JP2016526923A - マイクロ流体ボルテックス支援電気穿孔システム及び方法 - Google Patents

Abstract

システム及び方法が、関心のある細胞を多数のトラップまで、該トラップを接続するチャネルを介して送達すること、トラップ内のボルテックスフローを維持して、トラップ内に関心のある細胞を捕捉すること、関心のある第１の分子をトラップに提供すること、及び、トラップにわたって電場を提供して、トラップ内の関心のある細胞内への関心のある第１の分子の電気穿孔を行うことを含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年８月７日出願の米国実用特許出願第１３／９６１，０８４号に基づく利益及び優先権を主張するものであり、参照により全内容を本願に援用する。

外来性の分子を生細胞及びヒト組織に導入する能力は、生物学的研究及び医学における種々の応用のために重要な意味を有する。ウイルス媒介のアプローチ、化学的アプローチ、物理学的アプローチ及び光学的アプローチを含む数多くの方法が、外来性分子を細胞内に送達するために開発されてきた。現在、ウイルス媒介のアプローチが、最も効率的な遺伝子送達及び発現の方法である；しかし、核酸の送達に対してのみ有能であることに加えて、毒性、染色体の組込み及び免疫原性を含むウイルス送達システムを伴う考慮すべきリスクがある。ウイルスのアプローチは、従って、遺伝子治療及び細胞リプログラミング又は細胞系譜転換の調査等、最小の移植後のリスクを要求する多くの臨床的及び研究的応用に対して理想的であるとは決して言えない。

その結果、非ウイルス性分子送達技術は、不可避の代替案としてさらに注目され始めた。これらの技術の中でも、電気穿孔が、潜在的に細胞傷害性の化学試薬又はウイルスを必要とすることなくｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも標的細胞内に無数のタイプの分子を導入する能力のため、効果的且つ強力な技術として考慮されている。電気穿孔は、短い高電圧パルスを利用して、細胞膜上に孔を過渡的且つ可逆的に作製し、その孔を介して、関心のある分子プローブをサイトゾル内に送達することができる。しかし、キュベット又はミクロキャピラリーを使用する従来の電気穿孔技術は、容量確率論的分子送達プロセス（ｂｕｌｋ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ）に頼っており、それらのシステムを、運ばれる分子の用量の正確且つ個々の制御を要求する応用に対して不適当にしている。さらに、細胞膜を過渡的に崩壊させるのに要求される電界強度は細胞のサイズと大いに関連しているため、細胞直径において大きな不均一性を有する試料に対して実用的な効率及び生存率を得ることは困難である。

マイクロフルイディクスにおける最近の進歩は、微小規模の電気穿孔技術の開発を促進し、高められた細胞生存率を有した単細胞レベルの電気穿孔及び運ばれる分子の用量制御を可能にしている。

高められた生存率を有した処理量及び分子送達効率におけるその注目すべき改善にもかかわらず、単方向性フロースルースキームであって、現在のマイクロ流体電気穿孔システムのほとんどがそのスキーム下で作動する単方向性フロースルースキームが、現在のマイクロ流体電気穿孔を、多数の異なる分子を提供しないようにし、さらに、優れた用量制御を欠くようにもする。

システム及び方法が、関心のある細胞を多数のトラップまで、そのトラップを接続するチャネルを介して送達すること、トラップにおけるボルテックスフローを維持して、関心のある細胞をそのトラップ内に捕捉すること、関心のある第１の分子をトラップに提供すること、及び、トラップにわたって電場を提供して、トラップにおける関心のある細胞内への関心のある第１の分子の電気穿孔を行うことを含む。

１つの装置において、第１のチャネルは、第１のチャネルを通ってチャネルの側面に向かって移動するように溶液内の細胞を動かすために慣性集束領域を有する。複数のトラップが、慣性集束領域の下流に、第１のチャネルの長手方向に沿って配置される。各トラップのサイズは、溶液が第１のチャネルを流れながらトラップ内のボルテックスフローを促進してトラップ内に細胞を捕獲するように適応する。チャネルの排出口は、複数のトラップから下流に提供される。電極が、向かいあうトラップの端につながれて、細胞内への分子の電気穿孔に適した電場をトラップにわたって加える。

例として示される実施形態に従った電気穿孔システムのブロック図の上面図である。 例として示される実施形態に従った、トラップにわたって実質的に均一の電場をもたらすために使用される電極の斜視図である。 例として示される実施形態に従った、細胞を捕捉し、さらに、電気穿孔を行う方法を例示した流れ図である。 例として示される実施形態に従った代わりとなる電極の構造を有する電気穿孔システムのブロック図の斜視図である。 例として示される実施形態に従った、パターン形成された電極の構造を有する電気穿孔システムのブロック図の透視図である。 例として示される実施形態に従った、１つの側にトラップを有するチャネルのブロック図である。 例として示される実施形態に従った、交互の側にトラップを有するチャネルのブロック図である。 １つ又は複数の例として示される実施形態において制御機能を実行するコンピュータシステムの概略ブロック図である。

以下の説明において、本明細書の一部を形成する、及び、実行することができる特定の実施形態が例示として示される付随の図面が参照される。これらの実施形態は、当業者が本発明を実行するのを可能にするように十分詳細に記載され、さらに、他の実施形態を利用することができるということ、並びに、構造的、論理的及び電気的変更を、本発明の範囲から逸脱することなく行うことができるということが理解されることになる。以下の例として示される実施形態の説明は、従って、限定的な意味で解されることはなく、さらに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められる。

