CN107119075A - 一种脂质体介导的细胞转染方法 - Google Patents
一种脂质体介导的细胞转染方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107119075A CN107119075A CN201710218124.0A CN201710218124A CN107119075A CN 107119075 A CN107119075 A CN 107119075A CN 201710218124 A CN201710218124 A CN 201710218124A CN 107119075 A CN107119075 A CN 107119075A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transfection
- cell
- lipofectamine
- dna
- liposome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 54
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 11
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 9
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 101150048453 MSTN gene Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- -1 anion lipid Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种脂质体介导的细胞转染方法，其包括以下步骤：S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5‑2μg/mL的纤粘蛋白；S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。通过在处理过程中使用纤粘蛋白可使细胞快速贴壁，从而无需将对细胞进行培养24个小时以达到要求的汇合度，因此，该方法减少了操作时间，简化了操作程序，降低了操作难度，同时降低了细胞被污染的风险。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，更特别地，涉及一种脂质体介导的细胞转染方法。
背景技术
转染是将外源遗传物质转入到真核细胞内的一种专门技术，随着基因与蛋白功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中经常涉及的基本方法，它解决了外源遗传物质导入细胞的难题，为在细胞水平上进行基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术，按外源遗传物质是否与基因组整合来分，转染技术分为瞬时转染和稳定转染两大类；按转染实施手段来分，转染技术分为物理介导、化学介导和生物介导三大类。常见的转染方法有显微注射、电穿孔、基因枪、光学转染、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法等。转染技术的选择会影响细胞转染效率，进而影响到整个实验结果。因此在进行细胞转染前，需对转染过程中涉及的因素进行综合分析，以便筛选出针对特定细胞转染的最适方法和条件。
阳离子脂质体转染法具有操作简单，转染成功率高，对细胞类型的应用面广，可以转染DNA、RNA、寡核苷酸以及蛋白质、病毒等多种类型，可以负载大片段DNA等优点，既可用于瞬时转染，也可用于永久表达系的建立；既可用于细胞转染，也可用于体内的基因转染，现广泛用于人、大鼠、小鼠、兔、猪、马、牛、羊、鸡、鸭等动物细胞系或体内细胞的瞬时或稳定转染。脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体。最初人们只是运用脂质体模拟膜的构造及其功能，从而发现了膜的融合及内吞作用。脂质体介导转染的基本原理是细胞通过胞饮将脂质体/DNA复合物摄入胞浆中，阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根(PO4-3)通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂质体复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用偶尔也通过渗透作用，将DNA传递进入细胞形成包涵体或进入溶酶体。内吞后的DNA—脂质体复合体在细胞内形成的包涵体，在辅助脂质体DOPE作用下，细胞膜上的阴离子脂质因膜的去稳定而失去原有的平衡，扩散进入复合体，与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的游离出来进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行转录并表达。
目前常用的脂质体或脂质体复合物转染试剂有Lipofectamine 2000(Invitrogen)、FuGENE6(Roche)、Effectene Transfection Reagent(Qiagen)及国产的LipoFiter转染试剂(汉恒生物)、TransLipid Transfection Reagent(全式金)、Lipo6000Transfection Reagent(碧云天)等。这些试剂说明书中均说明在转染时细胞汇合度达到70％-90％或50％-80％、40％-80％、50％-70％等时，按照推荐的比例进行转染，即可达到理想的效果。但在实际实验中发现，在转染前一天将细胞传代至6孔板或12孔板，18-24h后，有个别或多个孔的细胞汇合度不在说明书要求的范围内，特别是对于不经常做细胞培养的“新手”来说，如何准确判断细胞汇合度达到70％-90％，也是个问题。当细胞汇合度达不到说明书的推荐要求时，又要重新培养细胞，耽误时间；或者有个别孔的细胞汇合度不在说明书要求的范围内，匆匆进行转染，既达不到实验效果，又浪费试剂，浪费时间。此外，长时间的培养会增加培养细胞被污染的风险。
然而，如果转染前细胞生长时间过短，细胞就不能很好地黏附于培养皿上，与脂质体接触后，细胞容易脱落而逐渐死亡。
因此，需要一种无需长时间培养细胞即可进行脂质体转染的方法。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种脂质体介导的细胞转染方法，其包括以下步骤：
S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5-2μg/mL的纤粘蛋白；
S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。
通过在处理过程中使用纤粘蛋白可使细胞快速贴壁，从而无需将对细胞进行培养24个小时以达到要求的汇合度，因此，该方法减少了操作时间，简化了操作程序，降低了操作难度，同时降低了细胞被污染的风险。
在一个实施方案中，S1中细胞的接种浓度为1-2×106个/mL。控制细胞的接种浓度使得转染过程中有足够的被转染的细胞存活下来，同时又不会因为细胞太密集而发生接触抑制的现象。
在另一个实施方案中，所述液体培养基为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。
在另一个实施方案中，S2具体包括：
S21：将所述转染DNA与脂质体转染试剂混匀，于室温下静置20分钟，得到转染DNA与脂质体转染试剂的混合液；
S22：将所述转染DNA与脂质体转染试剂的混合液加入到装有包含细胞的液体培养基的转染孔中，混匀；
S23：细胞于37℃下培养12-18小时；
S24：更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养基，即得到转染好的细胞。
在另一个实施方案中，S21中转染DNA为质粒DNA，脂质体转染试剂为Lipofectamine 2000、TransLipid HL。
附图说明
图1是采用本发明方法转染pEGFP-C1的DF-1细胞在白光和GFP激发光下显微照片，显微观察倍数均为×100；
图2是采用本发明方法使用TransLipidHL转染试剂转染GFP过表达逆转录病毒载体的DF-1细胞在GFP激发光下的荧光显微照片；
图3是采用本发明方法转染shRNA逆转录病毒载体的DF-1细胞在RFP激发光下的荧光显微照片。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.转染的步骤如下：
将细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白(购自Gibco公司)的DMEM高糖培养基(购自Gibco公司)，然后将转染DNA和转染试剂混合后加入6孔板中进行转染，37℃培养后后更换新鲜的细胞培养液。
