9부피의 500mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정]을 500mM 아세테이트 완충용액 75mL내에). 플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작용용액 240μL를 웰로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분후에, 시료의 탁도를 640nm에서 측정하고, 각 시료의 효소활성(U/mL로)을 검정곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눔으로써 비활성도(U/mg)를 계산하였다.
실시예 3
Gen1 인간 sPH20의 생산 및 정제
A. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 용존산소 설정점 25% 및 0 내지 100 cc/분의 공기오버레이와 온도설정점 37℃, pH 7.2(시작 설정점)이었다. 168시간에서, 피드#1 배지(50g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하였다. 216시간에서, 피드#2 배지(50g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250ml을 첨가하고, 264시간에서 피드#2 배지 250ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대세포밀도와 ml당 1600유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론 유래 조건배지를 10mM pH 7.0 Hepes 내로 심층여과 및 접선유동여과에 의해 정화하였다. 그리고 나서 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)에서 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액으로 400mM NaCl에서 용출시켰다. 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 술페이트가 되도록 2M 암모늄 술페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 술페이트 부재의 50mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후에, pH 6.9 Hepes로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2로 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 80mM pH 7.4 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조 표준(reference standard)을 이용한 미세탁도 분석방법(실시예 2)에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성도(specific activity)를 보유하였다. 한 예에서, 천연 rHuPH20의 비활성도는 약 120,000 유닛/mg 이었던 반면, 페길화된 rHuPH20 (하기 실시예 7에 기재)은 약 30,000 유닛/mg 의 비활성도를 가졌다. 정제된 sPH20는 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
B. 100L 생물반응기 세포배양으로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업(규모확대) 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별개로 정제하여 sHuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별개로 확장시키고, 125L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 전과정 동안 시료를 취하여 효소 수득률과 같은 파라미터를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 개시와 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척과 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 10 내지 11에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 40mL/L GlutaMAX가 함유된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL을 함유한 125mL 진탕 플라스크에서 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20PSI에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; pH:7.2; 용존산소:25%±10%; 임펠러(Impeller) 속도 50rpm; 용기압력 3psi; 공기분사 1L/분; 공기오버레이: 1L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 가동 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50g/L 글루코스 + 40mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일에서 또는 세포의 생존률이 50% 이하로 감소됐을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도와 1600유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마(mycoplasma), 미생물부하도(bioburden), 내독소(endotoxin), 바이러스, 바이러스 입자를 위한 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 먼저 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐을 통과, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과시켜 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 10mM HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 5는 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
[표 5] 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계와 관련된 모니터링 데이터
Figure pat00006
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도(conductivity) 및 내독소(LAL)를 측정하기 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 정용여과(diafiltered)된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 컬럼 부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 상기 단백질 용출물을 2M 암모늄 술페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로, 최종농도가 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트 및 0.1mM CaCl2 pH 7.0을 100cm/시간으로 첨가하였다. 통과물(flow through)을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다.
컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 컬럼을 통과시키고, 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 그리고 나서 20mM 비신, 100mM NaCl, pH 9.0으로 컬럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50mM Hepes, 100mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수확하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 측정하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도가 5mM 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2를 수득하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척한 다음, 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20nm 구멍이 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 시알산(sialic acid) 프로파일 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그다음 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. Hepes/식염수 용액(10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척함으로써 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0으로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
표 5 내지 11은 각각의 3D35M 세포 로트(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
[표 6] Q 세파로즈 컬럼 데이터
Figure pat00007
[표 7] 페닐 세파로즈 컬럼 데이터
Figure pat00008
[표 8] 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 데이터
Figure pat00009
[표 9] 히드록시아파타이트 컬럼 데이터
Figure pat00010
[표 10] DV20 여과 데이터
Figure pat00011
[표 11] 최종농도 데이터
Figure pat00012
[표 12] 최종제형으로 완충액-교환 데이터
Figure pat00013

정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5mL 및 1mL 충전부피(fill volume)의 멸균 바이알에 무균적으로 충전하였다. 단백질을 조작자-조절 펌프로 0.22μm 필터를 통과시키고, 상기 펌프는 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용된다. 바이알의 마개(stoppers)를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외부입자를 가시적으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에서 담가서 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 보관하였다.
실시예 4
가용성 인간 PH20(rHuPH20)을 함유하는 Gen2 세포의 생산
실시예 1에 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4mM GlutaMAX™-1 및 1.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 약 4주후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX™-1 및 2.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(master cell bank: MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결해서 사용하였다.
4mM GlutaMAX™-1 및 4.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대후, 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일후, 배지내 메토트렉세이트 농도는 16.0μM로 증가되었고, 18일후에는 20.0μM로 증가되었다. 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대세포를 4mM GlutaMAX™-1 및 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석법으로 클로닝하였다. 5 내지 6주후 클론을 확인하고, 20.0μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(research cell bank: RCB)로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈(genomic) 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 네개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한개의 주된 혼성화밴드 및 두개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 상기 유도된 cDNA(서열변호:56)가 예상된 시토신(C) 대신 티미딘(T)인 것으로 관찰된 위치 1131에서 한개의 염기쌍 차이를 제외하고는 참조서열(서열번호 47)과 동일함을 지시하였다. 이는 아미노산 서열상에 영향이 없는 침묵 돌연변이이다.
실시예 5
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 36L 스피너 플라스크를 통하여 진탕 플라스크로부터 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20mL이 있는 125mL 진탕 플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125mL 진탕 플라스크에서 40mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100mL 배양부피로 125mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200mL 배양부피로 250mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 이상에 도달했을 때, 배양물을 32L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 접종밀도 mL당 4.0x105개 생존세포 및 총부피 260L로, 400L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40 내지 55rpm; 용기압력 3psi; 공기분사 0.5 내지 1.5L/분; 공기오버레이: 3L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 가동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 160mL/L GlutaMAX™-1 + 83mL/L 이스톨레이트 + 33mg/L rHuInsulin) 10.4L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 배지(2×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 80mL/L GlutaMAX™-1 + 167mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 배지(1×CD-CHO + 50g/L 글루코스 + 50mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 1.80g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 배지(1×CD-CHO + 33g/L 글루코스 + 33mL/L GlutaMAX™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에서, 또는 세포의 생존률이 40% 이하로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도와 ml당 17,000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4 내지 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4 내지 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행의 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈 (Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 셀룰로오스 막을, 그다음 0.4 내지 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과후, 그다음 셀룰로오스 막을, 그다음 350L 용량의 멸균 일회용 신축성 백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 전 즉시 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9L 레진, H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물을 100cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10mM 트리스, 20mM Na2SO4, pH 7.5 및 10mM Hepes, 50mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10mM Hepes, 400mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 판독하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 수행하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(19 내지 21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, 0.1mM CaCl2, pH7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 술페이트, 1M 포타슘 포스페이트 및 1M CaCl2 저장용액으로 보충하여, 최종농도 각각 5mM, 0.5M 및 0.1mM 를 수득하였다. 단백질을 100cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과물(flow thru)을 수집하였다. 컬럼을 100cm/시간으로 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트 및 0.1mM CaCl2 pH7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과물에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과물을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과물을 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(Promtics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과물을 100cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 술페이트, pH7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 0.5M 암모늄 술페이트, pH9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20mM 비신, 100mM 염화나트륨, pH9.0으로 세척하였다. 단백질을 50mM Hepes, 100mM NaCl, pH6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5mM 포타슘 포스페이트, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제된 단백질을 최종농도 5mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1mM CaCl2로 보충하고, 100cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10mM 포타슘 포스페이트 pH 7, 100mM NaCl, 0.1mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그리고 나서 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 2L로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP-정제된 단백질을 20nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
다음으로 여과물내 단백질을 10kDa 분자량 차단(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과물을 샘플링하였다. 농축후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM 히스티딘, 130mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 완충액-교환후, 농축된 단백질을 20L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일 및 삼투압을 측정하였다.
그리고 나서 멸균여과된 벌크 단백질을 30mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20mL씩 무균적으로 분주하였다. 그다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 보관하였다.
C. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제(실시예 3.B에 기술됨)와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화가 있다. 표 13은 상기 방법 간에 단순한 스케일업 변화뿐만 아니라 실시예의 차이를 기재하고 있다.
[표 13]
Figure pat00014
Figure pat00015

Figure pat00016
실시예 6
히알루로난-풍부 종양에서 재조합 히알루로니다제 (rHuPH20)에 의한 히알루로난의 표적화
A. 히알루로난-풍부 종양 세포에 의한 히알루로난-특이적 세포주위 매트릭스 HALO의 시험관내 형성
히알루로난-풍부 종양 세포 배양물 및 히알루로난-결핍 종양 세포 배양물을, 입자 배제 검정 및 면역조직화학을 이용하여 시험관내에서 세포주위 매트릭스 (HALO)를 형성하는 능력에 대해 평가하였다. 이 연구를 위해, 히알루로난-풍부 인간 전립선 종양 암종 (PC3)의 저밀도 배양물 및 히알루로난-결핍 인간 폐 암종 (NCI H460)의 저밀도 배양물을 세포 배지에서 60분 동안 37℃에서 처리한 후, 0.5 mg/mL 소 어그리칸 (상업적으로 입수가능함) (큰 응집 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸임)의 존재 또는 부재하에 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
입자 배제에 의해 HALO 형성을 평가하기 위해, 작은 입자 (5 x 106 포르말린-고정된 적혈구(RBC))를 배양물에 첨가하였다. 입자가 침강된 후, 배양물을 400X 또는 100X 확대로 관찰하였다.
면역조직화학에 의해 히알루로난 발현을 평가하기 위해, 배양물의 서브세트를 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠(Seikagaku), 일본)로 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스(Vector Labs), 캐나다)을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어(Insight FireWire) 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠(Diagnostic Instruments), 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000U 현미경을 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다.
세포주위 매트릭스 HALO를 면역조직화학에 의해 HA에 대해 양성으로 염색된 면적, 및 입자 배제 검정에서 입자 (RBC)가 배제된 면적으로서 확인하였다. 결과는 어그리칸의 존재하에 예비처리된 히알루로난-풍부 종양 (PC3) 배양물 내의 HALO (대표적인 실험에서, 대략 세포 크기)를 나타내었다. 그와 대조적으로, HALO는 어그리칸의 부재하에 형성하지 않았고, 히알루로난-결핍 (NCI H460) 종양 세포의 배양물에서도 형성하지 않았으며, 이는 세포주위 매트릭스의 형성이 히알루로난 발현에 대해 의존적이라는 것을 제안하였다.
히알루로난의 표적화가 이들 HALO의 형성을 차단할 수 있는가를 결정하기 위해, 60분 동안 37℃에서 rHuPH20이라고 지칭되는 가용성 재조합 인간 히알루로니다제 조성물의 존재 또는 부재 하에 (어그리칸의 첨가 전에) 처리된 세포 배양물에서 입자 배제 연구 및 면역조직화학을 수행하였다. rHuPH20을 종양 세포 배양물에 mL 당 1000 효소 단위로 포함시켰다 (상기 실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 결정됨). 항-히알루로난 항체 (상업적으로 입수가능함)에 의한 면역형광 염색은 rHuPH20과의 인큐베이션 후 히알루로난 염색의 부재를 나타내었다. rHuPH20과의 인큐베이션 후, 상기 기재된 바와 같이 입자 검정을 수행하였다. 현미경 사진은 rHuPH20이 있는 경우 (PC3) 종양 세포 배양물에서 HALO가 형성되지 않았다는 것을 나타내었다. rHuPH20은 히알루로난-결핍 세포 (NCI H460) 배양물에 대해 전혀 효과를 나타내지 않았으며, 히알루로난-결핍 세포 (NCI H460) 배양물은 rHuPH20의 존재 또는 부재하에 세포주위 매트릭스를 형성하지 않았다. 이들 결과는 종양 세포 배양물에서 시험관내 HALO 형성이 히알루로난-의존적이라는 지적을 지지한다.
상기 이 실시예에 기재된 바와 같이 rHuPH20의 존재 또는 부재하에 다양한 정도의 HA 발현을 갖는 7종의 상이한 유형의 인간 종양 세포주로 동일한 입자 배제 검정을 수행하였다. 사용한 세포주는 BxPC3 (췌장 종양주), PC3 (전립선 종양주), MDA-MB-231 (유방 종양주), HCT 116 (결장 종양주), DU145 (전립선 종양주), MiaPaCa2 (췌장 종양주) 및 H460 (NSC 폐암주)였다. 평균 세포 면적 (픽셀 또는 ㎟)으로 나눈 배양 접시 내의 평균 HALO 면적 (픽셀 또는 ㎟)을 측정함으로써 "세포 면적 당 HALO" 값을 결정하였다. 상이한 종양 유형 세포 배양물에서 세포 면적 당 HALO를 비교하기 위해, BxPC3 세포에 대한 값을 100으로 설정하고, HA-결핍 세포주 H460에 대한 값을 0으로 설정하고, 각 세포 유형에 대한 "상대적 HALO 분율"을 비교에 의해 결정하였다. 결과는 하기 표 14에 기재되어 있다. 나열된 숫자는 n = 25 측정치의 평균 + 또는 - 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
[표 14]
Figure pat00017
또한, rHuPH20에 대한 세포의 일시적 노출, 이어서 세포를 효소의 부재 하에 세포 배지와 인큐베이션한 "추적" 기간 후 PC3 배양물 내의 HA 제거의 지속시간을 결정하기 위해 이 검정을 이용하여 시간경로 연구를 수행하였다. 상기와 같이, 평균 세포 면적 (픽셀 또는 ㎟)으로 나눈 평균 HALO 면적 (픽셀 또는 ㎟)을 측정함으로써 "세포 면적 당 HALO" 값을 결정하였다. 처리전 (영(0) 시) 세포 면적 당 HALO를 계산하고, 그 값을 100%로 설정하였다. 6개의 처리된 시점 각각에 대해, 세포를 1000 U/mL rHuPH20의 존재하에 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 이어서 효소를 제거하기 위한 세척 기간 및 세포를 효소 없이 인큐베이션한 추적 기간이 따라왔다 (각각 총 2, 4, 8, 16, 24 및 48시간 동안). 각 시점에 대해, 세포 면적 당 HALO를 계산하였고, 0시 값 100%와 비교하여 상대적 HALO 분율을 결정하였다. 결과는 하기 표 15에 기재되어 있다. 나열된 숫자는 n = 45 측정치의 평균 + 또는 - 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
[표 15]
Figure pat00018
B. 히알루로난-풍부 종양 모델 (경골주위 PC3 전립선 암종 이종이식편 모델)에서 정맥내 rHuPH20 투여는 원위 종양 간질액 압력 (IFP)을 감소시킨다.
히알루로난-풍부 종양에서 히알루로난의 표적화의 효과를 분석하기 위해, rHuPH20을 경골주위 전립선 암종 (PC3) 이종이식편 모델에 전신으로 투여하였다. 이 모델에 대해, 무흉선 수컷 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 인간 전립선암 세포인 PC3 (0.05 mL의 총 부피 중 1x106 세포)을 접종하였다. 모든 동물 연구를 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 수행하였다.
이들 동물에서 종양 간질액 압력 (IFP)을 평가하기 위해, 연속적 IFP 측정 (단위 = 수은 밀리미터 (mmHg))을 위해 밀라(Milar)® 마이크로-팁 카테터 압력 변환기 (SPR-320)를 에이디인스트루먼츠(ADInstruments)® 파워랩(PowerLab) 4/30 데이터 획득 장치 및 휴대용 랩탑 컴퓨터에 연결하였다. 상기 시스템을 보정하고, 주변 압력 측정이 15 내지 20분에 걸쳐 +/- 1.0 mmHg 초과 만큼 벗어나지 않은 경우 안정한 것으로 고려하였다. 프로브 배치를 위해, 압력 카테터를 21 게이지 바늘의 내부 구멍으로 삽입하고, 상기 바늘을 종양의 중심에 도입하였다. 바늘을 변환기 주변에서 회수하면서, 동시에 압력 카테터를 제자리에서 유지시켰다. 그 후, 시스템을 이용하여 종양 내의 IFP (mmHg)를 측정하였다.
한 예시적 실험에서, 이 방법을 이용한 26마리 이종이식편 모델 동물에서 기준선 원위 종양 IFP 측정치는 종양 부피와 IFP 사이의 상관관계 (상관 계수, r = 0.5652)를 나타내었으며, 이는 증가된 종양 부피가 증가된 IFP를 초래할 수 있다는 것을 제안하였다.
전신 rHuPH20 처리가 이 이종이식편 모델에서 종양 IFP를 감소시킬 수 있는가를 결정하기 위해, 10,000 단위 (실시예 2에서 결정됨)의 rHuPH20을 3마리 동물의 꼬리 정맥에 정맥내 주사에 의해 100 ㎕ 용량으로 투여하였다. rHuPH20의 투여 (주사) 전에, IFP를 대략 20 내지 30분 동안 측정하여, 기준선 IFP 측정치를 확립하였다. 그 후, IFP를 주사 동안 및 주사 후 측정하였다. rHuPH20 투여후 1 내지 2시간 동안 IFP를 측정하였다. 정맥내 rHuPH20 투여는 원위 종양 IFP의 감소를 유발하였다. 10분 내에, 종양 IFP는 기준선와 비교하여 34%의 평균만큼 감소하였다. 추가로, 종양 IFP 수준은 1시간 내에 34.06 ± 15.9 mmHg으로부터 14.86 ± 12.55 mmHg으로 강하하였으며 (기준선 수준의 38%의 평균; 61.3% 평균 감소), 이는 최대 감소였다. 대조로서 동물에게 투여된 열-불활성화된 rHuPH20은 간질액 압력을 감소시키지 않았다.
급속 히알루로난 턴오버와 일치하여, 종양 IFP는 24시간 내에 모든 마우스에서 기준선으로 복귀하였다. 초기 용량 후 제공된 48시간에 10,000 단위 rHuPH20의 반복 정맥내 투여는 IFP의 유사한 강하를 나타내었다 (기준선의 28.6%, 평균). 비-종양 보유 사지 내의 rHuPH20 투여전 및 투여후 측정된 측정치는 이들 조직 내의 간질액 압력의 변화를 나타내지 않았다. 이들 데이터는 히알루로니다제의 전신 정맥내 투여가 원위 종양 내의 간질액 압력을 감소시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
또한, 히알루로난-결핍 폐 암종 세포 (H460)의 주사에 의해 유사하게 생성된 이종이식편 모델에서 간질액 압력을 측정하였다. 이 모델의 종양은 높은 간질액 압력을 나타내었으나, rHuPH20의 정맥내 투여의 효과는 히알루로난-풍부 종양 모델과 비교하여 이 모델에서 훨씬 덜 현저하였으며, 이는 종양 간질 압력에 대한 rHuPH20의 효과가 히알루로난-의존적이라는 지적을 지지한다.
실시예 7
rHuPH20의 PEG화
A. rHuPH20으로의 mPEG-SBA-30K의 접합
PEG화된 가용성 인간 히알루로니다제를 생성시키기 위해, rHuPH20 (크기가 대략 60 KDa임)을 대략 30 kDa의 분자량을 갖는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)에 공유결합으로 접합시켰다. mPEG-SBA의 구조는 하기 반응식 2에 나타낸다.
반응식 2:
Figure pat00019

