CN102719480A - 悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，按如下步骤进行：将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；紫外线照射30分钟。本发明对细胞培养板预处理后，无需离心，既可使悬浮细胞“粘附”于细胞培养板上（类似悬浮细胞贴壁），加大了脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会，有效提高了悬浮细胞的转染效率（至少可达70%），可对悬浮细胞高效转染外源性基因（miR或siRNA），操作简单、省时省力。
Description
技术领域
本发明涉及一种悬浮细胞脂质体转染方法，尤其是一种操作方法简单，可对悬浮细胞高效转染外远性基因（miR或siRNA）的悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法。
背景技术
基因转移技术对于现代生命科学有着十分重要的意义。通常的外源性基因包括microRNA（miR）转染细胞的方法主要有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体转染法、逆转录病毒介导转染法、电穿孔转染法等。不同的转染方法各有不同的优缺点，其中脂质体转染法制备过程相对比较简单，不需要特殊的仪器，并且具有毒性低、包装容量大、研究周期短等优点而被广泛应用。以质粒DNA转染为例，现有脂质体转染的操作步骤是：
1. 将细胞铺于细胞培养板的培养孔内，用无抗生素培养基培养过夜；
2．将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti－MEM Ⅰ Reduced Serum Medium中，混合均匀；
3．将适量Lipofectamine 2000溶于50ul无血清的Opti－MEM Ⅰ中，混合均匀，在室温下孵育5分钟；
4. 将上述两种混合物混合（总体积100ul）均匀，在室温下孵育25分钟得复合物；
5．在细胞培养板（24孔板）的每个培养孔中加入100ul的复合物以及适量培养基，十字法混合均匀；
6. 细胞在37℃ CO2培养箱中培养18~48个小时。
由于脂质体转染是基于电荷吸引的原理，先形成脂质体-DNA或RNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，因此，脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。目前，为了提高悬浮细胞脂质体转染率，通常采用对细胞培养板预处理的方法，即先将转染用的细胞培养板用纤连蛋白（fibronectin）包被，然后在细胞培养板中加入悬浮细胞，随后离心约一小时使细胞处于“贴壁”状态。即使如此，其转染率最高也很难达到要求，分析其原因如下：
1．纤连蛋白是与细胞粘附有关的分子，其是细胞外基质的重要成分，也是CD44和整合素家族某些成员的配体之一，是整合素α 5 β 1 在人体的特异配体。在白血病研究领域，有研究发现，整合素α 5 β 1仅大量表达于慢性粒细胞白血病祖细胞上，但由于其功能存在缺陷而导致细胞异常增殖和黏附功能下降。因此，在白血病研究领域用纤连蛋白包被转染用的细胞培养板，虽然可使悬浮细胞“贴壁”，但并没能够真正提高细胞的转染效率；
2．离心不但操作复杂、费时费力，而且可使部分悬浮细胞损伤，直接影响转染效率。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单，可对悬浮细胞高效转染外源性基因（miR或siRNA）的悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法。
本发明的技术解决方案是：一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；
b. 将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；
c. 静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；
d. 紫外线照射30分钟。
本发明对细胞培养板预处理后，无需离心，既可使悬浮细胞“粘附”于细胞培养板上（类似悬浮细胞贴壁），加大了脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会，有效提高了悬浮细胞的转染效率（至少可达70%），可对悬浮细胞高效转染外源性基因（miR或siRNA），操作简单、省时省力。
附图说明
图1是本发明实施例1显微镜镜下结果图。
图2是本发明实施例1 FCM检测olig NC-FAM转染NB4细胞的转染效率示意图。
图3是本发明实施例2 FCM检测olig NC-FAM转染U937细胞的转染效率示意图。
具体实施方式
实施例1：
a. 将多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；
b. 将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔上，既可将a步骤所得溶液加入培养孔内，轻轻摇动使之完全覆盖培养孔表面；
c. 静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干，；
d. 紫外线照射30分钟。
使用前，先用少量培养液洗，加入需要转染的NB4悬浮细胞，37度5%CO2孵箱孵育，静置2小时左右，NB4悬浮细胞即可实“贴壁”（粘附于细胞培养板似贴壁细胞），然后按照lipo2000转染贴壁细胞的方法进行转染olig NC-FAM。
转染6h后换液一次；转染后72h，显微镜观察结果见图1，图中A荧光检测结果，B白光对照结果。荧光显微镜下转染olig NC-FAM的细胞可见荧光，而对照组细胞未见荧光；随后，流式细胞仪测得转染效率为72.31%（见图2）。图2中左上、左下为olig NC转染NB4细胞72小时的检测结果；图2中右上、右下为olig NC-FAM转染NB4细胞72小时的检测结果。
实施例2：
a. 将多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；
b. 将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔上，即将a步骤所得溶液加入培养孔内，轻轻摇动使之完全覆盖培养孔表面；
c. 静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；
d. 紫外线照射30分钟。
转染方法均同实施例1，所用细胞为U937悬浮细胞，转染后，测得转染效率为99.8%（见图3）。图3中左上、左下为olig NC转染U937细胞24小时的检测结果；图3中右上、右下为olig NC-FAM转染U937细胞24小时的检测结果。
Claims (1)
1.一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，其特征在于按如下步骤进行：
a．将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；
b．将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；
c．静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；
d．紫外线照射30分钟。
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