本明細書において記載される機能又はアルゴリズムは、一実施形態において、ソフトウェア又はソフトウェアの組み合わせ、及び、ヒトにより実行される手順において実行することができる。ソフトウェアは、メモリ又は他のタイプの記憶装置等のコンピュータ読取り可能媒体上に格納されるコンピュータ実行可能命令を含んでもよい。さらに、そのような機能は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア又はいかなるその組み合わせであるモジュールに対応する。多数の機能を、所望のように１つ又は複数のモジュールにおいて行ってもよく、記載される実施形態は単なる例である。ソフトウェアは、デジタル信号プロセッサ、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサ、又は、パーソナルコンピュータ、サーバー若しくは他のコンピュータシステム等、コンピュータシステム上で作動する他のタイプのプロセッサ上で実行されてもよい。

種々の実施形態において、システム及び方法が、正確且つ独立した分子量及びパラメータ制御可能性を有した予め選択された標的細胞への連続的なマルチ分子送達を利用するボルテックス支援マイクロ流体電気穿孔を提供する。

図１は、一実施形態において概して１００にて電気穿孔システムを例示している。システム１００は、一実施形態において、多数の溶液供給源１１０から溶液を受けるようにつながれた多数の注入口１０５を含む。種々の実施形態において、供給源１１０は、関心のある細胞を含む溶液、及び、関心のある異なる分子を含有する種々の溶液を保つのに適している。一部の実施形態において、溶液は、インキュベーション、及び、種々の溶液のフロー間又はその後での洗浄若しくはフラッシングのための溶液（ＤＰＢＳ等）も含んでよい。制御装置１１５は、供給源１１０を制御して、入力ポートまで所望の様式で溶液を順次供給する。一実施形態において、制御装置は、個々の溶液チャンバ１１０を時宜を得て且つ独立して加圧して、マイクロ流体エレクトロポレーター１００を通して流れを運ぶニューマチックフロー制御システムを含む。制御装置は、制御された連続的な様式で種々の溶液を提供するためにバルブマニホールド等のバルブも制御する。

注入口１０５は、粗いフィルタを含んでもよく、さらに、それぞれが、少なくとも第１のチャネル１２０、及び、任意で第２のチャネル１２５につながれて、溶液をチャネルに提供する。第１及び第２のチャネルは、一実施形態において、互いに対して実質的に平行して延び、さらに、同じ溶液を受ける。さらなるチャネルが、さらなる実施形態において含まれてもよい。それぞれのチャネルは、それぞれ１３０、１３１にて例示された慣性集束領域も含んでよい。慣性集束領域は、チャネルの壁に向かう溶液中の細胞の流体力学的な力に応答性である移動を可能にするのに役立つ。

例えばトラップ１３５、１３６及び１３７、１３８と呼ばれる多数のチャンバが、慣性集束領域１３０、１３１から下流で、それぞれチャネル１２０及び１２５につながれる。一実施形態において、それぞれのチャネルは向かいあうトラップの対をいくつか有し、向かいあうトラップの対は、各トラップの対におけるトラップ入口１４０及びトラップ出口１４１の近くに配置される。入口１４０及び出口１４１は、長方形の構造を形成するトラップ１３５、１３６の対を効果的に二分する。溶液は、各対のそれぞれの注入口及び排出口を介してトラップの対を流れ続け、最終的に、廃棄物及び細胞を収集することができる排出口１４３にて表される１つ又は複数のチャネルの出口を出る。さらなる実施形態において、トラップは、向かいあう必要はなく、さらに、チャネルに沿って互いに重なる様式若しくは重ならない様式でねじれ型であってもよく、又は、チャネルの片側からのみ延びてさえよい。

示されている実施形態においては、１つのチャネルあたり、５つの向かいあうトラップの対に相当する１０のトラップがある。２つのチャネルが与えられると、全部で２０のトラップになる。さらなる実施形態において、８０以上のトラップの対まで形成することができ、１６０以上の細胞を捕捉するためのボルテックスに等しい。トラップ及びチャネルは、一実施形態において、一般的なフォトリソグラフィプロセスを使用して形成されたシリコン鋳造用鋳型から、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）シートで形成されてもよい。ＰＤＭＳシートは、酸素プラズマクリーナーによって等、賦活化されても（又は機能を持たされても）よく、さらに、ガラスシートで頂上を覆って、トラップ及びチャネルを囲ってもよい。さらなる実施形態において、シリコン又はプラスチック等、異なる材料が使用されて、（ｉ）圧力下でのチャネルの断面変形のない剛壁のチャネル、及び、（ｉｉ）チャネルの層間剥離のない、より高い圧力下での流体圧入、従ってさらなるトラップの対を可能にしてもよい。

トラップのサイズは、一実施形態において、チャネル及びトラップを流れる溶液が、例えばトラップ１３５において１４５にて例示され且つトラップ１３６において１４６にて例示されているようにそれぞれのトラップにおいてボルテックスを形成するように選択される。レイノルズ数が約１００よりも大きい場合に、溶液は流れながら細胞がボルテックス１４５、１４６において捕捉される。溶液は、チャネルのセクション１５２、１５３によって分けられた残りの向かいあうトラップの対のそれぞれを流れ続ける。それぞれのトラップの対は、溶液が排出口１４３に向かって流れるに従い、捕捉される細胞と共にボルテックスをもたらす。一実施形態において、トラップのそれぞれは、ほぼ同じ細胞の集団を含有してもよい。