rHuPH20을 PEG화하는데 사용된 mPEG-SBA-30K를 제조하기 위해 사용된 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,672,662호에 기재되어 있다. 간단히, mPEG-SBA-30K를 하기 절차에 따라 제조하였다:
디옥산에 용해된 에틸 말로네이트 (2 당량)의 용액을 질소 분위기 하에 수소화나트륨 (2 당량) 및 톨루엔에 적가하였다. mPEG 메탄 술포네이트 (1 당량, MW 30 kDa, 쉬어워터(Shearwater))를 톨루엔에 용해시키고, 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 대략 18시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 원래 부피의 절반으로 농축시키고, 10% 수성 NaCl 용액으로 추출하고, 1% 수성 염산으로 추출하고, 수성 추출물을 합하였다. 수집된 수성층을 디클로로메탄 (3x)으로 추출하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 건조물로 증발시켰다. 생성된 잔류물을 염화나트륨을 함유하는 1N 수산화나트륨에 용해시키고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 6N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 대략 3으로 조정하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (2x)으로 추출하였다.
유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물을 디옥산에 용해시키고, 8시간 동안 환류시킨 후, 건조물로 농축시켰다. 생성된 잔류물을 물에 용해시키고, 디클로로메탄 (2x)으로 추출하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용액을 회전식 증발에 의해 농축시킨 후, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 생성된 화합물 (1 당량)을 디클로로메탄에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드 (2.1 당량)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 디클로로메탄 중 디시클로헥실카르보디이미드 (2.1 당량)의 용액을 적가하였다. 용액을 실온에서 대략 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에 건조시켜, mPEG-SBA-30K를 수득하였다.
PEG화된 rHuPH20을 제조하기 위해, 반응식 3에 나타낸 바와 같이 mPEG-SBA-30K를 공유결합 접합에 의해 rHuPH20의 아미노기(들)에 커플링시켜, rHuPH20과 mPEG 사이에 안정한 아미드 결합을 제공하였다.
반응식 3:
Figure pat00020
접합을 위해, mPEG-SBA-30K를 분말 형태로 rHuPH20에 첨가하였다 (130 mM NaCl/10 mM HEPES 중 10 mg/mL의 농도; pH 7). PEG:rHuPH20 비율은 10:1 (몰비)이었다. PEG를 완충액에 용해시킨 후, 용액을 멸균-여과하였다 (코닝(Corning) 50 mL 튜브 탑 필터, 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트 0.22 ㎛ 막). 접합을 저온실에서 4℃에서 밤새 교반하면서 수행하였다.
접합 후, 100,000 MWCO TFF 막을 사용하여 용액을 농축시키고, 완충액을 130 mM NaCl/10 mM HEPES (pH 6.8)에 대해 교환하였다. 생성된 물질 (상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 효소 활성에 대해 시험함)을 130 mM NaCl/10 mM HEPES (pH 6.8)를 사용하여 희석시켜, 100,000 U/mL (대략 2.5 mg 펩티드/mL에 상응함)의 최종 효소 활성을 얻었다. 이 PEG화된 rHuPH20 물질을 1 mL 부피로 13-mm 유형-1 유리 바이알에 충전하고, 브롬부틸 밀봉하고, 동결된 상태로 저장하였다 (더 오래 저장하기 위해 -80℃ 냉동실에서 밤새 동결한 다음 -20℃ 냉동실에 두었다).
B. PEG화된 rHuPH20의 분석
PEG화된 rHuPH20 물질을 겔 전기영동에 의해 검정하였다. 상기 실시예 7A에서와 같이 제조된 PEG화된 rHuPH20의 3개의 배치(batch)는 상이한 거리로 이동한 미반응 PEG 및 mPEG-rHuPH20 접합체의 다중 종을 나타내는 다중 밴드의 동일한 패턴을 나타내었다. 분자량 마커의 이동과의 비교를 기초로 하여, 종을 나타내는 밴드는 대략 90 KDa 내지 300 KDa 범위였으며, 3개의 어두운 밴드는 240 KDa 마커 위로 이동하였다. 이들 데이터는, mPEG-SBA-30K의 공유결합 접합에 의해 생성된 PEG화된 rHuPH20이 일-, 이- 및 삼-PEG화된 단백질을 포함할 가능성이 있는 PEG화된 rHuPH20 종의 불균질 혼합물을 함유하였다는 것을 나타내었다. 60 KDa에서의 가시적 밴드의 결핍은 모든 단백질이 PEG와 반응하였고, 검출가능한 천연 rHuPH20이 혼합물에 존재하지 않았다는 것을 제안하였다.
C. PEG화된 rHuPH20에 의한 히알루로난-풍부 종양 세포 내의 히알루로난-특이적 세포주위 매트릭스 HALO의 용량-의존적 감소
실시예 6A에 기재된 바와 유사한 검정으로, 히알루로난-풍부 인간 전립선 종양 암종 (PC3) 세포에서 세포주위 매트릭스 (HALO)의 형성에 대한 다양한 용량의 PEG화된 rHuPH20의 효과를 평가하였다. 이 검정을 위해, PC3 세포의 다양한 저밀도 배양물을 세포 배지 단독으로 (대조; 0) 또는 PEG화된 rHuPH20 (mL 당 3, 30, 300, 1000 또는 3000 효소 단위 (U/mL), 상기 실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 결정됨)으로 60분 동안 37℃에서 처리하였다. 그 후, 배양물을 0.5 mg/mL 소 어그리칸 (상업적으로 입수가능함; 큰 응집 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸)과 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
HA (히알루로난) 단백질 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 배양물 중 HA의 양을 시각화하기 위해, 그 후 세포를 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)로 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, 캐나다)을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다.
적혈구 (RBC) 입자 배제 검정을 위해, 5 x 106 포르말린-고정된 적혈구를 각 배양물에 첨가하였다. 입자가 침강한 후, 배양물을 100x 확대로 관찰하였다. 세포주위 매트릭스 HALO를 IHC에 의해 HA에 대해 양성으로 염색된 면적, 및 입자 배제 검정에서 입자 (RBC)가 배제된 면적으로서 확인하였다.
HA에 대해 양성으로 염색된 픽셀 (면역조직화학) 또는 RBC가 배제된 면적 ㎟ (입자 배제 검정)를 측정함으로써 "HALO 면적"을 결정하였다. 평균 세포 면적을 유사한 방식으로 각 검정에 대해 각각 픽셀 또는 ㎟로 결정하였다. 그 후, HALO 면적을 각 시료에 대한 시야에 대한 평균 세포 면적으로 나눔으로써 "세포 면적 당 HALO 면적"을 유도하였다. 그 후, 대조 시료 (배지 단독)에 대한 세포 당 HALO 면적을 100%로, 및 1000 U-PH20-처리된 히알루로난-분해된 H460 세포 (상기 실시예 6A로부터)에 대한 세포 당 HALO 면적을 0으로서 설정함으로써 "퍼센트 HALO"를 결정하였다. 결과는 하기 표 16에 나타낸다. 이 표는 각 연구 조건 (PEG화된 rHuPH20의 용량)에 대한평균 "퍼센트 HALO"를 나열하고; 각 조건을 3벌 웰에서 수행하고, 웰 당 25개 세포를 개수하고 (총 n=75 세포 개수됨); 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 데이터는 이 연구에서 HALO의 감소에서 PEG화된 rHuPH20의 최대 유효 농도의 절반 (EC50)이 3.1 U/mL (0.09 ㎍/mL)였음을 나타내었다. 75% 최대 유효 농도 (EC75)는 14.1 U/mL (0.4 ㎍/mL)였다.
[표 16]
Figure pat00021
D. PEG화된 rHuPH20은 시험관내에서 PC3 세포의 콜로니 성장을 억제한다.
PEG화된 rHuPH20이 시험관내에서 히알루로난-풍부 전립선 종양 세포 (PC3)의 비부착 성장 및 증식을 억제할 수 있는가를 결정하기 위해, 세포에 대해 삼차원 클론원성 검정을 수행하였다. 대략 80% 전면성장의 PC3 세포를 트립신화하고, 수확하고, 완전 배지에서 1회 세척하였다. 세포 밀도를 8x104/mL 세포로 조정하고, 얼음 상에서 마트리겔® (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주 산호세)에 현탁하였다. 이 세포/마트리겔® 혼합물 0.025 mL를 웰 당 0.1 mL로 마트리겔®로 예비코팅된 48 웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 1시간 동안 고체화시켰다. 17일에 걸친 연속적 노출을 위해, 대조 API 완충액 및 다양한 농도의 PEG화된 rHuPH20, 0.6 mL/웰의 API 완충액을 함유하는 완전 배지, 1, 3, 10 및 100 U/mL의 PEG화된 rHuPH20을 적절한 웰의 상단에 첨가하였다. 웰을 37℃에서 공기 중 5% CO2를 갖는 습윤 대기에서 17일 동안 인큐베이션하고, 적절한 농도의 효소를 함유하는 신선한 처리 배지를 적절하다면 17일 기간 동안 3 내지 4일마다 대체하였다.
17째일에, 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 도립 현미경으로 영상을 캡처하여 콜로니의 성장을 평가하였다. 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어 (오픈 소스 소프트웨어, 면적 및 픽셀 값의 계산을 위한, 영상의 디스플레이 및 분석을 위한 공개적으로 입수가능한 프로그램) 및 커플링된 보정 함수 (콜로니 직경 및 식 4/3πr3을 이용하여 콜로니 부피를 계산하였다)를 이용하여 콜로니 개수 및 각 콜로니의 직경 (㎛)을 측정하였다.
각 조건에 대한 웰의 평균 콜로니 부피를 결정하고, PEG화된 rHuPH20의 존재하에 인큐베이션된 시료과 대조 시료 (효소를 함유하지 않는 API (유효 약리 성분) 완충액 (10 mM Hepes 및 130 mM NaCl, pH 7.0)) 내의 평균 콜로니 부피를 비교함으로써 콜로니 부피에 대한 PEG화된 rHuPH20의 효과를 평가하였다. 하기 식을 이용하여 억제 비율을 계산하였다:
(대조의 평균 부피 - 처리된 것의 평균 부피) / (대조의 평균 부피)*100.
PEG화된 rHuPH20은 성장의 용량-의존적 억제를 유도하였으며, 이는 대조와 비교하여 더 낮은 콜로니 부피에 의해 입증되었다. 상기 식을 이용하여 계산된 억제 비율을 기초로 하여, 1, 3, 10 및 100 U/mL의 PEG화된 rHuPH20의 존재하에 인큐베이션된 배양물은 대조 완충액과 함께 인큐베이션된 배양물과 비교하여 각각 39%, 67%, 73% 및 75%의 콜로니 부피의 평균 감소를 나타내었다 (3 U 및 10 U 시료에 대해 p<0.01; 100 U 시료에 대해 p<0.001; n=6). 만-위트니(Mann-Whitney) 검정을 이용하여 통계적 차이를 분석하였다.
감소하는 콜로니 부피에서 PEG화된 rHuPH20의 IC50 (그래프패드(Graphpad) 프리즘(Prism)®4 프로그램 (그래프패드 소프트웨어, 인크.(Graphpad Software, Inc.), 미국 캘리포니아주 라호야)을 이용하여 결정됨)은 대략 1.67 U/mL였다. 콜로니의 평균 개수는 비히클-처리된 (대조) 배양물에서 웰 당 10.17±1.56이었고, PEG화된 rHuPH20 100 U/mL에 의해 처리된 배양물에서 웰 당 11.50±0.89이었다. 대조와 100 U/mL 배양물 사이에 콜로니 개수의 차이는 유의하지 않았다 (n=6, p>0.05). 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20이 히알루로난 풍부 암 세포의 증식 및/또는 생존을 억제할 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 8
PEG화된 rHuPH20: 천연 rHuPH20과 비교된 생체내 작용의 증가된 지속시간
A. 천연 rHuPH20 및 PEG화된 rHuPH20의 약력학의 평가
1. 천연 rHuPH20의 약력학의 평가
90마리의 수컷 CD-1 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 얻었다. 동물은 무작위화 당일에 대략 3 내지 5주령이었고, 체중이 약 17 내지 23 그램이었다. 0.398 mg/kg HUA (로트 번호 HUA0703MA; 실시예 3에 기재된 Gen1 생성을 사용하여 생성됨) 또는 0.433 mg/kg HUB (로트 번호 HUB0702CA; 실시예 4에 기재된 Gen2 생성을 사용하여 생성됨) rHuPH20의 꼬리 정맥 주사 (정맥내)를 통해 동물에게 투여하였다. 대략 30초에 걸쳐 정맥내 주사를 천천히 밀어넣었다. 투여전, 투여후 1, 5, 10, 30분 및 1, 2 및 3시간에 혈액 수집을 위해 PH20 (HUA 또는 HUB)이 투여된 6마리의 동물을 마취/안락사시켰다. 혈장 시료를 수확하고, rHuPH20 농도 측정까지 동결된 상태로 저장하였다.
96-웰 플레이트-기재 효소적 검정을 이용하여 rHuPH20의 혈장 농도를 결정하였다. 효소 검정은 혈장 표본 또는 조직 균질화액 중 rHuPH20 함량의 측정을 제공하는 문헌 [Frost et al. (1997) (A Microtiter-Based Assay for Hyaluronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents. Analytical Biochemistry (1997) 251:263-269)]에 기재된 방법의 변형이었다. 먼저, 바이오티닐화된 HA (bHA) 기질을 플라스틱 마이크로타이터 플레이트에 결합시켰다. 표준 및 표본에 존재하는 rHuPH20을 이들 bHA-코팅된 플레이트에서 대략 90분 동안 37℃에서 최적화된 조건하에 인큐베이션하였다. 효소 반응을 정지시킨 후, 초기에 스트렙타비딘-HRP 접합체를 60분 동안 첨가한 다음, 후속적으로 TMB 기질을 사용하여 반응을 시각화시킴으로써 나머지 결합된 bHA를 검출하였다. 표준 또는 시료 중 더 많은 rHuPH20은 SA-HRP에 결합할 이용가능한 더 적은 bHA를 초래하기 때문에, 광학 밀도 (450 nm) 값은 각 표본 중 히알루로니다제 활성의 농도에 반비례하였다. 검정 범위는 대략 0.013 내지 1 U/mL였다. 50배 시료 희석 인자에 대해, LLOQ는 대략 0.625 U/mL였다. 그러므로, 시료의 1:100 희석으로 검정의 정량의 하한 (LLOQ)은 효소 0.625 U/mL였다. 윈넌린 프로(WinNonLin Pro) 버전 5.1 (파사이트 코포레이션(Pharsight Corp.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 이용하여 약동학 (PK) 분석을 수행하였다. 비분획 방법을 이용하여 PK 파라미터를 유도하였다. 엑셀(EXCEL) (마이크로소프트 코포레이션(Microsoft Corp.), 미국 워싱턴주 시애틀) 또는 JMP v.5.0.1 (SAS 인스티튜트(SAS Institute), 미국 노스캐롤라이나주 캐리)를 이용하여 요약 통계를 계산하였다. JMP v.5.0.1을 이용하여 ANOVA를 수행하였다.
rHUPH20 (HUA 및 HUB)의 피크 혈장 농도를 IV 주입 초기에 (1-분 수집 시간에) 즉시 얻었다. HUA 및 HUB에 대한 평균 피크 농도 (Cmax)는 각각 1148 및 1176 ng/mL였다. 피크 농도로부터의 하락은 HUA 및 HUB 양자 모두에 대해 급속적이고 2상이었다. 투여후 1 내지 5분의 초기 분포기에 이어서, 약간 더 느린 소실기가 따라왔다. 혈장 농도는 투여후 30분 내에 검정 정량 한계 (0.625 U/mL) 아래로 하락하였다. IV 주사로부터의 말단 반감기 (T1/2 λz)는 HUA의 경우 0.045시간 (2.6분)이었고, HUB의 경우 0.038시간 (2.3분)이었다. 짧은 반감기는 수컷 CD-1 마우스에서 rHuPH20의 급속한 소실을 나타내었다.
2. PEG화된 rHuPH20의 약력학의 평가
수컷 IRC 마우스 (할런(Harlan))에서 단일 용량 PK 연구를 수행하여, PEG화된 rHuPH20 (PEGPH20)의 2개의 로트; 로트 2005-9-14 (비활성 38,000 U/mg) 및 로트 221-092 (비활성 32,000 U/mg)에 대해 혈장 농도 대 시간 프로파일을 특징화하고 비교하였다. 또한, 반복된 월요일-목요일 BIW (1주 2회) IV 주사 후 PK 농도를 동물의 하나의 연구군에서 시험하였다.
PEGPH20 (실시예 7A에 기재된 바와 같이 제조함)을 25 g 초과의 체중을 갖는 수컷 IRC 마우스에게 정맥내로 투여하였으며; IV 용량은 체중 킬로그램 당 125,000 히알루로니다제 활성 단위 (U/kg)였다. 투여전 및 투여후 예정된 시간에 혈액 시료를 수집하였다. 마우스의 제한된 혈액 부피로 인해, 순차적 혈액 수집을 위해 희박 샘플링 계획을 이용하였다. 연구 동물의 무작위화 및 희박 혈액 수집 시간은 표 16A에 나타낸다.
[표 16A]
Figure pat00022

