KR101605701B1 - 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 바이오물질을 단일 세포 수준에서 분석할 수 있는 미세액적-기반 바이오물질의 검출 장치 및 이를 이용한 분석 방법이 개시된다.

Description

미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치 및 방법{Apparatus and Method for Microdroplet-based Assay of Biomaterials}

본 개시 내용은 미세액적-기반 바이오물질의 검출 장치 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 바이오물질을 단일 세포 수준에서 분석할 수 있는 미세액적-기반 디바이스, 바이오물질의 검출 장치 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.

최근 사회·문화·경제적 요인으로 인하여 고위험성 감염병 질환 발병 확산과 유행 그리고 악성 종양의 발병과 다양한 종류의 암 발생으로 인하여 막대한 국가적, 사회적, 경제적 손실이 야기되고 있어 고위험성 바이러스, 박테리아 등과 같은 병원체를 신속하고 정확하게 판독하는 기술 개발의 필요성이 증대되고 있다. 예를 들면, E.coli 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다. 특히, O157:H7 혈청은 장 출혈성 대장균으로서 진단 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식품을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.

이러한 병원체는 오염된 토양, 그리고 수질 환경을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 적절한 환경에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다.

한편, 암은 심혈관 질환과 더불어 전 세계적으로 가장 높은 사망 원인 중 하나로서, 특히, 지난 50여 년간 암에 의한 사망률은 거의 감소하지 않았으며, 평균 수명까지 생존 시 암 발생 확률은 약 34%(3명 중 1명)인 것으로 알려져 있다. 따라서, 질병 진단 기술 중 암 분자 진단 시장은 급속히 성장하는 분야 중의 하나이다. 혈중 암 세포의 존재는 전이 초기 단계(전이성 암세포의 존재)로 해석할 수 있으며, 혈중 암 세포를 검출함으로써, 암의 조기진단 및 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 이러한 암 세포는 혈액 내 농도(예를 들면, 전체 세포 10억개 당 암세포 1개)가 극히 낮기 때문에 진단하는데 어려움이 있다.

따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체의 유무를 검출하거나, 또는 샘플 내 암 세포의 존재를 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 칩의 개발이 요구되고 있다.

이처럼, 바이오 칩을 이용하여 각종 병원체 및 종양(또는 암 세포)을 검출하는 연구가 이루어지고 있는 바, 종래에 단백질을 이용한 항원(antigen)-항체(antibody) 반응을 유도하여 검출하는 기술 (예를 들면, EP 0 318 734호 등), PCR(polymerase chain reaction; 중합효소 연쇄반응)법과 같이 병원체 내의 특이적 타겟 핵산(DNA, rRNA, mRNA 등)을 증폭하는 핵산 기반 기술 등이 알려져 있다. 이와 관련하여, PCR법은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 양 및 농도를 높이는 기술인 바, 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 시료를 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 53 ℃, 72 ℃ 및 92 ℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다(예를 들면, 국내특허번호 제 593687호 등). 최근에는 측정 기술의 발전이 이루어져 DNA 칩 어레이(DNA chip array)를 비롯하여 real-time PCR(rt-PCR)이 널리 각광받고 있다.

이와 관련하여, 마이크로 유체 디바이스는, 예를 들면, 미소 체적을 갖는 샘플 액체를 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성할 수 있기 때문에 각광을 받고 있는 분야로서, 바이오 칩 제작에 적용되고 있다.

이러한 미세유체 반응 디바이스는 크게 2가지 방식으로 구분되는 바, 미세채널을 이용하여 원료를 지속적으로 이동시키면서 반응을 수행하는 연속 반응 방식에서는 미세채널에 원료 용액이 지속적으로 미세채널을 통과하면서 혼합되어 반응이 일어난다. 반면, 미세 액적을 형성하여 액적 내부에서 반응이 일어나는 미세액적 방식에서는 물과 오일이 혼화성이 없다는 점을 이용하여 최소 2개 이상의 원료 용액이 오리피스를 통과하면서 도입된 오일의 전단력에 의하여 액적이 생성되고 생성된 액적이 미세채널을 지나면서 교반되어 반응이 일어난다. 특히, 미세액적 방식은 작은 반응 체적(피코리터에서 나노리터)이 이용되어 반응 속도를 증가시키고, 보다 농축된 생성물을 형성함으로써 초기 검출을 가능케 하고, 또한 종래의 벌크 체적 반응에 비하여 보다 많은 수의 독립된 측정이 가능하다는 장점을 갖는다. 그 결과, 샘플에 대한 검출 신뢰성이 높고, 보다 적은 량의 반응 시약을 사용하므로 테스트 비용을 절감할 수 있다.