一部の実施形態において、細胞に作用する力は、（例えばサイズ及び変形性等の）その生物物理学的性質に応じて、慣性集束領域１３０、１３１内等、チャネル壁付近の別の側方の平衡位置まで、細胞に慣性的に集束させ得る。この粒子／細胞整理現象は、流れている細胞に作用する２つの反作用する慣性の揚力、すなわち、壁面効果の揚力と剪断勾配の揚力との間のバランスから生じ得る。直線の集束チャネルにおいて別の側方位置にて細胞を浮遊させて運んだ壁面効果の揚力の大きさは、流れている細胞の付近からのチャネル壁の消失により減少するため、慣性的に集束される流れている細胞が電気穿孔チャンバ領域とも呼ばれる突然広がるトラップに入るに従い、剪断勾配の揚力のみが、微小規模のボルテックスの中心に向かう流れている細胞の側方移動を誘発する。剪断勾配の揚力は細胞の直径の三乗に対応するため、細胞が大きいほど、小さい細胞よりもはるかに迅速にボルテックスの中心に向かって移動する傾向がある。より大きな細胞がボルテックスの十分近くまで移動すると、それらの細胞はボルテックス内に捕捉されたまま残り、より小さい細胞は装置の外へと流される。この穏やか且つ安定した細胞捕捉機構は、ｉｎ ｓｉｔｕでのさらなる生物学的アッセイのカスケードを可能にする。試料注入時間は、電気穿孔チャンバ内の捕捉された細胞のサイズ及び数における時間依存的変化を調査するために、チャネルレイノルズ数Ｒｅ＞１００にて２０分から数分まで変えられてもよい。さらなるパラメータの変化が、さらなる実施形態において生じてもよい。

所望の数の細胞がボルテックスによってトラップ内に捕捉されると、細胞溶液は流すことができる。細胞含有溶液を流すために任意のフラッシング溶液が使用され、関心のある分子を含有する新たな溶液が続いてもよい。溶液の流れは、ボルテックスを維持するため、及び、細胞をトラップ内に捕捉されたまま保つために維持されてもよい。細胞含有溶液は、新たな溶液によってトラップ及びチャネルから効果的に除去される。所望の濃度の関心のある分子がトラップ内の細胞の近くで得られると、電極１６０、１６１、１６２が、トラップにわたって電場をもたらすために、及び、関心のある分子に、細胞内に分子を移動させるために使用される。本質的に膜不透過の分子を、正確に制御された量でサイトゾル全体にわたって均一に移すことができる。

一実施形態において、電極は、電気穿孔チャンバにおいて高圧短パルスを生成する電気器具１８０につながれてもよい。器具１８０は、一実施形態において、パルス発生器、及び、白金又は他の導電材料から作製することができる２つの電極１８２、１８３を含む。電極１８２、１８３は、トラップ内のポートを介して電気穿孔トラップ内の溶液と直接接触してもよい電極１６０、１６２及び１６１にそれぞれつながれてもよい。一実施形態において、大きさＶを有した方形波のパルスは、０．１から２ｋＶ／ｃｍに及ぶ電気穿孔トラップ又はチャンバにわたって加えられる電界強度Ｅ＝Ｖ／Ｌ_ｅを提供するために、１０Ｖから２００Ｖまで変えられてもよい。加えられるパルスの大きさ及び期間は、連続的なマルチ分子送達に対して最適な電気条件を決定するために、同時に変えられてもよい。ＤＣ信号もＡＣ信号も、種々の加えられる電圧及び周波数を用いた電気穿孔に対して効果的である。１つのＤＣの例において、２秒毎の１００Ｖ、３０ｍｓ方形波を使用することができる。ＡＣの例は、２秒毎の３０ｍｓの１００Ｖｒｍｓ、１０ｋＨｚの信号を含んでもよい。そのようなＤＣ及びＡＣ信号に対するパラメータは、有意に変えられてもよく、さらに、それぞれ異なる関心のある細胞及び分子のセットに対して最適化されてもよい。

さらなる実施形態において、異なる分子を有するさらなる溶液が、順次送達されてもよく、さらに任意で、電極により引き起こされる電気穿孔を介して細胞内に移されてもよい。一実施形態において、電極は、効率的な様式でトラップの端の近くに配置され、互いに隣接する異なるチャネルからのトラップが、１６１にて示されている負極性等、選択された極性の共通の電極を共有している。電極１６０及び１６２は、反対の極性として、この場合正極性として示されている。

図におけるチャネル及びトラップは、必ずしも縮尺通りに示されているというわけではない。一部の例として示される寸法は、チャネルを通って移動する細胞が、チャネルの幅の約３０パーセント又はそれ以上であるように幅を有する慣性集束領域１３０及び１３１のチャネルを含む。例えば、乳癌細胞が１６〜２０μｍの直径であり、結果として４０から５０μｍサイズのチャネルであってもよい。癌細胞は、一実施形態において、１ｘ１０^５から１ｘ１０^６細胞／ｍｌに及ぶ濃度で、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋のないＤＢＰＳ１Ｘ、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，ＵＳＡ等のリン酸緩衝生理食塩水溶液において緩衝されてもよい。細胞濃度は、さらなる実施形態において有意に変えられてもよい。例えば、血液、又は、尿若しくは胸水等の他の体液は、１ｘ１０^５細胞／ｍｌよりもはるかに小さい濃度で関心のある癌細胞を含有し得る。慣性集束領域は、一部の実施形態において、壁に向かう細胞の移動を確実にするために約０．７ｃｍ又はそれ以上であってもよく、ボルテックス内への細胞の侵入を促進する。一実施形態において、トラップは、約１ｍｍから５００μｍの辺を有してもよく、断面がほぼ正方形又は長方形である。さらなる実施形態において、チャネルと共に延びるトラップの辺は、トラップがチャネルから延びる距離又は深さよりも長くてもよい。

