CN113840657B - 用于材料的细胞内输送的微流体系统及其方法 - Google Patents

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Abstract

提供了通过使用惯性的细胞机械穿孔将外部物质输送到细胞中的微流体系统，该微流体系统包括流体通道结构，含有细胞和外部物质的溶液连续流过流体通道结构，其中，流体通道结构包括一个或多个通道之间的接合部，在接合部的界面附近生成局部化的涡流，细胞因涡流而变形，并且通过涡流而在细胞膜中生成瞬时不连续性，并通过细胞和细胞周围的流体之间的溶液交换，将外部物质引入到细胞中。

Description

用于材料的细胞内输送的微流体系统及其方法
技术领域
本公开涉及用于材料的细胞内输送的微流体系统及其方法。
背景技术
材料的细胞内输送为细胞工程中最关键步骤中的一个，而在细胞工程中，传统上通过使用载体或通过在细胞/核膜中物理制作纳米孔来输送材料。针对病毒或脂质载体技术，当被优化时，高效地输送材料为可能的，但是存在诸如安全性低、输送时速慢、载体制备过程人工/成本密集以及重现性低的缺点。
另一方面，针对通过向细胞膜施加能量(例如，电穿孔或微针)来物理制作纳米孔的方法，则存在相对各种材料能够输送到各种细胞系的优点。然而，由方法的侵入性引起的低细胞存活率、输送材料的变性和低吞吐量被指出为主要限制。
为了解决上述缺点，显著使用了能够处理大量细胞的微流体装置。典型地，存在一种平台，该平台在细胞通过瓶颈区段时通过细胞的物理变形而在细胞膜中创建纳米孔。然而，该方式具有诸如在实验期间瓶颈区段本身的堵塞和材料输送效率不一致的主要缺点。
例如，第2014-0287509号美国专利公开了用于凭借通过具有瓶颈结构的通道向细胞施加压力来诱发细胞变形的技术。然而，在这种情况下，存在细胞阻塞瓶颈结构的缺点，并且存在仅可能将材料输送到小于收缩尺寸的细胞的缺点。此外，也存在成本因为必须使用具有细直径的通道而上升的缺点。
因此，迫切的是，开发一种创新的下一代细胞内材料输送平台，该平台能够在利用微流体装置的高处理功能的同时，将各种材料均匀且高效地输送到细胞中。
发明内容
技术问题
相应地，为了解决上述问题，本公开的目的在于提供一种在不使用新的主动输送手段的情况下能够将材料高效地输送到大量细胞的系统和方法。
技术方案
为了解决上述问题，根据本公开的一个方面，提供了通过使用惯性和惯性作用的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的微流体系统，该微流体系统包括流体通道结构，含有细胞和外部材料的溶液连续流过该流体通道结构，其中，流体通道结构包括一个或多个通道之间的接合部，在接合部的界面附近生成局部化的涡流，细胞因涡流而变形，并且通过流体细胞变形在细胞膜中生成瞬时不连续性，并经由细胞和细胞周围流体之间的溶液交换，将外部材料引入到细胞中。
在本公开的实施方式中，包括一个或多个通道之间的接合部的流体通道结构可包括包含“T”形形状、“Y”形形状、十字形形状或它们的组合的接合部。
在本公开的实施方式中，当流体通道结构为“T”形形状或“Y”形形状的通道时，流体通道结构可包括流体停滞点附近的腔体。
在本公开的实施方式中，腔体可具有圆形、椭圆形、细长狭缝形、正方形、矩形、梯形、多边形和它们的组合以及它们的变形的形状。
在本公开的实施方式中，腔体的直径可根据细胞的直径来确定。
在本公开的实施方式中，微流体系统还可包括流体控制单元，用于允许溶液在流体通道结构中流动，并且流体控制单元可允许溶液以能够在接合部的界面附近生成局部化的涡流的水平的速度在流体通道中流动。
在本公开的实施方式中，流体控制单元可为注射泵或气动系统。
在本公开的实施方式中，溶液的雷诺数(Re)可为1至1000。
在本公开的实施方式中，涡流特征可由雷诺数确定。
在本公开的实施方式中，涡流可呈现封闭的或开放的再循环流动的形式。
在本公开的实施方式中，微流体系统可通过将根据权利要求1至12中任一项所述的微流体系统以串联、并联或它们的组合的形式进行组合而形成。
根据本公开的另一方面，提供了通过使用惯性和惯性作用的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的方法，该方法包括：允许含有细胞和外部材料的溶液连续流过流体通道；在接合部附近通过涡流生成手段形成涡流；通过涡流使细胞变形；以及允许外部材料通过因细胞的变形在细胞膜中创建的孔而被引入到细胞中。
在本公开的实施方式中，涡流生成手段可为流体通道的接合部结构。
在本公开的实施方式中，流体通道可包括包含“T”形形状、“Y”形形状、十字形形状或它们的组合的接合部。
有益效果
根据本公开，涡流通过允许细胞和外部材料流入到包括至少一个接合部的流体通道结构中而生成，并且导致的惯性和惯性作用使细胞变形以在细胞膜中诱发瞬时不连续性，从而使细胞膜穿孔。随后，细胞和细胞周围的流体之间的溶液交换通过穿孔的细胞膜而发生，并且结果，外部材料被引入到细胞中。因此，本公开不需要介体或活性细胞输送手段(例如，电场)。因此，本公开可仅通过溶液和通道结构特征将外部材料(例如，基因、质粒或纳米颗粒等)高效率和低成本地直接输送到细胞中。
附图说明
图1是用于示出在“+”形接合部通道中螺旋涡流的形成的示图。
