CN102586187A - 一种中性粒细胞体外保存方法及培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种中性粒细胞体外保存方法及培养基，所述用于中性粒细胞体外保存的培养基，所述培养基为RPMI1640培养基，所述培养基中添加有浓度为10^-4~10^-6MDEX。采用本发明所提供的培养基和方法，可以延长中性粒细胞体外保存的时间，步骤简单，效果显著。

Description

一种中性粒细胞体外保存方法及培养基

技术领域

本发明涉及细胞体外培养领域，尤其涉及一种中性粒细胞体外保存方法及培养基。

背景技术

中性粒细胞占血液白细胞总数的60-70%，是白细胞中数量最多的一种。中性粒细胞胞浆中含有初级和次级两种颗粒，初级颗粒较大，即溶酶体颗粒，内含髓过氧化物酶、酸性磷酸酶和溶菌酶；次级（特殊）颗粒较小，内含碱性磷酸酶、溶菌酶、防御素和杀菌渗透增强蛋白等。中性粒细胞具有很强的趋化作用和吞噬功能，当病原体在局部引发感染时，它们可迅速穿越血管内皮细胞进入感染部位，对侵入的病原体发挥吞噬杀伤和清除作用。也可通过调理作用促进和增强其吞噬杀菌作用。中性粒细胞是急性炎症反应中的主要效应细胞，从骨髓中释放出来的中性粒细胞在众多趋化因子的作用下聚集于炎症部位。中性粒细胞在组织损伤部位的聚集是机体自我保护、自我修复的生理性反应之一。

中性粒细胞来源于骨髓，产生速率高，每分钟约为1×10⁷个，但存活期短，用现有的体外保方法，只能保存约为1-2天。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种中性粒细胞体外保存方法及培养基，旨在解决现有技术中中性粒细胞体外保存时间短的问题。

本发明的技术方案如下：

一种用于中性粒细胞体外保存的培养基，其中，所述培养基为RPM I 1640培养基，所述培养基中添加有浓度为10^-4~10^-6M DEX。

所述的用于中性粒细胞体外保存方法的培养基，其中，所述RPM I 1640培养基中含 体积分数为10%的胎牛血清、2 mmol /L L2谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/L链霉素。

所述的用于中性粒细胞体外保存方法的培养基，其中，所述培养基中添加有浓度为10^-5M DEX。

一种中性粒细胞体外保存方法，其中，其具体步骤如下：

以RPM I 1640培养基为中性粒细胞的培养基，在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-4~10^-6M DEX；

将中性粒细胞悬浮于RPM I 1640培养基中，在37℃、湿度100%、体积分数为5%CO₂ 和体积分数为95%空气条件下进行培养。

所述的中性粒细胞体外保存方法，其中，在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-5M DEX。

有益效果：经过使用添加了DEX的培养基进行培养中性粒细胞，可以延长中性粒细胞的体外保存时间，其中采用10^-5mol /L的DEX的效果最好。采用本发明所提供的培养基和方法，不仅可以延长中性粒细胞体外保存的时间，而且步骤简单，效果显著。

附图说明

图1为本发明实施例1中对照组中性粒细胞体外培养活性测定结果图。

图2为本发明实施例1中实验组中性粒细胞体外培养活性测定结果图。

图3为本发明实施例1中在对照组和实验组的中性粒细胞体外培养活性测定结果对比图。

图4为本发明实施例2中在三种不同浓度的DEX下中性粒细胞体外培养活性测定结果图。

具体实施方式

本发明提供一种中性粒细胞体外保存方法及培养基，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供的用于中性粒细胞体外保存的培养基，是在中性粒细胞的培养基中添加浓度为10^-4~10^-6M DEX（地塞米松）制备而成的。采用所述用于中性粒细胞体外保存方法的培养基可延长中性粒细胞的体外保存时间。

所述中性粒细胞的培养基为RPM I 1640培养基，其中含 10%（体积分数）胎牛血清，2 mmol /L L2谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素。

正常体外中性粒细胞在普通的RPM I 1640培养基培养24小时后，只能存活50%，在72小时基本全部凋亡。而在RPM I 1640培养基中添加DEX后，中性粒细胞在体外培养24小时活性仍然可以达到90%，72小时后活性仍然可以达到50%。所述用于中性粒细胞体外保存方法的培养基，优选为添加10^-5M DEX，采用此培养基培养中性粒细胞，其体外保存时间最长。

本发明所提供的中性粒细胞体外保存方法，其具体步骤如下：

以RPM I 1640培养基为中性粒细胞的培养基，在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-4~10^-6M DEX；

将中性粒细胞悬浮于RPM I 1640培养基中，在37℃、湿度100%、5% （体积分数）CO₂ 和95% （体积分数）空气条件下进行培养。

采用本发明方法，即可延长中性粒细胞体外保存的时间，当在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-5M DEX时，中性粒细胞的保存时间最长。