종래에는 핵산(예를 들면, DNA 또는 RNA)을 함유하는 용액을 비혼화성 캐리어 유체 내에 분산시켜 형성된 미세액적에 대하여 증폭 반응(예를 들면, PCR 반응)을 수행하고, 이로부터 형광을 검출하는 방식으로 병원체 등에 대한 진단이 이루어졌다(미국특허번호 제7,041,481호 등). 이를 위하여는 헥산을 세포로부터 분리하고, 또한 다른 성분(예를 들면, 단백질, 지방 및 비주형 헥산 등)과 분리해야 할 필요성이 있다.

그러나, 가급적 적은 수의 타겟 세포(예를 들면, 병원성 세포, 암 세포 등)를 포획한 미세액적 내에서 PCR 반응 및 광학적 특성(예를 들면 형광) 변화에 대한 검출을 일괄적으로 수행할 수 있다면 분석 절차의 간편성, 비용 절감 등에 있어서 유리할 것이다. 특히, 단일 또는 이에 준하는 적은 수의 세포 수준으로 포획 가능한 미세액적 반응 시스템을 기반으로 다양한 바이오물질을 검출하는 경우, 샘플 내에 극미량의 세포가 함유되어 있더라도 효과적인 분석 방안을 제공할 수 있을 것이다.

이외에도, 병원성 세포 또는 암(종양) 세포와 같은 타겟 세포(또는 검출 대상 세포)뿐만 아니라 비병원성 세포 또는 정상 세포를 함유하고 있는 샘플 내에서 타겟 세포에 대한 검출 정확도를 높이기 위하여는 단일 세포 수준으로 미세액적 내에 타겟 세포를 포획할 수 있는 미세유체 디바이스가 바람직하다.

본 개시 내용에 따른 구체예는 종래에 알려진 미세액적 기반의 플랫폼이 갖는 기술적 한계를 극복하여 단일 세포 수준 또는 이에 준하는 수준에서 바이오물질을 검출할 수 있는 미세액적 기반 분석 장치 및 분석 방법을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

(i) 타겟 세포 및 (ii) 폴리머라아제, dNTP, 프라이머 및 표지 물질을 함유하는 PCR 혼합물을 포함하는 수계 유체를 도입하기 위한 제1 채널;

상기 제1 채널과 접합 영역(junction)을 형성하되 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 유체의 미세액적을 형성하도록 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널;

상기 접합 영역과 연통되어 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 유체의 미세액적을 이송하기 위한 제3 채널;

상기 수계 미세액적 내 타겟 세포에 대한 PCR을 수행하기 위한 PCR 영역; 및

상기 PCR 생성물을 함유하는 미세액적으로부터 표지 물질에 기인하는 신호(signal)를 검출하기 위한 검출 영역;

을 포함하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치가 제공된다.

예시적 구체예에서, 타겟 세포는 병원성 세포(또는 박테리아 세포) 및/또는 암 세포일 수 있다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

제1 채널을 통하여 (i) 타겟 세포 및 (ii) 폴리머라아제, dNTP, 프라이머 및 표지 물질을 함유하는 PCR 혼합물을 포함하는 수계 유체를 도입하는 단계;

상기 제1 채널과 접합 영역을 형성하되 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널을 통하여 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 미세액적을 형성하는 단계;

상기 접합 영역과 연통된 제3 채널을 통하여 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 미세액적을 배출하는 단계;

상기 수계 미세액적 내 타겟 세포에 대한 PCR을 수행하는 단계; 및

상기 PCR 생성물을 함유하는 미세액적으로부터 표지 물질에 기인하는 신호(signal)를 검출하는 단계;

를 포함하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법이 제공된다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 미세액적은 단일 병원성 세포 또는 암 세포를 함유할 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 표지 물질은 형광 물질을 포함하며, PCR 생성물로부터 배출되는 형광 특성을 검출한다.

