CN117070337A - 一种液滴内电转染微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液滴内电转染微流控芯片，包括：玻璃基底；微盖板，其内设置有依次相连通的入口组件、微通道组件和出口；电极单元，设置于玻璃基底与微盖板之间，其包括第一电极组件和第二电极组件，第一电极组件包括第一激发电极、悬浮电极组件、搭接于第一激发电极上的第一3D电极，悬浮电极组件包括多个第一悬浮电极、第二悬浮电极，第二电极组件包括第二激发电极、搭接于第二激发电极上的第二3D电极，悬浮电极组件对着微通道组件，第一3D电极、第二3D电极均设置于微通道组件内。本发明还公开了一种液滴内电转染微流控芯片的使用方法。本发明将动态捕获与静态转染相结合，提高了转染效率和细胞存活率，实现高效、精准的细胞遗传物质传递。

Description

一种液滴内电转染微流控芯片及其使用方法

技术领域

本发明涉及液滴内电转染技术领域，尤其涉及一种基于细胞-核酸同步捕获的液滴内电转染微流控芯片及其使用方法。

背景技术

随着生物技术和医学领域的迅猛发展，基因治疗和基因编辑等技术已成为治疗多种疾病的前沿研究领域。液滴内电转染技术是一种常用的基因传递方法，其通过将核酸材料(如DNA、RNA等)导入目标细胞，实现基因传递和编辑，成为基因治疗研究的重要手段之一。传统方法通常采用病毒转染，利用携带目标基因的病毒载体将遗传物质传递给目标细胞。然而，病毒转染存在传递效率难以控制、潜在的安全性风险等局限性。为了克服病毒转染的缺陷，电转染作为无病毒的基因传递方法被引入。电转染通过应用外部电场，使细胞膜产生短暂的微孔，以便引入外源核酸分子。

根据电场施加的方式，电转染可以分为静态转染和动态转染两种。静态转染是将细胞与外源核酸混合后，施加电场进行转染。虽然静态转染简单易行，但由于不同细胞的特性和外源核酸的多样性，传递效率和细胞存活率往往难以统一和优化，导致转染效率不稳定，影响实验结果的可重复性。动态转染则是将细胞和外源核酸分别分注进入微流控芯片，再施加电场实现转染。相较于静态转染，动态转染能够在转染过程中实时控制细胞与核酸的接触时间和条件，从而提高转染效率和细胞存活率。然而，动态转染的需要精确把握处理的时间和条件，避免过长或过短的处理时间对细胞产生不利影响，确保转染效率和细胞存活率。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种液滴内电转染微流控芯片及其使用方法。

为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：

一种液滴内电转染微流控芯片，包括：

玻璃基底；

微盖板，所述微盖板内设置有依次相连通的入口组件、微通道组件和出口；

电极单元，设置于所述玻璃基底与微盖板之间，所述电极单元包括第一电极组件和第二电极组件，所述第一电极组件包括第一激发电极、悬浮电极组件以及搭接于所述第一激发电极上的第一3D电极，所述悬浮电极组件包括多个第一悬浮电极、第二悬浮电极，所述第二电极组件包括第二激发电极、搭接于所述第二激发电极上的第二3D电极，所述悬浮电极组件对着所述微通道组件，所述第一3D电极、第二3D电极均设置于所述微通道组件内。

作为本发明的进一步改进，多个所述第一悬浮电极沿所述微通道组件的长度方向依次排列，相邻所述第一悬浮电极的中轴线不重合。

作为本发明的进一步改进，所述第一悬浮电极、第二悬浮电极均呈矩形。

作为本发明的进一步改进，所述第二悬浮电极的长度大于所述第一悬浮电极的长度。

作为本发明的进一步改进，所述入口组件包括第一入口、第二入口、第三入口，所述微通道组件包括分别与所述第一入口、第二入口、第三入口相连通的第一微通道、第二微通道、第三微通道，所述第一微通道、第二微通道相汇合并与一第四微通道相连通，所述第三微通道与所述第四微通道相连通。

作为本发明的进一步改进，所述第三微通道包括主微通道、与所述主微通道相连通的两个分微通道，两个所述分微通道均连通于所述第四微通道。

一种液滴内电转染微流控芯片的使用方法，使用所述的微流控芯片，包括以下步骤：

(1)准备细胞样品；

(2)准备核酸样品；

(3)微流控芯片预处理；

(4)分别将步骤(1)的细胞与步骤(2)的核酸从微流控芯片的入口组件加入，并往入口组件中通入油相，调节细胞、核酸与油相的流速，利用油相将细胞-核酸混合液隔断形成多个微液滴；

