WO2020184992A1 - 세포 내 물질 전달을 위한 미세유체 시스템 및 방법 - Google Patents

세포 내 물질 전달을 위한 미세유체 시스템 및 방법 Download PDF

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WO2020184992A1
WO2020184992A1 PCT/KR2020/003411 KR2020003411W WO2020184992A1 WO 2020184992 A1 WO2020184992 A1 WO 2020184992A1 KR 2020003411 W KR2020003411 W KR 2020003411W WO 2020184992 A1 WO2020184992 A1 WO 2020184992A1
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cells
cell
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fluid
vortex
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PCT/KR2020/003411
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정아람
강금영
허정수
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고려대학교 산학협력단
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the present invention for intracellular substance delivery It relates to microfluidic systems and methods.
  • Intracellular mass transfer is one of the most basic experiments in cell engineering, and transfers materials by using carriers or by making nanopores in the cell membrane/nuclear membrane.
  • Virus or Lipofectamine-centered carrier techniques are optimized for highly efficient mass transfer when optimized. Although possible, there are problems such as safety, slow delivery speed, labor/cost intensive carrier preparation process, and low reproducibility.
  • US Patent 2014-0287509 discloses a technology for inducing cell transformation rate by applying pressure to cells through a channel having a bottleneck structure.
  • the cells block the bottleneck structure, and there is a problem that the material can be transferred only to cells smaller than the size of the constriction.
  • high cost occurs in that a channel having a fine diameter must be used.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a system and method capable of delivering substances with high efficiency to a large number of cells without the use of new active delivery means.
  • the present invention is a microfluidic system for delivering foreign substances into cells by perforating cells using inertia, and includes a fluid channel structure in which a solution containing cells and foreign substances continuously flows, and the fluid channel
  • the structure includes a junction between one or more channels, a local vortex occurs near the interface of the connection point, the cell is deformed by the vortex, and a temporary discontinuity of the cell membrane is created by the vortex, and the cell and the cell It provides a microfluidic system, characterized in that the foreign material is introduced into the cell according to the exchange of solutions between the surrounding fluids.
  • the fluid channel structure when the fluid channel structure is a T or Y-shaped channel, it may include a cavity near the fluid stagnation point.
  • the cavity may include a circle, an oval, an elongated slit, a square, a rectangle, a trapezoid, a polygon, a combination thereof, and a modified shape thereof.
  • the diameter of the cavity is determined according to the diameter of the cell.
  • the microfluidic system further includes a fluid control means for flowing a solution in the fluid channel structure, and the fluid control means is a level capable of generating a local vortex near the interface of the connection point.
  • the solution can flow through the fluid channel at a rate.
  • the fluid control means may be a syringe pump or a pneumatic system.
  • the Reynolds number (Re) of the solution may be 1 to 1000.
  • the vortex characteristic may be determined according to the Reynolds number.
  • the vortex may be in the form of a closed or open recirculating flow.
  • the microfluidic system may be a combination of the above-described systems in series, parallel, or a combination thereof.
  • the present invention is also a method of delivering a foreign material into the cell by perforating cells using inertia, comprising: continuously flowing a solution containing the cells and the foreign material into a fluid channel; Forming a vortex by means of vortex generation means near the connection point; Transforming the cells by the eddy current; And introducing the foreign material into the cell through the perforation generated in the cell membrane by the cell deformation. It provides a method of delivering the foreign material into the cell by perforating the cell using inertia.
  • the vortex generating means may be a connection point structure of the fluid channel.
  • the fluid channel may include a connection point including a T, Y, cross shape, or a combination thereof.
  • vortices are generated by flowing cells and foreign substances in a flow channel structure including at least one junction, and the cells are deformed with the inertia to induce a temporary discontinuous phase of the cell membrane, thereby perforating the cell membrane. Thereafter, a solution exchange occurs between the cell and the fluid around the cell through the perforated cell membrane, and as a result, the foreign material is introduced into the cell.
  • the present invention does not require vectors or active cell delivery means (eg electric fields, etc.). Accordingly, the present invention can directly deliver foreign substances (ex: genes, plasmids, nanoparticles, etc.) into cells with high efficiency and low cost only with the characteristics of the solution and channel structure.
  • 1 is a diagram showing the formation of a helical vortex in a ⁇ connection point channel.
  • Fig. 2 is a schematic diagram (1) of cell deformation due to a spiral vortex and a high-speed microscope image (2) showing rotational cell motion (scale bar: 10 ⁇ m).
  • FIG. 4 is a schematic diagram of two types of channel structures according to an exemplary embodiment of the present invention and a diagram for explaining cell deformation in each channel.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a microfluidic system in which two types of fluid channels of FIG. 4 are connected in series in a fluid flow direction.
  • FIG. 8 is a graph in which cell capture and cell transformation time according to the eddy current collapse of FIG. 7 are normalized as a function of Reynolds number.
  • 10 to 12 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of a T connection point structure channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a high-speed microscopic image illustrating the mechanism of cell deformation and vortex formation in the T junction channel of the cavity structure.
  • each of the arrows indicates the direction of fluid flow.
  • 16 is a diagram showing an intracellular material delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • 17 to 19 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • 26 and 27 are photographs of analyzing the intracellular delivery effect of gold nanoparticles (GNP) and the results of counting scattering points.
  • FIG. 29 is a result of calculating the normalized yield by multiplying the number of scattering spots by the cell survival rate (FIG. 5F).
  • MSN menopausal silica nanoparticles
  • FIG. 31 is a time-dependent cell viability analysis result of the analyte of FIG. 30.
  • FIG. 32 is a histogram of fluorescence intensity measuring the transduction effect to K562 cells using mRNA (996-nucleotide mRNA fragment, green fluorescent protein) as a foreign material.
  • 39 and 40 show the results of analyzing the ITGa1 gene knockdown effect by Western blot by delivering siRNA to HeLa cells ( ⁇ 1 subunit of the integrin transmembrane receptor) and comparing the relative expression levels.
  • 45 is a confocal microscope image showing that quantum dots (qdot625) are transferred to MDA-MB-231 cells by the present invention ( ⁇ -Hydroporator), electroporator, and Lipofectamine 3000.
  • 49 and 50 are confocal images for two of the groups of FIGS. 47 and 48.
  • the present invention is a microfluidic system for delivering foreign substances into a cell by perforating cells using inertia, and includes a fluid channel structure in which a solution containing cells and foreign substances continuously flows,
  • the fluid channel structure includes one or more junctions between channels, a local vortex occurs near the interface of the connection point, the cell is deformed by the vortex, and a temporary discontinuity of the cell membrane is created by the vortex. It provides a microfluidic system, characterized in that the foreign material is introduced into the cell according to the solution exchange between the cell and the fluid surrounding the cell.
  • the present invention comprises the steps of continuously flowing a solution containing the cells and foreign substances into a fluid channel; Forming a vortex by means of vortex generation means near the connection point; Transforming the cells by the eddy current; And introducing the foreign material into the cell through the perforation generated in the cell membrane by the cell deformation. It provides a method of delivering the foreign material into the cell by perforating the cell using inertia.
  • the present invention is a system for delivering foreign substances outside the cell into a cell, and has a microfluidic channel structure including at least one junction to which at least two channels are connected. It provides a microfluidic system.
  • connection point refers to a point where each channel meets when two or more channels are connected in the form of T, Y, ⁇ or a combination thereof, and the connection point in the present invention is a single point defined as an inlet and an outlet of a fluid. There may be at least one or more in the channel.
  • an SU-8 mold or a silicon wafer is etched through a photolithography process to first form a mold having a channel according to the present invention.
  • a PDMS-based chip was made through polydimethylsiloxane (PDMS), and an inlet and an outlet were made on the chip, and by using a general slide glass and plasma treatment (Cute, Femto Science, South Korea) to manufacture a platform device.
  • a general slide glass and plasma treatment (Cute, Femto Science, South Korea) to manufacture a platform device.
  • a syringe pump After mixing the cells in the suspended state and the material to be delivered to the chip made, they are injected using a syringe pump.
  • intracellular material delivery can be controlled by controlling the flow rate of the syringe pump, and after delivery, only the cells are separated using a centrifuge and then cultured again or analyzed or used according to the purpose.
  • the scope of the present invention is not limited to the examples themselves.
  • Example 1 ⁇ Connection point structure microfluidic system
  • 1 is a diagram showing the formation of a helical vortex in a ⁇ connection point channel.
  • the term "near" refers to a region in which a fluid introduced to a junction can generate a vortex due to a junction structure.
  • Fig. 2 is a schematic diagram (1) of cell deformation due to spiral vortex and a high-speed microscope image (scale bar: 10 ⁇ m) showing rotational cell motion.
  • FIG 3 is a diagram for explaining a mechanism of mass transfer according to cell transformation according to an embodiment of the present invention.
  • nanopores are generated in the cell membrane according to cell deformation on the left side, and the foreign material is introduced into the cell according to the solution exchange between the cell and the fluid surrounding the cell. After that, within 1 to 10 minutes, the cell membrane self-recovers and closes, and this recovery time can be controlled by adjusting the concentration of an electrolyte such as calcium in the solution.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of two types of channel structures according to an exemplary embodiment of the present invention and a diagram for explaining cell deformation in each channel.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a microfluidic system in which two types of fluid channels of FIG. 4 are connected in series in a fluid flow direction.
  • the microfluidic system of the present invention includes (1) ⁇ cross junction and (2) a T connection point at which fluid induced while passing through a vortex from the ⁇ connection point structure channel collides with the channel wall. It has a rescue channel (T-Junction).
  • the microfluidic structure in the form of T, Y, ⁇ may be designed in series, parallel, or a combination of fluid flows, all of which fall within the scope of the present invention.
  • a plurality of connection points to which a plurality of unit channels are connected may be formed on a single channel defined as a cell reference inlet and an outlet.