结果表明，该细胞转染方法可获得较好的转染效果，与常规转染方法相比，可省去转染前的约24h的细胞培养时间，并无须判断细胞汇合度是否达到转染要求，大大提高了实验效率。
2.实验条件优化
1)纤粘蛋白添加量的优化
将接种浓度为1.2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，细胞培养液分别为含10％胎牛血清+0.1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+0.5μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+2μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基，纤粘蛋白每个添加量设置3个重复。将2μg pEGFP-C1质粒(一种表达绿色荧光蛋白的真核表达载体，由实验室保存)与4μL Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)按照说明书步骤孵育混合后加入12孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，并在不同时间显微观察细胞生长状况.
结果表明，0.5-2μg/mL的纤粘蛋白都能实现良好的转染效果，其中1μg/mL纤粘蛋白可获得最好的转染效果。
2)细胞接种浓度的优化
分别将接种浓度为2×105、5×105、1.2×106和2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，将接种浓度为5×105、1×106、2×106和3.5×106的DF-1细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清+1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基，每个接种浓度设置3个重复。将4μg pEGFP-C1质粒与8μL Lipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入6孔板中进行转染，将2μg pEGFP-C1质粒与4μL Lipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入12孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，并在不同时间显微观察细胞生长状况。
结果表明，1-2×106的细胞接种浓度都具有良好的转染效果，其中用于6孔板时细胞最佳接种浓度为2×106，12孔板细胞最佳接种浓度为1.2×106。
3)培养液中有无血清与纤粘蛋白(FN)的比较
将接种浓度为1.2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，接种时将细胞分为四组：血清FN组、血清组、FN组和无血清FN组，四组细胞的培养液分别为含10％胎牛血清+1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基(血清FN组)、含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(血清组)、含1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基(FN组)和不含胎牛血清与纤粘蛋白的DMEM高糖培养基(无血清FN组)，每组设置3个重复。将2μg pEGFP-C1质粒与4μL Lipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入12孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，并在不同时间显微观察细胞生长状况。
结果表明，本发明提供的细胞转染方法在细胞培养液中含有血清与纤粘蛋白时可获得较好的转染效果。
4)转染后换液时间的优化
将接种浓度为1.2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基。将2μgpEGFP-C1质粒与4μLLipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入12孔板中进行转染，分别于转染后6h、12h、18h和24h更换新鲜细胞培养液，并显微观察细胞生长状况。
结果表明，转染后12-18小时更换新鲜培养液可获得良好的转染效果，其中转染后12h更换新鲜细胞培养液获得的转染效果最佳。
5)质粒DNA量及比例的优化
将接种浓度为1.2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基。分别将1.5μg、2μg和3μg pEGFP-C1质粒与Lipofectamine 2000按照1:1(μg：μL，下同)、1:1.5、1:2、1:3进行孵育混合后加入12孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，并在不同时间显微观察细胞生长状况。
结果表明，本发明提供的细胞转染方法在质粒DNA为2μg，与转染试剂比例为1:2时可获得较好的转染效果。
实施例
实施例1
将浓度为1.2×106的DF-1细胞(购自美国ATCC)接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白(购自Gibco公司)的DMEM高糖培养基(购自Gibco公司)，同时将4μg pEGFP-C1质粒(一种表达绿色荧光蛋白的真核表达载体，由实验室保存)与8μLLipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)按照说明书步骤孵育混合后加入6孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，于不同时间观察转染效果。转染后的荧光显微照片如图1所示，这表明本发明提供的转染方法可获得较好的转染效果。
实施例2
将浓度为2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基；同时将4μgRCASBP.B-MSTN-GFP质粒(一种表达绿色荧光蛋白报告基因的MSTN基因过表达逆转录病毒载体，由实验室构建并保存)与10μLTransLipid HL(购自全式金公司)按照说明书步骤孵育混合后加入6孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，于不同时间观察转染效果。转染后的荧光显微照片如图2所示，这表明本发明提供的转染方法可适用于不同的转染试剂，并获得较好的转染效果。
实施例3
将浓度为1.8×107的DF-1细胞接种至37℃预热的10cm培养板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基；同时将20μg RCASBP.B-RFP-U6-sh1质粒(一种表达红色荧光蛋白报告基因的MSTN基因shRNA逆转录病毒载体，由实验室构建并保存)与40μL Lipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入10cm培养板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，于不同时间观察转染效果转染后的荧光显微照片如图3所示，这表明本发明的细胞转染方法可用于不同的载体类型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种脂质体介导的细胞转染方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5-2μg/mL的纤粘蛋白；
S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中细胞的接种浓度为1-2×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，S2具体包括：
S21：将所述转染DNA与脂质体转染试剂混匀，于室温下静置20分钟，得到转染DNA与脂质体转染试剂的混合液；
S22：将所述转染DNA与脂质体转染试剂的混合液加入到装有包含细胞的液体培养基的转染孔中，混匀；
S23：细胞于37℃下培养12-18小时；