수집된 혈액 시료로부터 혈장을 제조하고, 분석까지 -70℃에서 동결된 상태로 저장하였다. 실시예 2에 기재된 미세탁도 마이크로타이터 플레이트 기재-검정에 의해 각 혈장 시료 중 히알루로니다제 활성을 결정하였다. 검정에 대한 정량의 하한은 2.90 U/mL였다. 비분획 및 분획 방법에 의해 윈넌린 프로 버전 5.1 (파사이트 코포레이션, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 이용하여 혈장 농도 대 시간 데이터를 분석하였다. 유도된 PK 파라미터는 AUC, Cmax 및 Tmax를 포함하였다. 이들 파라미터를 PEGPH20의 2개의 로트 간에 비교하여, PK 비교가능성을 평가하였다. U/mL의 ㎍/mL로의 전환을 위해 35,000 U/mg의 일반적인 비활성을 사용하였다. 35,000 U/mg이 PEGPH20의 2개의 로트 (로트 221-092 및 2005-9-14)의 비활성의 평균이었다.
AUC 및 Cmax에 의해 정의된 전신 노출은 마우스에게 정맥내로 투여시 PEGPH20의 2개의 로트 간에 유사하였다. 또한, 2개의 로트로부터의 일반적인 PK 프로파일은 약 10 내지 11시간의 연장된 소실 반감기 및 10 mL/h-kg 미만의 느린 전신 청소율로 유사하였다. 혈액 수집 시간에 의한 평균 및 중위수 혈장 농도의 통계적 비교는 PEGPH20의 2개의 로트 간에 유의한 차이가 없다는 것을 나타내었다. 총 3개의 용량에 대한 PEGPH20의 반복된 BIW (월요일-목요일) IV 투여는 제1 용량의 약동학에 의해 예측될 수 있는 기대 혈장 농도를 제공하였다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20이 반감기의 약 250배 초과의 증가를 갖는, 정맥내 주사에 의한 투여 후 지속된 생체내 효소 활성을 갖는다는 것을 제안하였다.
B. 히알루로난-풍부 종양 모델 (경골주위 PC3 전립선 암종 이종이식편 모델)에서 생체내 활성
정맥내 투여 후 PEG화된 rHuPH20 및 천연 rHuPH20의 효과를 비교하기 위해, 상기 실시예 6에 기재된 경골주위 PC3 전립선 암종 이종이식편 모델 동물을 천연 rHuPH20 및 PEG화된 rHuPH20으로 처리하였다.
1. PEG화된 rHuPH20 투여 후 혈장 중 히알루로니다제 효소 활성의 증가된 지속시간
경골주위 PC3 전립선 암종 이종이식편 모델 동물 (PC3 인간 전립선암 이종이식편을 보유하는 무흉선 수컷; 상기 실시예 6 참조)의 2개의 군에게 10,000 단위의 PEG화된 rHuPH20 (실시예 7A에 기재된 바와 같이 제조됨) 및 천연 rHuPH20을 각각 정맥내로 주사하였다.
10,000 단위의 천연 rHuPH20/PEG화된 rHuPH20의 투여 전 및 투여 후 다양한 시점에 동물로부터 혈액을 취하였다. 혈장을 제조하고, 상기 실시예 2에 기재된 효소 활성 검정을 이용하여 이들 시점에 혈장 mL 당 rHuPH20 활성의 단위를 결정하였다. 결과는 천연 rHuPH20의 투여 후 혈장 중 효소 활성의 반감기가 1분 미만 이었음을 나타내었다 (이 실험에서 혈장 반감기는 0.59분이었다). 천연 rHuPH20의 투여 후 10분 내에 혈장 mL 당 5 미만의 효소 단위가 관찰되었다.
그와 대조적으로, PEG화된 rHuPH20은 24시간 초과의 혈장 효소 반감기를 나타내었다. 10,000 효소 단위의 PEG화된 rHuPH20의 투여 후 60분에, 혈장 mL 당 1000 초과의 효소 활성 단위 (주사된 것의 10% 초과)가 관찰되었다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20이 반감기의 2000배 초과의 증가를 갖는, 정맥내 주사에 의한 투여 후 지속된 생체내 효소 활성을 갖는다는 것을 제안하였다.
2. PEG화된 rHuPH20에 의한 원위 종양 중 히알루로난 감소의 증가된 지속시간
천연/PEG화된 rHuPH20 투여전, 및 투여후 45분, 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간에, 상기 실시예 8B.1에 기재된 마우스로부터의 경골주위 종양을 수확하고, 통상적인 완충 포르말린 (NBF)에서 고정시켰다. 면역조직화학 (IHC)에 의해 종양 중 히알루로난 (HA)의 수준을 평가하였다. IHC를 위해, 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)을 사용하여 5 ㎛ 종양 섹션을 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, (Vector Labs), 캐나다)을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어(Insight FireWire) 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠(Diagnostic Instruments), 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) TE2000U 현미경을 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다.
rHuPH20 투여전, 진한 녹색 염색은 종양 중 HA의 존재를 나타내었다. 10,000 단위 천연 rHuPH20의 정맥내 투여 후 사십오 (45) 분에, 종양은 가시적 HA 염색을 나타내지 않았다. 그러나, 24시간 내에, 종양 중 HA 수준은 투여전 관찰된 수준으로 복귀한 것으로 보였으며, 이는 급속 히알루로난 턴오버 및 천연 rHuPH20의 짧은 반감기와 일치하였다. 그러나, PEG화된 rHuPH20의 투여 후, 투여후 2시간, 48시간 및 72시간에 HA 염색이 관찰되지 않았다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20의 정맥내 투여가 투여후 72시간 이상 동안 종양 부위에서 지속된 효소 활성을 초래한다는 것을 제안하였다.
3. PEG화된 rHuPH20에 의한 원위 종양 중 HA-분해의 용량 반응
다른 연구에서, 경골주위 PC3 전립선 암종 이종이식편 모델 동물의 추가 군의 동물을 비히클 및 다양한 양 농도 (마우스 당 10, 100, 500, 1000 및 10,000 효소 단위 (U))의 PEG화된 rHuPH20으로 처리하였다. 이 처리 후 3일 (72시간)에, 마우스로부터 경골주위 종양을 수확하고, 통상적인 완충 포르말린에서 고정시켰다. 상기 실시예 8B.2에 기재된 바와 같이 면역조직화학 (IHC)에 의해 종양 중 히알루로난 (HA)의 수준을 평가하였다. 또한, 종양 섹션에 대해 헤마톡실린/에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. 결과는 100, 500, 1000 및 10,000 U PEG화된 rHuPH20으로 처리된 동물로부터의 종양 섹션 중 HA 염색의 용량-의존적 감소를 나타내었다. 1000 및 10,000 U PEG화된 rHuPH20을 투여받은 동물로부터의 섹션에서, 가시적 염색이 거의 관찰되지 않았다. 500 U PEG화된 rHuPH20을 투여받은 동물로부터의 섹션에서, 산발적 염색이 관찰되었으며, 이는 이 예시적 연구에서 HA 염색이 500 (이 경우에, 1000) U 초과의 용량의 경우에만 완전히 제거되었음을 나타내었다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20의 단일 전신 투여가 3일 이상 동안 원위 종양에서 히알루로난을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다. 이 연구에서 PEG화된 rHuPH20의 ED50 (HA 염색의 50% 감소를 초래하는 용량)은 킬로그램 당 13,000 효소 단위 (U/Kg)였으며, 이는 300 ㎍/Kg에 상응하였다.
4. 원위 PC3 종양으로부터의 HA의 PEG화된 PH20의 제거 작용의 지속시간
추가 연구에서, PC3 전립선 종양 모델 동물을 10일 동안 비히클로, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 마우스 당 10,000 U (대략 15 mg/Kg)의 PEG화된 rHuPH20으로 처리하였다. 처리 후, 마우스로부터의 경골주위 종양을 수확하고, 통상적인 완충 포르말린에서 고정시키고, 상기 실시예 8B.2에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 통해 히알루로난 (HA) 발현에 대해 평가하였다. HA 염색이 모든 시점에서 감소하였으며, 5째일 후에 HA 염색의 가시적 검출이 없었다.
실시예 9
PEG화된 rHuPH20에 의한 지속된 IFP 억제
A. PEG·rHuPH20 투여는 종양 IFP의 급속, 지속된, 용량-의존적 감소를 초래한다.
원위 종양 IFP에 대한 PEG화된 rHuPH20 (PEG rHuPH20) 및 천연 rHuPH20의 전신 투여의 효과를 비교하기 위해, 상기 실시예 6B에 기재된 방법을 이용하여, PC3 이종이식편 모델 동물에서 다양한 양의 각 효소의 정맥내 주사 후 종양 IFP를 측정하였다.
먼저, 군 당 3마리의 마우스를 사용하여 종양 IFP의 감소를 비교하였으며, 여기서 각 마우스는 10,000 단위 용량의 PEG rHuPH20 또는 천연 rHuPH20을 투여받았다. 상기 실시예 6B에 주목된 바와 같이, 천연 rHuPH20의 투여에 의해, 종양 IFP가 투여후 10분 내에 34% 및 1시간 내에 61.3%의 평균만큼 감소하였다. 10,000 단위의 PEG rHuPH20의 투여는 주사후 처음 10분 내에 유사한 (22.4%) 감소를 초래하였다. 그러나, 투여후 1시간 내에, PEG rHuPH20은 원위 종양 IFP를 기준선과 비교하여 88.6%의 평균만큼 감소시켰으며, 이는 PEG화된 가용성 히알루로니다제가 천연 효소와 비교하여 IFP에 대한 증가된 및/또는 지속된 효과를 갖는다는 것을 나타내었다.
다음, 간질액 압력에 대한 rHuPH20의 효과가 용량-의존적인가를 결정하기 위해, PC3 이종이식편 마우스의 10개의 군 (군 당 7마리의 마우스)을 사용하여 상기 실시예 6B에 기재된 방법을 수행하였으며, 여기서 각 군은 상기 기재된 바와 같이 처리하였고, 100, 1000, 3000, 7000 (오직 PEG화된 rHuPH20) 또는 10,000 단위의 PEG화된 또는 천연 rHuPH20, 또는 대조 담체 완충액을 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내로 투여하였다. 투여전, 투여 동안 및 투여후 연속적으로 IFP를 측정하였다. 투여후 120분까지 IFP를 측정하였다.
결과는 천연 rHuPH20 및 PEG화된 rHuPH20 양자 모두의 정맥내 투여가 용량-의존적 방식으로 원위 종양 IFP를 감소시켰다는 것을 나타내었다. 여러 용량의 PEG화된 rHuPH20은 투여후 1시간 및 2시간 내에 IFP의 더 큰 감소를 초래하였다. 예를 들어, 이 예시적 실험에서, 120분 후, 1000 단위의 천연 rHuPH20의 투여는 종양 IFP의 대략 30% 감소 (대조와 비교하여 대략 70%)를 초래한 반면, 동일한 용량 (1000 단위)의 PEG rHuPH20의 투여는 종양 IFP를 50% 초과만큼 (대조의 대략 48%) 감소시켰다. PEG화된 rHuPH20의 가장 높은 용량 (3,000 내지 10,000 U/마우스)에서 IFP 감소는 120분에 80% 초과였다. IC50 (PEG화된 rHuPH20 처리 후 120분에 IFP 억제 %에 대해)은 807.6 U/마우스였다. 3개의 가장 높은 용량 (3000, 7000 및 10,000 U PEG화된 rHuPH20/마우스) 효과는 이 시점에서 플래토(plateau)인 것으로 보였다.
B. PEG화된 rHuPH20의 정맥내 투여는 연장된 종양 IFP 억제를 초래한다.
실시예 8에서 관찰된 바와 같은 PEG화된 rHuPH20에 의한 생체내 활성의 증가된 지속시간이 종양 IFP의 연장된 억제로 바뀌는가를 결정하기 위해, PC3 이종이식편 모델 동물의 군 (군 당 4마리의 동물)에게 상기 기재된 바와 같이 담체 완충액 또는 10,000 단위의 PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 주사하고, 실시예 6B에 기재된 바와 같이 투여후 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 IFP를 측정하였다.
유사한 실험은 원위 종양 IFP가 천연 rHuPH20의 투여후 24시간 내에 대조 수준으로 복귀하였다는 것을 나타내었다. 그와 대조적으로, 이 실험에서, IFP는 10,000 단위 PEG화된 rHuPH20의 단일 용량의 정맥내 투여 후 8시간, 24시간 및 48시간에 약 50% 이상만큼 감소하였다. 이 실험에서, 평균 종양 IFP는 72시간 내에 대조 수준에 접근하였다. 이들 결과는 원위 종양 부위에서 연장된 간질액 압력 감소를 이행하기 위해 PEG화된 rHuPH20를 정맥내로 투여할 수 있다는 것을 나타내었다.
C. PEG화된 rHuPH20 투여에 의한 종양 IFP의 감소는 HA-의존적이다.
PEG화된 rHuPH20에 의한 종양 IFP의 감소가 종양 중 히알루론산 (HA)의 존재에 의존적이었다는 것을 입증하기 위해, IFP에 대한 효과를 5종의 상이한 종양 모델에서 평가하였다. 이 연구를 위해, PC3 모델에 대해 기재된 바와 같이 (상기 실시예 6 참조), 수컷 무흉선 누드 (nu/nu) 마우스를 적절한 세포주: PC3 (상기 예를 들어 실시예 6에 기재됨); BxPC3 (인간 췌장 암종 세포주); Mat LyLu (랫트 전립선 암종의 더닝(Dunning) 시리즈로부터 유래된 랫트 전립선 암종); Du145 (인간 호르몬 불응성 전립선 암종 세포주); 및 NCI H460 (인간 대세포 폐 암종 세포주)로 뒷다리에서 경골주위로 접종하여, 각 종양 모델에 대한 동물의 군을 생성시켰다.
하기 실시예 17에 기재된 바와 같이, 이들 마우스로부터 단리된 종양을 HA 발현 정도의 차이에 대해 면역조직화학 (IHC)에 의해 평가하였다. 종양으로부터의 섹션에 대해 IHC를 수행하고, 점수화 시스템을 사용하였으며, 여기서 "+++" 스코어는 시야의 80% 초과의 진한 염색을 나타내었고, "+/-"는 희박 염색을 나타내었고, "-"는 가시적 염색 없음을 나타내었다. 하기 실시예 17 및 표 17에서 주목된 바와 같이, 이 연구는 +++ 내지 +/- 범위의 종양 중 HA 수준의 범위를 나타내었다.
그 후, 400 내지 800 ㎣에 도달한 종양을 갖는, PC3 전립선 종양 모델, BxPC3 췌장 암종 종양 모델, Mat LyLu 전립선 종양 모델, Du145 인간 전립선 종양 모델 및 NCI H460 폐 암종 모델로부터의 동물에게 15 mg/Kg (마우스 당 10,000 U) PEG화된 rHuPH20 또는 대조 완충액 (API (유효 약리 성분) 완충액 (10 mM Hepes 및 130 mM NaCl, pH 7.0), 효소 비함유)을 정맥내로 주사하였다. 이들 모델 각각의 종양 HA의 상대적 양 (하기 실시예 17A에 기재된 바와 같이 결정됨)은 하기 표 17에 기재되어 있다.
상기 실시예 6B에 기재된 바와 같이 투여전, 투여 동안 및 투여후 연속적으로 IFP를 측정하였다. 투여후 120분까지 IFP를 측정하였다. 하기 표 17은 각 종양 모델에서 120분에 IFP의 대략 상대적 감소 (대조 완충액에 의한 처리와 비교하여)를 나타내었다. 이들 숫자에 대해, PEG화된 rHuPH20를 투여받은 동물의 IFP를 대조 완충액을 투여받은 동물의 IFP와 비교하였다. 결과는 PEG화된 rHuPH20 정맥내 투여가 HA-의존적 방식으로 원위 종양 내의 IFP를 감소시킨다는 것을 나타내었다.
[표 17]
Figure pat00023
실시예 10
rHuPH20의 정맥내 투여는 원위 종양 내의 증가된 혈관 부피를 초래한다
(PEG화된 rHuPH20에 의한 지속된 효과).
횡단 2차원 초음파 영상화를 이용하여, 상기 실시예 6에 기재된 이종이식편 모델의 경골주위 종양에서 rHuPH20 투여전 및 투여후 혈관 부피를 측정하였다.
비쥬얼소닉스(VisualSonics) 베보(Vevo) 770® 고해상도 초음파 (U/S) (비쥬얼소닉스, 인크.(VisualSonics, Inc.), 캐나다 온타리오주 토론토)를 대비 방식으로 이용하여, 종양 내의 혈관 부피의 상대적 측정치를 얻었다. 대비 방식 영상 획득 동안, 비-표적화된 질소/퍼플루오로부탄 충전된 마이크로마커(MicroMarker)® 마이크로-버블 (MB) (비쥬얼소닉스, 인크.) (그의 크기로 인해 혈관 공간 내에 포획되게 됨)을 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내로 투여하였다. MB는 과다에코였으며, 그러므로 강한 초음파 반사율을 제공하였고, 2.3 내지 2.9 mm의 중위수 직경을 가졌다. 그러므로, MB는 주사후 혈관 구획으로 격리되었다. 하기 식 (관심있는 종양 영역 (ROI) 당 MB 주사후 초음파 신호 강도 (B) - MB 주사전 초음파 신호 강도 (A))을 이용하여 상대적 혈관 부피를 계산하였다:
혈관 부피 (τ1) = [(B - A) / ROI]
상대적 혈관 부피의 변화는 하기 식에 따른 2개의 시점 (예를 들어, rHuPH20의 투여전 및 투여후)의 혈관 부피의 차이 (상기 식으로 계산됨)였다:
혈관 부피의 변화 = 혈관 부피 (τ2) - 혈관 부피 (τ1)
이들 방법을 이용하여, 상기 실시예 6 및 9에 기재된 바와 같이, 이종이식편 모델 동물에게 가용성 인간 히알루로니다제 (천연 또는 PEG화된)의 정맥내 투여후 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 경골주위 종양 내의 혈관 부피를 측정하였다. 천연 rHuPH20의 투여후 8시간 및 24시간에, 원위 종양 혈관 부피는 담체 완충액 단독의 주사후 혈관 부피보다 2 내지 2.5배 더 높았다. 그러나, PEG화된 rHuPH20의 투여후 8시간 및 24시간에, 혈관 부피는 완충액 단독의 주사후 혈관 부피보다 3 내지 4배 더 높았다. PEG화된 rHuPH20의 투여후 48시간 내에, 종양 혈관 부피는 완충액 단독의 주사후 관찰된 혈관 부피와 비교하여 여전히 3배 증가되었다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20의 전신 투여가 종양 혈관의 지속된 "효소적 감압"을 수행하여 증가된 혈관 부피를 초래할 수 있다는 것을 나타내었다.
또한, 종양 혈관의 효소적 감압을 혈관의 시각화를 위한 면역조직화학 (IHC)에 의해 평가하였다. 담체 완충액 또는 10,000 단위 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 (각각 3마리의 PC3 이종이식편 모델 동물의) 군으로부터의 경골주위 종양을 수확하고, 포르말린에서 고정시키고, 파라핀에 매봉하였다. 혈관의 검출을 위해, 랫트 항-마우스 CD31 항체 (파밍겐(Pharmingen), 미국 샌디에고)를 사용하여 종양으로부터의 섹션을 염색하였다. 일차 항체를 세척한 후, HRP-접합된 토끼 항-랫트 IgG (벡터 랩스, 캐나다)로 섹션을 염색하였다. 이차 항체를 세척한 후, DAB 기질을 사용하여 CD31 염색을 시각화하였다. 헤마톡실린으로 핵을 대비-염색하였다. 이미지제이 오픈 소스 소프트웨어 (면적 및 픽셀 값의 계산을 위한, 영상의 디스플레이 및 분석을 위한 공개적으로 입수가능한 프로그램)를 이용하여 미세혈관 면적을 정량하였다. 이 경우에, CD31 양성 미세혈관 내부의 면적을 계산하기 위해 상기 프로그램을 이용하였다. 결과는 48시간 전에 대조-처리된 동물로부터의 종양 섹션 내의 대략 200 마이크로미터 제곱 (㎛2)의 평균 CD31+ 미세혈관 면적, 및 PEG화된 rHuPH20의 정맥내 용량을 투여받은 마우스로부터의 종양 섹션 내의 대략 700 ㎛2의 평균 CD31+ 미세혈관 면적을 나타내었다. 이러한 3배 초과의 증가는 PEG화된 rHuPH20 투여가 종양 혈관의 지속된 효소적 감압을 수행한다는 발견을 지지하였다.
실시예 11
PEG화된 rHuPH20의 정맥내 투여는 종양 물 함량의 지속된 감소를 초래한다.
상기 실시예에 기재된 바와 같이 10,000 단위 PEG·rHuPH20 또는 담체 완충액 단독의 정맥내 투여후 다양한 시점에 PC3 이종이식편 동물의 군에서 (군 당 9마리의 마우스) 종양 물 함량을 측정하였다. 투여후 2, 8, 24, 48, 72, 96 및 120시간에 물 함량을 측정하였다.
물 함량을 측정하기 위해, PC3 종양 조각들을 수확하고, 블럿팅하고, 중량측정하고, 순간 동결하였다. 시료를 후속적으로 동결건조기에 위치시키고, 48시간 초과 동안 건조시키고, 중량측정하였다. 물 중량을 조직 습윤 중량 대 건조 중량 비율로서 보고하였다. 결과는 습윤/건조 중량 비율이 담체 완충액 주사를 투여받은 동물에 비해 PEG rHuPH20을 투여받은 마우스에서 측정된 모든 시점에서 유의하게 감소되었다 (p<0.05)는 것을 나타내었다.
상대적 H2O 확산 속도 (ADC) - 동물에게 천연 rHuPH20, PEG·rHuPH20 또는 담체 완충액을 투여하고, 시간이 지남에 따라 확산 가중 MRI를 측정하여, 겉보기 확산 계수 (ADC)를 결정하였다 (예를 들어, 문헌 [Park MJ et. al, Korean J Radiol. 2007 (5):390-6, The role of diffusion-weighted imaging and the apparent diffusion coefficient (ADC) values for breast tumors] 참조). ADC 값은 종양 물 함량을 반영하였다. 투여후 48시간 및 72시간에, PEG·rHuPH20 처리 후 평균 H2O 겉보기 확산 계수 (ADC)는 담체 완충액 단독에 의한 처리와 통계적으로 상이하였다. 물 ADC의 감소는 PEG화된 rHuPH20에 의해 정맥내로 처리된 동물의 종양 내의 물 확산/병진 운동의 감소를 반영하였다. 그러므로, 물 확산은 48시간 및 72시간에 이들 동물의 종양에서 대조에 비해 유의하게 감소되었다. 이 결과는 72시간 이상 동안 PEG화된 rHuPH20의 정맥내 투여 후 간질 부피 분율이 감소되었고/거나 간질액의 뒤틀림이 감소되었다는 것을 나타내었다.
실시예 12
시알산 및 단당류 함량의 결정
가용성 rHuPH20의 시알산 및 단당류 함량을 트리플루오로아세트산에 의한 가수분해 후 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)에 의해 평가할 수 있었다. 한 예에서, 정제된 히알루로니다제 로트 # HUB0701E (1.2 mg/mL; 본질적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조되고 정제됨)의 시알산 및 단당류 함량을 결정하였다. 간단히, 시료 100 ㎍을 100℃에서 4시간 동안 2벌로 40% (v/v) 트리플루오로아세트산에 의해 가수분해하였다. 가수분해 후, 시료를 건조시키고, 물 300 ㎕에서 재현탁하였다. 각 재현탁된 시료로부터의 분액 45 ㎕를 새로운 튜브로 이동시키고, 건조시키고, 10 mg/mL 아세트산나트륨 용액 10 ㎕를 각각에 첨가하였다. 메탄올 중 30 mg/mL 2-아미노벤조산, 20 mg/mL 나트륨 시아노보로히드라이드, 대략 40 mg/mL 아세트산나트륨 및 20 mg/mL 붕산을 함유하는 용액 50 ㎕를 첨가하여 방출된 단당류를 형광으로 표지하였다. 혼합물을 30분동안 80℃에서 암흑에서 인큐베이션하였다. 이동상 A (0.2% (v/v) n-부틸아민, 0.5% (v/v) 인산, 1% (v/v) 테트라히드로푸란) 440 ㎕를 첨가하여 유도체화 반응물을 켄칭하였다. 물의 매트릭스 블랭크를 또한 음성 대조군으로서 히알루로니다제 시료에 대해 기재된 바와 같이 가수분해하고 유도체화하였다. 옥타데실 (C18) 역상 컬럼 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기; 베이커(J.T. Baker))을 사용하여 RPLC에 의해 방출된 단당류를 분리하고, 형광 검출 (360 nm 여기, 425 nm 방출)에 의해 모니터링하였다. N-D-글루코사민 (GlcN), N-D-갈락토사민 (GalN), 갈락토스, 푸코스 및 만노스를 포함하는 단당류 표준의 크로마토그램과 히알루로니다제 시료로부터의 크로마토그램을 비교하여 단당류 함량을 정량하였다. 표 18은 히알루로니다제 분자 당 각 단당류의 몰비를 제공한다.
[표 18]
Figure pat00024