  • the system according to the present invention has a specific additional effect of capturing cells by vortex breakdown after cell transformation and mass transfer due to vortex formation and inducing transformation.
  • a specific trapping phenomenon of cells was observed for a certain period of time as the cell deformed region due to the first vortex flow. That is, slightly above the stationary point, the cells repeatedly moved up and down for about 30 ⁇ s, and then went out to the exit again. This means that immediately after leaving the vortex region, the cell is deformed for a certain period of time according to the inertia caused by the vortex collapse and then stays in the region near the junction (the region near the stagnation point), and thereby the intracellular mass transfer efficiency can be greatly improved.
  • FIG. 8 is a graph in which cell capture and cell transformation time according to the eddy current collapse of FIG. 7 are normalized as a function of Reynolds number.
  • FIG. 9 is a diagram showing an intracellular mass transfer platform according to an embodiment of the present invention.
  • the intracellular mass transfer platform includes: a first channel 100 through which a fluid including cells and a transfer material flows; A second channel 200 perpendicular to the first channel 100; And a first fluid control means 300 provided at one side of the first channel 100 to control a fluid velocity in the first channel 100 in a first direction.
  • the fluid in the first channel 100 flows oppositely to a point perpendicular to the second channel 200, and the first fluid control means 300 A kinetic energy applied to the cells on the first channel 100 by applying cell membrane deformation at a level at which nanopores are formed in the cells by the vortex formed at the point where the first channel 100 and the second channel 200 intersect vertically Characterized in that.
  • the other side of the first channel 100 may further include a second fluid control means 300 ′ for controlling the fluid velocity in the first channel 100 in a second direction.
  • first and second fluid control means (300, 300') controlled in opposite directions in the first channel (100) at a point where the first channel (100) and the second channel (200) cross each other perpendicularly. It may be formed, and physical deformation is applied to the cell by the inertial force and the inertial flow phenomenon generated accordingly, so that the cell membrane may be deformed.
  • the intracellular material delivery platform according to the present invention can deliver nucleic acids, proteins, transcription factors, vectors, plasmids, genetic scissors material, nanoparticles, and the like. However, it is not limited thereto.
  • the intracellular substance delivery platform is not limited to regenerative medicine, cancer immunotherapy, gene editing, or application to other fields.
  • 10 to 12 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • the fluid including the cells and the delivery material flows through the first channel 100 by the first fluid control means 300.
  • the second fluid control means 300 ′ formed on the other side of the first channel 100 also operates, so that the delivery material can flow in a direction facing the fluid controlled by the first fluid control means 300. .
  • the delivery material includes all materials that can be delivered into cells, and specifically, a genetic scissors material, a plasmid, a nucleic acid, a protein, a nanoparticle, etc. may all correspond to this.
  • another cell deformation is induced according to a vortex breakdown formed after passing through a vortex formed in the fluid.
  • Example 2 T or Y connection point structure microfluidic system
  • a cavity is an empty space formed in a channel at a point of congestion, and is a structure that eliminates or reduces the collision area between the cell and the channel wall when the cell of the solution and the channel wall collide at the connection point.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of a T connection point structure channel according to an embodiment of the present invention.
  • the cells Upon injection, the cells were concentrated in the center of the channel by inertia, and the cells collided with the channel wall. Each cell partially penetrates the above-described cavity (Fig. 13 (1)), and has been deformed (see the right photo of Fig. 13). Subsequently, after the first cell transformation according to the collision, the cells are captured in a local vortex near the stagnation point (point (2) in FIG. 13), and are hydrodynamically deformed, forming nanopores in the cell membrane, which are described in FIG. As shown.
  • a cavity is used in the T connection point channel structure, and the advantage is that cells can collide in a fluid form instead of a hard solid channel wall, thereby reducing cell damage due to collision with the hard solid channel wall. It is to let. Another is to form a stagnation point upstream of the incoming stream, supporting complex fluid behavior patterns, virtually preventing cell clogging. Therefore, the shape, size, shape, etc. of this cavity structure may vary depending on the cell. For example, as shown in FIG. 13, it may include not only a circular, elliptical, elongated slit, square, rectangular, trapezoidal, polygonal, combination thereof, and a modified form thereof, as shown in FIG. As long as they do not collide with, they all belong to the cavity of the present invention.
  • the cavity diameter is determined according to the cell diameter, and in particular, it is preferable to have a diameter of 10% to 5 times the cell size.
  • the cavity diameter according to the present invention is at least within the scope of the present invention as long as it can reduce the collision force caused by collision of the cells flowing into the connection point with the channel wall through the solution.
  • FIG. 14 is a high-speed microscopic image illustrating the mechanism of cell deformation and vortex formation in the T junction channel of the cavity structure.
  • each of the arrows indicates the direction of fluid flow.
  • VDI Vortex Deformation Index
  • t is the cell capture time in the vortex and c is the circularity ( , Where A and P are the area and radius at maximum strain), U is the average velocity of the fluid, and D is the cell diameter.
  • 16 is a diagram showing an intracellular material delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • Intracellular mass transfer platform comprises a third channel 101 forming a path through which a fluid containing cells and a transfer material moves; A fourth channel 201 extending vertically to both sides of the third channel 101 at an end of the third channel 101; And a fluid control means 301 provided in the third channel 101 to control a fluid velocity in the third channel 101.
  • 17 to 19 are diagrams for explaining a method for delivering intracellular substances using the intracellular substance delivery platform according to an embodiment of the present invention.
  • the fluid including the cells and the delivery material flows through the third channel 101 by the fluid control means 301.
  • the delivery material includes all materials that can be delivered into cells, and includes all materials such as scissor materials, plasmids, nucleic acids, proteins, and nanoparticles.
  • the cells of the third channel 101 accelerated by the fluid control means 301 are trapped by a vortex formed near a connection point and then deformed. This is as described in FIGS. 13 and 14. Thereafter, the cells collide with the partition wall of the fourth channel 201 connected to the end of the third channel 101.
  • the fourth channel 201 is provided with a slit-shaped cavity 401 formed in the same direction as the fluid flow direction in the third channel 101, and the cavity 1) prevents cell damage due to physical collision. 2) Prevent clogging 3) It causes the effect of forming stagnation points in the upstream.
  • a plurality of unit microfluidic systems may be connected in series or in parallel, or a combination thereof to construct an entire system.
  • the vortex in a circulating manner, the vortex may occur in a recirculated flow, in which case the vortex may be a closed or open flow.
  • the intracellular mass transfer effect according to the present invention can be confirmed through multiple FITC signals on the right.
  • FIG. 24 is a result of measuring dextran delivery efficiency in the complex microfluidic system of FIG. 5 (a combination of a connection point channel and a T connection point channel).
  • 25 is a comparison result of the transfer efficiency of the conventional electroporation (electroporation, a Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)) and the inertial-based material transfer method (hydroporation) according to the present invention.
  • electroporation electroporation, a Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)
  • hydroporation inertial-based material transfer method
  • the present invention in the case of 2000 kDa FITC-dextran, the present invention was 4 times higher than that of the electroporation method.
  • the method according to the present invention greatly improves the delivery efficiency of macromolecules that are difficult to penetrate into cells by the electroporation method, which suggests the possibility of intracellular delivery of molecular weight substances that cannot be achieved by conventional electroporation techniques.
  • FIGS. 26 and 27 are photographs of analyzing the intracellular delivery effect of gold nanoparticles (GNP) and the results of counting scattering points.
  • GNP gold nanoparticles
  • (A) is the result of the hydrodynamic drilling method (SH),
  • GNP can be delivered by electroporation, but it can be seen that only a few scattering points are detected (B). Furthermore, the endocytosis mechanism showed lower particle transfer efficiency than electroporation (C).
  • the intracellular mass transfer method and system according to the present invention have a higher survival rate than the electroporation method.
  • FIG. 29 is a result of calculating the normalized yield by multiplying the number of scattering spots by the cell survival rate (FIG. 5F).
  • MSN menopausal silica nanoparticles
  • DOX anti-containing drug doxorubicin
  • FIG. 31 is a time-dependent cell viability analysis result of the analyte of FIG. 30.
  • DOX cytotoxicity to MDA-MB-231 cells was measured by the trypan blue exclusion method, and it can be seen that approximately 85% of cancer cells died after 6 hours. From these results, it is indicated that the microfluidic system according to the present invention can investigate DOX-induced apoptosis without using a conventional surface ligand-based DOX delivery method.
  • FIG. 32 is a histogram of fluorescence intensity measuring the transduction effect to K562 cells using mRNA (996-nucleotide mRNA fragment, green fluorescent protein) as a foreign material.
  • mRNA 996-nucleotide mRNA fragment, green fluorescent protein
  • FIG. 32 (A) is endocytosis, (B) is the microfluidic system result according to the present invention, EGFP protein expression was evaluated based on mRNA delivery (2 ⁇ g / mL) using a flow cytometer.
  • the method according to the present invention shows a very high protein expression level. This means that the intracellular substance delivery method and system according to the present invention can be used for chimeric antigen (CAR-T) without the use of vectors or vaccines.
  • CAR-T chimeric antigen
  • the method according to the present invention detected a strong EGFP signal resulting from higher mRNA delivery efficiency.
  • DNA Unlike mRNA, which first binds to the cell substrate, DNA must first pass through the cell membrane and enter the nuclear membrane through the nuclear pore. Furthermore, in terms of mass transfer, naked plasmid DNA is easily degraded by nucleases and has a high viscosity. And high-density cytoplasm does not provide good conditions for long and twisted DNA to go to the nucleus by pure diffusion.
  • the present inventors provide a fluid-based microfluidic system according to the present invention as a method of delivering plasmid DNA to the nucleus. To this end, in this experimental example, an experiment was performed to encode copepod GFP and deliver 7.9 kbp plasmid DNA to HEK293t cells.