图2是由螺旋涡流引起的细胞变形的示意性示图(1)，并且示出了呈现出旋转细胞运动的高速显微镜图像(比例尺：10μm)(2)。
图3是用于描述根据本公开的实施方式的用细胞变形的材料输送机制的示图。
图4是根据本公开的实施方式的两种类型的通道结构的示意性示图和用于描述每个通道中的细胞变形的示图。
图5是微流体系统的示意性示图，在该微流体系统中图4的两种类型的流体通道在流体流动方向上串联连接。
图6示出了在“+”形接合部通道中朝向接合部(交叉点)在相反方向上流动的流体的根据雷诺数的行为实验结果。
图7示出了呈现出在“+”形接合部通道中的细胞(MDA-MB-231)捕获行为的高速显微镜图像。
图8示出了作为雷诺数的函数的通过图7的涡流破裂归一化细胞捕获和细胞变形时间的坐标图。
图9是用于示出根据本公开的实施方式的细胞内材料输送平台的示图。
图10至图12是用于示出根据本公开的实施方式的使用细胞内材料输送平台的用于材料的细胞内输送的方法的示图。
图13是根据本公开的实施方式的“T”形接合部通道的示意性示图。
图14示出了示出腔体结构的“T”形接合部通道的细胞变形和涡流变形机制的高速显微镜图像。这里，每个箭头指示流体流动方向。
图15示出了具有不同雷诺数的流体中的涡流变形指数(VDI)分析结果。
图16是用于示出根据本公开的实施方式的细胞内材料输送平台的示图。
图17至图19是用于示出根据本公开的实施方式的使用细胞内材料输送平台的用于材料的细胞内输送的方法的示图。
图20和图21示出了输送到细胞中的材料量的分析结果。
图22示出了在与图20中的相同的条件下通过改变雷诺数测量细胞存活率的结果。
图23示出了针对各种葡聚糖尺寸的输送效率的分析结果。
图24示出了在图5的复合微流体系统(“+”形接合部通道和“T”形接合部通道的组合)中测量葡聚糖输送效率的结果。
图25示出了相关技术中的电穿孔(Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国))和根据本公开的基于惯性的用于材料的输送的方法(Hydroporation，液穿孔)的输送效率的比较结果。
图26和图27分别是用于分析金纳米颗粒(GNP)的细胞内输送效果的照片和对散射点计数的结果。
图28示出了依据GNP输送测量细胞存活率的结果。
图29示出了通过将散射点的数量乘以细胞存活率来计算归一化的产率的结果。
图30示出了用作药物、蛋白质和核酸纳米载体代替金纳米颗粒的的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)的细胞内输送效率的分析结果。
图31示出了针对图30的分析物的时间依赖性细胞存活率的分析结果。
图32是通过对使用mRNA(996-核苷酸mRNA片段，绿色荧光蛋白质)作为外部材料的K562细胞的输送效果进行测量而获得的荧光强度的直方图。
图33示出了通过内吞作用(C)和根据本公开的微流体系统(D)在将mRNA输送到K562中之后的荧光图像。
图34示出了如图32和图33中所示的当根据本公开输送mRNA时测量输送效率(E)和存活率(F)的结果。
图35示出了通过内吞作用和实施方式2的方法在mRNA(996-核苷酸mRNA片段，绿色荧光蛋白质)输送到K562细胞中之后的荧光图像。
图36示出了依据mRNA浓度的mRNA转染效率(b)和平均荧光强度(c)的分析结果。
图37示出了通过内吞作用(对照)和实施方式2的方法在将质粒DNA输送到HEK293t细胞中之后的荧光图像。
图38示出了依据质粒DNA浓度分析HEK293t细胞的质粒DNA(pDNA)的转染效率(e)和HEK293t细胞的平均强度(f)的坐标图。
图39和图40分别是输送有siRNA的HeLa细胞(整合蛋白跨膜受体的α1亚基)的ITGa1基因敲落效果的Western印迹分析的结果和比较相对表达水平的结果。
图41示出了通过脂质体3000(Lipofectamine 3000)、电穿孔和本公开的转染产率的分析结果。
图42至图44是针对人体MSC、人体ADSC和小鼠BMDC的转染效率、细胞存活率和转染产率的分析结果。
图45示出了呈现出通过本公开(μ-液穿孔器(μ-Hydroporator))、电穿孔器和脂质体3000将量子点(Qdot 625)输送到MDA-MB-231细胞中的共聚焦显微镜图像。
图46示出了每个细胞的量子点(Qdot 625)的点数计数的分析结果。
图47是一实施方式(μ-液穿孔器，Ncell＝5,000/样品)的荧光强度直方图，在该实施方式中，通过阴性对照(未处理的K562细胞)、阳性对照(用纳米球共培的K562细胞，时间和浓度与该实施方式中的时间和浓度相同)和本公开(μ-液穿孔器)将纳米球(绿色荧光二氧化硅纳米球，Micromod，德国)输送到K562细胞中。
图48示出了测量相对平均荧光强度的结果。
图49和图50示出了图47和图48中的两组的共聚焦图像。
具体实施方式
在下文中，将参照附图详细描述根据本公开的基于惯性的用于材料的细胞内输送的系统的优选实施方式。作为参照，应理解的是，说明书和所附权利要求中使用的术语不应被解释为限于一般含义和字典含义，而应以允许发明人为了最佳解释而适当定义术语的原则为基础基于与本公开的技术方面对应的含义和概念来解释。另外，本公开中所公开的实施方式及附图中所示的配置只是本公开的一个优选实施方式，并不表示本公开的全部技术思想。因此，应理解的是，本公开涵盖各种变形和变化，只要它们在提交本申请时进入所附权利要求及其等同物的范围内。