１つの例として示される実施形態において、慣性集束チャネルは、（Ｌ＝４．５ｃｍ、Ｗ＝４０μｍ及びＨ＝６０μｍ）の寸法を有してもよい。電気穿孔チャンバ又はトラップは、各辺Ｗｃ＝４００μｍのほぼ正方形を有する。寸法は、さらなる実施形態において変えられ、チャネルの長さに沿ったトラップの長さは、溶液を介してトラップ内の過流を維持する能力を依然として維持しながら、幅よりも長くてもよい。１つの例として示されるチャンバ又はトラップの長さ及び幅は、約７２０ｘ２２５μｍである。上記のように、長さ及び幅は、チャンバ内のボルテックスを維持しながら高い縦横比を利用した細胞捕捉を最適化するために有意に変動し得る。トラップの高さは、製造の容易さを維持するためにチャネルの高さと実質的に同じであってもよい。高さは、６０から８０μｍ等、さらなる実施形態において変動し得る。

一実施形態において、記載される構造は、トラップ内に乳癌細胞を捕捉することができ、さらに、ヨウ化プロピジウムを含有するさらなる溶液が、捕捉された細胞まで送達されてもよい。デキストラン（３，０００から７０，０００Ｄａ、中性又は陰イオン分子）等、広範囲の分子量を有するさらなる分子が、さらなる実施形態において、捕捉された細胞まで送達されてもよい。細胞及び異なる分子は、分子毎に、電場を各細胞及び分子の組み合わせの電気穿孔に対して合せることができるように、順次送達されてもよい。加えて、生物学的応用において一般的に使用される広範囲の分子が使用されてもよい。一部の実施形態において、広範囲の分子は、（例えば陰イオン又は中性等）その電荷にかかわらず、同じ電気パラメータを使用して細胞内に導入することができる。

一実施形態において、システム１００は、予め選択されたほぼ同じ標的細胞の集団内への、正確且つ独立した用量制御可能性を有した多数の分子の連続的な送達を可能にするオンチップの微小規模電気穿孔システムであってもよい。システム１００は、均一のサイズ分布が、増加した分子送達効率及び細胞生存能力に寄与する細胞を捕捉する能力を提供する。加えて、システム１００は、送達プロセス全体のリアルタイムのモニタリング能力を提供することができ、時宜を得た且つ独立した細胞及び分子特異的電気穿孔パラメータの修正を可能にしている。電界強度及び分子注入期間を変えることによって、正確に制御された量の本質的に膜不透過の分子を、ヒト癌細胞等の細胞内に移すことができる。

一実施形態において、流体力は、流れの方向から外向きに、細胞等のより大きな粒子及びより大きな分子を押し、それらにおそらく、より小さな粒子よりもボルテックス内に捕捉させる傾向がある。より小さな粒子も、ボルテックスに侵入する場合でさえも捕捉される可能性は低く、捕捉及び電気穿孔が行われるとより大きな粒子を運ぶために使用される溶液を流すことを効果的にしている。

図２は、トラップにわたって実質的に均一のＤＣ又はＡＣ電場をもたらすために使用される電極２００の斜視図である。一実施形態において、電極２００は、一般的には丸い円筒のピンの形状又は他の形状の多数の突起物２１０を有して形成される。電極は、一実施形態においてアルミニウムから形成されてもよく、さらに、予め開けられた孔を有するアクリルに乗せられた、３ｘ５のアレイ等、アレイに形成される１５ほどの突起物から成ってもよい。他の取付け材料及び方法が、電極とトラップとの間の密閉をもたらすために使用されてもよく、より小さな電極が結果として生じ得る。より小さな電極は、トラップ間のチャネルに沿った間隔を減らすために使用することができ、より高い密度及びより多い数のトラップが結果として生じる。さらなる実施形態において、電極は、他の導電材料から形成されてもよく、さらに、より均一な電場を提供して、トラップ内に捕捉された各細胞に対して概して同じ電気穿孔結果を確実にするために、トラップの領域に対応する領域の近くにより均一に間隔があけられた突起物を有して形成されてもよい。電極は、ボルテックスの形成及び維持に不都合であり得る様式でトラップ内に突き出ることなく、トラップ内の溶液と通じるように置くことができる。

１つの例として示される方法において、各溶液は、流れ制御装置１１５を使用して４０ｐｓｉ（４００μＬ／ｍｉｎの流速に等しい）の作動圧力にて順次装置内に注入されるか、さもなければ装置に提供されてもよい。安定した微小規模のボルテックス生成に対して要求される流速を満たすために、細胞溶液の注入に先立ち、洗浄溶液が１分を超えて注入されてもよい。次に、標的細胞が、単に洗浄溶液から細胞溶液に有効な溶液ポートを変えることによって、マイクロボルテックス捕捉機構を使用して電気穿孔チャンバ内に単離される。

所望のサイズ及び数の電気穿孔チャンバ内に捕捉される細胞の分布が達成されると、捕捉された細胞がもたらした軌道を妨害することなく、捕捉されていない混入細胞を装置全体から除去するために、溶液が洗浄溶液に迅速に交換される。装置の溶液が２０秒間流された後で、移されることになる第１及び第２の分子（例えば蛍光核酸色素又は蛍光タンパク質プラスミド等）を含有する溶液が、順次注入されてもよい。

単一又は多数の高電場の短パルスが、各分子溶液の注入が開始された後で迅速に加えられてもよい。方形波の大きさ、期間及び数、並びに、インキュベーション時間は、より優れた実験結果を有するために、細胞及び分子のタイプに応じて個々に変えることができる。電気穿孔を使用した分子送達の完了後、単に作動圧力を５ｐｓｉ未満に下げた後で４０ｐｓｉにて１０秒間最終装置フラッシングステップを続けることによって、処理された細胞を、下流での分析のために洗浄溶液において再懸濁させ、さらに、装置から放出させてもよい。