  • the method according to the present invention shows a very strong fluorescence image.
  • FIG 38 is a graph showing the analysis of the plasmid DNA (pDNA) transformation efficiency of HEK293t cells (E (and the average intensity (F) of the average HEK293t cells according to the plasmid DNA concentration).
  • 39 and 40 show the results of analyzing the ITGa1 gene knockdown effect by Western blot by delivering siRNA to HeLa cells ( ⁇ 1 subunit of the integrin transmembrane receptor) and comparing the relative expression levels.
  • the ITGa1 gene knockdown effect was compared using a conventional cationic Lipofectamine 3000 known as a siRNA delivery method as a comparative example.
  • mRNA was selected as a delivery target, because after mRNA delivery, protein expression is expressed in the cytoplasm and induced to fat, and it can be well controlled, and it is easy to compare according to the amount-dependent transformation.
  • EGFP mRNA was converted to MSC (harton's jelly human umbilical cord mesenchymal stem cell), ADSC ( human adipose derived stem cell), and BMDC (mouse bone marrow derived dendritic cell).
  • the present invention shows a very high trait yield compared to Lipofectamine 3000 and the electroporation method.
  • the trait yield is defined as the product of the transformation efficiency and the cell viability, and this can be understood as the ratio of viable cells to cells transformed by material transfer.
  • lipofection showed improved cell viability compared to the present invention ( ⁇ -Hydroporator) and electroporation in all cell types, but it can be seen that substantially low transformation efficiency was shown in all cell types. have.
  • transformation efficiency was slightly higher in electroporator than in the present invention ( ⁇ -Hydroporation).
  • the present invention ⁇ -Hydroporator
  • the cell viability of the present invention may be further increased by simply adding trehalose or a polymer to the cell medium.
  • the present invention showed higher transformation efficiency and cell survival rate than the electroporation method, which shows that the present invention is highly likely to be used in cancer immunotherapy.
  • the present invention can process up to 1 x 106 cells/min while maintaining the same level of delivery efficiency, and since this throughput is based on a single microchannel, the cell throughput required for cancer immunotherapy through multiplexing and parallelization of microchannels You can run.
  • quantum dots Dibenzo cyclooctyne (DOBI)
  • silica nanospheres which are widely used as target molecules, were determined as intracellular delivery materials, and the delivery characteristics to the cells (MDA-MB-231) were analyzed.
  • 45 is a confocal microscope image showing that quantum dots (qdot625) are transferred to MDA-MB-231 cells by the present invention ( ⁇ -Hydroporator), electroporator, and Lipofectamine 3000.
  • the result of this analysis shows the degree of aggregation of the quantum dots.
  • the number of quantum dots per cell is the lowest. That is, electroporation or lipofection shows the number of quantum dots three and four times higher than that of the present invention.
  • electroporation or lipofection shows the number of quantum dots three and four times higher than that of the present invention.
  • Figure 47 is a negative control (untreated K562 cells, negative control), positive control (K562 cells cultured with nanospheres, the same time as in the Example, the same concentration) and the present invention ( ⁇ -Hydroporator) according to the nanospheres (green fluorescence)
  • Figure 48 shows the results of measuring the relative average fluorescence intensity.
  • 49 and 50 are confocal images for two of the groups of FIGS. 47 and 48.
  • a DiD lipophilic carbosiamine dye was used to visualize the cell membrane.
  • the green fluorescence signal from the positive control (co-culture) was present only in the cell membrane, but bright green fluorescence from the cytoplasm was observed only in the cells treated according to the present invention.
  • microfluidic system for delivering foreign substances into cells by perforating cells using inertia is recognized for its industrial applicability in the fields of bio and medicine that require transfer of substances into cells.

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Abstract

관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 세포 내로 전달하는 미세유체 시스템으로, 세포와 외부물질을 포함하는 용액이 연속적으로 흐르는 유체채널 구조를 포함하고, 상기 유체채널 구조는 하나 이상의 채널 간 연결점(junction)을 포함하며, 상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류가 발생하며, 상기 와류에 의하여 세포는 변형되며, 상기 와류에 의하여 세포막의 일시적 불연속성이 생성되며, 상기 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환에 따라 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템이 제공된다.

Description

세포 내 물질 전달을 위한 미세유체 시스템 및 방법
본 발명은 세포 내 물질 전달을 위한 미세유체 시스템 및 방법에 관한 것이다.
세포 내 물질 전달은 세포공학의 가장 기본이 되는 실험 중 하나로 보통 캐리어를 이용하거나 세포막/핵막에 나노구멍(nanopore)을 만들어 물질을 전달한다.바이러스 또는 Lipofectamine 중심의 캐리어 기법들은 최적화 시 고효율 물질 전달이 가능하나 안전성, 느린 전달 속도, 노동/비용 집약적인 캐리어 준비 과정, 낮은 재현성 등의 문제점들이 존재한다.
이에 반하여 세포막에 에너지를 가하여 나노구멍을 만드는 방법들(예: 전기천공(Electroporation) 또는 마이크로니들(microneedle))은 상대적으로 여러 물질을 다양한 세포주로 전달이 가능한 장점이 있다. 그러나 방법의 침습성으로 인한 낮은 세포 생존율, 전달 물질의 변성 그리고 낮은 처리량은 큰 한계로 지적되고 있다.
이러한 문제점들을 해결하고자 대량의 세포처리가 가능한 미세유체기기들의 사용이 두드러진다. 대표적으로 미세관에 병목 구간을 만들고 세포들이 병목 구간을 지날 때 세포의 물리적 변형을 통해 세포막에 나노구멍을 만드는 플랫폼이 존재한다. 그러나, 이 접근법은 실험 진행 시 병목 구간 자체가 막히고, 일정하지 못한 물질 전달 효율 등의 큰 단점들을 가진다.
예를 들어 미국 특허 2014-0287509호는 병목 구조를 갖는 채널을 통하여 세포에 압력을 인가하여 세포변형율 유도하는 기술을 개시하고 있다. 하지만, 이 경우, 세포가 병목구조를 막게 되는 문제가 있고, 협착부의 크기보다 작은 세포에만 물질 전달이 가능하다는 문제가 있다. 더 나아가, 미세한 직경의 채널을 사용하여야 하는 점에서 높은 비용이 발생하는 문제가 있다.
따라서 상기 미체유체 기기의 높은 처리 기능을 살리면서 세포 내에 다양한 물질을 균일하게 고효율로 전달할 수 있는 혁신적인 차세대 세포 내 물질 전달 플랫폼 개발이 시급하다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 새로운 능동전달 수단의 사용없이 대량의 세포에 고효율로 물질을 전달할 수 있는 시스템과 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 위하여, 본 발명은 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 세포 내로 전달하는 미세유체 시스템으로, 세포와 외부물질을 포함하는 용액이 연속적으로 흐르는 유체채널 구조를 포함하고, 상기 유체채널 구조는 하나 이상의 채널 간 연결점(junction)을 포함하며, 상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류가 발생하며, 상기 와류에 의하여 세포는 변형되며, 상기 와류에 의하여 세포막의 일시적 불연속성이 생성되며, 상기 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환에 따라 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 또한 상기 하나 이상의 채널 간 연결점을 포함하는 유체채널 구조는 T, Y, 십자형태 또는 이들의 조합을 포함하는 연결점을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유체채널 구조가 T 또는 Y 형태의 채널인 경우, 유체 정체점 부근에서 캐비티를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 캐비티는 원형, 타원형, 길쭉한 슬릿, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 다각형 및 이들의 조합과 그 변형된 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 캐비티의 직경은 상기 세포의 직경에 따라 결정된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 미세유체 시스템은, 상기 유체채널 구조에서 용액을 흐르게 하는 유체제어수단을 더 포함하며, 상기 유체제어수단은 상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류를 발생시킬 수 있는 수준의 속도로 상기 용액을 상기 유체채널에서 흘릴 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유체제어수단은 시린지 펌프 또는 공압시스템일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 용액의 레이놀즈 수(Re)는 1 내지 1000일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 와류 특징은 상기 레이놀즈 수에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 와류는 닫힌 또는 개방된 재순환 흐름 형태일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 미세유체 시스템은 상술한 시스템이 직렬, 병렬 또는 이들의 조합 방식으로 결합된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법으로, 상기 세포와 외부물질을 포함하는 용액을 유체채널로 연속적으로 흘리는 단계; 상기 연결점 근처에서 와류생성수단에 의하여 와류를 형성시키는 단계; 상기 와류에 의하여 상기 세포가 변형되는 단계; 및 상기 세포 변형에 의하여 세포막에 생성되는 천공을 통하여 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 와류생성수단은 상기 유체채널의 연결점 구조일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 유체채널은 T, Y, 십자형태 또는 이들의 조합을 포함하는 연결점을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 연결점(junction)을 적어도 하나 이상 포함하는 유세채널 구조에 세포와 외부물질을 흘림으로써 와류를 발생시켜, 그 관성으로 세포를 변형시켜 세포막 일시적 불연속상을 유도하여 세포막을 천공시킨다. 이후, 천공된 세포막을 통하여 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환이 일어나며, 그 결과 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입된다. 따라서, 본 발명은 벡터 또는 능동 세포 전달 수단(예를 들어 전기장 등)을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명은 용액과 채널구조 특성만으로 외부물질(ex: 유전자, 플라스미드, 나노 입자 등)을 세포내로 고효율로 저렴한 비용으로 직접 전달할 수 있다.
도 1은 ╋ 연결점 채널에서의 나선형 와류 형성을 나타내는 도면이다.
도 2는 나선형 와류에 의한 세포 변형 모식도(1)와, 회전 세포 운동을 나타내는 고속 현미경 이미지(2)(스케일 바:10μm)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 변형에 따른 물질전달의 기전을 설명하는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 2가지 형태의 채널 구조의 모식도와 각 채널에서의 세포 변형을 설명하는 도면이다.