(5)在第一激发电极上加电，导通至第一3D电极，扰动微液滴内细胞与核酸的接触界面，使得细胞与核酸微混合，然后对细胞和核酸进行同步捕获；

(6)在第二激发电极上加电，导通至第二3D电极，对细胞进行电转染。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中，准备细胞样品包括：

(1.1)将需要进行电转染的细胞样品培养至70％-80％的密度，收集细胞；

(1.2)用PBS洗细胞2次后，用胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化；

(1.3)轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min去除上清液，重悬于生理盐水中，使细胞密度为1×10^{^}7cells/mL。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中，准备核酸样品包括：配置一定浓度的待转染核酸至相应的终浓度，其中质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM，并上下吹打均匀。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中，微流控芯片预处理包括：

(3.1)用70％的乙醇溶液对微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤微流控芯片表面，然后在微流控芯片上加入含有2％BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗微流控芯片；

(3.2)将微流控芯片上的电极接入高频信号源和脉冲信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。

本发明的有益效果是：

本发明将动态捕获与静态转染相结合，提高了转染效率和细胞存活率，简化操作并提高可控性，为高效、精准的细胞遗传物质传递提供新的技术途径，具有重要的生物学和医学研究应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的优选实施例的整体结构示意图；

图2为本发明的优选实施例的分解结构示意图；

图3为本发明的优选实施例的俯视图；

图4为本发明的优选实施例的悬浮电极组件投影在微通道组件的结构示意图；

图5为图4中B的放大示意图；

图6为本发明的优选实施例的主视图；

图中：1、玻璃基底，2、微盖板，200、出口，201、第一激发电极，202、悬浮电极组件，203、第一3D电极，204、第一悬浮电极，205、第二悬浮电极，206、第二激发电极，207、第二3D电极，211、第一入口，212、第二入口，213、第三入口，214、第一微通道，215、第二微通道，216、第三微通道，2161、主微通道，2162、分微通道，217、第四微通道，218、第一容纳通道，219、第二容纳通道。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

请参阅图1-图6，本申请实施例公开了一种液滴内电转染微流控芯片，包括：玻璃基底1；微盖板2，微盖板2内设置有依次相连通的入口组件、微通道组件和出口200；电极单元，设置于玻璃基底1与微盖板2之间，电极单元包括第一电极组件和第二电极组件，第一电极组件包括第一激发电极201、悬浮电极组件202以及搭接于第一激发电极201上的第一3D电极203，悬浮电极组件202包括多个第一悬浮电极204、第二悬浮电极205，第二电极组件包括第二激发电极206、搭接于第二激发电极206上的第二3D电极207，悬浮电极组件202对着微通道组件，第一3D电极203、第二3D电极207均设置于微通道组件内。第一激发电极201、第二激发电极206能够实现与微盖板2之间的密封性，避免渗漏，第一激发电极201通电能够传导给第一3D电极203，第二激发电极206通电能够传导给第二3D电极207，且第一3D电极203、第二3D电极207能够提供均匀电场，从而在避免液体渗漏确保密封性的同时能够提供均匀的电场；多个第一悬浮电极204设置能够干扰待电转染的两个流体的接触界面，使得两种流体进行微混合，微混合后能够通过第二悬浮电极205对两个流体进行同步捕获，提高转染成功率。

优选玻璃基底1能够导电，在导电的玻璃基底1上采用光刻工艺形成第一激发电极201、第一悬浮电极204和第二悬浮电极205、第二激发电极206。

入口组件包括第一入口211、第二入口212、第三入口213，微通道组件包括分别与第一入口211、第二入口212、第三入口213相连通的第一微通道214、第二微通道215、第三微通道216，第一微通道214、第二微通道215相汇合并与一第四微通道217相连通，第三微通道216与第四微通道217相连通。

具体地，第三微通道216包括主微通道2161、与主微通道2161相连通的两个分微通道2162，两个分微通道2162均连通于第四微通道217。这样，两个分微通道2162与第四微通道217形成十字形。当第一微通道214、第二微通道215内的液体混合形成混合液后，两个分微通道2162通入的油相能够将混合液在十字形汇合处剪断形成多个微液滴。这样就使得多个微液滴之间互不干扰，每个微液滴都是一个独立的微环境，使得后续的混合效果好，且细胞包裹在微液滴内，避免细胞的贴壁生长，避免细胞粘在电极表面，提高电极的灵敏性，另外细胞和核酸包裹进微液滴内后，细胞转染后可直接进行细胞3D培养。

