JP7334127B2 - 多孔質支持体上の細胞への大きなカーゴの効率的な送達 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年3月28日に出願されたUSSN61/972,145の利益及び優先権を主張するものであり、この出願はあらゆる目的のために参照によってその全体を本明細書に組み込んだものとする。
政府支援の陳述
[適用なし]
前記第1のデバイス及び前記第3のデバイスが、前記第1のデバイス及び前記第3のデバイスを構成するリザーバ室と流体連結しているポート及び/またはチャンネルを備え、前記ポート及び/またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第1のデバイス及び前記第3のデバイスが、前記第1のデバイス及び前記第3のデバイスを構成するリザーバ室と流体連結しているポート及び/またはチャンネルを備え、前記ポート及び/またはチャンネルは互いに流体連結していない、実施形態91~96のいずれか1つに記載のシステム。
「カーゴ」という用語は、細胞への送達に対して本明細書中で使用される場合、細胞に送達するのが望ましい任意の部分を指す。実例となるカーゴとしては、細胞小器官、完全な染色体もしくは細菌、大きな核酸またはタンパク質コンストラクト、合成粒子及び同種のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に使用するためのトランスフェクションデバイスが提供される。特定の実例となるが非限定的な実施形態において、トランスフェクションデバイスは、リザーバ室上に配置された本明細書に記載されるとおりの多孔質膜を備える(例えば、図2Aを参照)。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多孔質膜の片側に配置された「レシピエント細胞」を準備することと、多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中のカーゴを準備することと、カーゴを多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力をリザーバ室に印加することとを含み、カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る。特定の実施形態において、リザーバ室の加圧には、多孔質膜の変形が伴う。
特定の実施形態において、複数のトランスフェクションデバイスは、トランスフェクションシステムに連結される。かかる実施形態において、各トランスフェクションデバイスは、異なるカーゴを各デバイスに存在する細胞に充填する/トランスフェクトするよう構成されてもよい。したがって、例えば、特定の実施形態において、単一のシステムは、そのシステムを構成する異なるトランスフェクションデバイス用の異なる装填ポート/チャンネルを備えてもよい(例えば、図7Aを参照)。あるいは、システムを構成する各トランスフェクションデバイスは、その他の装填手段を使用して異なるカーゴが装填されてもよい(例えば、本明細書に記載されるとおり)。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるトランスフェクションプラットフォームは、容易に既存の設備と一体化させることができる「モジュール」として提供される。例えば、特定の実施形態において、トランスフェクション支持体は、既存の顕微鏡に付け加えることができるか、または顕微鏡のステージに取って代わることができる形式で提供される。特定の実施形態において、支持体は、倒立顕微鏡(例えば、Zeis倒立顕微鏡)のx/y/zステージに取って代わるよう構成される。
本明細書に記載の方法及びデバイスを使用して本質的にあらゆる所望の材料を細胞に送達することが可能であると考えられる。そのような材料としては、核酸、タンパク質、細胞小器官、薬物送達粒子、プローブ、標識などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。複数の実施形態において、カーゴは、天然染色体または染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌(例えば、Pneumocystis jirovecii,Histoplasma capsulatum,Cryptococcus neoformansなど)、細胞内原生動物(例えば、アピコンプレックス門(例えば、Plasmodium属の種、Toxoplasma gondii、Cryptosporidium parvum)、トリパノソーマ科(例えば、Leishmania属の種、Trypanosoma cruziなど)及び同種のもの)ならびに細胞小器官(例えば、核、核小体、ミトコンドリア、クロロプラスト、リボソーム、リソソーム及び同種のもの)からなる群から選択される1つ以上の部分を含む。
本明細書に記載の方法及びデバイスは、細胞膜を有する本質的にあらゆる細胞と共に使用することができると考えられる。したがって、さまざまな実施形態において、本明細書に記載の方法及びデバイスを使用して本質的にあらゆる真核細胞をトランスフェクションすることができると考えられる。したがって、例えば、本明細書に記載される方法を使用してトランスフェクションすることができる適した細胞としては、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または無脊椎動物細胞である。