도 5는 도 4의 2가지 형태의 유체채널이 유체 흐름 방향으로 직렬적으로 연결된 미세유체 시스템의 모식도이다.
도 6은 ╋ 연결점 구조 채널에서 서로 연결점(교차점) 방향으로 대향하여 유입되는 유체의 레이놀즈 수에 따른 거동을 실험한 결과이다.
도 7은 ╋ 연결점 구조 채널에서의 세포(MDA-MB-231) 포획 거동을 보여주는 고속 현미경 이미지이다.
도 8은 레이놀즈 수 함수로 도 7의 와류붕괴에 따른 세포포획과 세포변형시간을 정규화한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 10 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따란 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 T 연결점 구조 채널의 모식도이다.
도 14는 캐비티 구조의 T 연결점 채널의 세포 변형과 와류 형성 메커니즘을 설명하는 고속 현미경 이미지이다. 여기에서 화살표 각각은 유체 흐름 방향을 의미한다.
도 15는 상이한 레이놀즈 수를 갖는 유체에서의 와류 변형 지수(VDI) 분석 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 17 내지 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 20 및 21은 세포내로의 물질전달량의 분석결과이다.
도 22는 도 19과 동일 조건에서 레이놀즈 수를 달리하여 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 23은 다양한 덱스트란 크기에 대한 전달 효율성 분석 결과이다.
도 24는 도 5의 복합 미세유체 시스템(╋ 연결점 채널과 T 연결점 채널의 조합)에서의 덱스트란 전달 효율을 측정한 결과이다.
도 25는 종래의 전기천공법(electroporation, a Neon TransfectionSystem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA))과 본 발명에 따른 관성 기반 물질전달방법(hydroporation)의 전달 효율의 비교 결과이다.
도 26 및 27은 각각 금 나노입자(GNP)의 세포내 전달 효과를 분석한 사진, 산란 지점을 카운트한 결과이다.
도 28은 GNP 전달에 따른 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 29는 산란 스팟 개수에 셀 생존율(도 5F)을 곱하여 정규화 된 수율을 계산한 결과이다.
도 30은 금 나노입자 대신 약물, 단백질, 및 핵산 나노캐리어로 사용되는 메노포러스 실리카 나노입자(nanoparticles (MSN))의 세포내 전달 효율을 분석 결과이다.
도 31은 도 30의 분석 물질에 대한 시간 의존적 세포 생존력 분석 결과이다.
도 32는 mRNA(996-뉴클레오타이드 mRNA 조각, 녹색 형광 단백질)을 외부물질로 사용하여 K562 세포로의 전달효과를 측정한 형광 세기 히스토그램이다.
도 33은 (C) 엔도사이토시스 및 (D) 본 발명에 따른 미세유체 시스템에 따라 mRNA를 K562로 전달한 후 형광 이미지이다.
도 34는 도 32 및 33과 같이 mRNA가 본 발명에 따라 전달되는 경우, 전달 효율(E)과 생존율(F)을 측정한 결과이다.
도 35는 엔도사이토시스와 실시예 2의 방법으로 mRNA(996-뉴클레오타이드 mRNA 조각, 녹색 형광 단백질)을 K562 세포내로 전달한 후의 형광이미지이다.
도 36은 mRNA 형질주입 효율(b)과 mRNA 농도에 따른 평균 형광 세기(c)를 분석한 결과이다.
도 37은 엔도사이토시스(control)와 실시예 2의 방법으로 플라스미드 DNA를 HEK293t에 전달한 후의 형광이미지이다.
도 38은 HEK293t 세포의 플라스미드 DNA(pDNA) 형질 전환 효율(E)과 플라스미드 DNA 농도에 따른 평균 HEK293t 세포의 평균 강도(F)를 분석한 그래프이다.
도 39 및 40은 각각 HeLa 세포(인테그린 막 횡단 수용체의 α1 서브유닛)에 siRNA을 전달하여 ITGa1 유전자 녹다운 효과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과와, 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다.
도 41은 Lipofectamin 3000, 전기천공 방식 및 본 발명에 따른 형질 수율의 분석 결과이다.
도 42 내지 44는 인간 MSC, 인간 ADSC, 쥐 BMDC에 대한 형질전한 효율, 세포 생존율 및 행질전환 수율의 분석결과이다.
도 45는 본 발명(μ-Hydroporator), 전기천공법(electroporator) 및 Lipofectamine 3000에 의하여 양자점 (qdot625)이 MDA-MB-231 세포로 전달되는 것을 보여주는 공초점 현미경 이미지이다.
도 46은 세포당 양자점(Qdot 625)의 스팟 카운트 수 분석 결과이다.
도 47은 음성 대조군(처리안된 K562 세포, negative control), 양성 대조군(나노구와 함께 배양된 K562 세포, 실시예와 동일 시간, 동일 농도) 및 본 발명(μ-Hydroporator)에 따라 나노구(녹색 형광 실리카 나노구, Micromod, 독일)가 K562 세포로 전달된 실시예(μ-Hydroporator, 샘플당 Ncell = 5,000)의 형광세기 히스토그램이다.
도 48은 상대적 평균 형광 세기 측정 결과이다.
도 49 및 50은 도 47 및 48의 그룹 중 두 그룹에 대한 공초점 이미지이다.
이하, 본 발명에 따른 관성을 기반으로 한 세포 내 물질전달 시스템의 바람직한 실시예를 첨부한 도면들에 의거하여 상세히 설명한다. 참고로, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어와 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석해야만 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
상술한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 미세유체 시스템으로, 세포와 외부물질을 포함하는 용액이 연속적으로 흐르는 유체채널 구조를 포함하며, 상기 유체채널 구조는 하나 이상의 채널 간 연결점(junction)을 포함하며, 상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류가 발생하며, 상기 와류에 의하여 세포는 변형되며, 상기 와류에 의하여 세포막의 일시적 불연속 형상이 생성되며, 상기 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환에 따라 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포와 외부물질을 포함하는 용액을 유체채널로 연속적으로 흘리는 단계; 상기 연결점 근처에서 와류생성수단에 의하여 와류를 형성시키는 단계; 상기 와류에 의하여 상기 세포가 변형되는 단계; 및 상기 세포 변형에 의하여 세포막에 생성되는 천공을 통하여 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포내 물질전달 방법과 시스템은 와류를 유체채널 내에서 생성시키고 와류에 의하여 세포를 변형하여 천공을 세포막에 발생시키는 기술적 특징에 기초한다. 특히 본 발명은 이러한 와류에 세포가 유입되는 경우 와류에 의한 세포변형과, 이어디는 와류 붕과(vortex breakdown)에 의한 세포 변형으로 세포내 물질 전달 효율을 향상시킨다. 본 발명의 일 실시예에서 와류는 연결점과 같은 유체채널의 물리적 구조를 통하여 와류를 생성시키나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.
와류생성수단이 연결점인 일 실시예에 따르면, 본 발명은 세포 내로 세포 바깥의 외부물질을 전달하기 위한 시스템으로, 적어도 둘 이상의 채널이 연결되는 연결점(Junction)을 하나 이상 포함하는 유체채널 구조의 미세유체 시스템(microfluidic system)을 제공한다. 본 발명에서 "연결점"이라 함은 둘 이상의 채널이 T, Y, ╋ 또는 이들의 조합 형태로 연결될 때 각 채널이 만나는 지점을 의미하며, 본 발명에서의 연결점은 유체의 입구와 출구로 정의되는 단일 채널에서 적어도 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체 시스템에서, 세포와 외부물질을 포함하는 용액이 상기 연결점으로 유입됨에 따라 연결점 계면에서는 와류(Vortex)가 발생하며, 이때 와류와 와류붕괴(Vortex Breakdowm)를 연속적으로 경험하는 세포는 관성에 의하여 연속적으로 포획, 변형되며, 그 이후 세포내 물질전달의 통로가 되는 세포막 천공이 변형이 진행됨에 따라 차례로 형성된다. 즉, 본 발명에 따른 미세유체 시스템은, 레이놀즈 수(1 내지 1000)와 같은 유체 특성과, T, Y, ╋ 또는 이들의 조합 형태의 채널 구조를 활용하여 세포 내 물질 전달 효율을 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 하기 실시예의 미세유체 시스템은 보통 포토리소그래피(photolithography) 공정을 통해서 SU-8 몰드 또는 실리콘 웨이퍼를 식각(etching)하여 본 발명에 따른 채널이 형성된 몰드를 먼저 만들었다. 이후 그리고 폴리디메틸실록산(PDMS)을 통해서 PDMS 기반 칩을 만들었으며, 이 때 만들어진 칩에 입구(inlet)와 출구(outlet)를 만들고, 일반 슬라이드 글래스와 플라즈마 처리를 이용하여(Cute, Femto Science, South Korea) 결합하여 플랫폼 기기를 제조하였다. 이후 만들어진 칩에 부유 상태의 세포들과 전달하고자 하는 물질을 혼합 후, 시린지 펌프를 사용하여 주입하게 된다. 이때 시린지 펌프의 유량 조절을 통해서 세포내 물질 전달을 컨트롤 할 수 있고, 전달 후, 원심분리기를 이용하여 세포만을 분리 후 다시 배양하거나 분석하거나 목적에 맞게 이용하게 하였다. 하지만 본 발명의 범위는 실시예 자체에 제한되지 않는다.
실시예 1: ╋ 연결점 구조 미세유체 시스템
도 1은 ╋ 연결점 채널에서의 나선형 와류 형성을 나타내는 도면이다.