多个第一悬浮电极204沿微通道组件的长度方向依次排列，相邻第一悬浮电极204的中轴线不重合。具体地，微通道组件的第四微通道217设置有与第一3D电极203形配合的第一容纳通道218、与第二3D电极207形配合的第二容纳通道219，便于第一3D电极203置于该第四微通道217与第一容纳通道218内，便于第二3D电极207置于第四微通道217与第二容纳通道219内。

为了更好地诱导出双电层现象，优选第一悬浮电极204、第二悬浮电极205均呈矩形。

为了更好地将细胞和核酸捕获在一起，优选第二悬浮电极205的长度大于第一悬浮电极204的长度。

优选玻璃基底1的长度L0为60mm，玻璃基底1的宽度W1为50mm。微盖板2采用PDMS材质制成。微盖板2的厚度H1为4mm。第一微通道214与第二微通道215的长度相等，第一微通道214的长度L1为8mm。优选第一微通道214与第二微通道215之间的夹角A为90度。优选分微通道2162的长度L2为12mm、分微通道2162的长度L3为18mm。第一微通道214、第二微通道215、第三微通道216、第四微通道217的深度H2为0.2mm。第一微通道214、第二微通道215、第三微通道216、第四微通道217的宽度W2为0.2mm。优选相邻第一悬浮电极204之间的距离D1为0.2mm。优选第一悬浮电极204的宽度W3为0.1mm，第一悬浮电极204的长度L4为0.2mm。优选第一悬浮电极204在第四微通道217内的投影的一侧距离第四微通道217的内侧壁之间的距离D2为0.8mm。优选第二悬浮电极205的长度L5为0.6mm，第二悬浮电极205的宽度W4为0.12mm。优选第一3D电极203的长度L6为5.2mm。优选第二3D电极207的长度L7为1.5mm。

本发明通过设置不对称排列的多个第一悬浮电极204，通过施加交流电场，这些电极可以诱导出双电层现象，产生感应电荷电渗流(ICEO)和交流电热耦合(ACET)等电动力效应。这些效应会导致电极表面电势的变化，同时影响双电层的电容性质。进而，电极表面的电渗透电流发生变化，在微流控芯片的第四微通道217内形成非对称的流体漩涡，交替干扰左右两个流体的接触界面。由此，核酸与细胞之间的快速微混合得以实现。再对所得的混合流体施加电脉冲信号，从而实现高效电转染。微混合均匀后，每个微液滴内的每个细胞附近的核酸都均匀，使得最后电转染后核酸导入细胞的量也均匀，便于标准化。本发明的微流控芯片可为核酸与细胞的混合过程提供高效且快速的解决方案，通过灵活设计第一悬浮电极的位置和形状，可以实现对流体行为的精确控制，从而在生物医学和化学领域等具有重要应用价值的场景中发挥重要作用。

本申请实施例还公开了一种液滴内电转染微流控芯片的使用方法，使用所述的微流控芯片，包括以下步骤：

(1)准备细胞样品；

(2)准备核酸样品；

(3)微流控芯片预处理；

(4)分别将步骤(1)的细胞与步骤(2)的核酸从微流控芯片的入口组件加入，并往入口组件中通入油相，调节细胞、核酸与油相的流速，利用油相将细胞-核酸混合液隔断形成多个微液滴；

(5)在第一激发电极上加电，导通至第一3D电极，扰动微液滴内细胞与核酸的接触界面，使得细胞与核酸微混合，然后对细胞和核酸进行同步捕获；

(6)在第二激发电极上加电，导通至第二3D电极，对细胞进行电转染。

为了更好地说明本发明的液滴内电转染微流控芯片的使用方法，以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。

1、准备细胞样品包括：

(1.1)将需要进行电转染的细胞样品培养至70％-80％的密度，收集细胞；

(1.2)用PBS洗细胞2次后，用胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化；

(1.3)轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min去除上清液，重悬于生理盐水中，使细胞密度为1×10^{^}7cells/mL。

2、准备核酸样品包括：配置一定浓度的待转染核酸至相应的终浓度，其中质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM，并上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20＝10ug。

3、微流控芯片预处理包括：

(3.1)用70％的乙醇溶液对微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤微流控芯片表面，然后在微流控芯片上加入含有2％BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗微流控芯片；