본 개시 내용의 제3 면에 따르면,

수계 유체를 도입하기 위한 제1 채널;

상기 제1 채널과 접합 영역(junction)을 형성하되 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 유체의 미세액적을 형성하도록 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널; 및

상기 접합 영역과 연통되어 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 유체의 미세액적을 이송하기 위한 제3 채널;

을 포함하며

상기 제1 채널은 수계 유체의 주입구 또는 이에 근접한 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역을 구비하는 것을 특징으로 하는 미세액적 형성용 디바이스가 제공된다.

본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치는 바이오물질, 특히 타겟 세포로서 병원체(또는 병원성 세포), 암 세포 등을 단일 세포 수준 또는 이에 준하는 수준에서 미세액적 내에 포획할 수 있고 종래 기술에서와 같이 별도의 핵산 추출 과정을 수반하지 않고도 미세액적 내에 포획된 세포에 대한 PCR 및 검출을 수행할 수 있기 때문에 간편하면서도 정확히 바이오물질을 검출할 수 있는 장점을 갖는다. 또한, 추가적인 구체예에서 제공되는 미세액적 형성용 디바이스는 캐리어 유체와 접합하기에 앞서 세포가 정렬하도록 유도하여 세포의 급격한 유입을 방지함으로써 이후 균일한 사이즈의 미세액적을 제조할 수 있고 단일 세포 수준에서 미세액적 내에 세포를 포획할 수 있다. 따라서, 향후 광범위한 활용이 기대된다.

도 1은 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치 내 미세액적의 생성 및 함유 성분을 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 2a는 일 구체예에 따라 바이오물질을 포획(캡슐화)하기 위한 미세유체 디바이스의 설계도이고;
도 2b는 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치에 있어서 미세액적이 생성되는 것을 보여주는 현미경 사진이고,
도 3은 일 구체예에서 바이오물질 분석 장치 내 미세유체 디바이스를 구성하는 기판의 패턴을 형성하는 일련의 예시적인 공정을 도시하는 도면이고,
도 4a 및 4b는 각각 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치에 의하여 복수의 세포가 포획된 미세액적의 현미경 사진 및 단일 세포가 포획된 미세액적의 현미경 사진이고;
도 5a는 예시적 구체예에 있어서 미세액적 내에 세포, 특히 단일 세포를 효과적으로 포획하도록 캐리어 유체와 접합하기에 앞서 세포-함유 수계 용액을 주입하는 미세유로의 예시적 패턴을 도시하는 도면이고;
도 5b는 예시적 구체예에서 제1 채널의 미세유로 내에서 세포가 정렬되어 이동하는 형태를 나타내는 현미경 사진이고;
도 6a 및 도 6b는 각각 또 다른 구체예에 따라 제1 채널 및 제2 채널이 T자 형으로 연결(접합)된 미세유로를 따라 각각 이송된 세포-함유 수계 유체 및 캐리어 유체가 만나 오리피스를 통과하면서 미세액적을 형성함으로써 미세액적 내에 단일 세포 또는 적은 개수의 세포를 포획하는 것을 나타내는 현미경 사진이고;
도 7은 실시예 1에 따라 E.coli O157:H7 및 Salmonella 세포가 미세액적 내에 포획된 후, PCR을 거쳐 얻어진 생성물의 형광 특성을 나타내는 사진이고;
도 8a 및 도 8b는 각각 실시예 1에 따라 미세액적 내에 포획된 E. coli O157:H7 및 Salmonella 세포의 개수에 따른 형광 비드 유무 결과를 나타내는 그래프이고; 그리고
도 9는 실시예 2에 있어서 다양한 개수의 세포가 포획된 미세액적의 크기 및 크기 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다

본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.