도 1을 참조하면, ╋ 채널 양 끝단에서 서로 대향하는 방향으로 유체를 흘림에 따라, 상기 채널과 교차하는 또 다른 2개의 채널로 상기 유체는 나가게 되는데, 이때 정체점 부근에서의 유체 불안성은 강한 나선형의 국소 와류(localized vortex)를 인접점 인근에서 유도한다. 이러한 국소 와류는 다음 설명하는 세포 변형과 세포내 물질 전달 현상의 이유를 설명한다. 본 발명에서 "인근(near)"이라 함은 연결점(junction)으로 도입되는 유체가 연결점 구조에 의하여 와류가 발생가능한 영역이다.
도 2는 나선형 와류에 의한 세포 변형 모식도(1)와, 회전 세포 운동을 나타내는 고속 현미경 이미지(스케일 바:10μm)이다.
도 2를 참조하면, 본 발명은 중간 정도의 레이놀즈 수(1-1000)로 유체를 연결점 구조 채널(Junction channel)로 흘리는 경우, 세포들은 대칭적인 세포 신장(cell elongation) 대신 나선형으로 움직이는데, 이때 상기 세포는 와류 흐름의 정체점으로 접근함에 따라 큰 변형을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 변형에 따른 물질전달의 기전을 설명하는 도면이다.
도 3을 참조하면, 좌측의 세포 변형에 따라 세포막에서 나노구멍이 생성되며, 상기 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환에 따라 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입된다. 이후 1분 내지 10분 이내로 세포막은 자체 회복되어 닫히는데, 이러한 회복 시간은 용액의 칼슘과 같은 전해질 농도를 조정하여 제어할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 2가지 형태의 채널 구조의 모식도와 각 채널에서의 세포 변형을 설명하는 도면이다.
도 4에서의 2가지 형태의 채널 구조는, 서로 반대로 흐르는 유체는 연결점 부근에서 충돌하여 연결점 근처에서 와류가 형성되는 ╋ 구조와, 유입되는 세포가 채널벽에 충돌하는 T자 구조이다.
도 5는 도 4의 2가지 형태의 유체채널이 유체 흐름 방향으로 직렬적으로 연결된 미세유체 시스템의 모식도이다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 미세유체 시스템은 (1) ╋ 연결점 구조 채널(Cross Junction)과, (2) 상기 ╋ 연결점 구조 채널로부터 와류를 통과하면서 유도된 유체가 채널벽과 충돌하는 T 연결점 구조 채널(T-Junction)를 갖는다.
이러한 시스템의 경우, ╋ 연결점 구조 채널(Cross Junction)에서의 정체점을 벗어난 세포는 다시 관성에 의하여 채널 중심으로 유도되어 채널 벽과 다시 충돌하게 된다. 즉, 본 발명에 따른 T, Y, ╋ 형태의 미세유체 구조는 유체 흐름에 대하여 직렬, 벙렬 또는 그 조합 형태로 설계될 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 범위에 속한다. 이 경우 세포 기준 입구와 출구로 정의되는 단일 채널 상에 복수 개의 단위 채널이 연결된 복수 개의 연결점이 형성될 수 있다.
도 6은 ╋ 연결점 구조 채널에서 서로 연결점(교차점) 방향으로 대향하여 유입되는 유체의 레이놀즈 수에 따른 거동을 실험한 결과이다.
도 6을 참조하면, 최저 레이놀즈 수에서, 두 유체 흐름 사이의 계면은 대칭으로 분명한 형태로 유지되며, 3차원 소용돌이 운동은 레이놀즈 수 37.9(임계 레이놀즈 수)에서 명백하게 시작한다. 이후 레이놀즈 수가 증가함에 따라 두 유체 흐름간 교차는 더욱 강력해지고 복잡해 진다(1).
도 6의 (2), (3)은 공초점 현미경 이미지로서, 레이놀즈 수가 증가함에 따라 반 시계 방향의 나선형 소용돌이가 임계 레이놀즈 수 이상으로 발전했으며 나선형이 수직 및 수평으로 확장된다. 이상의 결과는 연결점 근처에서의 와류 발생과, 그 형태, 패턴, 속도 등은 유체의 레이놀즈 수에 따라 가변되는 것을 의미한다. 이것은 또한 원하는 세포 종류, 전달되어야 하는 물질의 종류에 따라 레이놀즈 수를 가변시키는 방식으로 전달 효율을 향상시킬 수 있는 것을 암시한다.
본 발명에 따른 시스템은, 와류 형성에 따른 세포변형 및 물질전달 후 와류 붕과(Vortex Breakdown)에 의하여 세포가 포획되고 변형을 유도하는 특이적인 추가 효과가 있다.
도 7은 ╋ 연결점 구조 채널에서의 세포(MDA-MB-231) 포획 거동을 보여주는 고속 현미경 이미지이다.
도 7을 참조하면, 첫번째 와류에 의한 세포 변형 영역을 벗어남에 따라 세포의 특이한 포획(trapping)현상이 일정시간 관찰되었다. 즉, 정체점 약간 위쪽에서, 약 30μs 동안 세포가 반복적으로 위 아래로 움직임 후 다시 출구쪽으로 나갔다. 이것은 와류 영역을 벗어난 직후 와류 붕괴에 의한 관성에 따라 세포는 일정 시간 변형된 후 연결점 인근 영역(정체점 부근 영역)에 체류하며, 이로써 세포 내 물질전달 효율이 크게 향상될 수 있음을 의미한다.
도 8은 레이놀즈 수 함수로 도 7의 와류붕괴에 따른 세포포획과 세포변형시간을 정규화한 그래프이다.
도 8을 참조하면, 레이놀즈 수가 증가함에 따라 세포포획 및 변형 시간은 증가하며, 이러한 와류 형성 후의 일정 시간의 세포 변형은 세포 내 물질 전달 효율을 크게 향샹시킬 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 ╋ 연결점 구조 미세유체 시스템을 설명한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
도 9를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 유동하는 제 1 채널(100); 상기 제 1 채널(100)과 수직 교차하는 제 2 채널(200); 및 상기 제 1 채널(100)에 일측에 구비되어 상기 제 1 채널(100)에서의 유체 속도를 제 1 방향으로 제어하는 제 1 유체제어수단(300)을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 1 채널(100)에서의 유체는 상기 제 2 채널(200)과 수직 교차하는 지점으로 대향하여 유동하며, 상기 제 1 유체제어수단(300)은 상기 재 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 수직 교차하는 지점에 형성된 와류에 의하여 상기 세포에 나노구멍이 형성되는 수준의 세포막 변형을 가하는 운동에너지를 상기 제 1 채널(100) 상의 세포에 인가하는 것을 특징으로 한다.
이에 더하여, 상기 제 1 채널(100)의 타측에는 제 1 채널(100) 에서의 유체 속도를 제 2 방향으로 제어하는 제 2 유체제어수단(300')을 더 포함할 수 있다.
특히, 제 1 채널(100) 에서 서로 반대방향에서 제어되는 제 1, 2 유체제어수단(300, 300') 제 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 서로 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성될 수 있고, 이에 따라 발생되는 관성력과 관성 유동 현상에 의해서 세포에 물리적인 변형이 가해져 세포막이 변형될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은 핵산, 단백질, 전사인자, 벡터,　플라스미드, 유전자 가위 물질, 나노입자 등을 전달할 수 있다. 다만, 이에 한정하는 것은 아니다.
나아가, 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼은 재생의학, 암면역치료, 유전자 편집이나 다른 분야로의 적용에 제한을 받지 않는다.
도 10 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 10을 참조하면, 상기 제 1 채널(100)에 상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 제 1 유체제어수단(300)에 의하여 유동된다. 이때, 상기 제 1 채널(100)의 타측에 형성된 제 2 유체제어수단(300') 또한 작동하여, 제 1 유체제어수단(300)에서 제어되는 유체와 마주보는 방향으로 전달물질을 유동시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 전달 물질은 세포 내로 전달될 수 있는 모든 물질을 포함하며, 구체적으로, 유전자 가위 물질, 플라스미드, 핵산, 단백질, 나노입자 등이 이에 모두 해당될 수 있다.
도 11을 참조하면, 상기 제 1 유체제어수단(300)에 의하여 가속된 유체는 연결점 근처에서 대향하는 유체와의 계면에 따라 와류를 형성하며, 와류에 의하여 포획된 세포는 변형된다. 이후 세포 변형에 따라 세포에는 나노구멍이 형성되며. 이상기 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 상기 세포 내로 전달된다. 따라서, 제 1, 2 유체제어수단(300, 300')은 유체가 연결점 부근에서 와류가 형성될 수준의 레이놀즈 수를 갖는 운동에너지를 인가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 유체에 형성되는 와류를 지난 후 형성되는 와류붕괴(vortex breakdown)에 따른 또 다른 세포 변형을 이끌게 된다.
도 12를 참조하면, 와류를 통과하는 세포는 와류붕괴를 경험하며, 관성에 의하여 다시 세포 변형이 일어난다. 이때 발생하는 또 다른 세포 변형에 따라 상기 세포막에 형성된 나노구멍을 통하여 상기 전달물질이 세포 내로 또 다시 전달되어세포 내 물질 전달 효율이 크게 향상된다.
실시예 2: T 또는 Y 연결점 구조 미세유체 시스템
본 발명의 또 다른 일 실시예는 캐비티를 구비한 T 또는 Y 연결점 구조 채널을 이용한, 세포 내 물질 전달 시스템을 제공한다. 본 발명에서 캐비티라 함은 정체점 지점에 채널에 형성된 빈 공간으로, 상기 연결점에서 상기 용액의 세포와 채널벽간의 충돌시 상기 세포와 채널벽간 충돌면적을 없애거나 감소시키는 구조이다.
이 경우, 상술한 ╋ 연결점 채널과 유사하게 국소 와류가 T자 연결점 근처에서 형성되며, 이후 세포 변형-세포막 나노구멍 형성-외부 물질의 세포내 전달-세포막 나노구멍 닫힘이 진행된다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 T 연결점 구조 채널의 모식도이다.