실시예 13
3D35M 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20의 C-말단 이질성
100 L 생물반응기 부피에서 3D35M 세포 (로트 HUA0505MA) 및 300 L 생물반응기 부피에서 2B2 세포 (로트 HUB0701EB)로부터 제조되고 정제된 sHuPH20의 2개의 로트에 대해 C-말단 서열분석을 수행하였다. 아스파르트산 및 시스테인산에서 펩티드 결합을 N-말단에서 특이적으로 절단하는 엔도프로테이나제 Asp-N에 의해 로트들을 별개로 소화시켰다. 이는 서열번호 4의 위치 431에서 아스파르트산에서 가용성 rHuPH20의 C-말단 부분을 방출시켰다. C-말단 단편을 분리하고, 특징화하여, 로트 HUA0505MA 및 로트 HUB0701EB의 각 집단의 서열 및 존재비를 결정하였다.
3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제가 이질성을 나타내었고, C-말단 서열이 서로 상이한 폴리펩티드를 함유하였다는 것이 관찰되었다 (표 19 및 20). 이 이질성은 제조 및 정제 공정 동안 세포 배양 배지 또는 다른 용액에 존재하는 펩티다제에 의한 발현된 447 아미노산 폴리펩티드 (서열번호 4)의 C-말단 절단의 결과일 가능성이 있다. 가용성 rHuPH20 제제 중 폴리펩티드는 서열번호 4에 기재된 가용성 rHuPH20 서열의 아미노산 1-447, 1-446, 1-445, 1-444 및 1-443에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 이들 폴리펩티드 각각의 전장 아미노산 서열은 서열번호 4 내지 8에 각각 기재되어 있다. 표 19 및 20에 주목된 바와 같이, 3D35M 세포 및 2B2 세포로부터의 가용성 rHuPH20 제제 중 각 폴리펩티드의 존재비는 상이하다.
[표 19]
Figure pat00025

[표 20]
Figure pat00026
실시예 14.
전립선암 모델에서 정맥내 투여 후 PEG화된 rHuPH20 및 세포독성제의 항종양 효과
호르몬 불응성 전립선암 이종이식편 모델 및 골 전이 모델을 사용하여 PEG화된 rHuPH20 및 세포독성제 도세탁셀 (탁소테레®; 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis)) 및 리포좀 독소루비신 (독실®; 오르토 바이오테크(Ortho Biotech))의 공동투여의 항종양 효과를 평가하였다.
A. 전립선암 이종이식편 모델
PC3 경골주위 호르몬 불응성 전립선암 이종이식편 모델을 확립하기 위해, 34 ± 16 mmHg의 평균 간질액 압력을 갖는 종양을 생성시키기 위해, 무흉선 수컷 누드 마우스를 우측 경골 골막에 인접하여 인간 PC3 전립선암 세포 (0.05 mL의 총 부피 중 마우스 당 1x106 세포)으로 근육내로 접종하였다. 종양을 세포독성제/PEG화된 rHuPH20, 세포독성제 단독 또는 PEG화된 rHuPH20 단독에 의한 처리의 개시 전에 400 내지 500 ㎣의 평균 종양 부피로 성장시켰다. 비쥬얼소닉스 영상화 마이크로-초음파 시스템을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 한 군의 마우스에게 0 및 7째일에 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) 및 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 투여하였다. 먼저, 탁소테레® (도세탁셀) 0.1 mL를 주사기로 뽑은 후 PEG화된 rHuPH20 0.1 mL를 주사기로 뽑은 직후, 용액 0.2 mL를 마우스의 꼬리 정맥으로 즉시 주사하여 이를 수행하였다. 또한, 이들 마우스는 3 및 10째일에 0.2 mL의 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20의 추가 용량을 정맥내로 투여받았다. 마우스의 대조군 (G2)은 0 및 7째일에 10 mg/kg 도세탁셀을 Q7Dx2 정맥내로 투여받았다. 마우스의 다른 대조군은 0 및 7째일에 30 mg/kg 도세탁셀을 Q7Dx2 정맥내로 투여받았다. 마우스의 추가 대조군에게 0, 3, 7 및 10째일에 정맥내로 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20를 투여하였다. 오직 API 완충액만을 투여받은 최종 대조군을 또한 연구에 포함시켰다 (G1). 종양 부피를 다양한 시점에 측정하였고 (도 1 및 표 21), 1500 ㎣ 종양 부피에 대한 생존율 %를 또한 관찰하였다 (도 2). 표 22는 생존에 대한 탁소테레® (도세탁셀) 및 PEG화된 rHuPH20의 공동투여의 효과의 분석을 제공한다. 각 군의 개별 동물을 기초로 하여 1500 ㎣ 종양 부피까지의 중위수 시간에 의해 중위수 생존 시간 (MST) (일)을 계산하였다. % T/C=(T/C)x100 (여기서, T는 처리군에서 1500 ㎣ 종양 부피까지의 중위수 생존 시간이고, C는 API 완충액 대조군에서 1500 ㎣ 종양 부피까지의 중위수 생존 시간임)에 의해 % T/C를 계산하였다. 국립암협회 (NCI) 기준에 의해, 125% 초과의 % T/C를 갖는 제품을 활성이라고 고려하였다. 수명의 증가 (ILS)는 [(T-C)/C]x100 (여기서, (T-C)는 처리군 (T)과 대조군 (C) 사이의 1500 ㎣ 종양 부피까지의 중위수 일자의 차이임)으로서 계산된 항종양 활성의 척도이다. NCI 기준에 의해, 25% 초과의 % ILS를 갖는 제품을 효과적이라고 고려하였다.
탁소테레® (도세탁셀) 및 PEG화된 rHuPH20의 공동투여는 Q7Dx2에 의해 제공된 10 mg/kg의 도세탁셀 단독 또는 PEG화된 rHuPH20 단독보다 유의하게 우수한 73일의 기간에 걸친 상승작용적 종양 성장 억제, 및 생존 시간 (1500 ㎣의 종양 부피에 도달하는데 걸리는 시간으로서 정의됨)의 증가를 초래하였다.
[표 21]
Figure pat00027

[표 22]
Figure pat00028
PEG화된 rHuPH20 및 리포좀 독소루비신의 공동투여의 항종양 효과를 평가하기 위해, PC3 종양을 보유하는 마우스에게 0, 7 및 14째일에 6 mg/kg 독실® 리포좀 독소루비신 및 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 투여하였다. 먼저, 독실® 리포좀 독소루비신 0.1 mL를 주사기로 뽑은 후 PEG화된 rHuPH20 0.1 mL를 주사기로 뽑은 직후, 용액 0.2 mL를 마우스의 꼬리 정맥으로 즉시 주사하여 이를 수행하였다. 또한, 이들 마우스는 3, 5, 10, 12째일에 0.2 mL의 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20의 추가 용량을 투여받았다. 마우스의 대조군은 0, 7 및 14째일에 6 mg/kg 독실® 리포좀 독소루비신을 정맥내로 투여받았다. 마우스의 다른 대조군에게 0, 3, 5, 7, 10, 12 및 14째일에 0.2 mL의 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20의 용량을 투여하였다. 오직 API 완충액만을 투여받은 최종 대조군을 또한 연구에 포함시켰다. 종양 부피를 다양한 시점에 관찰하였다 (도 3 및 표 23). 공동투여된 PEG화된 rHuPH20 및 리포좀 독소루비신의 항종양 효과가 리포좀 독소루비신 단독의 것보다 통계적으로 유의하게 우수한 것으로 관찰되었다.
[표 23]
Figure pat00029

B. PC-3M-luc-C6 골 전이 모델
문헌 [Jenkins et al. (Clin Exp Metast (2003) 20:745-756)]에 기재된 바와 같이 누드 마우스에서 PC-3M-luc-C6 골 전이 모델을 확립하였다. PC-3M-luc-C6 세포의 생체발광으로 인해, 마우스의 생존을 모니터링하는 것 이외에, 마우스를 영상화하여 PC-3M-luc-C6 전이를 시각화하였다. 간단히, 7 내지 10주령 nu/nu 수컷 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈)를 마취시키고, 멸균 DPBS 50 ㎕에 현탁된 3 × 106 PC-3M-luc-C6 세포 (생체발광 인간 전립선 암종 세포주)를 심장내 주사에 의해 0째일에 주사하였다. PC-3M-luc-C6 세포로부터의 전이에 대한 잠재성을 증가시키기 위해 비수술적 수단에 의해 심장의 좌심실에 마우스에게 주사하였다. 종양 세포의 심장내 주사는 폐를 우회하고, 동물 내의 여러 조직에 전이를 시딩하기 위해 세포를 일반 순환으로 분산시키기 위한 방법으로서 작용하였다. 좌심실로의 만족스러운 주사는 생체발광 영상화 (BLI)에 의해 수분 내에 검출가능하였으며, 전체 동물에 걸쳐 즉시 그러나 일시적 전신 생체발광 (마우스의 완전 청색 신호 BLI에 의해 표시됨)에 의해 확인하였다. 실패한 착상은 일반적으로 시간이 지남에 따라 동물의 흉부 영역 내에서만 단리되고 지속된 더 편재화된 신호를 생성하였다. 0 및 11째일에 흉부에서 높은 생체발광 신호를 나타낸 동물을 연구에서 제외시켰다. 0째일에 PC-3Mluc-C6 세포를 성공적으로 심장내 주사된 마우스 (n = 10 내지 13마리 마우스/군)를 4주 이하 동안 1주 2회 영상화하였고, 후속적으로 49째일까지 및 상기 시점을 지나서 생존에 대해 추적 조사하였다. 모든 마우스에서, 세포의 주사후 14일 내에 다양한 조직으로의 전이의 초기 징조가 관찰되었다. 관찰된 전이 패턴은 마우스의 가슴, 턱 및/또는 다리에서 발생된 병변을 나타내었다.
14째일에, 여러 치료 요법 중 하나로 마우스를 처리하였다. 한 세트의 대조 마우스에게 API 완충액 (10 mM Hepes 및 130 mM NaCl, pH 7.0)을 오직 14, 16, 18, 21, 23, 25, 28, 30 및 32째일에 투여하였다. 다른 두 세트의 마우스는 14 및 21째일에 30 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) Q7Dx2 또는 14, 21 및 28째일에 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) Q7Dx3을 각각 투여받았다. 다른 군의 마우스에게 14, 16, 18, 21, 23, 25, 28, 30, 32 및 35째일에 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 투여하였다. 다른 두 군의 마우스에게 혼합된 PEG화된 rHuPH20/탁소테레® (도세탁셀)를 투여하거나, 또는 순차적으로 PEG화된 rHuPH20, 이어서 탁소테레® (도세탁셀)를 투여하였다. 이들 군 중 제1 군에게 주사후 14, 21 및 28째일에 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) 및 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 투여하였다. 먼저, 탁소테레® (도세탁셀) 0.1 mL를 주사기로 뽑은 후 PEG화된 rHuPH20 0.1 mL를 주사기로 뽑은 직후, 용액 0.2 mL를 마우스의 꼬리 정맥으로 즉시 주사하여 이를 수행하였다. 또한, 이들 마우스는 16, 18, 23, 25, 30 및 32째일에 0.2 mL의 10,000 U/마우스 PEG화된 rHuPH20의 추가 용량을 정맥내로 투여받았다. 이들 군 중 제2 군은 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀)/10,000 U PEG화된 rHuPH20의 혼합물 대신에 동일한 용량을 투여받았으며, 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) 용량의 투여전 2시간에 10,000 단위 PEG화된 rHuPH20 용량을 투여하였다.
이전에 기재된 바와 같이 (문헌 [Jenkins et al. (2003) Clin Exp Metast 20:745-756]) IVIS® 영상화 시스템 (제노겐(Xenogen))을 이용하여 마우스를 영상화하고, 생체발광 PC-3M-luc-C6 전이를 시각화하기 위해 0, 11, 15, 18, 22, 25 및 29째일에 리빙 이미지(Living Image)® 소프트웨어 (제노겐)를 이용하여 분석하였다. 0 및 11째일에 초기 신호를 29째일까지 순차적 이미지에 의해 확인하고, 거의 모든 전이성 부위는 시간이 지남에 따라 생체발광의 점차적 증가를 나타내었다. 마우스의 턱 영역으로부터의 생체내 생체발광 신호는 치수, 하악골 또는 경부 림프절에서 미세전이에 상응하였다. 하지 생체내 신호는 경골 또는 대퇴골 다리뼈에서 확인된 전이성 병변에 상응하였다. 생체내에서 관찰된 흉부 신호는 심장, 폐 또는 흉강의 흉막 표면으로 시딩된 잔류 종양 세포와 관련되었다. 0째일에 성공적인 전신 주사를 나타내고 29째일까지 전이의 생체내 증거를 나타내는 영상을 갖는 마우스를 처리군의 분석에 포함시켰다.
14 및 21째일에 30 mg/kg로 정맥내로 투여된 탁소테레® (도세탁셀)는 MTD (최대 내약 용량)에서 가장 높은 용량 수준을 나타내었다. 11째일부터 29째일까지 찍은 영상은 약물이 처리된 마우스에서 모든 전이성 부위에서 유의한 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내었다. 11째일의 영상은 시간에 따라 점차적으로 소멸되는 대표적인 전이성 패턴을 갖는 마우스를 나타내었으며, 이는 29째일에 살아있는 잔존한 11마리의 마우스 중 10마리에서 29째일에 검출가능한 생체발광 강도의 감소에 의해 표시되었다. 발광 감소의 유사한 경향 (그러나 더 적은 정도)이 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) 처리된 마우스 (종양 세포 주사후 29째일에 12마리의 생존한 동물 중 9마리)의 영상에서 관찰되었다. 대조적으로, 대조 PEG화된 rHuPH20 처리된 동물은 전체 동물 생체발광의 순차적 재발의 증거를 나타내었으며, 이는 6마리의 생존한 마우스의 영상에서 볼 수 있는 바와 같이 29째일에 반동 신호에 의해 표시되었다. 혼합된 PEG화된 rHuPH20/탁소테레® (도세탁셀)를 투여받은 마우스 및 PEG화된 rHuPH20 및 탁소테레® (도세탁셀)를 순차적으로 투여받은 마우스의 29째일의 영상은 BLI 신호 양 및 강도의 변하지 않은 수준 내지 감소된 수준을 나타내었으며, 이는 골 부위로의 종양 파종의 안정화를 표시하였다. 특히, PEG화된 rHuPH20 및 탁소테레® (도세탁셀)의 순차적 용량을 투여받은 4마리의 마우스는 29째일에 완전히 신호가 없게 된 것으로 보였으며, 이는 가능한 치유 또는 장기간 생존자 효과를 표시하였다.
PC-3M-luc-C6의 심장내 주사후 49일에 각 군의 마우스의 생존율은 표 24에 제공된다. 10,000 단위 PEG화된 rHuPH20 및 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀)의 공동투여가 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀) 단독에 의한 처리보다 더 큰 항종양 활성을 초래하였다는 것이 관찰되었다.
[표 24]
Figure pat00030

실시예 15.
독성 연구 - PEG화된 rHuPH20 단독 및 도세탁셀과 조합된 PEG화된 rHuPH20
PEG화된 rHuPH20 단독 및 탁소테레® (도세탁셀)와 조합된 PEG화된 rHuPH20의 독성 연구를 위해, 누드 마우스에게 다양한 용량의 PEG화된 rHuPH20를 10 mg/kg 탁소테레® (도세탁셀)와 함께 투여하였다. 또한, PEG화된 rHuPH20 단독, 탁소테레® (도세탁셀) 단독 또는 API 완충액 단독을 투여받은 마우스의 대조군을 연구에 포함시켰다. 표 25에는 각 군의 마우스에 대한 치료 요법이 기재되어 있다. 독성 연구를 위해, 26일 이하 동안 연구 과정에 걸쳐 체중 및 생전 관찰을 모니터링하였다. 외부 임상시험수탁기관인 바이오콴트 인크(BioQuant Inc) (미국 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 전혈 및 혈청 시료에 대해 분별 및 혈청 임상 화학과 함께 전혈 화학을 평가하였다.
표 26 및 27 및 도 4 및 5에는 PEG화된 rHuPH20 단독, PEG화된 rHuPH20/탁소테레® (도세탁셀) 및 탁소테레® (도세탁셀) 단독의 투여후 체중의 변화가 기재되어 있다. 표 27 및 도 6에는 PEG화된 rHuPH20 단독, PEG화된 rHuPH20/탁소테레® (도세탁셀) 및 탁소테레® (도세탁셀) 단독이 투여된 마우스의 혈액 중 과립구의 개수가 기재되어 있고, 표 28 및 도 7에는 PEG화된 rHuPH20 단독, PEG화된 rHuPH20/탁소테레® (도세탁셀) 및 탁소테레® (도세탁셀) 단독이 투여된 마우스의 혈청 알부민 수준이 기재되어 있다. 건강한 마우스의 혈액 중 과립구의 개수에 대한 정상적인 범위는 1.2 내지 6.8×103 세포/㎕이고, 정상적인 혈청 알부민 범위는 2.5 내지 4.8 g/dL였다. 도세탁셀 및 PEG화된 rHuPH20의 공동투여가 호중구감소증의 유의한 증가 없이 잘 관용되었고 (과립구의 유의한 감소 없음에 의해 표시됨), 30 mg/kg의 최대 내약 용량 (MTD)에서 도세탁셀 처리 단독과 비교하여 더 양호하게 관용된 것으로 관찰되었다. 또한, 30,000 U/마우스 이하의 용량의 PEG화된 rHuPH20 단독의 투여가 잘 관용되었다.
[표 25]
Figure pat00031