为了解决以上所描述的问题，本公开提供了通过使用惯性和惯性作用的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的微流体系统，该微流体系统包括流体通道结构，含有细胞和外部材料的溶液连续流过该流体通道结构，在该微流体系统中流体通道结构包括在一个或多个通道之间的接合部，局部化的涡流在接合部的界面附近生成，细胞因涡流而变形，并且细胞膜的瞬时不连续形状因涡流而生成且外部材料通过细胞与细胞周围流体之间的溶液交换而引入到细胞中。
此外，本公开提供了通过使用惯性和惯性作用的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的方法，该方法包括：允许含有细胞和外部材料的溶液连续流过流体通道；通过涡流生成手段在接合部附近形成涡流；通过涡流使细胞变形；以及允许外部材料通过因细胞的变形在细胞膜中创建的孔而引入到细胞中。
实施本发明的方式
根据本公开的实施方式的用于材料的细胞内输送的方法和系统基于在流体通道中生成涡流并且通过涡流使细胞变形以在细胞膜中创建孔的技术特征。特别地，当细胞流入到涡流中时，本公开通过由涡流引起的细胞变形和因稍后的涡流破裂的细胞变形来提高细胞内材料输送效率。在本公开的实施方式中，涡流通过流体通道的物理结构(诸如接合部)而生成，但是本公开的范围不限于此。
根据涡流生成手段为接合部的实施方式，本公开提供了具有流体通道结构的微流体系统作为用于将在细胞外部的外部材料输送到细胞中的系统，该流体通道结构包括一个或多个接合部，而至少两个通道一个或多个接合部处连接。在本公开中，“接合部”意味着当两个或更多个通道以“T”形、“Y”形、“+”形或它们的组合的形式连接时每个通道与另一通道相遇的点，并且在本公开中，至少一个接合部可设置在由流体的入口和出口限定的单个通道中。
在根据本公开的实施方式的微流体系统中，当含有细胞和外部材料的溶液流入到接合部中时，在接合部的界面处生成涡流，并且此时，连续经历涡流和涡流破裂的细胞因惯性和惯性作用而连续被捕获和变形，并且随后，随着变形进行，作为用于材料的细胞内输送的通路的细胞膜中的孔逐一形成。也就是说，根据本公开的微流体系统可通过利用诸如雷诺数(1至1000)的流体性能以及“T”形、“Y”形、“+”形或它们的组合的形式的通道结构来极大地提高细胞内材料输送效率。
在本公开的下面的实施方式的微流体系统中，首先通过常规光刻工艺蚀刻SU-8模具或硅晶片来制作形成有根据本公开的通道的模具。随后通过聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制作基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的芯片，且此时在如上述制作的芯片中制作了入口和出口，并且使用等离子处理(Cute，Femto Science，韩国)来组合一般载玻片，从而制作了平台装置。随后，将悬浮状态的细胞和待输送的材料混合，并且随后通过使用注射泵来将混合物注入到制作的芯片中。在这种情况下，可通过调节注射泵的流速来控制材料的细胞内输送，并且在输送之后，通过使用离心机来仅分离细胞，并且随后根据目的来进行培养或分析或使用。然而，本公开的范围不限于实施方式本身。
实施方式1：“+”形接合部结构微流体系统
图1是用于示出在“+”形接合部通道中螺旋涡流的形成的示图。
参照图1，当流体在“+”形通道的两端处在相反方向上流动时，流体进入到与该通道相交的其它两个通道中，并且此时，在停滞点附近的流体不稳定诱发近点附近的强螺旋局部化涡流。局部涡流解释了针对以下描述的细胞变形和材料的细胞内输送的现象的原因。在本公开中，“附近”是指流入到接合部中的流体的涡流可由于接合部结构而生成的区域。
图2是由螺旋涡流引起的细胞变形的示意性示图(1)，并且示出了呈现出旋转细胞运动的高速显微镜图像(比例尺：10μm)。
参照图2，在本公开中，当允许具有中等雷诺数(1至1000)的流体流动到接合部通道时，细胞螺旋移动而不是对称的细胞伸长，并且此时，当细胞接近涡流流动的停滞点时细胞示出大的变形。
图3是用于描述根据本公开的实施方式的用细胞变形的材料输送机制的示图。
参照图3，通过左侧的细胞变形，在细胞膜中创建纳米孔，并且通过细胞与在细胞周围的流体之间的溶液交换，将外部材料引入到细胞中。随后，在1分钟至10分钟内，细胞膜自行恢复并关闭，并且恢复时间可通过调整溶液中的诸如钙的电解质的浓度来控制。
图4是根据本公开的实施方式的两种类型的通道结构的示意性示图和用于描述每个通道中的细胞变形的示图。
图4中的两种类型的通道结构是对向流动的流体在接合部附近碰撞以在接合部附近形成涡流的“+”形结构以及引入的细胞与通道壁碰撞的“T”形形状结构。
图5是微流体系统的示意性示图，在该微流体系统中图4的两种类型的流体通道在流体流动方向上串联连接。
参照图5，本公开的微流体系统具有(1)“+”形接合部通道(十字形接合部)和(2)“T”形接合部通道(“T”形接合部)，在该“T”形接合部通道中，在从“+”形接合部通道穿过涡流的同时被引导的流体与通道壁碰撞。