電気穿孔チャンバ内の捕獲された細胞の平均サイズ及びサイズ均一性は、細胞溶液注入時間が増えると共に増加する。捕捉される細胞の平均直径Ｄ_ａｖｅは、細胞溶液注入が開始されたすぐ後（ｔ＝１０ｓ）に４０％の変異係数（ＣＶ）で約２０μｍであり得るけれども、Ｄ_ａｖｅは、ｔ＝３０ｓにて２５％の減少したＣＶで３２μｍまで増加してもよい。正方形の電気穿孔チャンバの形状（各辺＝４００μｍ）に対して、各実行において処理される細胞の平均数は、最大のサイズ及び均一性が達成された場合に約２０であってもよく、さらに、細胞の数は、電気穿孔プロセス全体の過程を通して同じまま維持される。

細胞サイズ分布は膜透過化処理に対して重要な意味を有するため、均一サイズ分布で細胞を捕捉する能力は、より優れた分子送達効率及び細胞生存率を有することに肯定的に寄与する。細胞が細胞外の電場Ｅに曝露される場合、膜電位差ΔＶ_ｍ＝ｆＥＤｃｏｓθが細胞内で誘発される。ここで、ｆは、加えられた電場分布においてどのくらい細胞が寄与するかの程度である重み付け係数であり、さらに、Ｄ及びθはそれぞれ、細胞の直径、及び、外場に関して測定される極角である。細胞溶解することなく細胞を過渡的に透過性にするために、ΔＶ_ｍは、膜電位差ΔＶ_ｓを超えるが、不可逆性の電気穿孔閾値ΔＶ_ｃを下回ったままであるべきである。哺乳類細胞に対して、ΔＶ_ｓは、パルス幅に応じて２００ｍＶから１Ｖに及ぶと報告され、ΔＶ_ｃは１Ｖを超えると予想される。大きなサイズ変化を有する細胞株を用いて行われた以前の電気穿孔テストは、サイズにおいてより高い不均一性を有する試料が、成功する過渡的な膜透過化処理に対する最適な範囲の範囲外にあるΔＶ_ｍを誘発したより多くの数の細胞を有すると予想されるため、低い電気穿孔効率及び生存率を有すると報告されている。従って、サイズにおいてより高い均一性を有する細胞を予め単離する現在のシステムの能力が、大きな細胞サイズ変化に付随する望ましくない結果を最小限にすることができる。

一実施形態において、細胞が同じ分子量に曝露され（例えば、溶液が４０秒間（６．４μｇ）装置内に注入され）、さらに、処理された細胞が分子のないＤＰＢＳで１０秒間洗浄された場合に、移される分子の量は電界強度に比例して増加する。Ｅ_ｉ＝０．４ｋＶ／ｃｍは、一実施形態において、細胞への分子の送達を開始するのに十分であり、さらに、２．０ｋＶ／ｃｍを超えるＥは、細胞溶解をもたらし得る。同様に、分子移動用量は、設定された電界強度Ｅ_ｏ＝０．８ｋＶ／ｃｍで溶液注入時間を増やすことによって単調に増やすことができる。Ｅ_ｏは、最適条件のうちの１つであり、処理された細胞は高い生存率（８３％）及び電気穿孔効率（７０％）を示す。電気穿孔された細胞の分子の取り込みは、細胞が（溶液注入時間ｔ＝５ｓに等しい）約８００ｎｇの分子に曝露された後で開始されてもよい。異なる細胞に対して、同様の傾向を、わずかに高いＥ_ｉ＝０．６ｋＶ／ｃｍ及びＥ_ｏ＝１．０ｋＶ／ｃｍで観察することができる。異なる効果的な電場値は、膜の性質又は平均細胞直径における差次第であり得る。リアルタイムでのモニタリング能力と組み合わされたシステムの迅速な溶液交換スキームは、単にインキュベート期間及び／又は電界強度を変えることによって、正確且つ独立した制御及び各移される分子用量の最適化を可能にした。

興味深いことに、提案されるボルテックス支援システムを使用して電気穿孔された細胞によって取り込まれる分子は、サイトゾル全体にわたって均一に分布することができ、静止条件下での同じ装置内の電気穿孔された細胞は、送達された分子によって部分的に占有することができる。おそらく、現在のシステムが独自に提供する電気穿孔プロセスの間のボルテックス内に捕捉された細胞の穏やか且つ継続的な撹拌が、電気穿孔効率を改善する主要因であると知られる均一な透過化処理を促進することができる。実際、現在のシステムを使用して電気穿孔された細胞は、定常の細胞試料を利用する以前の研究よりも３倍高い電気穿孔効率を示すことができる。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の多重遺伝子導入の場合、結果は、同じ電気穿孔条件下（３０ｍｓのパルス幅でＥ＝０．７ｋＶ／ｃｍ及び１５μｇ／ｍｌのプラスミド濃度）での従来のキュベットシステムから得られる結果に匹敵し得る。遺伝子導入効率は、従来のキュベットシステムとは有意に相違しておらず（ｐ＞０．１）、それは、遺伝子導入効率における減少が、おそらく、ネイキッドプラスミド送達プロセスに付随した困難性によって引き起こされている、及び／又は、電気穿孔において使用されたテストされるプラスミドに対する上限を潜在的に反映しているということを意味し得る。