도 13을 참조하면, T자 채널의 연결점 부근에 채널 형의 캐비티(1)이 형성된 것을 알 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포내로 전달되는 외부물질이 혼합 된 세포를 적당한 레이놀즈 수에서 통상의 시린지 펌프 (PHD 2000, 미국 하버드 장치)를 유체를 흘리는 유체제어수단으로 사용하여 도 13의 미세유체채널에 주입하였다.
주입에 따라, 세포는 관성에 의하여 채널 중심에 집중되었고, 세포는 채널벽과 충돌하였다. 각 세포는 일부 상술한 캐비티(도 13의 (1))을 일부 관통하며, 변형되었다(도 13의 우측 사진 참조). 이후 충돌에 따라 첫번째 세포 변형 후, 세포는 정체점(도 13의 (2) 지점) 근처의 국소 와류 내에서 포획되며, 유체 역학적으로 변형되어, 세포막의 나노구멍이 형성되며, 이는 도 3에서 설명한 바와 같다.
이후 와류 영역을 통과한 세포는 다시 와류 붕괴에 따라 포획된 후 변형된다(도 13의 (3)). 이러한 추가적인 세포 포획과 변형의 장점은 도 7에서 상술한 바와 같이 세포 내 물질 전달 효율의 향상이다.
본 발명의 일 실시예에는 T 연결점 채널 구조에 캐비티를 사용하였는데, 그 장점은 딱딱한 고체 형태의 채널벽 대신 유체 형태로 세포가 충돌할 수 있게 하여, 딱딱한 고체 채널벽과 충돌에 따른 세포 손상을 감소시키는 것이다. 또 다른 하나는 정체점을 유입되는 업스트림에 형성시켜, 복잡한 유체 거동 패턴을 받들어, 사실상 세포 끼임 문제(clogging)를 방지하는 것이다. 따라서, 이러한 캐비티 구조는 그 형태, 크기, 형상 등은 세포에 따라 가변할 수 있다. 예를 들어 도 13과 같이 길죽한 슬릿 구조 뿐만 아니라 원형, 타원형, 길쭉한 슬릿, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 다각형 및 이들의 조합과 그 변형된 형태를 모두 포함할 수 있으며, 적어도 유입되는 세포가 그대로 채널벽과 충돌하지 않는 한, 이는 모두 본 발명의 캐비티에 속한다.
또한 캐비티 직경은 세포 직경에 따라 결정되며, 특히 세포 크기의 10% 내지 5배 수준의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 캐비티 직경은 적어도 용액을 통하여 연결점으로 유입되는 세포가 채널 벽과의 충돌에 따른 충돌력을 감소시킬 수 있는 한 이는 모두 본 발명의 범위에 속한다.
도 14는 캐비티 구조의 T 연결점 채널의 세포 변형과 와류 형성 메커니즘을 설명하는 고속 현미경 이미지이다. 여기에서 화살표 각각은 유체 흐름 방향을 의미한다.
도 14를 참조하면, 정체점 부근에서의 국소와류에 의한 포획(도 14의 (1))과, 정체점 부근의 유체 불안정성으로 인하여 정체점을 통과한 세포의 와류붕괴에 의한 포획(도 14의 (2))을 확인할 수 있으며, 이것은 상술한 ╋ 구조의 채널과 유사하게 와류-와류붕괴에 의한 세포포획-변형이 연속적으로 일어나는 것을 알려준다. 특히 도 14의 (2)에서 세포는 약 20μs 동안 정적 상태를 유지하다 다운스트림으로 빠져 나가는 것을 알 수 있다.
도 15는 상이한 레이놀즈 수를 갖는 유체에서의 와류 변형 지수(VDI) 분석 결과이다. 여기에서 VDI는 하기 식을 따르며, 이것은 세포 변형지수의 정도와 세포막 투과 지속시간으로 해석될 수 있으며, 이는 결국 세포 내 물질 전달 효율을 나타낸다.
Figure PCTKR2020003411-appb-I000001
여기에서 t는 와류에서의 세포 포획 시간, c는 원형성(
Figure PCTKR2020003411-appb-I000002
, 여기에서 A와 P는 면적과 최대 변형 상태에서의 반지름), U는 유체의 평균 속도, D는 세포 직경이다.
도 15를 참조하면, 레이놀즈 수가 증가함에 따라 (1)와류 (2)와류붕괴시 VDI가 증가하는데, 이것은 높은 레이놀즈 수가 보다 높은 세포내 물질 전달 효율을 갖는다는 것을 나타낸다.
이하 보다 구체적으로 본 발명에 따른 T 연결점 구조 미세유체 시스템을 설명한다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼을 나타낸 도면이다.
본 발명에 따른 세포 내 물질 전달 플랫폼은, 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 이동하는 경로를 형성하는 제 3 채널(101); 상기 제 3 채널(101)의 단부에 상기 제 3 채널(101)의 양 측면으로 수직 연장된 제 4 채널(201); 및 상기 제 3 채널(101)에 구비되어 상기 제 3 채널(101)에서의 유체 속도를 제어하는 유체제어수단(301)을 포함한다.
도 17 내지 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 세포 내 물질 전달 플랫폼을 이용한 세포 내 물질 전달 방법을 설명하는 도면이다.
도 17을 참조하면, 상기 제 3 채널(101)에 상기 세포 및 전달물질을 포함하는 유체가 유체제어수단(301)에 의하여 유동된다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 전달물질은 세포 내로 전달될 수 있는 모든 물질을 포함하며, 유전자 가위 물질, 플라스미드, 핵산, 단백질, 나노입자 등이 모두 이에 해당된다.
도 18을 참조하면, 상기 유체제어수단(301)에 의하여 가속된 제 3 채널(101)의 세포는 연결점 근처에서 형성된 와류에 의하여 포획된 후 변형된다. 이는 도 13 및 14에서 설명한 바와 같다. 이후 상기 세포는 상기 제 3 채널(101)의 단부에 연결된 제 4 채널(201)의 격벽과 충돌하게 된다.
이때 상기 제 4 채널(201)에는 상기 제 3 채널(101)에서의 유체 흐름 방향과 동일 방향으로 형성되는 슬릿 형태의 캐비티(401)가 구비되며, 상기 캐비티는 1) 물리적 충돌에 의한 세포 손상 방지 2) 막힘 방지 3) 업스트림에서의 정체점 형성의 효과를 발생시킨다.
본 발명에서는 상술한 바와 같이 복수 개의 단위 미세유체 시스템이 직렬 또는 병령 또는 이들의 조합방식으로 연결되어 전체 시스템을 구축할 수 있다. 이 경우 순환 방식으로 상기 와류는 재순환되는 흐름에서 발생할 수 있는데, 이 경우 상기 와류는 닫힌 또는 개방된 흐름일 수 있다.
실험예
실험예 1
본 실험예에서는 실시예 1에 기반한 미세유체 시스템의 전달특성을 분석하였다.
도 19는 18시간 후 엔도시토시스 작용(대조군, Endocytosis)과 본 발명에 따른 세포내 물질전달 방법(Spiral Hydroporation)에 따른 세포내 물질전달 효율을 비교한 결과이다. 여기에서 MDA-MB-231 세포 내로 3-5 kDa FITC가 컨쥬게이트된 덱스트란을 전달시켰으며, 그 결과를 형광이미지(스케일 바 : 40μm)로 나타내었다. 특히 여기에서 주목할 점은 MDA-MB-231 세포내로 덱스트란 전달은 매우 어렵다고 알려졌다는 것이다. 이하 설명되는 실험에서 별도의 언급이 없는 한 세포는 MDA-MB-231이다.
도 19를 참조하면, 본 발명에 따른 세포내 물질전달 효과는 우측의 다수 FITC 신호를 통하여 확인할 수 있다.
도 20 및 21은 세포내로의 물질전달량의 분석결과이다. 본 분석에서는 5% 이상의 형광 신호 분율로 전달 효율을 정의하였고 이것은 적색 점선에 대응한다.
도 20 및 21을 참조하면, 레이놀즈 수 366에서, 대략 96.5 %의 전달 효율이 달성되었고, Re가 증가함에 따라 형광 강도가 증가하여 히스토그램 프로파일이 오른쪽으로 이동함을 확인할 수 있다. 이는 레이놀즈 수를 조정함으로써, 세포 내 물질 전달량을 조정할 수 있음을 의미한다.
도 22는 도 19과 동일 조건에서 레이놀즈 수를 달리하여 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 22를 참조하면, 세포 생존율과 관련하여, 보다 높은 레이졸즈 수에서, 생존율의 감소가 관찰되는데, 레이놀즈 수가 높을수록 세포 교란이 상당히 커지기 때문으로 판단된다.
또한 세포 생존율을 더 조사하기 위해, 대사 기능을 통해 표준 MTT 분석을 수행하였고 이를 도 22에 나타내었다. 트리판 블루 제외 방법과 MTT 분석 사이의 전반적인 경향은 서로 잘 일치하는 반면, MTT 분석은 높은 레이놀즈 수에서 약간 낮은 생존율 값을 나타냈다.
도 23은 다양한 덱스트란 크기에 대한 전달 효율성 분석 결과이다. 본 분석에는 2-55nm의 유체 역학적 직경에 상응하는, 3-2000 kDa 범위 분자량의 덱스트란을 사용하였는데, 동일한 흐름 조건 (Re=366) 하에서 5개의 상이한 크기와 동일 농도의 FITC-덱스트란(3-5, 70, 150, 500 및 2000 kDa)을 MDA-MB-231 세포 내로 실시예 1과 동일한 방법으로 전달하고 그 효율을 계산하였다.
도 23을 참조하면, 비교적 작은 덱스트란(<70 kDa)은 큰 덱스트란보다 높은 전달 효율을 갖는 것으로 나타났다. 이는 작은 덱스트란의 경우, 세포막을 가로지르는 덱스트란의 대류 및 확산 수송이 발생하는 반면, 큰 덱스트란의 수송은 대류수송이 지배하기 때문이다.