[표 26]
Figure pat00032

[표 27]
Figure pat00033

[표 28]
Figure pat00034

[표 29]
Figure pat00035

실시예 16
PC3 이종이식편 모델에서 PEG화된 rHuPH20 단독의 항종양 활성
PEG화된 rHuPH20 단독의 항종양 활성을 나타내기 위해, 상기 실시예에 기재된 PC3 이종이식편 모델을 사용하여 반복된 및 지속된 투여후 종양 성장을 측정하였다.
A. PEG화된 rHuPH20의 반복된 정맥내 투여는 PC3 인간 전립선암 모델에서 항종양 효과를 생성한다.
PC3 인간 전립선암 모델을 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. 높은 간질액 압력을 갖는 종양을 생성시키기 위해, 무흉선 수컷 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 인간 PC3 전립선암 세포 (0.05 mL의 총 부피 중 마우스 당 1x106 세포)를 근육내로 (IM) 접종하였다. 종양을 아래와 같이 대조 비히클 및 다양한 효소 단위 (U) 양의 PEGPH20에 의한 정맥내 처리의 개시 전에 400 내지 500 ㎣의 평균 종양 부피로 성장시켰다. 다섯 군의 마우스를 사용하였다. 대조 비히클을 군 1 (11마리의 동물)에게 투여하고; 1000 U PEG화된 rHuPH20를 군 2 (8마리의 동물)의 각 동물에게 투여하고; 3,000 U PEG화된 rHuPH20를 군 3 (8마리의 동물)의 각 동물에게 투여하고; 10,000 U PEG화된 rHuPH20를 군 4 (8마리의 동물)의 각 동물에게 투여하고; 30,000 U PEG화된 rHuPH20를 군 5 (11마리의 동물)의 각 동물에게 투여하였다. PEG화된 rHuPH20 또는 대조 비히클을 각 동물에게 1주 3회 (Q3W), 격일로 (EOD), 월요일, 수요일 및 금요일 (총 8개의 용량의 경우 0째일에 1개의 용량, 및 이어서 3, 5, 7, 10, 12, 14 및 17째일)에 투여하였다.
비쥬얼소닉스 초음파 시스템 및 초음파 영상화 소프트웨어 프로그램을 이용하여 영상을 캡쳐하여, 연구 과정에 걸쳐 동물의 각 군에서 2, 4, 7, 11, 14 및 18째일에 종양 부피 (㎣)를 측정하였다. 데이터는 하기 도 8 및 표 30에 제공된다. 도 8의 오차 막대는 표준 오차를 나타내며, 이는 또한 표 30에 나열되어 있다. 결과는 반복된 정맥내 PEG화된 rHuPH20의 각 용량이 종양 성장의 감소를 유발하였다는 것을 나타내었으며, 이는 각 처리후 시점에 대조군과 비교하여 더 작은 종양 부피에 의해 입증되었다.
[표 30]
Figure pat00036

처리된 동물의 종양 중 HA의 제거를 나타내기 위해, 또한 상기 실시예 8B.2에 기재된 바와 같이 각 군의 동물으로부터의 종양을 단리하고, 고정시키고, 절개하였다. 상기 실시예에 기재된 바와 같이 5 ㎛ 섹션을 염색하였다. 면역조직화학을 위해, 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)을 사용하여 5 ㎛ 종양 섹션을 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, 캐나다)을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다. 결과는 각 처리된 동물의 종양에서 가시적 염색이 없었다는 것을 나타내었으며, 이는 1,000, 3,000, 10,000 및 30,000 U PEG화된 rHuPH20의 전신 투여가 이 인간 전립선암 동물 모델에서 원위 종양 내의 모든 검출가능한 히알루로난을 제거하였다는 것을 나타내었다.
B. PEG화된 rHuPH20에 대한 지속된 전신 노출은 종양 부피를 감소시킨다.
상기 기재된 바와 같이, 경골주위 착상에 의해 무흉선 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 인간 PC3 전립선암 세포 (0.05 mL의 총 부피 중 마우스 당 1x106 세포)를 근육내로 (IM) 접종하여, 10마리의 PC-3 경골주위 종양-보유 마우스를 생성시켰다. 대략 300 ㎣ 종양 부피를 갖는 PC-3 경골주위 종양 보유 마우스에게 대조 완충액 (API 완충액) (5마리의 동물 - 대조군) 또는 0.2 ml 부피 당 대략 20,000 효소 단위 (U) (12일에 걸쳐 각 마우스에게 투여된 0.7 mg/마우스 (35 mg/Kg))의 PEG화된 rHuPH20 (5마리의 동물)을 함유하는 알자(Alza) 펌프 (알제트(Alzet)® 소형-삼투압 펌프, 모델 No. 2002, 듀렉트 코포레이션(Durect Corporation), 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노)에 의해 피하로 (SC) 이식하였다. 각 군에 대해, 펌프는 14일에 걸쳐 시간 당 0.5 마이크로리터를 전달하였으며, 이는 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 군의 경우 시간 당 50 U; 1일 당 1,200 U와 동등하였다.
비쥬얼소닉스 초음파 시스템 및 초음파 영상화 소프트웨어 프로그램을 이용하여 영상을 캡처하여, 처리전 -1째일 및 12째일에 연구의 종결에 종양 부피 (㎣)를 측정하였다. 결과는 하기 표 31에 기재되어 있다. 표에서 주목된 바와 같이, 대조군 중 1마리 마우스는 연구의 결말 전에 죽은 것으로 발견되었다.
[표 31]
Figure pat00037

표 31에 기재되어 있는 바와 같이, PEG화된 rHuPH20 (12일에 걸쳐 총 20,000 U)에 대한 지속된 정맥내 노출은 대조 동물과 비교하여 종양 성장을 감소시켰다. 대조군 및 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 군에서 종양 부피 간에 12째일에 유의한 차이 (p < 0.0015)가 관찰되었다. 그러므로, PEG화된 rHuPH20의 연속적 투여는 인간 전립선 종양 이종이식편 모델에서 항종양 효과를 갖는다.
또한, -1, 0, 4, 6, 8 및 11째일에 마우스의 체중을 측정하였다. 이들 결과는 하기 표 32에 기재되어 있다.
[표 32]
Figure pat00038

실시예 17
다중 HA-발현 종양에서 PEG화된 rHuPH20의 생체내 HA 감소 활성 및 항종양 활성
A. PEG화된 rHuPH20의 전신 투여는 다수의 HA-발현 종양에서 HA를 제거한다.
상기 실시예 8B.2에 기재된 바와 같이 종양의 동물 모델의 다양한 종양 (하기 표 33에 나열됨)에서 비히클 또는 PEG화된 rHuPH20 (10,000 U/마우스 = 15 mg/Kg)의 정맥내 투여후 2시간에 히알루로난 (HA)의 발현을 평가하였다. 하기 기재된 바와 같이 다양한 암성 세포주로부터 모델을 생성시켰다.
(i) 세포주
동물 종양 모델을 제조하기 위해 사용된 암성 세포주는 하기 표 33에 나열되어 있다. 인간 호르몬 불응성 전립선암 세포주 (PC3, DU145); 인간 췌장암 세포주 (MIAPACA II, BXPC3); 인간 유방암 세포주 (MDA MB 231); 인간 결장암 세포주 (HCT116, HT29) 및 인간 비소세포 폐암 세포주 (NCI H460)를 ATCC (미국 버지니아주 머내서스)로부터 구매하였다. 더닝 랫트 전립선암 세포주 (Mat LyLu)는 맥길대학교 보건소 (캐나다 H3A 1A1 퀘벡주 몬트리올)의 의학, 생리학 및 종양학 부문으로부터의 친절한 선물이었다. 마우스 유방 세포주 (4T1-GFP)는 시드니 키멜 암센터 (SKCC, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터의 선물이었다. 인간 췌장암 세포주인 Capan-1 H2B는 시드니 키멜 암센터 (SKCC, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터의 선물이었다.
10% 소 태아 혈청 (FBS)과 함께 1.5 g/L 중탄산나트륨을 함유하도록 조정된, 2 mM L-글루타민을 갖는 햄(Ham) F12K 배지 (미디어테크 인크.(Mediatech Inc.))에서 PC3 세포를 유지시켰다. 10% FBS를 갖는 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지 (미디어테크 인크.)에서 MIAPACA II 세포를 유지시켰다. 10% FBS, 2 mM L-글루타민 및 250 nM 덱사메타손을 갖는 RPMI 1640에서 Mat LyLu 세포를 유지시켰다. 10% FBS을 갖는 RPMI 1640 배지에서 다른 세포를 유지시켰다. 상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 PC3 인간 전립선암 동물 모델을 생성시켰다. 대략 400-800 ㎣에 도달된 종양 부피를 갖는 동물을 선택한 후, 비히클 또는 PEG화된 rHuPH20 (10,000 U/마우스 = 15 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 처리하였다.
(ii) 동물 종양 모델
PC3 및 Du145 인간 전립선 이종이식편 모델
PC3 및 Du145 세포를 사용하여 아래와 같이 PC3 및 Du145 이종이식편 종양 모델을 각각 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크(Hank) 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 동물에 접종전 얼음 상에서 HBSS 중 50% 마트리겔®에서 2x107 세포/mL로 재현탁하였다. 무흉선 수컷 누드 마우스에게 경골주위로 좌측 뒷다리에서 (경골 골막에 근접하여) 근육내로 (IM) 이 세포 현탁액 0.05 mL를 접종하였다. 동물의 종양의 부피가 400 내지 500 ㎣에 도달된 것으로 보이는 경우, 수직축 2차원을 이용하여 비쥬얼소닉스 초음파를 이용하여 실제 종양 부피를 결정하였다.
동물들을 각각 3 내지 4마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누고, 비히클 (API 완충액) 및 PEG화된 rHuPH20 (10,000 U/마우스 = 대략 15 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 2시간에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
MIAPACA II, BXPC3 (인간 췌장암 모델), HCT116, HT29 (인간 결장암 모델) 및 NCI H460 (인간 비소세포 폐암 모델)
MIAPACA II, BXPC3, HCT116, HT29 및 NCI H460 세포를 사용하여 아래와 같이 MIAPACA II, BXPC3, HCT116, HT29 및 NCI H460 이종이식편 종양 모델을 각각 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 동물에 접종전 얼음 상에서 HBSS에서 2x107 세포/mL로 재현탁하였다. 무흉선 암컷 누드 마우스에게 경골주위로 좌측 뒷다리에서 (경골 골막에 근접하여) 근육내로 (IM) 세포 현탁액 0.05 mL를 접종하였다. 동물의 종양의 부피가 400 내지 500 ㎣에 도달된 것으로 보이는 경우, 비쥬얼소닉스 초음파를 이용하여 실제 종양 부피를 결정하였다. 동물들을 각각 3 내지 4마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누고, 비히클 (API 완충액) 및 PEG화된 rHuPH20 (10,000 U/마우스 = 대략 15 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 2시간에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
MDA MB 231 인간 유방암 이종이식편 모델
MDA MB 231 세포주를 사용하여 아래와 같이 MDA MB 231 인간 유방 종양 이종이식편 모델을 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 접종전 얼음 상에서 HBSS 용액 중 50% 마트리겔®에서 4x107 세포/mL로 재현탁하였다. 무흉선 암컷 누드 마우스에게 유방 지방대에서 동위에서 세포-마트리겔® 현탁액 0.05 mL를 접종하였다. 불량한 종양 취득으로 인해, 연구를 위해 더 많은 종양을 보유하는 동물을 생성시키기 위해 종양 조직 이식을 수행하였다. 500 ㎣ 초과의 종양 부피를 갖는 동물을 선택하고, 이들 동물로부터 종양을 절제하고, 멸균 배지에서 헹구고, 칼날에 의해 1 mm 입방체로 잘게 잘랐다. 그 후, 투관침을 사용하여 이들 종양 조직을 암컷 누드 마우스의 유방 지방대로 이식하였다. 고형 종양 덩어리의 길이 (L) 및 너비 (W)를 캘리퍼스로 1주 2회 측정하고, 종양 부피 (TV)를 (L x W2)/2로서 계산하였다. 그의 종양 부피가 약 1000 ㎣에 도달된 경우, 동물들을 각각 5마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누고, 두 군의 동물들을 비히클 또는 PEG화된 rHuPH20 (3000 U/마우스 = 대략 4.5 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 3일에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
Capan-1 인간 췌장 종양 이종이식편 모델
Capan-1 HB2 세포주를 사용하여 아래와 같이 Capan-1 인간 췌장 이종이식편 종양 모델을 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 접종전 얼음 상에서 HBSS 용액에서 5x107 세포/mL로 재현탁하였다. 무흉선 암컷 누드 마우스에게 피하로 세포 현탁액 0.1 mL를 접종하였다. 고형 종양 덩어리의 길이 (L) 및 너비 (W)를 캘리퍼스로 1주 2회 측정하고, 종양 부피 (TV)를 (L x W2)/2로서 계산하였다. 그의 종양 부피가 대략 약 500 내지 700 ㎣에 도달된 경우, 동물들을 각각 3 내지 4마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누었다. 이들 군의 동물들을 비히클 (API 완충액) 및 PEG화된 rHuPH20 (5000 U/마우스 = 대략 7.5 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 3일에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
4T1-GFP 유방암 종양 모델
4T1-GFP 세포주를 사용하여 아래와 같이 4T1-GFP 유방암 모델을 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 4T1-GFP 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 접종전 얼음 상에서 HBSS에서 2x106 세포/mL로 재현탁하였다. 암컷 Balb/c 마우스에게 유방 지방대에서 동위에서 세포 현탁액 0.05 mL를 접종하였다. 고형 종양 덩어리의 길이 (L) 및 너비 (W)를 캘리퍼스로 1주 2회 측정하고, 종양 부피 (TV)를 (L x W2)/2로서 계산하였다. 그의 종양 부피가 대략 500 내지 700 ㎣에 도달된 경우, 동물들을 각각 3 내지 4마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누고, 군들을 비히클 및 PEG화된 rHuPH20 (10,000 U/마우스 = 대략 15 mg/Kg)의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 2시간에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
Mat LyLu 랫트 전립선 종양 모델
Mat LyLu 세포주를 사용하여 아래와 같이 Mat LyLu 종양 모델을 생성시켰다. 대략 80% 전면성장의 종양 세포를 트립신화하고, 수확하고, HBSS (행크 균형 염 용액, 미디어테크 인크.)에서 1회 세척하고, 접종전 얼음 상에서 HBSS에서 1x106 세포/mL로 재현탁하였다. 무흉선 수컷 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 근육내로 랫트 Mat LyLu 전립선암 세포 (0.04 mL의 총 부피 중 마우스 당 2x105 세포)를 접종하였다. 종양 부피가 400 내지 500 ㎣에 도달된 것으로 보이는 경우, 비쥬얼소닉스 초음파를 이용하여 실제 부피를 결정하였다. 동물들을 각각 3 내지 4마리의 동물의 두 군으로 무작위로 나누고, 동물들을 비히클 및 PEG화된 rHuPH20의 정맥내 주사에 의해 각각 처리하였다. 종양 조직을 처리후 2시간에 수확하고, 추가 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액 (NBF)에서 고정시켰다.
(iii) 면역조직화학
각 동물 모델 (상기 실시예 17A(ii))로부터의 고정된 종양을 5 ㎛ 섹션으로 절단하였다. 수확된 종양 중 히알루로난 (HA)의 양을 평가하기 위해, 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)을 사용하여 섹션을 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, 캐나다) 또는 텍사스 레드(Texas Red)-표지된 스트렙타비딘 (4T1-GFP 종양 섹션에 대해; 벡터 랩스, 캐나다)를 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 현미경을 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다.
+++ (시야의 80% 초과의 진한 염색) 내지 +/- (희박 염색), - (가시적 염색 없음) 범위의 점수화 시스템을 이용하여 섹션 (종양 면적 및 관련된 기질 면적) 중 형광 강도의 수준에 의해 섹션 중 HA 발현을 등급화하였다. 결과는 하기 표 33에 제공된다. 표는 마우스 이종이식편 모델을 생성시키기 위해 사용된 각 세포주의 명칭, 종양 및 종 (이로부터 세포주를 단리함)의 유형을 나타낸다. 비히클 및 PEG화된 rHuPH20에 의한 처리후 각 종양 유형 모델에 대해 HA 발현의 정도를 나타낸다. 결과는 모든 HA-발현 종양에서 PEG화된 rHuPH20에 의한 처리에 의해 HA 발현이 감소되었다는 것을 나타내었다. 표에서 주목된 바와 같이, HT29 종양 섹션 및 Capan-1 종양 섹션 (비히클이 주사된 동물로부터)은 PEG화된 rHuPH20 투여 전에 세포주위 구역에서 음성 염색 및 기질에서 양성 염색을 나타내었다.
[표 33]
Figure pat00039