キット。
本発明者らは、単離された機能するミトコンドリアのmtDNA枯渇rho(0)細胞への送達を実演し、ドナー細胞ミトコンドリアのゲノムを含有するトランスフォームされたrho(0)細胞株を得た。安定してトランスフォームされたトランスミトコンドリア細胞株を得る発生頻度は約10-4であり、これは各送達実験の多数のコロニーに対応する。実質的に、トランスミトコンドリア細胞株が毎回得られることになる。送達プロセスを図1に示す。レシピエント細胞を、膜を貫通する孔(1.6×106孔/cm2で1μm直径の孔または8×105孔/cm2で3μmの孔)を有する10μm厚のポリマー膜上で培養した。ドナー細胞からのミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア懸濁液(タンパク質濃度10mg/mL)をポリマー膜の反対側にあるリザーバ室に装填した。特定の実施形態において、本方法をポリエステル、ポリカーボネート及びポリエチレンテレフタラート(PET)膜を使用して試験した。リザーバ室の容量は100μLである。下部リザーバ室に一時的な圧力を印加して、ミトコンドリア懸濁液を膜孔を通してレシピエント細胞の方へ送り込む。圧力により動かされた流れのためポリマー膜はわずかに変形し、送達後にレシピエント細胞及び膜孔内でミトコンドリア及びミトコンドリア凝集体が観察された(図3)。
(A)100μLのミトコンドリア懸濁液を多孔質膜上で培養されるレシピエント細胞に添加し、24時間コインキュベートした;及び
(B)100μLのミトコンドリア懸濁液を多孔質膜上に回転させてつけた後、レシピエント細胞を接種し、24時間インキュベートした。
Claims (19)
- 100nmから10μmまでの範囲のサイズの大きなカーゴを真核細胞に送達する方法であり、前記方法は、
多孔質膜の片側に配置された前記細胞を準備することと、
前記多孔質膜の反対側にあるリザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することと、
前記カーゴを前記多孔質膜を構成する孔を通過させるのに十分な圧力を前記リザーバ室に印加することとを含み、前記カーゴは細胞膜を通って前記細胞に入る、前記方法。 - 前記リザーバ室の容積は、10μLから500μLまで、または40μLから500μLまで、または50μLから400μLまで、または60μLから300μLまで、または70μLから200μLまで、または80μLから150μLまで、または10μLから100μLまでに及ぶ、請求項1に記載の方法。
- 前記多孔質膜の厚さは、5μmから30μm、もしくは5μmから20μm、もしくは5μmから15μmに及び;及び/または
前記多孔質膜の孔サイズの平均もしくは中央値は、100nmから20μmまでもしくは20μmまで、もしくは500nmから8μmまで、もしくは1μmから5μmまでに及び:及び/または
前記多孔質膜は、1×105孔/cm2から最大1×107孔/cm2、もしくは5×105孔/cm2から最大5×106、もしくは1×105孔/cm2から最大1×107孔/cm2を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記膜はポリマー膜を含み;並びに/または
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)膜、ポリエステル膜、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)膜、ポリエチレン(PE)膜、ポリプロピレン(PP)膜、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜、エチルビニルアセタート(EVA)膜、熱可塑性ポリウレタン(TPU)膜、ポリエーテルスルホン(PES)膜、ポリカーボネート膜及びポリエチレンテレフタラート(PET)膜からなる群から選択される材料を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記圧力を印加することは、前記多孔質膜のゆがみを引き起こす、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記圧力を印加することは、一時的な圧力を印加することを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記圧力を印加することは、ポートを通して前記リザーバ室の中へ圧力を印加することを含み;または
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室が一杯で閉鎖されているときに前記リザーバ室の壁を撓ませることを含み;または
前記圧力を印加することは、前記リザーバ室の壁を通して溶液を注入することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、ポートを通して前記リザーバ室に前記溶液を導入することを含み;または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記カーゴ溶液を前記リザーバにピペットで入れることを含み;または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記多孔質膜を前記リバーザ室上もしくは内に置く前に前記リザーバ室に装填することを含み;または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記溶液を前記リザーバ室の壁を貫通する針を通して注入することを含み;または