针对上述系统，在“+”形接合部通道(十字形接合部)中的停滞点之外的细胞通过惯性再次被引导至通道中心并且再次与通道壁碰撞。也就是说，根据本公开的“T”形形状微流体结构、“Y”形形状微流体结构和“+”形形状微流体结构相对于流体流动可设计成串联、并联或它们的组合，所有这些落入在本公开的范围内。在这种情况下，连接多个单元通道的多个接合部可形成在在单元方面由入口和出口限定的单个通道上。
图6示出了在“+”形接合部通道中朝向接合部(交叉点)在相反方向上流动的流体的根据雷诺数的行为实验结果。
参照图6，以最低雷诺数，两个流体流之间的界面保持清楚对称，并且三维涡流运动清楚地在雷诺数37.9(临界雷诺数)开始。随后，随着雷诺数的增加，两个流体流之间的交叉点变得更强和更复杂(见(1))。
图6中的(2)和(3)是共聚焦显微镜图像，其中随着雷诺数的增加，逆时针螺旋涡流发展超过临界雷诺数，并且螺旋竖直和水平扩展。以上结果意味着涡流在接合部附近生成并且其形状、模式和速度等依据流体的雷诺数而变化。这也表明，依据所需的细胞类型和要输送的材料类型，可通过改变雷诺数来提高输送效率。
根据本公开的系统具有如下的特定附加效果：捕获细胞并通过由于涡流形成而导致的细胞变形和材料输送之后的涡流破裂而诱发其变形。
图7示出了呈现出在“+”形接合部通道中的细胞(MDA-MB-231)捕获行为的高速显微镜图像。
参照图7，当细胞通过第一涡流离开细胞变形区域时，观察到在一定时间段内细胞的特定捕获现象。也就是说，略微在停滞点上方，细胞反复上下移动约30μs，并且随后再次朝向出口出去。这意味着在刚离开涡流区域之后，细胞在一定时间段内变形并且随后因由涡流破裂引起的惯性而停留在接合部附近的区域(停滞点附近的区域)中，并且因此细胞内材料输送效率可极大提高。
图8示出了作为雷诺数的函数的通过图7的涡流破裂归一化细胞捕获和细胞变形时间的坐标图。
参照图8，随着雷诺数的增加，细胞捕获和变形时间增加，并且在涡流的形成之后的一定时间段内的细胞变形能极大提高细胞内材料输送效率。
更具体地，将描述根据本公开的“+”形接合部结构的微流体系统。
图9是用于示出根据本公开的实施方式的细胞内材料输送平台的示图。
参照图9，根据本公开的实施方式的细胞内材料输送平台包括：第一通道100，包括细胞和输送材料的流体流过该第一通道100；与第一通道100垂直相交的第二通道200；以及第一流体控制单元300，设置在第一通道100的一侧上以控制第一通道100中在第一方向上的流体速度。
根据本公开的实施方式，第一通道100中的流体在相反方向上流动到第一通道100与第二通道200垂直相交的点，并且第一流体控制单元300以通过在第一通道100和第二通道200彼此垂直相交的点处形成的涡流在细胞中形成纳米孔的水平向第一通道100中的细胞施加用于引起细胞膜变形的动能。
除此之外，用于控制在第二方向上在第一通道100中的流体速度的第二流体控制单元300'可进一步包括在第一通道100的另一侧上。
特别地，在第一通道100中，涡流可通过执行相反方向上的控制的第一流体控制单元300和第二流体控制单元300'而形成在第一通道100和第二通道200彼此垂直相交的点处，并且由于以这种方式生成的惯性力和惯性流动，细胞内可能发生物理变形，并且细胞膜可相应地变形。
同时，根据本公开的细胞内材料输送平台可输送核酸、蛋白质、转录因子、介体、质粒、基因剪刀材料和纳米颗粒等。然而，本公开不限于此。
此外，细胞内材料输送平台不限于应用于再生医学、癌症免疫治疗、基因组编辑或其它领域。
图10至图12是用于示出根据本公开的实施方式的使用细胞内材料输送平台的用于材料的细胞内输送的方法的示图。
参照图10，含有细胞和输送材料的流体通过第一流体控制单元300在第一通道100中流动。此时，形成在第一通道100的另一侧上的第二流体控制单元300'也操作以使得输送材料在与由第一流体控制单元300控制的流体相反的方向上流动。
在本公开的实施方式中，输送材料包括所有可输送到细胞中的材料，并且具体地，基因剪刀材料、质粒、核酸、蛋白质和纳米颗粒等可全部为输送材料。
参照图11，由第一流体控制单元300加速的流体沿着与接合部附近的反向流体的界面形成涡流，并且使由涡流捕获的细胞变形。随后，通过细胞变形在细胞中形成纳米孔。输送材料通过纳米孔输送到细胞中。相应地，期望第一流体控制单元300和第二流体控制单元300'施加具有在接合部附近形成流体的涡流的水平的雷诺数的动能。
根据本公开的另一实施方式，在穿过流体中形成的涡流之后形成的涡流破裂使另一细胞变形。
参照图12，穿过涡流的细胞经历涡流破裂，并且由于惯性再次发生细胞变形。通过因此时发生的另一细胞变形而在细胞膜中形成的纳米孔，输送材料再次被输送到细胞中，这极大地提高了细胞内材料输送效率。
实施方式2：“T”形或“Y”形接合部结构的微流体系统
本公开的另一实施方式提供了使用具有腔体的“T”形接合部通道或“Y”形接合部通道的细胞内材料输送系统。在本公开中，腔体是指在停滞点处在通道中形成的空的空间，该空间是当溶液的细胞和通道壁在接合部处碰撞时细胞与通道壁之间的碰撞面积被消除或减少的结构。
在这种情况下，类似于以上所描述的“+”形接合部通道，在“T”形接合部附近形成局部化涡流，并且依次执行细胞变形、细胞膜中纳米孔的形成、外部材料的细胞内输送以及细胞膜中的纳米孔的关闭。
图13是根据本公开的实施方式的“T”形接合部通道的示意性示图。