B. 예시적 HA-풍부 종양에서 PEG화된 rHuPH20에 의한 종양 HA의 용량-의존적 제거
상기 기재된 바와 같이 생성된, 한 예시적 HA-풍부 (++) 종양 모델의 동물인 4T1-GFP를 비히클 및 다양한 양 (마우스 당 10, 100, 1,000, 3,000 및 10,000 효소 단위 (U))의 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리하였다. 이 처리의 투여후 3일 (72시간)에, 마우스로부터의 경골주위 종양을 수확하고, 통상적인 완충 포르말린에서 고정시켰다. 상기 실시예 17A에 기재된 바와 같이 이차 시약으로서 아비딘-텍사스 레드를 사용하여 면역조직화학 (IHC)에 의해 종양 중 히알루로난 (HA)의 수준을 평가하였다. 또한, 종양 섹션에 대해 헤마톡실린/에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. 결과는 100, 1,000, 3,000 및 10,000 U PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 동물로부터의 종양 섹션 중 HA 염색의 용량-의존적 감소를 나타내었다. 1,000, 3,000 및 10,000 U PEG화된 rHuPH20을 투여받은 동물로부터의 섹션에서, 가시적 염색이 관찰되지 않았다. 이들 결과는 PEG화된 rHuPH20의 단일 전신 투여가 3일 이상 동안 유방 원위 종양 모델에서 히알루로난을 감소시킬 수 있다는 것을 나타내었다.
C. PEG화된 rHuPH20 투여는 HA-풍부 종양 모델에서 종양 성장을 억제하고 생존을 증가시킨다.
PEG화된 rHuPH20 단독의 반복된 투여가 다수의 종양 모델 시스템에서 항종양 효과를 생성한다는 것을 입증하기 위해, 이전 실시예에 나열된 세포주를 사용하여 생성된 3종의 상이한 마우스 종양 모델에서 종양 성장 및 생존을 평가하였다. 이들 연구에서, 2종의 상이한 전립선암 모델 (PC3 (HA +++, 상기 실시예 17A에서 결정됨) 및 Mat LyLu (HA +, 상기 실시예 17A에서 결정됨)) 및 1종의 유방암 모델 (4T1-GFP (HA ++, 상기 실시예 17A에서 결정됨)을 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리하였다.
이들 연구를 위해, 총 6군의 마우스 (각 종양 모델에 대해 각각 하나의 대조군 및 실험군) (n = 군 당 6 내지 8마리의 동물)에게 하기 기재된 바와 같이 PEG화된 rHuPH20를 투여하고, 종양 부피 및 생존에 대해 평가하였다. 각 군에 대해, 처리 전에 종양 성장을 측정한 후, 비쥬얼소닉스 영상화 마이크로-초음파 시스템을 이용하여 처리 과정 전반에 걸쳐 모니터링하였다. 하기 기재된 바와 같이 1500 ㎣ 종점 종양 부피를 빈사 상태로 균등화함으로써 동물 생존에 대한 PEG화된 rHuPH20 처리의 효과를 평가하였다.
상기 기재된 바와 같이 PC3 인간 전립선암 모델을 생성시켰다. 높은 간질액 압력을 갖는 종양을 생성시키기 위해, 무흉선 수컷 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 인간 PC3 전립선암 세포 (0.05 mL의 총 부피 중 마우스 당 1x106 세포)를 근육내로 접종하였다. 종양을 마우스 당 3,000 효소 단위 (U)의 PEG화된 rHuPH20 또는 대조 비히클 (API-완충액) (n = 군 당 7마리 마우스)에 의한 정맥내 처리의 개시 전에 400 내지 500 ㎣의 평균 종양 부피로 성장시켰다. 동물들을 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 및 24째일에 Q3dx9 스케쥴 (3일마다 1회, 총 9개의 용량)에 따라 3일마다 1회 처리하였다.
상기 기재된 바와 같이, BALB/c 암컷 마우스에게 동위에서 유방 지방대에서 4T1-GFP 유방암 세포 (0.05 mL의 총 부피 중 마우스 당 5x105 세포)를 접종함으로써 4T1-GFP 유방 종양 모델을 생성시켰다. 종양을 정맥내 처리의 개시 전에 100 ㎣의 평균 종양 부피로 성장시켰다. 처리를 위해, 마우스에게 격일로 (EOD) (총 6개의 용량 (Q2dx6 요법)의 경우 0, 2, 4, 7, 9 및 11째일에) API-완충액 (대조군) 또는 마우스 당 3,000 효소 단위 (U)의 PEG화된 rHuPH20을 주사하였다 (n = 군 당 6 내지 8마리 마우스).
Mat LyLu 전립선 종양 모델을 위해, 높은 간질액 압력을 갖는 종양을 생성시키기 위해, 무흉선 수컷 누드 마우스에게 우측 경골 골막에 인접하여 랫트 Mat LyLu 전립선암 세포 (0.04 mL의 총 부피 중 마우스 당 2x105 세포)를 근육내로 접종하였다. 종양을 처리의 개시 전에 100 ㎣의 평균 종양 부피로 성장시켰다. 처리를 위해, 동물들에게 API-완충액 (대조군) 또는 3000 U PEG화된 rHuPH20을 정맥내로 투여하였다 (n = 군 당 6 내지 8마리 동물). 격일로, 1주 3회, 월요일, 수요일 및 금요일에 (Q2dx6) 0, 2, 4, 7, 9 및 11째일에 용량을 투여하였다. 그러나, 대조군의 Mat LyLu 종양이 11째일 내에 임계 부피 또는 2,000 ㎣ 초과에 도달하였으며, 그러므로 인도적인 이유로 희생시켰다.
PC3-종양 보유 동물의 각 군에 대해, 비쥬얼소닉스 (VS) 영상화 마이크로-초음파 시스템을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 4T-1 및 Mat LyLu-종양 보유 동물에서 종양 성장을 캘리퍼스로 측정하였다. 식 0.4 (a x b2) (여기서, "a"는 긴 종양 직경이고, "b"는 짧은 수직 직경임)을 이용하여 캘리퍼스로 2차원 직경 측정에 의해 순차적 종양 부피를 얻었다.
시간이 지남에 따라 종양 부피 및 생존을 평가한 이 연구의 결과는 아래 섹션에서 논의된다. 종양 부피 데이터는 하기 섹션 (i)에 기재되어 있고, 표 33 내지 36, 및 도 9 내지 14 의 상단 패널에 제공되어 있다. 생존 데이터는 하기 섹션 (ii)에 기재되어 있고, 표 38 및 도 9 내지 14 의 바닥 패널에 제공되어 있다.
(i) 종양 부피 효과
VS-초음파 및 캘리퍼스 종양 부피를 ㎣로 표시하였다. PC3 종양-보유 동물의 두 군 (대조 및 3000 U PEG-rHuPH20)에 대해, -1, 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 31, 34, 38, 41 및 45째일에 측정치를 취하였다. 결과는 표 34에 기재되어 있다. 1500 ㎣ 초과에 도달한 종양을 갖는 동물을 인도적인 이유로 하기 기재된 바와 같이 희생시켰다. 그러므로, PC3 모델에 대해, 동물의 100%가 이 종양 중량에 도달했기 때문에, 27째일 후 측정하지 않았다. 4T1-GFP-보유 종양의 두 군에 대해, 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 및 21째일에 캘리퍼스 측정치를 취하였다. 결과는 표 35에 기재되어 있다. Mat Ly Lu-보유 종양의 두 군에 대해, 0, 2, 4, 7 및 9째일에 캘리퍼스 측정치를 취하였다. 결과는 표 36에 기재되어 있다.
[표 34]
Figure pat00040

[표 35]
Figure pat00041

[표 36]
Figure pat00042

종양 부피 측정에 의해 나타낸 바와 같이, PEG화된 rHuPH20의 반복된 정맥내 투여는 각 모델에서 종양 내의 HA의 양과 상관관계 있게 종양 성장을 감소시켰다 (상기 실시예 17A에서 결정됨). 예를 들어, 각 종양 모델에서 PEG화된 rHuPH20 처리군 및 대조군 사이의 종양 부피의 유의한 차이 (PC3 전립선암 모델에서 27째일에 p = 0.001; 4T1 유방암 모델에서 14째일에 p = 0.04; 및 Mat LyLu 전립선암 모델에서 9째일에 p = 0.02).
하기 식을 이용하여 각 개별 종양 모델에 대한 종양 성장 억제 백분율 (TGI)을 계산하였다:
% TGI = [1 - (T n -T 0 ) ÷ (C n -C 0 )] x 100%
여기서, "Tn"은 PEG화된 rHuPH20의 최종 용량 후 "n"째일 (여기서, PC3, 4T1 및 Mat LyLu 모델에 대해 각각 27째일, 14째일 및 9째일)에 처리군 (PEG화된 rHuPH20을 투여받은 동물)에 대한 평균 종양 부피이고; "T0"은 처리전 0째일에 상기 처리군에서 평균 종양 부피이고; "Cn"은 "n"째일 (여기서, PC3, 4T1 및 Mat LyLu 모델에 대해 각각 27째일, 14째일 및 9째일; 비히클의 최종 용량 후 어떤 시점)에 상응하는 대조군에 대한 평균 종양 부피이고; "C0"은 처리전 0째일에 대조군에서 평균 종양 부피이다. 1,500 ㎣의 종양 부피에 도달할 때까지 걸린 평균 시간으로서 각 종양 모델에 대한 종양 부피까지의 시간 (TTV)을 계산하였다.
[표 37]
Figure pat00043

표 37에 나타낸 바와 같이, 이 연구의 결과는 PC3 전립선, 4T1 유방 및 Mat LyLu 전립선 종양 모델에서 각각 전신 PEG화된 rHuPH20 투여에 의한 70%, 60% 및 34% 종양 성장 억제율 (TGI)을 나타내었다 (각각 투여후 27째일, 14째일 및 9째일에).
도 9 내지 14 및 표 34 내지 37에 나타낸 바와 같이, 종양 부피에 대한 효과는 종양 HA 발현의 수준 (상기 실시예 17A에서 결정됨)과 상관관계가 있었다. 예를 들어, 종양 부피는 PEG화된 rHuPH20에 의해 종양 (PC3 (HA +++)에서 가장 높은 상대적 HA 발현을 갖는 모델에서 최대 (TGI = 70%) 감소하였고, 종양 (Mat LyLu (HA +)에서 가장 낮은 상대적 HA 발현을 갖는 모델에서 최소 (TGI = 34%) 감소하였다. 종양 부피의 감소는 4T1-GFP 모델에서 중간 (TGI = 60%)이었으며, 이는 상기 실시예 17A에서 ++의 상대적 HA 수준을 나타내었다.
(ii) 생존 효과
각 시점에서 각 군에서 "생존한" 동물의 백분율을 결정함으로써, 각 모델에서 생존에 대한 전신 반복된 PEG화된 rHuPH20 투여의 효과를 평가하였다. 이 연구를 위해, 종점으로서 1500 ㎣ 이상의 종양 부피를 선택하였으며, 이를 빈사 (비-생존) 상태와 유사한 것으로 고려하였다. 그러므로, 1500 ㎣ 미만의 종양 부피를 갖는 동물을 생존으로 고려한 반면, 1500 ㎣ 이상의 종양 중량을 갖는 동물을 병적 상태로 고려하였다.
다양한 모델에 대한 PEG화된 rHuPH20의 반복된 투여에 의한 생존의 효과는 도 9 내지 14 (바닥 패널)에 기재되어 있다. 도 9 내지 14 (바닥 패널)에 나타낸 바와 같이, PEG화된 rHuPH20에 의한 처리는 대조 처리와 비교하여 PC3, 4T1-GFP 및 Mat LyLu 종양 모델에서 각각 빈사 상태라고 지칭되는 상태에 도달하는데 2배, 1.7배 및 1.5배 지연을 초래하였다. 그러므로, 생존에 대한 효과는 또한 종양 내의 HA의 상대적 발현 (상기 실시예 17A에 측정됨)과 상관관계가 있었다.
각 군의 마우스가 1500 ㎣ 종양 부피 종점이라고 지칭된 상태에 도달하기 전에 중위수 시간으로서 각 동물 군에 대해 중위수 생존 시간 (MST) (일)을 결정하였다. 하기 식을 이용하여 대조와 비교하여 PEG화된 rHuPH20에 의한 항종양 활성의 척도인 퍼센트 ILS (수명의 증가)를 각 모델에 대해 계산하였다:
% ILS = [(T-C)/C] x 100
여기서, "T"는 PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 군의 MST이고, "C"는 대조군에 대한 MST이다. 국립암협회 (NCI) 기준에 의해, 25% 초과의 % ILS를 갖는 처리를 효과적이라고 고려하였다. 결과는 하기 표 38에 요약되어 있다.
[표 38]
Figure pat00044

상기 표 38에 기재된 바와 같이, PEG화된 rHuPH20에 의한 전신 처리는 PC3 전립선, 4T1 유방 및 Mat LyLu 전립선 종양 모델에서 각각 97%, 73% 및 56%의 수명의 증가 (ILS)를 초래하였으며, 이는 다시 상기 실시예 17A에 기재된 바와 같은 종양 내의 측정된 상대적 HA 수준 (각각 +++, ++ 및 +)과 상관관계가 있었다.
이들 결과는 PEG화된 가용성 히알루로니다제 단독의 반복된 전신 투여가 수많은 HA-풍부 종양 모델에서 항암 치료로서 효과적이고, 항종양 효과의 정도가 종양에서 HA의 발현과 상관관계가 있다는 것을 나타내었다.
(iii) 종양에서 HA의 감소
추가로, 종양 조직 히알루로난의 면역조직화학적 검출을 위해 최종 PEG화된 rHuPH20 또는 대조 처리 후 종양을 수확하였다. 이 연구를 위해, PC-3 종양을 최종 처리 (20째일)후 72시간에 수확하고, 4T1-GFP 종양을 최종 처리 (14째일)후 72시간에 수확하고, Mat LyLu 종양을 최종 처리 (12째일)후 24시간에 수확하였다. 수확된 종양을 통상적인 완충 포르말린 (NBF)에서 고정시키고, 5 ㎛ 섹션을 절단하고, 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)을 사용하여 염색하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, PC-3 및 Mat LyLu 종양을 위해 FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, 캐나다) 또는 텍사스 레드-표지된 스트렙타비딘을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 도립 형광 현미경 또는 동일한 영상화 시스템을 갖는 자이스(ZEISS) 오버헤드 스코프 (칼자이스, 인크.(Carl Zeiss, Inc.))를 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다. 결과는 대조 종양에서 강한 HA 염색을 나타내었으나, PEG화된 rHuPH20에 의해 처리된 동물로부터의 종양에서 검출가능한 히알루로난 염색을 나타내지 않았으며, 이는 처리에 의해 유발된 종양 히알루로난의 지속된 감소를 나타내었다.
실시예 18
PEG화된 rHuPH20의 혈액 뇌 장벽 투과성 및 뇌 종양 모델의 처리
PEG화된 rHuPH20이 동물 모델에서 뇌 종양 내의 히알루론산 (HA)을 감소시킬 수 있고 방사선요법과 조합하여 생존을 증가시킬 수 있다는 것을 입증하기 위해 연구를 수행하였다.
A. 뇌 종양 모델
뇌 종양 모델을 생성시키기 위해, 아래와 같이 다양한 군의 각 마우스의 입체공간적 구조를 갖는 우측 대뇌 반구에 행크 배지 2 ㎕ 중 4x104 PC3 세포를 주사하였다.
B. 혈액 뇌 장벽 투과성 및 정맥내로 투여된 PEG화된 rHuPH20에 의한 뇌 HA의 분해
정맥내로 투여된 PEG화된 rHuPH20이 뇌 종양 내의 HA를 분해할 수 있다는 것을 입증하기 위해 이 연구를 수행하였다. 상기 실시예 18A에 기재된 뇌 종양 모델 동물의 상이한 군에게 3,000 효소 단위 (U) PEG화된 rHuPH20 및 대조 완충액 (API)을 정맥내로 투여하였다. 동물들을 4시간 후 희생시켰다. 분석을 위해 후속적으로 뇌를 수집하고 절개하였다.
종양 모델 동물에서 저항력저하 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 평가를 위해, 동물의 서브세트에 대해 BBB 투과성 검정을 수행하였다. 이 검정을 위해, 희생시키기 1시간 전에 이들 마우스의 꼬리 정맥으로 2% 에반스 블루 염료 0.1 mL를 정맥내로 주사하였다. 대뇌 섹션을 만들고, 하기 기재된 바와 같이 시각화하였다. 대뇌 섹션 내의 블루 염료는 에반스 블루와 복합체를 이룬 큰 혈청 단백질 (67 kDa)인 알부민의 존재를 나타내었으며, 이는 증가된 BBB 투과성 (BBB의 상대적 "누출")을 나타내었다.
처리 후 뇌 종양 내의 HA의 양의 평가를 위해 뇌 섹션을 바이오틴 표지된 히알루로난 결합 단백질 (HABP-bio) (세이카가쿠, 일본)과 함께 인큐베이션하였다. 일차 시약을 제거하기 위해 세척한 후, FITC-표지된 스트렙타비딘 (벡터 랩스, 캐나다)을 이차 시약으로서 사용하였다. DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 시약을 사용하여 핵을 대비-염색하였다. 뇌 내의 종양을 확인하기 위해 헤마톡실린/에오신 염색을 또한 수행하였다. 인사이트 파이어와이어 디지털 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠, 미국 미시건주)에 커플링된 니콘 이클립스 TE2000U 형광 현미경 또는 동일한 영상화 시스템을 갖는 라이츠(Leitz) 오버헤드 스코프를 통해 현미경 사진을 캡쳐하였다.
결과는 대조 종양에서 강한 HA 염색를 나타내었으나, PEG화된 rHuPH20이 주사된 동물에서 검출가능한 HA 염색을 나타내지 않았으며, 이는 이 효소가 정맥내로 투여시 뇌 종양 내의 HA를 감소시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
C. PEG화된 rHuPH20 처리후 동물의 생존
PEG화된 rHuPH20 단독에 의한 처리후 뇌 종양 모델 동물의 생존을 평가하기 위해, 20마리의 PC3 뇌 종양 모델 마우스 (상기 실시예 18A에 기재됨)를 주사후 12째일에 머무르게 했다. 5000 효소 단위 (U)의 PEG화된 rHuPH20 (10마리의 마우스) 또는 API 완충액 (10마리의 대조 마우스)을 4주 동안 1주 2회 마우스에게 꼬리 정맥으로 주사하였다.
동물의 사멸을 모니터링하여 시간이 지남에 따른 동물의 생존율을 모니터링하였다. 도 15에 기재된 결과는 PEG화된 rHuPH20 처리된 동물과 대조 동물 간에 생존의 유의한 변화가 없었다는 것을 나타내었다.
D. 방사선요법과 조합된 PEG화된 rHuPH20의 생존에 대한 효과
방사선과 조합된 PEG화된 rHuPH20에 의한 처리 후 뇌 종양 모델 동물의 생존을 평가하기 위해 3개의 군의 PC3 뇌 종양 모델 마우스 (상기 실시예 18A에 기재됨)를 사용하였다.
이 연구를 위해, 27마리의 종양-보유 마우스를 접종후 13째일에 체중을 기초로 하여 3개의 군 (A, B 및 C)으로 단계지었다. 각 군에 대해, PC3 세포의 접종 후 13째일에 투여를 개시하였다. q3d x 4 요법 (3일마다 1회, 총 4회)을 사용하여 각 처리군/대조군에게 투여하였다. 각 투여시, 대조군인 군 A에게 100 ㎕ API 완충액 단독의 정맥내 주사를 제공하였다. 군 B를 전뇌 방사선 (5 Gy)으로 처리하였다. 조합 치료요법 군인 군 C를 5000 효소 단위의 PEG화된 rHuPH20 (API 완충액 100 ㎕)으로 처리한 다음 4시간 후에 전뇌 방사선 (3 Gy)으로 처리하였다. 이 투여 요법은 하기 표 39에 기재되어 있다.
[표 39]
Figure pat00045

동물의 사멸을 모니터링함으로써 시간이 지남에 따른 각 군의 동물의 생존을 모니터링하였다. 도 16 및 표 40에 기재된 결과는 대조 (처리 없음)보다 조합 처리 (방사선 및 PEG화된 rHuPH20; 군 C)에 의한 생존의 개선 (최대 45% 더 긴 생존), 및 방사선 단독 (군 B)보다 조합 처리 (방사선 및 PEG화된 rHuPH20; 군 C)에 의한 생존의 개선 (최대 10% 더 긴 생존)을 나타내었다.
[표 40]
Figure pat00046

실시예 19
동물에서 PEG화된 rHuPH20의 약동학 특성
작용제의 정맥내 투여 후 수많은 시점에 혈액 시료 중 혈장 히알루로니다제를 측정함으로써 할런 (미국 인디아나주 인디애나폴리스)으로부터의 ICR 마우스, 랫트 및 필리핀 원숭이에서 PEG화된 rHuPH20 (상기 실시예 7에 기재된 바와 같이 mPEG-SBA-30K에 의해 제조됨)의 약동학 특성을 평가하였다.
마우스에서, 70시간의 기간에 걸쳐 연구를 수행하였다. 이 연구의 "0시"에, 할런으로부터의 암컷 ICR 마우스 (각각 19 내지 25 그램의 체중)에게 가측 꼬리 정맥을 통해 0.5 mg/ml로 희석된 대략 3000 U 정제된 PEG화된 rHuPH20을 주사하였다. 대부분의 경우에, 이후 평가를 위해 처리후 5분에 안구뒤 얼기로부터의 혈액을 유리 모세관에 의해 취하였다. 그 후, 동물을 우리로 돌려보냈다. PEG화된 rHuPH20의 투여후 다양한 시점에, 5% 이소플루란으로 간단히 마취시킨 동물로부터 안구뒤 얼기로부터의 혈액 시료를 유리 모세관에 의해 취하였다. 응고를 방지하기 위해 자색-탑 마이크로테이너(Microtainer) 혈액 수집 튜브에서 각 시료로부터의 혈액을 EDTA와 혼합하였다. 탁상용 원심분리 상에서 5000 rpm에서 15분 동안 튜브를 원심분리하고, 혈장을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 히알루로니다제 활성을 결정하기 위한 검정 전에 혈장을 -20℃에서 동결시켰다.
다양한 시점에서 혈장 히알루로니다제 활성의 결정을 위해, 혈장에 대해 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 표준 미세탁도 플레이트 검정을 수행하여 혈장 중 히알루로니다제 활성의 양을 측정하였다. 마우스의 적은 총 혈액 부피 때문에, 연구 과정 전체에 걸쳐 동물 당 오직 2 또는 3회의 혈액 채취를 수행하였다. 따라서, 전체 시간 과정에 걸쳐 약동학 곡선을 다중 동물로 적합화하였다. 그래프패드 프리즘® (그래프패드 소프트웨어, 인크., 미국 캘리포니아주 라호야) 소프트웨어 또는 윈넌린 소프트웨어 (파사이트(Pharsight)® 코포레이션, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 PK 곡선 적합화를 수행하였다.
랫트 및 필리핀 원숭이에서 유사한 연구를 수행하였다. 랫트에서, 96시간의 기간에 걸쳐 연구를 수행하였다. 마우스에 대한 상기 기재된 연구와 유사한 연구에서, 랫트에게 125,000 U/kg (대략 4 mg/kg) PEG화된 rHuPH20을 투여하였다. 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 표준 미세탁도 플레이트 검정을 사용하여 다양한 시점에서 혈장 히알루로니다제 활성을 모니터링하였다. 시점 마다 3마리의 랫트를 평가하였다. 필리핀 원숭이에서, MPI 28일 정맥내 용량 연구를 수행하였으며, 여기서 2마리의 암컷 원숭이에게 PEG화된 rHuPH20을 0.5, 2.0 및 6.0 mg/kg의 상승 용량으로 투여하였다. 후속적 투여 전에 원숭이가 모든 PEG화된 rHuPH20를 세정하도록 하였다. 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 표준 미세탁도 플레이트 검정을 이용하여 96시간에 걸쳐 다양한 시점에 혈장 히알루로니다제 활성을 모니터링하였다. 마우스, 랫트 및 필리핀 원숭이에 대한 PEG화된 rHuPH20의 정맥내 용량 비교는 표 41에 기재되어 있다.
[표 41]
Figure pat00047