例外的に低い動作中の電流は１℃未満の温度上昇をもたし、従来のキュベットテストの即時の温度上昇が、同じ動作中の電場（Ｖ＝１６０Ｖ、Ｌｅ＝２ｍｍ及びＩ＝５Ａ）が加えられる場合にジュール加熱からΔＴ＝３８℃であると計算される。予想されるように、システム１００を使用して電気穿孔された細胞は、従来のキュベットシステムを使用して処理された細胞から観察されるよりも７倍高い生存率を示した。

図３は、例として示される実施形態に従って細胞を捕捉し電気穿孔を行う方法３００を例示した流れ図である。方法３００は、３１０にて示されているように、関心のある細胞を多数のトラップまで、トラップを接続するチャネルを介して送達するステップを含む。３１５にて、ボルテックスフローがトラップ内で維持されて、関心のある細胞をトラップ内に捕捉する。３２０にて、関心のある第１の分子がトラップに提供される。細胞がボルテックス内で捕捉されると、電場が、トラップにわたって提供されて、トラップ内の関心のある細胞内への関心のある第１の分子の電気穿孔３２５を行う。一実施形態において、トラップにわたる電場は、実質的に均一である。

一実施形態において、３１０にて関心のある細胞を送達するステップは、関心のある細胞を含有する第１の流体溶液を、流体が１００を超えるレイノルズ数を有してトラップ内にボルテックスフローをもたらすような速度でチャネルを介して運ぶことによって行われる。３２０にてトラップに関心のある第１の分子を提供することは、トラップ内のボルテックスフローを維持し且つ第１の溶液を除去しながら、関心のある分子を含有する第２の流体溶液を使用することを含んでもよい。

さらなる実施形態において、関心のあるさらなる分子を含有する第３の溶液が、トラップ内のボルテックスフローを維持しながら、３３０にて提供される。関心のあるさらなる分子は、関心のある第１の分子の電気穿孔に続いて提供されている。関心のあるさらなる分子の提供に続いて、任意の電場が３３５にてトラップにわたって提供されて、トラップ内の関心のある細胞内への関心のある第２の分子の電気穿孔を行う。電場は、一実施形態において、２つの異なる関心のある分子を送達するために一度加えられてもよい。さらなる実施形態において、電場は、特に分子が全く異なる分子サイズ又は電気特性を有する場合に、各異なる分子の送達を最適にするために調整又は合わされてもよい。第２の流体は、トラップ内のボルテックスフローを維持しながら、第３の溶液と交換される。ボルテックスフローは、細胞をトラップ内に捕捉されたまま保つために、方法全体の間維持することができる。細胞は、３４０にて示されているように、３２５での関心のある第１の分子を用いた電気穿孔に続いて、又は、３３５での関心のある第２の分子を用いた電気穿孔に続いて、トラップから要求があり次第放出することができる。

さらなる実施形態において、３１０にて、溶液内の関心のある細胞を多数のトラップまで、トラップを接続するチャネルを介して送達するステップは、慣性集束領域を介して第１の溶液をチャネルに提供して、関心のある細胞に、流体力を介してチャネルの側面の近くまで移動させることを含む。別のさらなる実施形態において、１つのチャネルが多数のチャネルに分かれ、それぞれが、チャネルの長手方向に沿って配置される向かいあうトラップの対を有する。

図４は、代わりとなる電極の構造を有する電気穿孔システム４００のブロック図の斜視図である。システム４００は、多数の電気穿孔チャンバにつながれ且つ異なる電極構造を利用するチャネル４１０及び４１５の三次元表示をもっと示しているということを除いて、図１におけるシステム１００と類似している。電極構造は、チャネルから延びるチャンバの長手方向に沿ってそれぞれ配置された３つの電極４２０、４２５及び４３０を含有しているとして示されている。一実施形態において、電極４２０及び４３０は、チャンバの外側に隣接する正極として示され、電極４２５は、負極として示されている。３つの電極は、チャンバ内に電場をもたらすように作動する。一実施形態において、電極は、電気穿孔を行うための電場の生成を促進するために、チャンバ内の流体と流体接触する流体で満たされる空洞を含んでもよい。一実施形態において、多数のシステムが互いの上に積み重ねられて、三次元電気穿孔システムを作製してもよい。

図５は、パターン形成された電極を例示するさらなる電気穿孔システム５００の水平断面図である。システム５００は、チャネル５１５及び５２０に沿って配置される多数のチャンバ５１０を含む。３つの導体５２５、５３０、５３５が、チャネル及びチャンバも支持する基板５４０上にパターン形成され示されている。上記の実施形態のように、外側の導体５２５及び５３５は正であってもよく、チャネル間に延びる真ん中の導体５３０は負であってもよい。導体のそれぞれは、それぞれのチャンバ内に延びる電極を含有する。導体５２５は、チャネル５１５の２つの外側のチャンバのそれぞれに延びる電極５４５を有しているとして示されている。真ん中の導体５３０は、チャネル５１５及び５２０の内側のチャンバのそれぞれに延びる電極５５０を有する。外側の導体５３０は、チャネル５２０の２つの外側のチャンバのそれぞれに延びる電極５５５を有する。継続線によって表されているように、多くのさらなるチャンバが対応する電極と共にあってもよいということに留意されたい。電極は、細胞内への分子の実質的に等しい電気穿孔を促進するために一部の実施形態において実質的に均一な電場であってもよい電場を提供するように構成される電極チップとも呼ぶことができる。