实施例1

1、中性粒细胞采集：取健康大鼠静脉血，用3.8%枸橼酸钠抗凝(9∶1)。血细胞部分中加入6%葡聚糖，沉降30分钟后，吸取无红细胞的上层液，用0.9%生理盐水洗涤2次后，然后加入2ml 42%和51%的Percoll并离心，收集42%到51% percoll界面间的中性粒细胞，然后用0.9%生理盐水洗涤2次，以含10%热灭活小牛血清，青霉素100U／ml、链霉素100 U／ml的RPMI 1640培养液悬浮细胞，使其浓度为2×10⁷个／ml(中性粒细胞≥95%)。

2、中性粒细胞培养：中性粒细胞悬浮于 RPM I 1640培养基，其中含 10%(体积分数)胎牛血清，2 mmol /L L2 谷氨酰胺，100 U /mL青霉素，100 mg/L链霉素。按每孔终浓度 2×10⁶细胞/mL接种于24孔平底培养板（美国 Costar公司)，实验组10^-5mol /L的地塞米松( dexamethas one,DEX) ，对照组不加任何药物。在37℃、湿度100%、5% (体积分数) CO₂和95% (体积分数)空气条件下进行培养。

3、中性粒细胞活性的测定：加 0.12mL中性粒细胞悬液于干净、硅化的小塑料试管中，再加等量的0.11%NBT 溶液，然后在 37℃孵育20分钟，接着在室温(22℃)静置10 分钟，取底部细胞涂片、瑞氏染色，在×100 倍油镜下计数 100 个中性粒细胞，其中胞浆有蓝黑色甲沉淀者为NBT 阳性(激活)中性粒细胞。由此可计算出激活中性粒细胞的百分率。通过台盼蓝排斥实验计数并评价细胞存活率。形态学观察中性粒细胞纯度达 94%～97%。

4、凋亡检测及标记: 中性粒细胞培养设定额度时间后采用溴化丙锭( PI)染色,流式细胞技术( FCM)检测。吖啶橙和溴乙啶均用生理盐水配置为100mg/L浓度，吖啶橙用于核形态观察，以识别凋亡，溴乙啶用于检测细胞活性。取25μL细胞悬液加5μL染液染色10min，置玻片上，在荧光显微镜下观察，每个样品至少计数100个细胞。同时流式细胞术进行验证。用无凋亡核形态的活细胞数除以观察的总细胞数，求得活细胞百分比。

其中，对照组和实验组是分别设定培养0h、12h、24h、36h、48h、72h，每组设定 3个平行孔。在培养0h、12h、24h、36h、48h、72h，分别取对照组和实验组中的中性粒细胞，测定其活性。具体结果如图1~3所示，对照组在进行体外培养24小时后，只能存活50%，在72小时基本全部凋亡。而在RPM I 1640培养基中添加DEX后，中性粒细胞在体外培养24小时活性仍然可以达到90%，72小时后活性仍然可以达到50%。

实施例2

中性粒细胞采集、中性粒细胞培养、中性粒细胞活性的测定、凋亡检测及标记的步骤与实施例1基本相同。不同在于，实验组为3组，分别是添加了10^-4 M的地塞米松，10^-5 M的地塞米松，10^-6 M的地塞米松。

经过活性测定，可以发现，经过使用添加了地塞米松的培养基进行培养中性粒细胞，可以延长中性粒细胞的体外保存时间，其中采用10^-5 M的地塞米松的效果最好。如图4所示，图4为体外培养24小时后，不同浓度DEX下中性粒细胞的存活率。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于中性粒细胞体外保存的培养基，其特征在于，所述培养基为RPM I 1640培养基，所述培养基中添加有浓度为10^-4~10^-6 M DEX。

2.根据权利要求1所述的用于中性粒细胞体外保存方法的培养基，其特征在于，所述RPM I 1640培养基中含体积分数为10%的胎牛血清、2 mmol /L L2谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100U/L链霉素。

3.根据权利要求1所述的用于中性粒细胞体外保存的培养基，其特征在于，所述培养基中添加有浓度为10^-5M DEX。

4.一种中性粒细胞体外保存方法，其特征在于，其具体步骤如下：

以RPM I 1640培养基为中性粒细胞的培养基，在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-4~10^-6M DEX；

将中性粒细胞悬浮于RPM I 1640培养基中，在37℃、湿度100%、体积分数为5%CO₂ 和体积分数为95%空气条件下进行培养。

5.根据权利要求4所述的中性粒细胞体外保存方法，其特征在于，在所述RPM I 1640培养基中添加浓度为10^-5M DEX。

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