약동학 회귀 곡선을 유도된 데이터에 대해 적합화하고, 그래프패드 프리즘® (그래프패드 소프트웨어, 인크., 미국 캘리포니아주 라호야)의 하기 식을 이용하여 혈장 반감기 (T1/2)를 결정하였다.
비선형 회귀를 위한 프리즘 소프트웨어를 이용하여 혈장 반감기를 결정하였다. 정맥내 주사 후 반감기 곡선 적합화를 위한 표준화된 식은 아래와 같다:
C p = C 0 exp(-k el )t
여기서, kel = 0.693/T1/2
t = 시험 용품 투여 후 시간
C0은 이론적 출발 값이고,
Cp는 시간 t에 측정된 값이다.
하기 식을 이용하였다:
하나의 구성성분 지수적 붕괴:
Y=span1*exp (-kelX) + 플래토;
여기서 kel은 0.693/T1/2와 동등한 붕괴 속도 상수이고, 플래토는 붕괴가 무한대에 접근할 때 점근값이다.
2-구성성분 지수적 붕괴:
Y= span1*exp (-k1 el X) + span2*exp (-k2 el X) + 플래토;
여기서 k1el 및 k2el은 각각 span 1 및 span 2에 대한 붕괴 속도 상수이고, 플래토는 붕괴가 무한대에 접근할 때 점근값이다.
농도-시간 데이터의 2-구획 모델링에 의해 유도된 상기 연구의 결과는 하기 표 42에 기재되어 있으며, 여기서 PK 파라미터 기재는 표 43에 기재되어 있고, T1/2 알파는 분포기 반감기이고, T1/2 베타는 소실기 반감기이고, MRT는 평균 체류 시간이다. 마우스에서, 혈장 중 효소의 알파기 (분포기) 반감기 및 베타기 (소실기) 반감기는 각각 0.696시간 및 19.23시간이었다. 마우스에서의 결과는 도 17에 나타내며, 여기서 혈장 히알루로니다제의 초기 급속 분해가 관찰되었고 (분포기), 이어서 시간이 지남에 따른 저속 점차적 붕괴 (소실기)가 관찰되었다. 랫트에서, 혈장 중 효소의 알파기 (분포기) 반감기 및 베타기 (소실기) 반감기는 각각 1.13시간 및 7.48시간이었다. 필리핀 원숭이에서, 혈장 중 효소의 알파기 (분포기) 반감기 및 베타기 (소실기) 반감기는 각각 1.13시간 및 21.75시간이었다.
[표 42]
Figure pat00048

[표 43]
PK 파라미터 기재
실시예 20
PEGPH20의 단일 용량 정맥내 투여 후 혈장 히알루로니다제 수준의 약동학 분석
PEGPH20의 단일 용량 투여 후 할런 (미국 인디아나주 인디애나폴리스)으로부터의 ICR 마우스 및 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 랫트 (할런)에서 약동학 (PK) 연구를 수행하였다. 하기 기재된 바와 같이 PEGPH20의 주사 후, 실시예 2에 기재된 바와 같은 변형된 탁도측정 검정을 이용하여 히알루로니다제 활성을 측정함으로써 PEGPH20의 혈장 수준을 결정하였다. 간단히, 히알루로니다제를 함유하는 혈장 시료를 히알루로네이트 (HA)와 함께 60분 동안 인큐베이션하였다. 산성화된 혈청을 첨가하여 소화되지 않은 HA를 침전시켰다. 30분 발생 기간 후 640 nm에서 생성된 시료의 탁도를 측정하였으며, 생성된 탁도는 존재하는 히알루로니다제 활성의 척도였다. 통상적으로 산성 pH에서 활성을 나타내는 혈장 중 내인성 리소좀 히알루로니다제 활성을 억제하는 pH 조건하에 검정을 수행하였다. PEGPH20 농도는 보정 곡선으로부터 보간하여 히알루로니다제 활성의 단위 (U)/mL로서 표시하거나, PEGPH20 로트의 비활성 (U/mg)을 사용하여 ㎍/mL로서 계산하였다. 일반적으로, 랫트에 대해, 정량의 더 낮은 수준은 10 U/mL였고, 검정은 최대 100 u/mL 히알루로니다제 활성의 측정에 대해 이용가능하였다.
A. 마우스
수컷 ICR 마우스 (3마리/군)에게 단일 IV 용량 (125,000 U/kg; 3.3 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하고, 투여후 5분 내지 24시간의 선택된 간격으로 혈장 시료를 수집하였다. 상기 기재된 바와 같이 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 결과는 IV 주사후 PEGPH20의 혈장 농도가 2상 방식으로 감소하였다는 것을 나타내었다. 초기 급속 감소는 전신 순환으로부터의 분포를 나타내며, 이어서 소실기를 나타내는 더 느린 감소가 따라왔다. 시간이 지남에 따른 히알루로니제 활성의 비분획 분석으로부터 유도된 약동학 파라미터는 표 44에 기재되어 있다. 값은 비분획 분석을 이용하여 3마리의 마우스로부터 유도된 평균 데이터였다. 데이터는 PEGPH20의 소실 반감기 (t½ λz)가 대략 10시간이었다는 것을 나타내었다. 평균 분포 부피 (Vz)는 대략 122 mL/kg이었으며, 이는 마우스에서의 기대 혈장 부피의 대략 2배였고 (즉, 50 mL/kg; 문헌 [Davies and Morris 1993]), 이는 PEGPH20이 말초 조직으로 광범위하게 분포되지 않았다는 것을 제안하였다.
[표 44]
Figure pat00050

B. 랫트
수컷 스프라그-돌리 랫트 (3마리/군)에게 단일 IV 용량 (125,000 U/kg; 3 mg/kg)의 PEGPH20을 투여하고, 투여후 5분 내지 96시간의 선택된 간격으로 혈장 시료를 수집하였다. 상기 기재된 바와 같이 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 결과는 IV 주사후 PEGPH20의 혈장 농도가 2상 방식으로 감소하였다는 것을 나타내었다. 초기 급속 감소는 전신 순환으로부터의 분포를 나타내며, 이어서 소실기를 나타내는 더 느린 감소가 따라왔다. 시간이 지남에 따른 히알루로니제 활성의 비분획 분석으로부터 유도된 약동학 파라미터는 표 45에 기재되어 있다. 값은 비분획 분석을 이용하여 3마리의 랫트로부터 유도된 평균 데이터였다. 데이터는 PEGPH20의 소실 반감기 (t½ λz)가 대략 8시간이었다는 것을 나타내었으며, 이는 마우스에서 관찰된 것보다 더 급속하였다. 이는 또한 마우스에서 관찰된 것보다 더 짧은 평균 체류 시간 (MRT) 및 더 급속한 절대 청소율 (CL)에서 반영되었다. 평균 분포 부피 (Vz)는 대략 296 mL/kg이었으며, 이는 랫트에서의 기대 혈장 부피 (즉, 31 mL/kg; 문헌 [Davies and Morris 1993])보다 더 컸고, 이는 대략 랫트에서의 기대 세포외 유체 부피였다 (즉, 297 mL/kg; 문헌 [Davies and Morris 1993]).
[표 45]
Figure pat00051

C. 요약
마우스 및 랫트에서의 단일 정맥내 용량 연구에서, 혈장 히알루로니다제 활성이 2상 방식으로 감소하였다 (급속 초기 분포기 및 더 느린 소실기). 평균 소실 반감기 (t½)는 마우스에서 대략 10시간 및 랫트에서 8시간이었다. 평균 분포 부피 (Vz)는 마우스에서 122 mL/kg이었으며, 이는 PEGPH20가 마우스에서 말초 조직으로 광범위하게 분포되지 않았다는 것을 제안하였다. 평균 Vz은 랫트에서 296 mL/kg으로 더 높았다.
실시예 21
필리핀 원숭이에서 단일 정맥내 용량 투여 후 PEGPH20의 용량 범위 및 약동학 연구
필리핀 원숭이에서 다양한 용량 범위의 PEGPH20의 단일 용량 투여 후 약동학 (PK) 연구를 수행하였다. 하기 기재된 바와 같이 PEGPH20의 주사 후, 실시예 20에 기재된 바와 같은 변형된 탁도측정 검정을 이용하여 히알루로니다제 활성을 측정함으로써 PEGPH20의 혈장 수준을 결정하였다. 랫트에서와 같이, 정량의 더 낮은 수준은 10 U/mL였고, 검정은 최대 100 u/mL 히알루로니다제 활성의 측정에 대해 이용가능하였다.
수컷 필리핀 원숭이 (1 내지 5마리/군)에게 1 mg/kg (38,000 U/kg), 3 mg/kg (114,000 U/kg), 6 mg/kg (228,000 U/kg), 12.5 mg/kg (412,500 U/kg) 및 33 mg/kg (1,089,000 U/kg) 범위의 농도의 PEGPH20의 단일 IV 용량을 투여하고, 투여후 0.5 내지 72시간의 선택된 간격으로 혈장 시료를 수집하였다. 상기 기재된 바와 같이 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 결과는 혈장 농도의 감소가 1상이었으며, 이는 급속 분포기가 투여후 0.5시간에 제1 PK 혈액 수집 시간으로 컵쳐되지 않았기 때문이라는 것을 나타내었다. 시간이 지남에 따른 히알루로니제 활성의 비분획 분석으로부터 유도된 약동학 파라미터는 표 46에 기재되어 있다. 표에 기재된 값은 비분획 분석을 이용하여 1 내지 5마리의 원숭이로부터 유도된 평균 데이터였다.
데이터는 PEGPH20의 소실 반감기 (t½ λz)가 39 내지 53시간 (1.6 내지 2.2일)의 범위였다는 것을 나타내었다. 긴 반감기는 대략 1.0 mL/h kg의 느린 전신 청소율로부터 기인되었다. IV 주사 직후 시간으로의 역외삽에 의해 결정된 바와 같은 최대 혈장 농도 [C0], 말단 소실 속도 kλz 및 절대 청소율 (CL)이 분포 부피 (Vz)의 추정치를 제공하였다. 평균 Vz의 범위는 70 내지 93 mL/kg이었고, 이는 원숭이에서의 기대 혈장 부피 (즉, 45 mL/kg; 문헌 [Davies and Morris 1993])의 대략 2배였고, 이는 PEGPH20가 말초 조직으로 광범위하게 분포되지 않았다는 것을 제안하였다.
혈장 농도-시간 곡선하면적, 외삽된 최대 농도 [C0] 및 관찰된 Cmax를 사용하여 용량 선형성을 검사하였다. 로그변환 IV 용량과 로그변환 PK 파라미터의 상관관계는 1.0에 상당한 기울기를 갖는 선형 관계를 나타내었으며, 이는 원숭이에서 PEGPH20의 PK가 용량과 관련하여 선형이었다는 것을 제안하였다. 전신 노출 및 관찰된 최대 혈장 농도가 용량의 증가와 비례적으로 증가하였다.
[표 46]

요약
원숭이에서의 단일 정맥내 용량 연구에서, 혈장 히알루로니다제 활성이 2상 방식으로 감소하였다 (급속 초기 분포기 및 더 느린 소실기). 평균 소실 반감기 (t½)는 원숭이에서 대략 40 내지 53시간이었다. 평균 분포 부피 (Vz)는 원숭이에서 70 내지 93 mL/kg이었으며, 이는 PEGPH20가 말초 조직으로 광범위하게 분포되지 않았다는 것을 제안하였다. PEGPH20의 여러 용량 수준을 평가하는 원숭이 연구에서, 최대 관찰된 혈장 농도 (Cmax) 및 혈장 농도 대 시간에 대한 곡선하면적 (AUC)은 PEGPH20 용량의 증가와 함께 선형으로 증가하였다.
실시예 22
반복된 용량
스프라그-돌리 랫트 (할런) 및 필리핀 원숭이에서 PEGPH20의 반복 용량 투여 후 약동학 (PK) 및/또는 독성학 (TK) 연구를 수행하였다. 실시예 20에 기재된 바와 같이 혈장 히알루로니다제 수준을 결정하였다.
A. 랫트
스프라그-돌리 랫트에서 PEGPH20의 IV 투여 후 4-주 반복-용량 독성 연구를 수행하였다. 3마리의 랫트/성별/군의 4개의 군에게 비히클 (10 mM Hepes pH 7.0 + 130 mM NaCl) 또는 0.5, 5 또는 25 mg/kg의 PEGPH20의 정맥내 1주 2회 용량을 각각 연속 4주 동안 투여하였다. 투여후 예정된 시간에 1 및 25째일에 각 동물로부터 혈액 시료를 수집하였다. 실시예 20에 기재된 바와 같이 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 혈장 농도-대-시간 데이터의 비분획 모델링을 이용하여 각 IV 용량에 대한 독성동태학 파라미터를 유도하였다. 유도된 TK 파라미터는 표 47에 기재되어 있다. PEGPH20의 1주 2회 IV 용량 투여 후 혈장 농도 대 시간의 분석은 노출 (Cmax 및 AUC)이 PEGPH20 용량의 증가와 함께 증가하였다는 것을 나타내었다. 독성동태학은 평가된 용량 범위 전반에 걸쳐 대략 선형이었다. 소실 반감기 (t½)는 PEGPH20 용량의 증가와 함께 증가하였다. 노출은 임의의 제공된 용량 수준 및 투여 일에 대해 성별 간에 일반적으로 유사하였다. PEGPH20의 반복된 IV 투여 후, 5 mg/kg 및 25 mg/kg 용량군에서 1째일과 비교하여 25째일에 AUC 증가에 대한 경향이 있었다. 그러나, 25째일 AUC 노출은 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일에 관찰된 노출의 < 2배로 유지되었다. Cmax에 의해 결정된 노출은 일반적으로 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일 내지 25째일에 일정하게 유지되었다.
[표 47]
Figure pat00053

1주 2회 IV 투여는 랫트에서 잘 관용되었다. 체중의 일시적 감소가 있었으며, 투여 기간의 종료 전에 연구전 값으로 회복되었다. 이 효과는 세포외 히알루로난 및 그의 관련된 물의 감소로서 PEGPH20 약리학으로 인한 것이었다. 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)의 보통의 연장이 있었으나, 프로트롬빈 시간은 변하지 않았다. 부검에서 극도로 또는 시험된 임의의 조직에서 현미경적으로 수행된 관찰된 출혈은 없었다. 그러므로, APTT 연장이 랫트에서 유해 사건이라는 평가로 인해, 관찰된 유해 효과 없음 수준 (NOAEL)은 랫트에서 5 mg/kg/용량으로서 정의되었다. 사료 소비 또는 거동의 변화는 관찰되지 않았다. 다른 시험 용품-관련 소견이 관찰되지 않았기 때문에, 관찰된 연장된 APTT를 제외하고 25 mg/kg/용량을 NOAEL이라고 지칭하였다.
B. 원숭이
1. 반복 용량 독성 연구
암컷 필리핀 원숭이 (N = 3)에게 연구 1, 3, 8, 11, 15, 22, 25 및 29째일에 PEGPH20의 6 mg/kg (198,000-222,000 U/kg) IV 용량을 투여하였다. 1, 3, 8, 11 및 25째일에 투여후 0.083 내지 96시간의 선택된 간격으로 혈장 시료를 수집하였다. 실시예 20에 기재된 바와 같은 마이크로-탁도 플레이트 검정을 이용하여 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 혈장 농도-대-시간 데이터의 비분획 모델링을 이용하여 각 IV 용량에 대한 독성동태학 파라미터를 유도하였다. 각 용량을 이전 순차적 용량에 대해 독립적으로 모델링하였다. 결과는 표 48에 나타낸다. 암컷 원숭이에게 PEGPH20의 반복된 IV 용량 투여 후 혈장 농도-대-시간 데이터의 TK 분석은 PEGPH20의 6 mg/kg (~210,000 U/kg) 용량의 IV 주사 후 혈장 농도의 감소가 2상이었다는 것을 나타내었다. 농도의 초기 급속 감소가 있었고, 이어서 시간에 따른 농도의 더 느린 감소가 따라왔다. 분포 부피 (Vz)의 추정치는 PEGPH20가 말초 조직으로 광범위하게 분포되지 않았다는 것을 제안하였다. PEGPH20의 전신 청소율은 연구 1, 3, 8 및 11째일에 결정된 바와 같이 0.9 내지 1.6 mL/h-kg 범위의 평균 속도로 느렸다. 느린 청소율은 긴 소실 반감기 (t½ λz)에 기여하였다. PEGPH20에 대한 관찰된 평균 소실 반감기 (t½ λz)는 28 내지 64시간 (1.2 내지 2.7일)의 범위였다. 연구 25째일에 3마리의 동물 중 2마리에서 PEGPH20에 대한 가속된 청소율이 관찰되었다. 연구 25째일에 수집된 혈장 시료를 재검정하여 PEGPH20 농도를 확인하였고, 평균 농도를 보고하였다.
[표 48a]
Figure pat00054
[표 48b]
Figure pat00055

2. 4-주 반복 정맥내 용량 독성 연구
필리핀 원숭이에서 PEGPH20의 IV 투여 후 4-주 반복-용량 독성 연구를 수행하였다. 4 군의 원숭이들 (PEGPH20의 0.2 mg/kg/용량을 투여받은 군은 성별 당 4마리의 동물인 것을 제외하고, 성별 당 6마리의 동물)에게 비히클, 0.2, 2.0 또는 10.5 mg/kg/용량의 PEGPH20의 IV 1주 2회 용량을 각각 연속 4주 동안 투여하였다. 1 및 25째일에 투여전 및 투여후 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 및 72시간에 각 동물로부터 혈액 시료를 수집하였다. 4, 8, 11, 15, 18 및 22째일에 투여전 및 투여후 2분에 추가 혈액 시료를 수집하였다. 실시예 20에 기재된 탁도측정 검정을 이용하여 히알루로니다제 활성에 대해 혈장 시료를 분석하였다. 혈장 농도-대-시간 데이터의 비분획 모델링을 이용하여 각 IV 용량에 대한 독성동태학 파라미터를 유도하였다. 결과는 표 49에 기재되어 있다. 원숭이에게 연속 4주 동안 PEGPH20의 1주 2회 IV 용량 투여 후 혈장 농도-대-시간 데이터의 TK 분석은 노출 (Cmax 및 AUC)이 PEGPH20 용량의 증가와 함께 증가하였다는 것을 나타내었다. 독성동태학은 평가된 용량 범위 전체에 걸쳐 대략 선형이었다. 소실 반감기 (t½)는 PEGPH20 용량의 증가와 함께 증가하였다. 반복된 투여시, t½는 저용량 및 중간용량 수컷에서 감소하였다. 또한, 저용량에 대한 노출 데이터는 동물이 반복된 투여시 노출 손실을 갖는다는 것을 나타내었다. 노출은 임의의 제공된 용량 수준 및 투여 일자에 대해 성별 간에 일반적으로 유사하였다. PEGPH20의 반복된 IV 투여 후, 2 mg/kg 및 10.5 mg/kg 용량군에서 1째일과 비교하여 25째일에 Cmax 및 AUC의 증가에 대한 경향이 있었다. 그러나, 25째일 AUC 노출은 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일에 관찰된 노출의 < 2배로 유지되었다. 연구 25째일에 8마리의 동물 중 3마리에서 0.2 mg/kg 군에서 PEGPH20에 대한 노출의 손실이 관찰되었다.
[표 49]
Figure pat00056