参照图13，能看出的是，在“T”形通道的接合部附近形成了通道形状腔体(1)。在本公开的实施方式中，通过使用相关技术中的注射泵(PHD 2000，Harvard Apparatus，美国)作为流体控制单元，以适当的雷诺数将与输送到细胞中的外部材料混合的细胞注入到图13的微流体通道中。
一经注入，细胞就通过惯性而集中在通道中心，并且细胞与通道壁碰撞。每个细胞穿过上述腔体(图13的(1))的一部分并变形(参照图13右侧的照片)。随后，在因碰撞而导致的第一次细胞变形之后，细胞被捕获在停滞点(图13中的点(2))附近的局部化涡流中，并且流体动力学地变形为在细胞膜中形成纳米孔，如图3中所描述的。
随后，已穿过涡流区域的细胞被捕获，并且随后再次因涡流破裂而变形(图13的(3))。这种附加的细胞捕获和变形的优点是细胞内材料输送效率的提高，如以上图7中所描述的。
在本公开的实施方式中，在“T”形接合部通道结构中使用了腔体，其优点是通过允许细胞与流体形式的通道壁而非刚性固体形式的通道壁碰撞来减少由于与刚性固体通道壁的碰撞而导致的细胞损伤。另一优点是实际上通过在流体流动方向上向上游创建停滞点来防止细胞堵塞，以支持复杂的流体行为模式。相应地，腔体结构的形式、尺寸和形状等可依据细胞而变化。例如，腔体不仅可包括如图13中所示的细长狭缝结构，而且可包括圆形、椭圆形、细长狭缝形、正方形、矩形、梯形、多边形、它们的组合以及它们的修改形式，并且至少只要被引入的细胞不按原样与通道壁碰撞，则它们都属于本公开的腔体。
此外，腔体直径依据细胞直径确定，并且特别地，腔体直径优选为细胞尺寸的10％至5倍左右。根据本公开的腔体直径在本公开的范围内，至少只要腔体直径能降低由通过溶液引入到接合部的细胞与通道壁之间的碰撞引起的碰撞力。
图14示出了示出腔体结构的“T”形接合部通道的细胞变形和涡流变形机制的高速显微镜图像。这里，每个箭头指示流体流动方向。
参照图14，能确认的是，通过在停滞点附近的局部化涡流的捕获(图14中的(1))和通过由于在停滞点附近的流体不稳定而导致的涡流破裂的穿过停滞点的细胞的捕获(图14中的(2))，这示出了涡流、通过涡流破裂的捕获和变形连续发生，类似于以上所描述的“+”形通道的通道。特别地，在图14的(2)中，能看出的是，细胞保持静止状态约20μs，并且随后向下游退出。
图15示出了具有不同雷诺数的流体中的涡流变形指数(VDI)分析结果。这里，VDI定义为下面的公式，这能被解释为细胞变形指数的程度和细胞膜渗透的持续时间，这进而指示细胞内材料输送效率。
VDI＝t(1-c)U/D
其中，t是涡流中的细胞捕获时间，c是圆度(c＝4πA/P2，其中，A和P分别是在具有最大变形的状态下的面积和半径)，U是流体的平均速度，并且D是细胞直径。
参照图15，随着雷诺数的增加，在(1)涡流和(2)涡流破裂期间VDI增加，从而指示出高雷诺数具有较高的细胞内材料输送效率。
在下文中，将更详细地描述根据本公开的“T”形接合部结构的微流体系统。
图16是用于示出根据本公开的实施方式的细胞内材料输送平台的示图。
根据本公开的细胞内材料输送平台包括：第三通道101，形成包括细胞和输送材料的流体移动通过的通路；第四通道201，在第三通道101的一端处垂直延伸至第三通道101的两侧；以及流体控制单元301，设置在第三通道101处，以控制第三通道101中的流体速度。
图17至图19是用于示出根据本公开的实施方式的使用细胞内材料输送平台的用于材料的细胞内输送的方法的示图。
参照图17，含有细胞和输送材料的流体通过流体控制单元301在第三通道101中流动。在本公开的实施方式中，输送材料包括可输送到细胞中的所有材料，并且基因剪刀材料、质粒、核酸、蛋白质和纳米颗粒等全部是输送材料。
参照图18，由流体控制单元301加速的第三通道101中的细胞由在接合部附近形成的涡流捕获并且随后变形。这与参照图13和图14描述的相同。随后，细胞与连接到第三通道101的端部的第四通道201的分隔壁碰撞。
此时，第四通道201设置有在与第三通道101中的流体流动方向相同的方向上形成的狭缝形状的腔体401，并且该腔体产生如下效果：1)防止因物理碰撞的细胞损坏、2)防止堵塞和3)向上游形成停滞点。
在本公开中，如以上所描述的，多个单元微流体系统可以串联或并联或它们的组合来连接，以构建完整系统。在该情况下，涡流可以循环模式在再循环流中发生，其中，涡流可为封闭的或开放的流。
实验示例
实验示例1
在实验示例中，分析了基于实施方式1的微流体系统的输送特性。
图20示出了对通过内吞作用(对照组)和根据本公开的细胞内传质方法(螺旋液穿孔)的18小时之后的细胞内材料输送效率进行比较的结果。这里，3-5kDa的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的葡聚糖被输送到MDA-MB-231细胞中，并且结果示出为荧光图像(比例尺：40μm)。特别地，这里应注意的是，葡聚糖输送到MDA-MB-231细胞中已知是非常困难的。在以下描述的实验中，除非另有标注，否则细胞是MDA-MB-231。
参照图20，能通过右侧的多个FITC信号确认根据本公开的细胞内材料输送效果。
图20和图21示出了输送到细胞中的材料量的分析结果。在分析中，输送效率被定义为荧光信号的等于或大于5％的一部分，对应于虚线。