一実施形態において、電極５４５、５５０及び５５５は、幹線導体と呼ぶことができる、導体から分れるリード導体を介して、そのそれぞれの導体につながれる。導体、リード導体及び電極のそれぞれは、基板５４０上に、標準的なパターン形成技術を介して、金又は他の導電材料から形成されてもよい。チャネル及びチャンバも、電極がチャンバ内の流体に曝露されて均一な電場をもたらすように基板５４０上に形成され、且つ、基板５４０によって支持されてもよい。一実施形態において、電極は、チャンバ内のチャネルから遠位の壁に置かれる長方形の電極として示されている。電極の他の形状及び位置を、もし電極が適切に駆動された場合に実質的に均一の電場をもたらすように作動可能であるとすれば、さらなる実施形態において利用することができる。一実施形態において、多数のシステムが互いの上に積み重ねられて、三次元電気穿孔システムを作製することができる。

図６は、チャネルの１つの側にチャンバ６１０を有する代わりとなるチャネル６００を表すブロック図である。電極は、均一な電場をもたらすために、チャンバ６１０の両側に提供されてもよい。

図７は、チャネルの両側にチャンバ７１０を交互に有する代わりとなるチャネル７００を表すブロック図である。この実施形態において、チャンバは、交互に生じて重なり合わない。さらなる実施形態において、チャンバは、重複なしから、図１において示されている向かいあうチャンバに一致する完全な重複まで量を変えることによって重なり合ってもよい。

図８は、１つ又は複数の例として示される実施形態において制御１１５を実行するコンピュータシステム８００の概略ブロック図である。オブジェクト指向、サービス指向又は他のアーキテクチャーを使用して、制御方法を行うための機能を実行することができる。１つの例として示される、コンピュータ８００の形状のコンピュータ装置は、処理ユニット８０２、メモリ８０３、可換型記憶装置８１０及び固定型記憶装置８１２を含んでもよい。メモリ８０３は、揮発性メモリ８１４及び不揮発性メモリ８０８を含んでもよい。コンピュータ８００は、揮発性メモリ８１４及び不揮発性メモリ８０８、可換型記憶装置８１０及び固定型記憶装置８１２等、種々のコンピュータ読取り可能媒体を含んでも（又は、それらを含むコンピュータ環境へのアクセスを有しても）よい。コンピュータ記憶装置は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去プログラム可能読取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）及び電気的消去プログラム可能読取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ若しくは他のメモリ技術、コンパクトディスク読取り専用メモリ（ＣＤ ＲＯＭ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）若しくは他の光ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置若しくは他の磁気記憶装置、又は、コンピュータ読取り可能命令を格納する能力を持ついかなる他の媒体も含む。コンピュータ８００は、入力８０６、出力８０４及び通信接続８１６を含んでも、又は、それらを含むコンピュータ環境へのアクセスを有してもよい。コンピュータは、データベースサーバー等の１つ又は複数の遠隔コンピュータに接続するために通信接続を使用してネットワーク化された環境で作動し得る。遠隔コンピュータは、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、ピアー装置又は他の一般的なネットワークノード等を含んでもよい。通信接続は、構内ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）又は他のネットワークを含んでもよい。

コンピュータ読取り可能媒体上に格納されるコンピュータ読取り可能命令は、コンピュータ８００の処理ユニット８０２によって実行可能である。ハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ及びＲＡＭは、非一時的コンピュータ読取り可能媒体を含む物の一部の例である。例えば、データアクセスに対する、及び／又は、構成要素オブジェクトモデル（ＣＯＭ）ベースのシステムにおけるサーバーのうちの１つに対する操作を行うことに対するアクセスコントロールチェックを行うために汎用技術を提供する能力を有するコンピュータプログラム８１８が、ＣＤ−ＲＯＭ上に含まれ、さらに、ＣＤ−ＲＯＭからハードドライブにロードされてもよい。コンピュータ読取り可能命令は、コンピュータ８００が、多数のユーザ及びサーバーを有するＣＯＭベースのコンピュータネットワークシステムにおいて汎用アクセスコントロールを提供するのを可能にする。

いくつかの実施形態が詳細に先に記載されてきたけれども、他の修正も可能である。例えば、図において描かれている論理の流れは、所望の結果を達成するために、示されている特定の順又は順番を要求しない。他のステップが提供されてもよく、又は、ステップは記載された流れから除去されてもよく、さらに、他の構成要素が、記載されたシステムに加えられてもよく、又は、記載されたシステムから除かれてもよい。他の実施形態が、以下の特許請求の範囲の範囲内であってもよい。

Claims (27)