(3.2)将微流控芯片上的电极接入高频信号源和脉冲信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。

4、分别将准备好的细胞与核酸从微流控芯片的第一入口211、第二入口212加入，并往第三入口213中通入硅油，调节细胞、核酸与硅油的流速至合适的数值，利用硅油将细胞-核酸混合液隔断形成多个微液滴。

5、在第一激发电极201上加电，导通至第一3D电极203，扰动细胞与核酸的接触界面，使得微液滴内细胞与核酸微混合，然后对细胞和核酸进行同步捕获。

6、在第二激发电极206上加电，导通至第二3D电极207，通过电脉冲使细胞表面形成穿孔，使细胞附近的核酸进入到细胞内，对细胞进行电转染。

7、利用荧光素溶液对转染后的细胞染色，并在显微镜下观察转染情况，调整相关参数，重复上述步骤，并观察细胞电转染情况。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，包括：

玻璃基底；

微盖板，所述微盖板内设置有依次相连通的入口组件、微通道组件和出口；

电极单元，设置于所述玻璃基底与微盖板之间，所述电极单元包括第一电极组件和第二电极组件，所述第一电极组件包括第一激发电极、悬浮电极组件以及搭接于所述第一激发电极上的第一3D电极，所述悬浮电极组件包括多个第一悬浮电极、第二悬浮电极，所述第二电极组件包括第二激发电极、搭接于所述第二激发电极上的第二3D电极，所述悬浮电极组件对着所述微通道组件，所述第一3D电极、第二3D电极均设置于所述微通道组件内。

2.根据权利要求1所述的液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，多个所述第一悬浮电极沿所述微通道组件的长度方向依次排列，相邻所述第一悬浮电极的中轴线不重合。

3.根据权利要求1所述的液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，所述第一悬浮电极、第二悬浮电极均呈矩形。

4.根据权利要求1所述的液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，所述第二悬浮电极的长度大于所述第一悬浮电极的长度。

5.根据权利要求1所述的液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，所述入口组件包括第一入口、第二入口、第三入口，所述微通道组件包括分别与所述第一入口、第二入口、第三入口相连通的第一微通道、第二微通道、第三微通道，所述第一微通道、第二微通道相汇合并与一第四微通道相连通，所述第三微通道与所述第四微通道相连通。

6.根据权利要求5所述的液滴内电转染微流控芯片，其特征在于，所述第三微通道包括主微通道、与所述主微通道相连通的两个分微通道，两个所述分微通道均连通于所述第四微通道。

7.一种液滴内电转染微流控芯片的使用方法，其特征在于，使用如权利要求1-6中任一项所述的微流控芯片，包括以下步骤：

(1)准备细胞样品；

(2)准备核酸样品；

(3)微流控芯片预处理；

(4)分别将步骤(1)的细胞与步骤(2)的核酸从微流控芯片的入口组件加入，并往入口组件中通入油相，调节细胞、核酸与油相的流速，利用油相将细胞-核酸混合液隔断形成多个微液滴；

(5)在第一激发电极上加电，导通至第一3D电极，扰动微液滴内细胞与核酸的接触界面，使得细胞与核酸微混合，然后对细胞和核酸进行同步捕获；

(6)在第二激发电极上加电，导通至第二3D电极，对细胞进行电转染。

8.根据权利要求7所述的液滴内电转染微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，准备细胞样品包括：

(1.1)将需要进行电转染的细胞样品培养至70％-80％的密度，收集细胞；

(1.2)用PBS洗细胞2次后，用胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化；

(1.3)轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min去除上清液，重悬于生理盐水中，使细胞密度为1×10^{^}7cells/mL。

9.根据权利要求7所述的液滴内电转染微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，准备核酸样品包括：配置一定浓度的待转染核酸至相应的终浓度，其中质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM，并上下吹打均匀。

10.根据权利要求7所述的液滴内电转染微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，微流控芯片预处理包括：

(3.1)用70％的乙醇溶液对微流控芯片进行消毒，用无菌生理盐水洗涤微流控芯片表面，然后在微流控芯片上加入含有2％BSA的生理盐水溶液进行孵育30分钟，去除剩余的BSA溶液，用生理盐水清洗微流控芯片；

(3.2)将微流控芯片上的电极接入高频信号源和脉冲信号源，设置高频信号频率为1MHz，脉冲信号频率为1kHz，高频电压为10V，脉冲电压为1.5V。