도 24는 도 5의 복합 미세유체 시스템(╋ 연결점 채널과 T 연결점 채널의 조합)에서의 덱스트란 전달 효율을 측정한 결과이다.
도 24를 참조하면, 연속적인 세포 변형이 이루어지는 도 5의 복합 미세유체 시스템은 상대적으로 단독(stand alone)보다 높은 전달 효율을 보이는 것을 알 수 있다.
도 25는 종래의 전기천공법(electroporation, a Neon TransfectionSystem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA))과 본 발명에 따른 관성 기반 물질전달방법(hydroporation)의 전달 효율의 비교 결과이다. 본 실험예에서는 500 및 2000 kDa FITC-덱스트란을 외부물질로 사용하였다.
도 25를 참조하면, 2000 kDa FITC- 덱스트란 경우, 본 발명은 전기천공법에 비하여 4배 정도 높았다. 특히 본 발명에 따른 방법은 전기천공 방식으로는 세포내 침투가 어려운 거대 분자의 전달효율을 크게 향상시키며, 이것은 종래의 전기천공 기술이 도저히 달성할 수 없는 분자량 물질의 세포내 전달 가능성을 시사한다.
도 26 및 27은 각각 금 나노입자(GNP)의 세포내 전달 효과를 분석한 사진, 산란 지점을 카운트한 결과이다. 여기에서 (A)는 본 발명에 따른 유체역학적 천공법(SH), (B) 전기천공법(EP), (C)엔도사이토시스(EC)의 결과이다.
도 26 및 27을 참조하면, 매우 큰 GNP(직경 200nm)가 본 발명에 따른 유체시스템을 통하여 MDAMB-231 세포 내로 성공적으로 전달되었다는 것을 알 수 있다(A). 반면 전기천공법으로는 GNP를 전달할 수 있지만,소수의 산란 지점만이 검출되는 것을 알 수 있다(B). 더 나아가 엔도사이토시스 기전인 경우 전기천공보다 낮은 입자 전달 효율을 나타내었다(C).
도 28은 GNP 전달에 따른 세포 생존율을 측정한 결과이다.
도 28을 참조하면, 전기천공법에 비하여 본 발명에 따른 세포내 물질 전달 방법과 시스템이 보다 생존율이 높은 것을 알 수 있다.
도 29는 산란 스팟 개수에 셀 생존율(도 5F)을 곱하여 정규화 된 수율을 계산한 결과이다.
도 29를 참조하면, 본 발명에 따른 물질 전달 효율은 전기천공법이나 엔도사이토시스에 비하여 효율이 무려 3배 이상임을 알 수 있다.
도 30은 금 나노입자 대신 약물, 단백질, 및 핵산 나노캐리어로 사용되는 메노포러스 실리카 나노입자(nanoparticles (MSN))의 세포내 전달 효율을 분석 결과이다. 본 실험에서는 항함약물인 독소루비신(DOX)이 MSN에 로딩되었고, MDA-MB-231 세포 내로 이를 전달하였다.
도 30을 참조하면, 본 발명에 따른 방법(Spiral control)의 경우 엔도사이토시스에 비하여 다수의 밝은 형광점을 나타내는 것을 알 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 방법으로 기능성 물질을 담지한 캐리어가 세포 내로 효과적으로 전달될 수 있다는 것을 시사한다.
도 31은 도 30의 분석 물질에 대한 시간 의존적 세포 생존력 분석 결과이다.
도 31을 참조하면, MDA-MB-231 세포에 대한 DOX 세포 독성을 트립판 블루 제외 방법으로 측정하였고 6 시간 후, 대략 암 세포의 85 %가 사멸된 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 미세유체 시스템은 종래의 표면 리간드 기반 DOX 전달방법을 사용하지 않고서도 DOX-유도 세포사멸을 조사할 수 있다는 점을 나타낸다.
도 32는 mRNA(996-뉴클레오타이드 mRNA 조각, 녹색 형광 단백질)을 외부물질로 사용하여 K562 세포로의 전달효과를 측정한 형광 세기 히스토그램이다. 도 32에서 (A)는 엔도사이토시스, (B)는 본 발명에 따른 미세유체 시스템 결과이고, 유동 세포 계측기를 사용하여 mRNA 전달(2μg / mL)에 기초하여 EGFP 단백질 발현을 평가하였다.
도 32를 참조하면, 본 발명에 따른 방법의 경우 매우 높은 단백질 발현량을 보이는 것을 알 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 세포내 물질전발 방법과 시스템이 벡터나 백신을 사용하지 않고서도 CAR-T(chimeric antigen, receptor-expressing T-cell)에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 33은 (C) 엔도사이토시스 및 (D) 본 발명에 따른 미세유체 시스템에 따라 mRNA를 K562로 전달한 후 형광 이미지이다.
도 33을 참조하면, 엔도사이토시스에 비하여 본 발명에 따른 방법은 보다 높은 mRNA 전달 효율 결과인 강한 EGFP 신호가 검출되었다.
도 34는 도 32 및 33과 같이 mRNA가 본 발명에 따라 전달되는 경우, 전달 효율(E)과 생존율(F)을 측정한 결과이다.
도 34를 참조하면, 세포 생존력을 희생시키지 않으면서 ∼92 % 수준의 전달 효율이 달성되었으며, 이는 추후 인간 면역 세포를 시험하기 위한 추가 조사가 필요하지만, 면역 요법 연구에 사용하기 위한 플랫폼이 지닌 높은 잠재력을 나타낸다.
실험예 2
본 실험예에서는 실시예 2에 기반한 미세유체 시스템(μ-Hydroporator)의 전달특성을 분석하였다.
도 35는 엔도사이토시스와 실시예 2의 방법으로 mRNA(996-뉴클레오타이드 mRNA 조각, 녹색 형광 단백질)을 K562 세포내로 전달한 후의 형광이미지이다.
도 35를 참조하면, 엔도사이토시스(control)과 달리 실시예 2의 방법으로 mRNA를 세포내로 전달한 경우 녹색 형광이 검출되는 것을 알 수 있다. 이것은 상술한 실시예 1과 동일하게 본 발명에 따른 T-연결점 채널 시스템(실시예 2)이 mRNA의 세포내 전달을 높은 효율로 가능하게 한다는 것을 증명한다.
도 36은 mRNA 형질주입 효율(b)과 mRNA 농도에 따른 평균 형광 세기(c)를 분석한 결과이다.
도 36을 참조하면, 플로우 사이토머트리 분석에 기초하여, 상이한 농도의 mRNA가 평가되었고, 2㎍/ml의 경우, 형질 감염 효율을 약 93 %까지 달성하였다. 이것은 종래의 병목 구조와 같은 압축 기반 미세유체 시스템에서는 불가능한 효율이다.
세포기질과 먼저 결합하는 mRNA와 달리 DNA는 먼저 세포막을 먼저 통과하고 핵 포어를 통하여 핵막에 들어가야 한다. 더 나아가, 물질 전달 측면에서 네이키드 플라스미드 DNA는 뉴클레아제에 의하여 분해되기 쉽고, 점도가 높다는 문제가 있다. 그리고 고밀도 세포질은 길고 꼬인 DNA가 순수하게 확산만으로 핵까지 가는데 있어 좋은 조건을 제공하지 않는다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자는 플라스미드 DNA를 핵으로 전달하는 방법으로 본 발명에 따른 유체기반 미세유체시스템을 제공한다. 이를 위하여, 본 실험예에서는 copepod GFP를 인코딩하고 HEK293t 세포에 7.9 kbp 플라스미드 DNA를 전달하는 실험을 하였다.
도 37은 엔도사이토시스(control)와 실시예 2의 방법으로 플라스미드 DNA를 HEK293t에 전달한 후의 형광이미지이다.
도 37을 참조하면, 본 발명에 따른 방법인 경우, 매우 강한 형광 이미지를 나타내는 것을 알 수 있다.
도 38은 HEK293t 세포의 플라스미드 DNA(pDNA) 형질 전환 효율(E(과 플라스미드 DNA 농도에 따른 평균 HEK293t 세포의 평균 강도(F)를 분석한 그래프이다.
도 38을 살펴보면, pDNA 농도가 증가할 수록 형질 전환 효율이 증가하며,평균 형광 강도 또한 증가하는 것을 알 수 있다.
도 39 및 40은 각각 HeLa 세포(인테그린 막 횡단 수용체의 α1 서브유닛)에 siRNA을 전달하여 ITGa1 유전자 녹다운 효과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과와, 상대적 발현 정도를 비교한 결과이다. 여기에서 siRNA 전달 방법으로 알려진 종래의 양이온 Lipofectamine 3000를 비교예로 사용하여 ITGa1 유전자 녹다운 효과를 비교하였다.
도 39 및 40을 참조하면, 본 발명을 사용하는 경우, ITGA1 발현(197 kDa)이 거의 없어졌으나, 비교예인 Lipofectamine 3000의 경우 부분적인 녹다운만이 관찰되었다. 이 결과부터 본 발명은 적어도 세 배 더 큰 녹다운 효율(97% 대 30%)을 가지며, 이것은 본 발명이 가지는 유전자 편집에 있어서의 높은 사용 가능성을 시사한다.
하기 실험에서는 비기능성 물질 또는 극도로 작은 분자(예를 들어 칼세인, 프로피디움 요오드화물 및 3 kDa 덱스트란)를 세포주로 전달하는 실험을 진행하였다. 하기 실험예서 mRNA를 전달 표적으로 선정하였는데, 이것은 mRNA가 전달된 후 단백질 발현은 세포질에서 발현되어 지방으로 유도되며, 또한 잘 제어될 수 있으며, 주입량 의존적인 형질전환에 따라 비교가 용이하기 때문이다.