1주 2회 IV 투여는 원숭이에서 잘 관용되었다. 랫트와 유사하게, 체중의 일시적 감소가 있었으며, 투여 기간의 종료 전에 연구전 값으로 회복되었다. 랫트와 유사하지 않게, 연장된 APTT는 없었고, 오직 응고 파라미터의 변화는 혈장 피브리노겐의 일시적 및 용량-독립적 증가로 제한되었으며, 이는 PEGPH20 투여에 대한 일시적 급성기 반응과 일치하였다. 무릎 및 팔꿈치에서 움직임 범위의 용량-관련 감소와 함께 원숭이에서 사지 관절의 변화가 관찰되었으며, 이는 투여 중단 후 부분 내지 완전 회복을 나타내었다. 또한, 방사선 검사에 의해 관찰된 단일 고용량 동물에서 연질 조직 질량 (골격근)의 중간 감소가 있었다. 이는 조직으로부터 히알루로난 및 그의 관련된 세포외 물을 제거하는 PEGPH20의 약리학적 효과와 일치하였다. 무릎 관절 또는 골격근의 관련된 조직병리적 변화도 없었고, 무릎 관절 그 자체의 비정상적인 방사선촬영 소견도 없었다. 사료 소비 또는 거동의 변화는 관찰되지 않았다. 시험 용품-관련 소견이 관찰되지 않았기 때문에, 10.5 mg/kg/용량의 고용량을 NOAEL 원숭이라고 지칭하였다.
C. 요약
PEGPH20의 6 mg/kg (대략 210,000 U/kg) 용량이 29-일 기간에 걸쳐 8회 투여된 원숭이에서의 반복 IV 용량에서, 노출 (평균 Cmax 및 AUC 값에 의해 평가됨)은 연구 기간 전반에 걸쳐 유사하였다. PEGPH20의 전신 청소율 (CL)은 0.9 내지 1.6 mL/h kg의 평균 속도로 느렸다. 느린 청소율은 28 내지 64시간 (1.2 내지 2.7일) 범위의 긴 소실 반감기에 기여하였다.
연속 4주 동안 1주 2회 다양한 용량으로 PEGPH20를 투여받은, 랫트 및 원숭이에서의 독성학 연구는 노출 (Cmax 및 AUC 값)이 용량 증가와 함께 선형으로 증가하였고, 소실 반감기가 용량 증가와 함께 증가하였다는 것을 나타내었다. 랫트에서 소실 반감기의 평균 값은 대략 3시간 (0.5 mg/kg 용량) 내지 24시간 (25 mg/kg 용량)의 범위였고, 원숭이에서 17시간 (0.2 mg/kg 용량) 내지 78시간 (10.5 mg/kg 용량)의 범위였다. 두 종 모두에서, 노출은 임의의 제공된 용량 수준 및 투여 일에 대해 성별 간에 일반적으로 유사하였다. 그러나, 25째일에 8마리의 동물 중 3마리에서 0.2 mg/kg 군에서 노출의 손실이 관찰되었다. 랫트에서, 5 mg/kg 및 25 mg/kg 용량군에서 1째일과 비교하여 25째일에 AUC 증가에 대한 경향이 있었으나, 그럼에도 불구하고, 25째일 AUC 노출은 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일에 관찰된 노출의 < 2배로 유지되었다. Cmax에 의해 결정된 노출은 일반적으로 랫트에서 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일 내지 25째일에 일정하게 유지되었다. 원숭이에서, 2 mg/kg 및 10.5 mg/kg 용량군에서 1째일과 비교하여 25째일에 Cmax 및 AUC의 증가에 대한 경향이 있었다. 랫트와 유사하게, 원숭이에서 25째일 AUC 노출은 임의의 제공된 용량군 내에서 1째일에 관찰된 노출의 < 2배로 유지되었다.
실시예 23
상대성장 척도 모델
실시예 20에 기재된 마우스, 랫트 및 원숭이에서 단일-용량 정맥내 약동학 연구는 대체로 혈관계 내에 유지되는 큰 분자에 이용가능한 상대성장 척도 모델의 기초를 형성하였으며, 이는 인간에서 PEGPH20에 대한 약리상 활성 용량 (PAD) 및 투여 빈도를 추정하기 위해 이용하였다. PEGPH20의 큰 분자 크기 (분자량이 100 내지 270 kDa인 것으로 추정됨)로 인해, 작은 분자에 대해 사용되는 통상적인 종간 척도 인자 기술은 혈관내 구획에 한정된 분자에 대해 이용가능하지 않았다.
파라미터를 동물의 체표면적 및 동물의 체중에 대해 상대성장적으로 척도하여, 마우스, 랫트 및 원숭이에서 관찰된 PK 파라미터로부터 상대성장 모델링을 수행하였다. 유도된 종간 상대성장 관계를 인간에 대한 일차 PK 파라미터를 계산/예측하기 위해 사용하였다. 계산된 파라미터는 전신 청소율 (CL), 말초 청소율 (CL2), 중심 구획의 부피 (V1), 말초 구획의 부피 (V2), 중심 구획으로부터의 소실 속도 상수 (k10), 및 중심 구획과 말초 구획 간의 분포 속도 상수 (k12 및 k21)였다. IV 용량의 증가에 따른 전신 노출의 비례 증가의 가정하에, 인간에서 PEGPH20에 대한 농도-시간 프로파일을 1500, 3,000, 6,000, 12,000, 24,000 및 48,000 U/kg의 IV 용량 수준에 대해 2-구획 모델로 모의하였다. 월요일-목요일 또는 월요일-금요일 스케쥴의 1주 2회 (BIW) 용량 투여를 검사하였으며, 임상 용량 ≥ 1,500 U/kg (50 ㎍/kg) 및 월요일-목요일 BIW 용량 스케쥴이 역치 혈장 농도 (C최저치)를 ≥ 10 U/mL의 약리상 효과적인 농도 초과로 유지시키기 위해 계획되었다는 것을 나타내었다.
0.05 mg/kg의 인간 용량은 설치류에 대한 통상적인 1/10 안전성 인자와 일치하였으며, 여기서 5 mg/kg 용량 수준이 랫트에서 NOAEL로서 정의되었다. 원숭이 연구에서 최저 용량은 0.2 mg/kg이었고, 최고 용량은 10.5 mg/kg이었다. 이들 2개의 용량 수준을 각각 취하고, 이들이 유해 사건과 관련이 없다는 것을 주목하여, 0.05 mg/kg의 인간 용량은 영장류에게 투여된 용량에 비해 4배 및 210배 안전성 인자를 나타내었다.
변형이 당업자에게 명백할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해서만 제한되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. <120> Modified Hyaluronidases And Uses In Treating Hyaluronan-Associated Diseases And Conditions <130> 3800020.00102/3066PC <150> US 61/124,278 <151> 2008-04-14 <150> US 61/130,357 <151> 2008-05-29 <150> US 61,195,624 <151> 2008-10-08 <160> 189 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 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<213> Dolichovespula maculata <220> <223> hyaluronidase <400> 15 Ser Glu Arg Pro Lys Arg Val Phe Asn Ile Tyr Trp Asn Val Pro Thr 1 5 10 15 Phe Met Cys His Gln Tyr Gly Leu Tyr Phe Asp Glu Val Thr Asn Phe 20 25 30 Asn Ile Lys His Asn Ser Lys Asp Asp Phe Gln Gly Asp Lys Ile Ser 35 40 45 Ile Phe Tyr Asp Pro Gly Glu Phe Pro Ala Leu Leu Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gly Asn Tyr Lys Ile Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Ile 65 70 75 80 Thr Ile His Leu Gln Arg Phe Ile Glu Asn Leu Asp Lys Thr Tyr Pro 85 90 95 Asn Arg Asn Phe Asn Gly Ile Gly Val Ile Asp Phe Glu Arg Trp Arg 100 105 110 Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Gly Asn Met Met Ile His Lys Lys Phe 115 120 125 Ser Ile Asp Leu Val Arg Asn Glu His Pro Phe Trp Asp Lys Lys Met 130 135 140 Ile Glu Leu Glu Ala Ser Lys Arg Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Phe 145 150 155 160 Met Glu Glu Thr Leu Lys Leu Ala Lys Lys Thr Arg Lys Gln Ala Asp 165 170 175 Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Cys Phe Asn Met Ser Pro Asn Asn 180 185 190 Leu Val Pro Asp Cys Asp Ala Thr 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<213> Oryctolagus cuniculus <220> <223> PH20 <400> 25 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Gly Ser Ala Val Glu 1 5 10 15 Leu Ser Gly Val Phe Gln Ile Val Phe Ile Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Ala Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Thr Glu Phe Cys Leu Gly Lys Ser 50 55 60 Gly Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Leu Phe Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Lys Asn Lys Thr Gly Gln Gly Ile Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Pro His Thr Gly Ala Ile Val His Gly 100 105 110 Arg Ile Pro Gln Leu Gly Pro Leu Gln Gln His Leu Thr Lys Leu Arg 115 120 125 Gln Glu Ile Leu Tyr Tyr Met Pro Lys Asp Asn Val Gly Leu Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Leu Pro Thr Trp Leu Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Ile Tyr Arg Ile Lys Ser Ile Glu Leu Val Lys Ser Gln His 165 170 175 Pro Gln Tyr Asn His Ser Tyr Ala Thr Glu Lys Ala Lys Arg Asp Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Met Glu Glu Thr 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gtccagtttt 840 tactgatggg tcttcaacat acctttctca gggtgacctt gtgaattcgg ttggtgagat 900 cgttgctcta ggtgcctctg ggattataat gtggggcagt ctcaatctaa gcctaactat 960 gcaatcttgc atgaacctag gcaattactt gaacactaca ctgaatcctt acataatcaa 1020 cgtcacccta gcagccaaaa tgtgcagcca agtgctttgc cacgatgaag gagtgtgtac 1080 aaggaaacaa tggaattcaa gcgactatct tcacctgaac ccaatgaatt ttgctattca 1140 aactgggaaa ggtggaaaat acacagtacc tgggaaagtc acacttgaag acctgcaaac 1200 gttttctgat aaattttatt gcagttgtta tgccaacatc aactgtaaga agagagttga 1260 tataaaaaat gttcatagtg ttaatgtatg tatggcagaa gacatttgta tagagggccc 1320 tgtgaagtta caacccagtg atcattcctc tagccagaat gaggcatcta ctaccaccgt 1380 cagcagtatc tcaccctcta ctacagccac cacagtatct ccatgtactc ctgagaaaca 1440 gtcccctgag tgcctcaaag tcaggtgttt ggaagccatc gccaacgtca cccaaacggg 1500 gtgtcaaggt gttaaatgga agaacacttc cagtcagtca agtattcaaa atattaaaaa 1560 tcaaacaacc tattaaaata taaattcagt gcttataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 <210> 67 <211> 793 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. <220> <223> hyaluronan lyase (strain FB24) <400> 67 Met Thr Arg Glu Phe Ser Arg Arg Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Leu Ala Met Val His Gly Pro Ala His Ala Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Gly Leu Arg Gln 35 40 45 Arg Trp Val Asp Gln Ile Thr Gly Arg Lys Val Leu Val Ala Gly Asp 50 55 60 Asn Asp Phe Val Thr Ala Leu Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ala Arg Thr 65 70 75 80 Ala Ile Asp Leu Leu Glu Arg Ser Ala Gly Arg Leu Thr Val Phe Ser 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Thr Asp Leu Val Thr Thr His Thr Arg 100 105 110 Leu Ala Thr Met Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Gly Ser Glu His Phe 115 120 125 Ala Asp Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ile Arg Ala Gly Leu Ala Asp Ala 130 135 140 Asn Ser Leu Cys Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Glu Gln Gly Asn Trp Trp 145 150 155 160 Ser Trp Glu Ile Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ala Asp Thr Met Val Leu 165 170 175 Leu His Ala Glu Leu Thr Ala Ala Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Ala Ala 180 185 190 Ile Asp His Phe Val Pro Asp Pro Trp Gln Gln Phe Pro Pro 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Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro Ser Thr 450 <210> 189 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Mature HuPH20 36-486 <400> 189 Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro Phe Leu Trp 1 5 10 15 Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe Asp Glu Pro 20 25 30 Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg Ile Asn Ala 35 40 45 Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu Gly Tyr Tyr 50 55 60 Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly Gly Ile Pro 65 70 75 80 Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys Lys Asp Ile 85 90 95 Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val Ile Asp Trp 100 105 110 Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro Lys Asp Val 115 120 125 Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn Val Gln Leu 130 135 140 Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe Glu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys Leu Leu Arg 165 170 175 Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys Tyr Asn His 180 185 190 His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn Val Glu Ile 195 200 205 Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser Thr Ala Leu 210 215 220 Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val Ala Ala Thr 225 230 235 240 Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val Ser Lys Ile 245 250 255 Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr Arg Ile Val 260 265 270 Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu Leu Val Tyr 275 280 285 Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile Val Ile Trp 290 295 300 Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu Leu Leu Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn Val Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln Gly Val Cys 340 345 350 Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu Asn Pro Asp 355 360 365 Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr Val Arg Gly 370 375 380 Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys Phe Tyr Cys 385 390 395 400 Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp Val Lys Asp 405 410 415 Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys Ile Asp Ala 420 425 430 Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile Phe Tyr Asn 435 440 445 Ala Ser Pro 450

Claims (28)

  1. 변형된 히알루로니다제로 히알루로난 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 대상체를 확인하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 미리 수득된 시료에서 마커의 발현 또는 수준을 측정하는 단계로서, 상기 마커는 히알루로난 관련 질환 또는 상태와 관련된 것인 단계;
    b) 대조 시료 또는 표준에서의 발현 또는 수준과 마커의 발현 또는 수준을 비교하는 단계; 및
    c) 마커가 대조 시료 또는 표준과 비교하여 변화된 경우, 시료가 수득된 대상체를 변형된 히알루로니다제로 치료하기 위한 대상체로 확인하는 단계로서, 상기 히알루로니다제의 변형은 폴리머에 접합된 것인 단계를 포함하는 방법.
  2. 대상체에서 히알루로난 관련 질환 또는 상태의 치료에 있어서 사용하기 위한 폴리머에 접합됨으로써 변형된 가용성 히알루로니다제를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 대상체는 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 치료됨:
    ⒜ 대상체로부터의 시료에서 히알루로난 발현 또는 히알루로난을 측정하는 단계: 및
    ⒝ 대상체로부터의 시료에서 히알루로난 발현 또는 히알루로난이 상승되었거나 질환 또는 상태를 나타내는 수준인 경우, 가용성 히알루로니다제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계.
  3. 제1항의 방법 또는 제2항의 약학적 조성물에 있어서, 상기 대상체로부터의 시료는 조직 또는 체액인 방법 또는 약학적 조성물.
  4. 제3항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 조직은 종양인 방법 또는 약학적 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 시료는 종양 생검물인 방법 또는 약학적 조성물.
  6. 제4항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 대상체로부터의 시료는 체액이고 상기 체액은 혈액 시료, 뇌척수액, 뇨, 땀, 정액 또는 타액 시료인 방법 또는 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 시료 내의 히알루로난은 면역조직화학 또는 ELISA에 의해 측정되는 방법 또는 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 폴리머는 시알화(sialation) 또는 페길화(pegylation) 부분(moiety)인 방법 또는 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 마커는 히알루로난인 방법 또는 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 대상체로부터의 시료 내의 마커의 수준은 대조 시료 또는 표준 내의 발현과 비교하여 상승된 방법 또는 약학적 조성물.
  11. 제10항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 대조 시료는 정상 대상체인 또 다른 대상체로부터 미리 수득된 유사한 시료 또는 종양 세포주 중으로부터 선택된 방법 또는 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 디스크 압박, 암 및 부종 중으로부터 선택된 방법 또는 약학적 조성물.
  13. 제12항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 암이고, 상기 암은 종양인 방법 또는 약학적 조성물.
  14. 제13항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 고형 종양인 방법 또는 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 난소암, 상피내 암종(ISC), 편평세포 암종(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 뇌암 및 결장암의 임의의 하나 또는 그 이상 중으로부터 선택된 방법 또는 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 암이고, 상기 시료 내의 히알루로난 수준은 대조 시료와 비교하여 0.5-배 이상 상승된 방법 또는 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 시료는 종양이고 중등도 내지 고도의 히알루로난이 대상체에서 측정되는 방법 또는 약학적 조성물.
  18. 제17항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 중등도 내지 고도의 히알루로난은 히알루로난을 발현하는 종양 영역의 적어도 30%에서 존재하는 방법 또는 약학적 조성물.
  19. 제12항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 부종이고, 상기 부종은 장기 이식, 뇌졸중 또는 뇌외상에 의해 유발된 방법 또는 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다제는 가용성 PH20인 방법 또는 약학적 조성물.
  21. 제20항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 PH20은 양, 마우스, 원숭이, 소, 박테리아 및 인간 PH20 중으로부터 선택된 방법 또는 약학적 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 PH20의 가용성 형태는 C-말단 GPI 앵커 부착 서열을 결여하는 말단절단된 PH20인 방법 또는 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다제는 서열번호 1의 아미노산 36-467, 36-468, 36-469, 36-470, 36-471, 36-472, 36-473, 36-474, 36-475, 36-476, 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482, 또는 36-483로 기재되는 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1의 아미노산 36-467, 36-468, 36-469, 36-470, 36-471, 36-472, 36-473, 36-474, 36-475, 36-476, 36-477, 36-478, 36-479, 36-480, 36-481, 36-482, 또는 36-483으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성을 갖는 방법 또는 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다제는 서열번호 4-9 및 46-48 중 임의의 서열로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중으로부터 선택되거나, 서열번호 4-9 또는 46-48 중 임의의 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드인 방법 또는 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다제에 접합된 폴리머는 페길화 부분(PEG)을 포함하는 방법 또는 약학적 조성물.
  26. 제25항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 PEG는 메톡시-PEG(mPEG)인 방법 또는 약학적 조성물.
  27. 제26항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 PEG는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-히드록시숙신이미딜 에스테르인 방법 또는 약학적 조성물.
  28. 제25항의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 상기 폴리머는 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (5 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-부티르알데히드 (mPEG-부티르알데히드) (30 kDa), 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (30 kDa); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (10 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (20 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (40 kDa 분지형); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (60 kDa 분지형); 바이오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (바이오틴-PEG-NHS) (5 kDa 바이오티닐화된); 폴리(에틸렌 글리콜)-p-니트로페닐 카르보네이트 (PEG-p-니트로페닐-카르보네이트) (30 kDa); 및 폴리(에틸렌 글리콜)-프로피온알데히드 (PEG-프로피온알데히드) (30 kDa) 중에서 선택된 것인 방법 또는 약학적 조성물.
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