"액적(droplet)"은 전형적으로 구형 형상을 갖는 적은 체적의 액체로서 에멀션의 연속 상과 같은 비혼화성 유체에 의하여 둘러싸여 있다.

"미세액적"은 액적의 체적이 약 1 마이크로리터 이하, 약 1 마이크로리터와 1 나노리터 사이, 또는 약 1 마이크로리터와 1 피코리터 사이의 값을 가질 수 있다. 택일적으로, 미세액적은 약 200 마이크로미터 미만의 직경을 갖는 분산 상(dispersed phase)를 의미할 수도 있다.

"캐리어 유체"는 물(또는 수용액)과 비혼화성인 임의의 액체 화합물 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 전형적으로는 탄소 함량이 높은 오일을 의미할 수 있다.

"샘플"은 검출하고자 하는 검체를 함유할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다.

"반응시약(reagent)"은 샘플에 대한 특정 테스트를 수행하기 위하여 샘플과 결합되는 화합물 또는 이들의 세트, 및/또는 조성을 의미할 수 있다. 예시적으로, 반응시약은 증폭용 시약일 수 있는데, 구체적으로 타겟 핵산의 증폭용 프라이머, 증폭 생성물의 검출을 위한 프로브 및/또는 염료, 폴리머라아제, 뉴클레오티드(구체적으로, dNTP), 마그네슘 이온, 염화칼륨, 버퍼 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

"증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.

"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)로 이루어질 수 있다.

"상보적"이라는 용어는 뉴클레오티드 또는 핵산 사이의 염기쌍을 혼성화할 수 있는 것을 의미하며, 통상 A와 T(또는 U), 또는 C와 G이다.

"채널"은 유체가 이동하는 통로를 의미하며, 예를 들면 튜브(예를 들면, 모세관), 평면 구조 내 또는 그 위(예를 들면, 칩) 또는 이의 조합에 의하여 형성될 수 있다. 본 명세서에서 채널은 평면 흐름 경로를 따라 연장되는 채널(예를 들면, 꾸불꾸불하거나 스파이럴(spiral) 평면 패턴의 채널) 또는 비평면 흐름 경로(예를 들면, 나선형의(helical) 3차원적 채널)일 수 있다.

본 명세서에서 임의의 구성 요소 또는 부재가 다른 구성 요소 또는 부재와 "연결된다" 또는 "연통된다"고 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 다른 구성 요소 또는 부재와 직접 연결 또는 연통되어 있는 경우뿐만 아니라, 다른 구성 요소 또는 부재의 개재 하에서 연결 또는 연통되어 있는 경우도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.

미세액적의 생성

도 1은 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치 내 미세액적의 생성 시스템 및 미세액적 내 함유 성분을 개략적으로 도시하는 도면이다.

도시된 미세액적의 생성 시스템(1)에 있어서, 제1 채널(11)을 통하여 타겟 세포(구체적으로, 병원성 세포, 암(종양) 세포 등) 및 PCR 혼합물을 함유하는 수계 액체가 도입되어 이동한다. 이와 함께, 서로 교차(intersection)된 형태로 배열된 복수의, 구체적으로 한 쌍의 제2 채널(12, 12')를 통하여 캐리어 유체가 도입된다. 이때, 교차된 형태는 한 쌍의 제2 채널이 서로 다른 위치로부터 연장되어 만나면서 제1 채널(11)과 접합 영역(13)을 형성할 수 있는 배열을 의미할 수 있는 바, 예를 들면 Y자 형, T자 형(즉, 제1 채널에 대하여 수직이면서 서로 대향하는 방향으로 캐리어 유체가 도입됨) 등의 기하학적 형태를 갖도록 배열될 수 있다.

이때, 상기 제1 채널 내로 도입되는 검출 대상 바이오물질은 복수의 세포로 이루어질 수 있고 핵산일 필요는 없으며, 예를 들면 병원체(병원성 세포) 또는 암(종양) 세포일 수 있다.