본 실험에서는 실시예 2의 방법(Electroporator), Lipofectamine 3000과 전기천공방식의 Neon 형질전환 시스템(Thermo Fisher Scientific, Electroporator)을 사용하여 EGFP mRNA를 MSC(harton's jelly human umbilical cord mesenchymal stem cell), ADSC(human adipose derived stem cell), 그리고 BMDC(mouse bone marrow derived dendritic cell)에 전달하였다.
도 41은 Lipofectamin 3000, 전기천공 방식 및 본 발명에 따른 형질 수율의 분석 결과이다.
도 41을 참조하면, Lipofectamine 3000과 전기천공방식에 비하여 본 발명은 매우 높은 형질 수율을 보이는 것을 알 수 있다. 본 분석결과에서 형질 수율은 형질전환 효율과 세포 생존율의 곱으로 정의되며, 이것은 물질 전달에 의하여 형질전환된 세포이 생존 세포 비율로 이해될 수 있다.
도 42 내지 44는 인간 MSC, 인간 ADSC, 쥐 BMDC에 대한 형질전한 효율, 세포 생존율 및 행질전환 수율의 분석결과이다.
도 42 내지 44를 참조하면, lipofection은 모든 세포 유형에서 본 발명(μ-Hydroporator)과 전기천공법에 비하여 향상된 세포 생존력을 보여 주었으나, 모든 세포 유형에서 실질적으로 낮은 형질전환효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한 MSC와 ADSC의 경우 본 발명(μ-Hydroporation)보다 전기천공(electroporator)에서 약간 높은 형질전환 효율이 나타났다. 그러나, 모든 세포 유형에 대해, 본 발명(μ-Hydroporator)은 전기천공(electroporator)에 필요한 특수 안정화 완충액을 사용하지 않고서도 더 높은 세포 생존율을 보여주었다. 더 나아가, 본 발명의 세포 생존율은 단순히 세포 배지에 트레할로스 또는 폴리머를 첨가하여 추가로 증가시킬 수도 있다.
BMDC의 경우, 전기 천공법보다 본 발명에서 더 높은 형질전환효율과 세포 생존율이 나타 났으며, 이는 본 발명이 암 면역 요법에 사용될 가능성이 높다는 것을 보여준다.
이러한 본 발명은 면역 세포 치료에 있어서 종래의 전기천공법에 비하여 몇가지 장점을 가지는데, 우선은 전기천공법은 1차 T 세포의 중요한 특성을 변화시켜(예를 들어 비특이적인 사이토카인 폭발과 둔화된 IFN-γ반응), 치료적 성능을 낮추는 부작용이 알려져 있다. 하지만, 전기 천공법의 낮은 확장성 (런당 104-105 세포 처리)은 일반적으로 108 세포 처리가 필요한 암 면역 요법의 잠재적 임상 사용에 대한 문제가 된다.
하지만 본 발명은 동일한 수준의 전달 효율을 유지하면서 최대 1 x 106 세포 / 분까지 처리 할 수 있으며, 이 처리량은 단일 마이크로 채널을 기반으로 하므로 마이크로 채널의 다중화와 병렬화를 통해 암 면역 요법에 필요한 세포 처리량을 달설 할 수 있다.
하기 실험에서는 표적분자로 널리 사용되는 양자점(Dibenzo cyclooctyne (DOBI))과 실리카 나노구(nanosphere)를 세포 내 전달물질로 결정하고, 세포(MDA-MB-231)에 대한 전달 특성을 분석하였다.
도 45는 본 발명(μ-Hydroporator), 전기천공법(electroporator) 및 Lipofectamine 3000에 의하여 양자점 (qdot625)이 MDA-MB-231 세포로 전달되는 것을 보여주는 공초점 현미경 이미지이다.
도 45를 참조하면, 모든 방법이 우수한 전달 효율을 보였으나, 세포질에서 양자점이 잘 분산된 결과는 본 발명에 따른 방법으로 세포내 전달이 진행된 경우였다. 전기천공과 Lipofectamine 3000에 의하여 처리된 세포는 복수의 적색 점이 관찰되었고, 이것은 양자점의 응집 또는 엔도솜 포획의 가능성을 나타낸다. 이러한 양자점 응집은 결국 세포내 물질 전달의 효율을 감소시키는 원인이 되므로 본 발명에 따른 세포내 물질전달 방법은 미세물질의 세포내 전달에도 유용하다는 것을 의미한다.
도 46은 세포당 양자점(Qdot 625)의 스팟 카운트 수 분석 결과이다.
도 46을 참조하면, 본 분석결과는 양자점의 응집 정도를 나타내는데, 본 발명의 경우 세포당 양자점 수가 제일 낮은 것을 알 수 있다. 즉, 전기천공이나 lipofection은 본 발명에 비하여 3배 및 4배 수준의 양자점 수를 나타낸다. 이것은 도 45의 분석결과와도 일치하는 것으로, 본 발명으로 양자점과 같은 입자를 세포내 전달하는 경우 세포 변형 후 세포막을 통한 용액 교환에 의하여 빠른 용액 교환에 따라 세포 질 내에 양자점이 잘 분산되는 것을 나타낸다.
도 47은 음성 대조군(처리안된 K562 세포, negative control), 양성 대조군(나노구와 함께 배양된 K562 세포, 실시예와 동일 시간, 동일 농도) 및 본 발명(μ-Hydroporator)에 따라 나노구(녹색 형광 실리카 나노구, Micromod, 독일)가 K562 세포로 전달된 실시예(μ-Hydroporator, 샘플당 Ncell = 5,000)의 형광세기 히스토그램이다.
또한 도 48은 상대적 평균 형광 세기 측정 결과이다.
도 47 및 48을 참조하면, 본 발명에 따라 처리된 세포에서는 평균적으로 더 높은 형광 강도가 관찰되었지만, 유동 세포 분석법 분석에서는 공동 배양 그룹에서 높은 형광 신호가 검출되었다. 짧은 배양 시간과 엔도사이토시스에 있어서는 과도하게 큰 나노구 크기를 고려하여 볼때, 양성 대조군에서의 형광은 세포 표면상에 부착(adhesion)된 나노구로부터 얻어진 것으로 판단된다.
도 49 및 50은 도 47 및 48의 그룹 중 두 그룹에 대한 공초점 이미지이다. 여기에서 DiD 친유성 카보시아민 염료를 사용하여 세포막을 시각화하였다.
도 49 및 50에 도시된 바와 같이, 양성 대조군(공동 배양)으로부터의 녹색 형광 신호는 세포막에만 존재하였지만, 세포질로부터의 밝은 녹색 형광은 본 발명에 따라 처리된 세포에서만 관찰되었다. 이것은 정전기적 작용에 의하여 나노구가 세포 표면에 부착되는 작용만이 확인되는 양성 대조군을 고려할때, 세포 내로 나노구를 전달할 수 있는 기술은 본 발명에 따른 세포내 물질전달 시스템만이 가능하다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 세포 내로 전달하는 미세유체 시스템은, 세포 내로 물질 전달이 필요한 바이오, 의학 분야에서의 산업상 이용 가능성이 인정된다.

Claims (16)

  1. 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 세포 내로 전달하는 미세유체 시스템으로,
    세포와 외부 물질을 포함하는 용액이 연속적으로 흐르는 유체채널 구조를 포함하고,
    상기 유체채널 구조는 하나 이상의 채널 간 연결점(junction)을 포함하며,
    상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류가 발생하며,
    상기 와류에 의하여 세포는 변형되며,
    상기 와류에 의하여 세포막의 일시적 불연속성이 생성되며, 상기 세포와 세포 주변 유체 사이의 용액교환에 따라 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 채널 간 연결점을 포함하는 유체채널 구조는 T, Y, 십자형태 또는 이들의 조합을 포함하는 연결점을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유체채널 구조가 T 또는 Y 형태의 채널인 경우, 유체 정체점 부근에서의 캐비티를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 캐비티는 원형, 타원형, 길쭉한 슬릿, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴, 다각형 및 이들의 조합과 그 변형된 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 캐비티의 직경은 상기 세포의 직경에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 캐비티는 상기 연결점에서 상기 용액의 세포와 채널벽간의 충돌시 상기 세포와 채널벽간 충돌면적을 없애거나 감소시키는 구조인 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세유체 시스템은,
    상기 유체채널 구조에서 용액을 흐르게 하는 유체제어수단을 더 포함하며,
    상기 유체제어수단은 상기 연결점 계면 근처에서 국소 와류를 발생시킬 수 있는 수준의 속도로 상기 용액을 상기 유체채널에서 흘리는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 유체제어수단은 시린지 펌프 또는 공압시스템인 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액의 레이놀즈 수(Re)는 1 내지 1000인 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 와류 특징은 상기 레이놀즈 수에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  11. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 와류는 닫힌 또는 개방된 재순환 흐름 형태인 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  12. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유체채널은 적어도 용액 입구와 출구 사이의 채널에서 복수 개의 연결점을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유체 시스템.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 미세유체 시스템은
    제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 시스템이 직렬, 병렬 또는 이들의 조합 방식으로 결합된 것을 특징으로 미세유체 시스템.
  14. 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법으로,
    상기 세포와 외부물질을 포함하는 용액을 유체채널로 연속적으로 흘리는 단계;
    상기 연결점 근처에서 와류생성수단에 의하여 와류를 형성시키는 단계;
    상기 와류에 의하여 상기 세포가 변형되는 단계; 및
    상기 세포 변형에 의하여 세포막에 생성되는 천공을 통하여 상기 외부 물질이 상기 세포 내로 도입되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 와류생성수단은 상기 유체채널의 연결점 구조인 것을 특징으로 하는, 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 유체채널은 T, Y, 십자형태 또는 이들의 조합을 포함하는 연결점을 포함하는 것을 특징으로 하는, 관성을 이용한 세포 천공에 의하여 외부 물질을 새포 내로 전달하는 방법.
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