リザーバ室に配置された溶液中の前記カーゴを準備することは、前記溶液を前記膜を通過させて前記リザーバ室に装填することを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記カーゴは、天然染色体もしくは染色体フラグメント、合成染色体、細菌、合成粒子、細胞内真菌、細胞内原生動物、リポソーム内にパッケージングされたDNA及び/またはRNA(例えば、リポフェクタミン)ならびに細胞小器官からなる群から選択される1つあるいは部分を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、脊椎動物細胞、真菌細胞及び酵母菌細胞からなる群から選択され;または
前記細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び無脊椎動物細胞からなる群から選択され;または
前記細胞はリンパ球もしくは幹細胞を含み;または
前記細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞及び人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞は、吸着、接着分子、遠心力及びゲルマトリックスの1つ以上によって前記多孔質膜に付着させられ;または
前記細胞は、前記多孔質膜上で培養され;または
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - 多孔質膜と、
前記多孔質膜の片側にある、容積が500μL未満のリザーバ室と
を備える、100nmから10μmまでの範囲のサイズの大きなカーゴを真核細胞に送達するためのデバイス。 - 前記多孔質膜の厚さは、5μmから30μm、もしくは5μmから20μm、もしくは5μmから15μmに及び;並びに/または
前記多孔質膜の孔サイズの平均もしくは中央値は、100nmから20μmまでもしくは20μmまで、もしくは500nmから8μmまで、もしくは1μmから5μmまでに及び;並びに/または
前記多孔質膜は、1×105孔/cm2から最大1×107孔/cm2、もしくは5×105孔/cm2から最大5×106、もしくは1×105孔/cm2から最大1×107孔/cm2を含む、請求項12に記載のデバイス。 - 前記膜はポリマー膜を含み;または
前記膜は、ナイロン膜、ナイロンメッシュ、フィルター膜、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜、延伸ポリテトラフルオロエチレン(ePTFE)膜、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)膜、延伸ポリエーテルエーテルケトン(ePEEK)膜、ポリエチレン(PE)膜、ポリプロピレン(PP)膜、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)膜、エチルビニルアセタート(EVA)膜、熱可塑性ポリウレタン(TPU)膜及びポリエーテルスルホン(PES)膜からなる群から選択される材料を含み;または
前記膜は、ポリエステル膜、ポリカーボネート膜もしくはポリエチレンテレフタラート(PET)膜を含む、請求項12または13に記載のデバイス。 - 前記リザーバ室は、溶液を前記リザーバ室に導入するよう構成されたポートもしくはチャネルと流体連結している;または
前記リザーバ室は閉鎖及び/もしくは密閉した(例えば、前記リザーバからの流れは前記多孔質膜を通してのみ生じることができる)、請求項12~14のいずれか一項に記載のデバイス。 - リザーバ室は、前記真核細胞に送達されるカーゴを含む溶液を含有する、請求項12~15のいずれか一項に記載のデバイス。
- 真核細胞は、前記リザーバ室に近接する側と反対の前記多孔質膜の表面に配置される、請求項12~16のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記細胞は、前記多孔質膜上で培養され;及び/または
前記細胞は、前記多孔質膜上で付着層として培養され;及び/または
前記細胞は、前記多孔質膜上でコンフルエンスになるまで培養される、請求項17に記載のデバイス。 - 請求項12~18のいずれか一項に記載の第1のデバイスと、
請求項12~18のいずれか一項に記載の第2のデバイスと
を含み、
前記第1のデバイス及び前記第2のデバイスが、前記第1のデバイス及び前記第2のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び/またはチャンネルを備え、前記ポート及び/またはチャンネルは互いに流体連結しているか、あるいは前記第1のデバイス及び前記第2のデバイスが、前記第1のデバイス及び前記第2のデバイスを構成する前記リザーバ室と流体連結しているポート及び/またはチャンネルを備え、前記ポート及び/またはチャンネルは互いに流体連結していない、大きなカーゴを真核細胞に送達するためのシステム。
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