参照图20和图21，能看出的是，在雷诺数366处，实现了约96.5％的输送效率，并且荧光强度随着Re的增加而增加，并且直方图轮廓向右移位。这意味着可通过调整雷诺数来调整输送到细胞中的材料量。
图22示出了在与图20中的相同的条件下通过改变雷诺数测量细胞存活率的结果。
参照图22，关于细胞存活率，在较高雷诺数处，观察到存活率降低，大概是因为雷诺数越高，细胞扰动越大。
此外，为了进一步研究细胞存活率，经由代谢功能来执行标准MTT比色法，并且结果示出在图22中。台盼蓝排除法和MTT比色法的总体趋势彼此极为一致，而在高雷诺数处，MTT比色法示出略微较低的存活率值。
图23示出了针对各种葡聚糖尺寸的输送效率的分析结果。在分析中，对应于2nm至55nm的水力直径，使用了分子量范围为3kDa至2000kDa的葡聚糖，其中，以与实施方式1中的相同的方式在相同的流动条件(Re＝366)下将5个不同尺寸和相同浓度的FITC-葡聚糖(3kDa至5kDa、70kDa、150kDa、500kDa和2000kDa)输送到MDA-MB-231细胞中并计算效率。
参照图23，示出的是，相对小的葡聚糖(<70kDa)比相对大的葡聚糖具有更高的输送效率。这是因为，针对小的葡聚糖，发生了葡聚糖跨细胞膜的对流和扩散传输，而针对大的葡聚糖，对流传输是主要传输。
图24示出了在图5的复合微流体系统(“+”形接合部通道和“T”形接合部通道的组合)中测量葡聚糖输送效率的结果。
参照图24，能看出的是，执行了连续细胞变形的图5的复合微流体系统比独立的微流体系统展示了相对更高的输送效率。
图25示出了相关技术中的电穿孔(Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国))和根据本公开的基于惯性的用于材料的输送的方法(液穿孔)的输送效率的比较结果。在实验示例中，500kDa和2000kDa的FITC-葡聚糖被用作外部材料。
参照图25，针对2000kDa的FITC-葡聚糖，本公开的效率是电穿孔的效率高约4倍。特别地，根据本公开的方法极大地提高了难以通过电穿孔输送到细胞中的大分子的输送效率，这表明通过相关技术中的电穿孔技术不可能实现的分子量材料的细胞内输送的可能性。
图26和图27分别是用于分析金纳米颗粒(GNP)的细胞内输送效果的照片和对散射点计数的结果。这里，(A)示出了根据本公开的液穿孔(SH)的结果，(B)示出了电穿孔(EP)的结果，并且(C)示出了内吞作用(EC)的结果。
参照图26和图27，能看出的是，非常大的GNP(直径200nm)通过根据本公开的流体系统成功输送到MDAMB-231细胞中(A)。另一方面，能看出的是，尽管电穿孔能够输送GNP，但仅检测到几个散射点(B)。此外，内吞作用机制展示了比电穿孔的颗粒输送效率更低的颗粒输送效率(C)。
图28示出了依据GNP输送测量细胞存活率的结果。
参照图28，能看出的是，根据本公开的用于材料的细胞内输送的方法和系统展示了比电穿孔的存活率更高的存活率。
图29示出了通过将散射点的数量乘以细胞存活率来计算归一化的产率的结果。
参照图29，能看出的是，根据本公开的材料输送效率是电穿孔或内吞作用的材料输送效率的三倍。
图30示出了用作药物、蛋白质和核酸纳米载体代替金纳米颗粒的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)的细胞内输送效率的分析结果。在实验中，将抗癌药物阿霉素(DOX)加载到MSN中，并将该MSN输送到MDA-MB-231细胞中。
参照图30，能看出的是，与内吞作用相比，根据本公开的方法(螺旋对照)展示了许多明亮的荧光点。这表明通过根据本公开的方法能将携带功能材料的载体有效地输送到细胞中。
图31示出了针对图30的分析物的时间依赖性细胞存活率的分析结果。
参照图31，通过台盼蓝排除法测量DOX对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，并且能看出的是，6小时之后约85％的癌细胞被杀死。该结果指示出根据本公开的微流体系统可在不使用相关技术中的基于表面配体的DOX输送方法的情况下研究DOX诱发的细胞死亡。
图32是通过对使用mRNA(996-核苷酸mRNA片段，绿色荧光蛋白质)作为外部材料的K562细胞的输送效果进行测量而获得的荧光强度的直方图。在图32中，(A)示出了内吞作用的结果并且(B)示出了根据本公开的微流体系统的结果，其中使用流式细胞仪基于mRNA输送(2μg/mL)来评估EGFP蛋白质表达。
参照图32，能看出的是，根据本公开的方法展示了非常高的蛋白质表达水平。这意味着根据本公开的用于材料的细胞内输送的方法和系统可用于表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)而无需使用介体或疫苗。
图33示出了通过(C)内吞作用和(D)根据本公开的微流体系统在将mRNA输送到K562中之后的荧光图像。
参照图33，在根据本公开的方法中，与内吞作用相比，检测到强EGFP信号，而强EGFP信号导致了更高的mRNA输送效率。
图34示出了如图32和图33中所示的当根据本公开输送mRNA时测量输送效率(E)和存活率(F)的结果。
参照图34，在不牺牲细胞存活率的情况下实现了高达约92％的输送效率，这表示该平台用作免疫治疗调查的平台的高潜力，尽管未来需要进一步研究以测试人类免疫细胞。