1. 関心のある細胞を多数のチャンバまで、該チャンバを接続するチャネルを介して送達するステップと、
   前記チャンバ内のボルテックスフローを維持して、前記チャンバ内に前記関心のある細胞を捕捉するステップと、
   関心のある第１の分子を前記チャンバに提供するステップと、
   前記チャンバにわたって電場を提供して、前記チャンバ内の前記関心のある細胞内への前記関心のある第１の分子の電気穿孔を行うステップと、
   を含む方法。
2. 関心のある細胞を送達するステップは、前記関心のある細胞を含有する第１の流体溶液を、該流体が１００を超えるレイノルズ数を有して前記チャンバ内に前記ボルテックスフローをもたらすような速度で前記チャネルを介して運ぶことによって行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記関心のある第１の分子をチャンバに提供するステップは、前記チャンバ内のボルテックスフローを維持し且つ前記第１の溶液を除去しながら、前記関心のある分子を含有する第２の流体溶液を使用することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記チャンバにわたる電場は実質的に均一である、請求項３に記載の方法。
5. 前記チャンバ内のボルテックスフローを維持しながら、関心のあるさらなる分子を含有する第３の流体溶液を使用するステップをさらに含み、前記関心のあるさらなる分子は、前記関心のある第１の分子の電気穿孔に続いて提供される、請求項３に記載の方法。
6. 電場を前記チャンバにわたって提供して、前記チャンバ内の関心のある細胞内への前記関心のある第２の分子の電気穿孔を行うステップをさらに含み、前記電場は、前記細胞への前記関心のある第２の分子の送達を高めるように適応する、請求項５に記載の方法。
7. 前記第２の流体を、前記チャンバ内のボルテックスフローを維持しながら、関心のあるさらなる分子を含有するさらなる流体と交換するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記ボルテックスフローは、当該方法全体の間維持される、請求項６に記載の方法。
9. 溶液内の関心のある細胞を多数のチャンバまで、該チャンバを接続するチャネルを介して送達するステップは、慣性集束領域を介して前記第１の溶液を前記チャネルに提供して、前記関心のある細胞に、流体力を介して前記チャネルの側面の近くまで移動させることを含む、請求項２に記載の方法。
10. 前記チャネルは多数のチャネルに分かれ、それぞれが、前記チャネルの長手方向に沿って配置される向かいあうチャンバの対を有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記関心のある細胞は、癌患者の体液から抽出される腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
12. 第１のチャネルであって、当該チャネルの側面に向かって当該第１のチャネルを通って移動するように溶液内の細胞を動かすために慣性集束領域を有する第１のチャネルと、
    前記慣性集束領域の下流に、前記第１のチャネルの長手方向に沿って配置される複数のトラップであって、各トラップのサイズは、前記溶液が前記第１のチャネルを通って流れながら前記トラップ内のボルテックスフローを促進して、前記トラップ内に前記細胞を捕捉するように適応する、トラップと、
    前記複数のトラップから下流に配置される前記チャネルの排出口と、
    前記細胞内への分子の電気穿孔に適した電場を前記トラップにわたって加えるために前記トラップの端につながれる電極と、
    を含むシステム。
13. 前記チャネルは、前記チャネルを通って移動する前記細胞のサイズが、前記チャネルの幅の約３０パーセント又はそれ以上であるように幅を有する、請求項１２に記載のシステム。
14. 前記チャネルの前記慣性集束領域は、約０．７ｃｍ又はそれ以上である、請求項１２に記載のシステム。
15. 前記第１のチャネルと同じに構成される第２のチャネルが、前記第１のチャネルに平行している、請求項１２に記載のシステム。
16. チャネルの対の積み重ねを形成する、同様に構成される第１及び第２のチャネルの多数の層をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記第１及び第２のチャネルの慣性集束領域への多数の注入口をさらに含み、該注入口は、細胞溶液及び分子溶液を含む多数の供給源から溶液を受けるように適応する、請求項１５に記載のシステム。
18. 前記注入口は、インキュベーション及びフラッシングのためのさらなる溶液を受けるように適応する、請求項１７に記載のシステム。
19. 前記第１及び第２のチャネルはそれぞれ、５つの向かいあうトラップの対を含み、該トラップの対は、各チャネルの前記慣性集束領域から下流に連続的に配置される、請求項１５に記載のシステム。
20. 各トラップは、形状が長方形であり、さらに、向かいあうトラップの対を形成し、該向かいあうトラップの対は、該向かいあうトラップの対を二分するチャネルの入口及び出口をそれぞれ有する長方形を形成する、請求項１５に記載のシステム。
21. 前記トラップは、約１ｍｍから５００μｍの辺を有する、請求項２０に記載のシステム。
22. 前記電極は、実質的に均一の電場をもたらすように適応する多数の電極チップを含み、さらに、前記第１のチャネルからのトラップ及び前記第２のチャネルからの隣接するトラップは、１つの極性の電極を共有する、請求項１５に記載のシステム。
23. トラップ内の細胞内への分子の電気穿孔の様子を提供するように置かれる顕微鏡をさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
24. 第１のチャネルであって、当該チャネルの側面に向かって当該第１のチャネルを通って移動するように溶液内の細胞を動かすために慣性集束領域を有する第１のチャネルと、
    第２のチャネルであって、当該チャネルの側面に向かって当該第２のチャネルを通って移動するように溶液内の細胞を動かすために慣性集束領域を有する第２のチャネルと、
    前記慣性集束領域の下流に、前記第１のチャネルの長手方向に沿って配置される第１の複数のトラップであって、各トラップのサイズは、前記溶液が前記第１のチャネルを通って流れながら前記トラップ内のボルテックスフローを促進して、前記トラップ内に前記細胞を捕捉するように適応する、トラップと、
    前記慣性集束領域の下流に、前記第２のチャネルの長手方向に沿って配置される第２の複数のトラップであって、各トラップのサイズは、前記溶液が前記第２のチャネルを通って流れながら前記トラップ内のボルテックスフローを促進して、前記トラップ内に前記細胞を捕捉するように適応し、当該第２の複数のトラップは、前記第１の複数のトラップに隣接して延び、前記第１及び第２の複数のトラップは、前記第１及び第２のチャネルに沿って２つの内側のトラップの列及び２つの外側のトラップの列を形成する、トラップと、
    前記複数のトラップから下流に配置される前記チャネルの排出口と、
    前記２つの外側のトラップの列における前記トラップの端につながれる電極を有する同じ極性の導体の対と、
    前記細胞内への分子の電気穿孔に適した電場を前記トラップにわたって加えるために、前記内側の列における前記トラップの端につながれる電極を有する反対の極性の導体と、
    を含むシステム。
25. 前記導体及び電極は、前記チャネル及びトラップを支持する基板上でパターン形成される、請求項２４に記載のシステム。
26. 前記電極は、前記トラップ内で循環している間に溶液に接触するように前記トラップの内側に置かれる、請求項２４に記載のシステム。
27. 三次元電気穿孔システムを作製するために、互いの上に積み重ねられる多数のシステムをさらに含む、請求項２４に記載のシステム。

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