S24：更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，即得到转染好的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S21中转染DNA为质粒DNA，脂质体转染试剂为Lipofectamine 2000、TransLipid HL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710218124.0A CN107119075A (zh) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | 一种脂质体介导的细胞转染方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710218124.0A CN107119075A (zh) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | 一种脂质体介导的细胞转染方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107119075A true CN107119075A (zh) | 2017-09-01 |
Family
ID=59725648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710218124.0A Pending CN107119075A (zh) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | 一种脂质体介导的细胞转染方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107119075A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129365A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-16 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154212A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-08-17 | 大连医科大学 | 脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法 |
| CN102719480A (zh) * | 2012-07-08 | 2012-10-10 | 大连医科大学 | 悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法 |
| CN104911212A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-09-16 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种高效转染HaCaT细胞的方法 |
-
2017
- 2017-04-05 CN CN201710218124.0A patent/CN107119075A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102154212A (zh) * | 2010-12-31 | 2011-08-17 | 大连医科大学 | 脂质体介导构建表达hPEPT2的海拉细胞方法 |
| CN102719480A (zh) * | 2012-07-08 | 2012-10-10 | 大连医科大学 | 悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法 |
| CN104911212A (zh) * | 2015-05-27 | 2015-09-16 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种高效转染HaCaT细胞的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张晨等: "层粘连蛋白、纤粘连蛋白对两株小鼠肝癌细胞实验粘附的影响", 《大连医科大学学报》 * |
| 苑晓玲等: "提高悬浮细胞脂质体转染效率的方法", 《军事医学科学院院刊》 * |
| 许丽等: "FIP200对呼吸道上皮细胞细胞粘附迁移的影响", 《江西医学院学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129365A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-16 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用 |
| CN110129365B (zh) * | 2019-05-22 | 2023-05-05 | 北京景达生物科技有限公司 | 一种高效稳定瞬时表达重组蛋白的方法及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7334127B2 (ja) | 多孔質支持体上の細胞への大きなカーゴの効率的な送達 | |
| Zeitelhofer et al. | High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection | |
| Perris et al. | Local embryonic matrices determine region-specific phenotypes in neural crest cells | |
| Sariyer | Transfection of neuronal cultures | |
| CN107523588A (zh) | 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用 | |
| WO2019228108A1 (zh) | 用于提高细胞转染效率的试剂组合物 | |
| CN103492554A (zh) | 使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方法 | |
| RAPTIS et al. | Electroporation of adherent cells in situ | |
| Hsu et al. | An integrated approach toward the biomanufacturing of engineered cell therapy products in a stirred-suspension bioreactor | |
| CN107119075A (zh) | 一种脂质体介导的细胞转染方法 | |
| Hecker | Nonviral, cationic lipid-mediated delivery of mRNA | |
| Ma et al. | Transdifferentiation of fibroblasts into muscle cells to constitute cultured meat with tunable intramuscular fat deposition | |
| CN106047739A (zh) | 一种可表达vsv‑g的重组毕赤酵母菌及其制备和应用 | |
| CN104846016A (zh) | 人胚肾细胞hek293t电转染的方法 | |
| CN104928250A (zh) | 永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用 | |
| CN104073514B (zh) | 一种制备多能性干细胞的方法 | |
| CN106399370B (zh) | 一种建立稳定转基因的牙鲆胚胎细胞株方法 | |
| You et al. | Enhancement of transfection efficiency by protamine in DDAB lipid vesicle-mediated gene transfer | |
| Nikcevic et al. | Improved transfection efficiency of cultured human cells | |
| Badakov et al. | Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection | |
| CN101705227B (zh) | 抑制人AP-2alpha基因表达的siRNA在抗宫颈癌药物制备中的应用 | |
| Pelofy et al. | Transfer of small interfering RNA by electropermeabilization in tumor spheroids | |
| CN110129367A (zh) | 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用 | |
| CN102409021A (zh) | 金华猪成纤维细胞系的建立及其培养方法 | |
| Sariyer | Transfection of Neuronal Cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170901 |