实验示例2
在该实验示例中，分析了基于实施方式2的微流体系统(μ-液穿孔器)的输送特性。
图35示出了通过内吞作用和实施方式2的方法在将mRNA(996-核苷酸mRNA片段，绿色荧光蛋白质)输送到K562细胞中之后的荧光图像。
参照图35，能看出的是，与内吞作用(对照)不同，当通过实施方式2的方法将mRNA输送到细胞中时检测到绿色荧光。这证明根据本公开(实施方式2)的“T”形接合部通道系统能够如以上所描述的实施方式1中的具有高效的mRNA的细胞内输送。
图36示出了依据mRNA浓度的(b)mRNA转染效率和(c)平均荧光强度的分析结果。
参照图36，基于流式细胞术分析获得了mRNA的不同浓度，并且在2μg/ml中，转染效率高达约93％。这是在基于压缩的微流体系统(诸如相关技术中的瓶颈结构)中不可能的效率。
与首先与细胞基质结合的mRNA不同，DNA必须首先穿过细胞膜并通过核孔进入核膜。此外，在材料输送方面，裸质粒DNA的缺点在于它容易被核酸酶降解并且具有高粘度。此外，高密度的细胞质不为长而扭曲的DNA提供有利条件以纯通过扩散到达细胞核。为了克服上述缺点，本发明人提供了根据本公开的基于流体的微流体系统作为用于将质粒DNA输送到细胞核的方法。为此，在实验示例中，执行实验以对桡足类GFP进行编码并将7.9kbp的质粒DNA输送到HEK293t细胞。
图37示出了通过内吞作用(对照)和实施方式2的方法在将质粒DNA输送到HEK293t中之后的荧光图像。
参照图37，能看出的是，根据本公开的方法展示了非常强的荧光图像。
图38示出了依据质粒DNA浓度分析HEK293t细胞的质粒DNA(pDNA)的转染效率(E)和HEK293t细胞的平均强度(F)的坐标图。
参照图38，能看出的是，随着pDNA浓度的增加，转染效率增加，并且平均荧光强度也增加。
图39和图40分别是输送有siRNA的HeLa细胞(整合蛋白跨膜受体的α1亚基)的ITGa1基因敲落效果的Western印迹分析的结果和比较相对表达水平的结果。这里，作为比较示例，使用相关技术中的阳离子的脂质体3000，其被称为siRNA输送方法，比较ITGa1基因的敲落效果。
参照图39和图40，当使用本公开时，ITGA1表达(197kDa)几乎被消除；而在脂质体3000(比较示例)中，仅观察到部分敲落。根据该结果，本公开具有大至少三倍的敲落效率(97％vs.30％)，从而表明本公开在基因编辑中使用的高潜力。
在以下实验中，将非功能性材料或极小分子(例如，钙黄绿素、碘化丙啶和3kDa葡聚糖)输送到细胞系。在以下实验中，选择mRNA作为输送目标，因为mRNA输送之后的蛋白质表达发生在细胞质中并被引导至脂肪，所以良好可控，并且易于通过剂量依赖性转染进行比较。
在该实验中，通过使用实施方式2的方法(电穿孔器)、脂质体3000和电穿孔Neon转染系统(电穿孔器；Thermo Fisher Scientific)将EGFP mRNA输送到Harton的胶状人体脐带间充质干细胞(MSC)、人体脂肪源性干细胞(ADSC)和小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)。
图41示出了通过脂质体3000、电穿孔和本公开的转染产率的分析结果。
参照图41，能看出的是，与脂质体3000和电穿孔相比，本公开展示了非常高的转染产率。在分析结果中，转染产率被定义为转染效率和细胞存活率的乘积，细胞存活率能被理解为活细胞与由材料输送所转染的细胞的比率。
图42至图44是针对人体MSC、人体ADSC和小鼠BMDC的转染效率、细胞存活率和转染产率的分析结果。
参照图42至图44，能看出的是，与本公开(μ-液穿孔器)和电穿孔相比，脂质体转染在所有细胞类型中展示了提高的细胞存活率，但是在所有细胞类型中展示了大体上低的转染效率。
此外，针对MSC和ADSC，电穿孔器中的转染效率比本公开(μ-液穿孔器)中的转染效率略微更高。然而，针对所有细胞类型，本公开(μ-液穿孔器)在不使用电穿孔器所需的特殊稳定缓冲液的情况下展示了较高的细胞存活率。此外，本公开的细胞存活率可简单地通过向细胞培养基中添加海藻糖或聚合物来进一步增加细胞存活率。
针对BMDC，本公开展示了比电穿孔更高的转染效率和细胞存活率，从而指示出本公开具有用于癌症免疫治疗的高潜力。
相对于免疫细胞疗法，本公开具有优于相关技术中的电穿孔的几个优点。首先，已知的是，电穿孔具有改变原代T细胞的重要性能(例如，非特异性细胞因子爆发和减弱的IFN-γ反应)、降低了治疗性能的副作用。然而，电穿孔的低可扩展性(每次运行处理104至105个细胞)是关于其在癌症免疫治疗中的潜在临床用途的缺点，而癌症免疫治疗通常需要处理108个细胞。
然而，在本公开中，可在保持相同水平的输送效率的同时处理1×106个细胞/分钟，并且该吞吐量基于单个微通道，并且因此本公开可通过微通道的多路复用和并行化来实现癌症免疫治疗所需的细胞吞吐量。
在以下实验中，广泛用作靶分子的量子点(二苯并环辛炔(DOBI))和二氧化硅纳米球被确定为细胞内输送材料，并分析了对细胞(MDA-MB-231)的输送性能。
图45示出了呈现出通过本公开(μ-液穿孔器)、电穿孔器和脂质体3000将量子点(Qdot 625)输送到MDA-MB-231细胞中的共聚焦显微镜图像。
参照图45，所有方法示出优异的输送效率，但是当通过根据本公开的方法执行细胞内输送时，示出了量子点良好地分散在细胞质中的结果。在用电穿孔和脂质体3000处理的细胞中，观察到多个红点，指示了量子点的聚集或内体截留的可能性。由于这种量子点聚集最终引起材料的细胞内输送效率的降低，因此该结果意味着根据本公开的用于材料的细胞内输送的方法也可用于微材料的细胞内输送。
图46示出了每个细胞的量子点(Qdot 625)的点数计数的分析结果。
参照图46，分析结果表示量子点的聚集程度，并且能看出的是，在本公开中，每个细胞的量子点数是最低的。也就是说，与本公开相比，电穿孔或脂质体转染展示了三倍和四倍水平的量子点计数。这也与图45的分析结果一致，指示出当根据本公开执行诸如量子点的颗粒的细胞内输送时，通过在细胞变形之后通过细胞膜的快速溶液交换，量子点良好地分散在细胞质中。
图47是一实施方式(μ-液穿孔器，Ncell＝5,000/样品)的荧光强度直方图，在该实施方式中，通过阴性对照(未处理的K562细胞)、阳性对照(用纳米球共培的K562细胞，时间和浓度与该实施方式中的时间和浓度相同)和本公开(μ-液穿孔器)将纳米球(绿色荧光二氧化硅纳米球，Micromod，德国)输送到K562细胞中。
此外，图48示出了测量相对平均荧光强度的结果。
参照图47和图48，平均而言，在根据本公开处理的细胞中观察到更高的荧光强度，但在流式细胞术分析中在共培组中检测到高荧光信号。考虑到培育时间短和用于内吞作用的纳米球尺寸过大，阳性对照中的荧光好像是从粘附在细胞表面的纳米球获得的。
图49和图50示出了图47和48中的两组的共聚焦图像。这里，细胞膜通过使用DiD亲脂性碳菁染料而可视化。
如图49和图50中所示，来自阳性对照(共培)的绿色荧光信号仅存在于细胞膜中，而来自细胞质的亮绿色荧光仅在根据本公开处理的细胞中观察到。这指示出考虑到仅确认通过静电粘附到细胞表面的纳米球的作用的阳性对照，仅根据本公开的用于材料的细胞内输送的系统可能作为能够将纳米球输送到细胞中的技术。
工业适用性
根据本公开的通过使用惯性的细胞机械穿孔的用于将外部材料输送到细胞中的微流体系统在需要将材料输送到细胞中的生物和医学领域具有工业实用性。

Claims (14)

1.一种通过使用惯性的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的微流体系统，所述微流体系统包括：
流体通道结构，含有所述细胞和所述外部材料的溶液连续流过所述流体通道结构，
其中，所述流体通道结构包括一个或多个通道之间的接合部，
其中，包括所述一个或多个通道之间的所述接合部的所述流体通道结构包括包含“T”形形状、“Y”形形状、十字形形状或它们的组合的接合部，
在所述接合部的界面附近生成局部化的涡流，
所述细胞因所述涡流而变形，并且
通过所述涡流而在细胞膜中生成瞬时不连续性，并且通过所述细胞与所述细胞周围的流体之间的溶液交换，将所述外部材料引入到所述细胞中。
2.根据权利要求1所述的微流体系统，其中，当所述流体通道结构为“T”形形状或“Y”形形状的通道时，所述流体通道结构包括在流体停滞点附近的腔体。
3.根据权利要求2所述的微流体系统，其中，所述腔体具有圆形、椭圆形、细长狭缝形、多边形和它们的组合的形状。
4.根据权利要求2所述的微流体系统，其中，所述腔体的直径根据所述细胞的直径来确定。
5.根据权利要求2所述的微流体系统，其中，所述腔体具有用于在所述溶液的所述细胞与通道壁在所述接合部处碰撞时消除或减少所述细胞与所述通道壁之间的碰撞面积的结构。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微流体系统，还包括用于允许所述溶液在所述流体通道结构中流动的流体控制单元，
其中，所述流体控制单元允许所述溶液在所述流体通道中以能够在所述接合部的所述界面附近生成所述局部化的涡流的水平的速度流动。
7.根据权利要求6所述的微流体系统，其中，所述流体控制单元为注射泵或气动系统。
8.根据权利要求1所述的微流体系统，其中，所述溶液的雷诺数为1至1000。
9.根据权利要求8所述的微流体系统，其中，所述涡流由所述雷诺数确定。
10.根据权利要求1所述的微流体系统，其中，所述涡流呈现封闭或开放的再循环流的形式。
11.根据权利要求1所述的微流体系统，其中，所述流体通道至少在所述溶液的入口和出口之间的通道中具有多个所述接合部。
12.根据权利要求9所述的微流体系统，其中，所述微流体系统通过将根据权利要求1至5、8至11中任一项所述的微流体系统以串联、并联、或它们的组合的形式进行组合来形成。
13.根据权利要求3所述的微流体系统，其中，所述多边形为正方形、矩形、梯形。
14.一种通过使用惯性的细胞机械穿孔将外部材料输送到细胞中的方法，所述方法包括：
允许含有所述细胞和所述外部材料的溶液连续流过流体通道；
在接合部附近通过涡流生成手段来形成涡流；
通过所述涡流使所述细胞变形；以及
允许所述外部材料通过因所述细胞的变形在细胞膜中创建的孔而被引入到所述细胞中，
其中，所述涡流生成手段为所述流体通道的接合部结构，
其中，所述流体通道包括包含“T”形形状、“Y”形形状、十字形形状或它们的组合的接合部。
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