이와 관련하여, 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물로서, 그람 양성균 및 그람 음성균을 포함할 수 있고, 바람직하게는 대장균 O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi 등일 수 있다.

또한, PCR 혼합물은 반응시약으로서 폴리머라아제, dNTP, 프라이머(한 쌍의 프라이머; 포워드 프라이머(forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer)) 및/또는 표지 물질을 함유할 수 있다.

폴리머라아제는, 예를 들면 Taq DNA 폴리머라아제일 수 있는 바, 구체적으로 와일드-형 효소(wild-type enzyme), FastStart 폴리머라아제, Pfu DNA 폴리머라아제, S-Tbr 폴리머라아제, Tth 폴리머라아제, Vent 폴리머라아제 또는 이들의 조합일 수 있다.

특정 구체예에 따르면, 상기 표지 물질은 형광 물질 또는 형광 염료로서, 구체적으로 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알렉사플로어계(alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광 물질 등이며, 이중 1종 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 또한, 상기 형광 물질을 함유하는 형광 마이크로입자 또는 나노 입자 중 1 또는 그 이상 사용할 수 있다. 이외에도, PCR 혼합물 또는 수계 유체 내에는, 예를 들면 마그네슘 이온, 염화칼륨, 버퍼(buffer), 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

한편, 물(수용액)과 비혼화성을 갖는 캐리어 유체는 전형적으로 탄소계 오일일 수 있는 바, 몇몇 경우에 있어서는 불소, 실리콘, 산소 또는 이의 조합과 같은 이종 원소를 함유할 수 있다. 예시적 구체예에서, 상기 오일은 식물유(예를 들면, 포도씨유, 올리브유, 콩기름, 캐놀라유 등) 및 공업용 오일(예를 들면, 실리콘 오일, 광물유, 불화탄소유 등)로부터 1 또는 2 이상 선택될 수 있다.

본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 연속상인 캐리어 유체 내에 액적(미세액적)이 형성되는 원리는, 제1 채널(11) 및 제2 채널(12, 12') 각각을 통하여 도입된 수계 유체 및 이와 실질적으로 혼화성이 없거나 혼화성이 낮은 캐리어 유체는 접합 영역(13)에서 만나게 되고 오리피스(14)를 통과한다. 이때, 채널 또는 오리피스 표면에 대한 2가지 유체의 젖음성 차이, 그리고 오일의 전단력(shear force)에 의하여 수계 액체가 절단되고, 주변의 캐리어 유체와 수계 액체의 표면 장력에 의하여 절단된 수계 액체는 구형을 유지함으로써 마이크로미터 사이즈의 액적을 형성하는 것으로 설명될 수 있다.

이처럼, 미세액적은 분산된 상(dispersed phase) 또는 에멀션(emulsion)으로 존재하며, 액적 내부를 구성하는 상(phase)은 수계인 반면, 미세액적을 둘러싸는 연속 상은 캐리어 유체이다.

전술한 바와 같이 형성된 미세액적은 제3 채널(15)을 통하여 배출되는데, 이때 수계 유체의 구성 성분, 즉 단일 또는 복수(예를 들면, 가급적 적은 수)의 타겟 세포 및 PCR 혼합물의 구성 성분들이 미세액적 내에 함유된다.

도 2a는 일 구체예에 따라 바이오물질의 포획(캡슐화)을 위한 미세유체 디바이스의 설계도이다. 또한, 도 2b는 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치에 의하여 생성된 미세액적의 현미경 사진이다.

상기 도시된 구체예에 있어서, 미세유체 디바이스를 구성하는 재질의 대표적인 예는 폴리에스테르(구체적으로, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리이미드(PI), 폴리스틸렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 폴리우레탄, 폴리비닐리덴플루오라이드, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리비닐클로라이드(PVC), 사이클릭올레핀 공중합체(COC), 액정 고분자(LCP), 폴리아미드(PA), 폴리이미드(PI), 폴리(페닐렌 에테르) (PPE), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에테르 설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 아크릴 계통의 수지, 실리콘 계열 폴리머인 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 폴리디메틸실록산(PDMS)일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

도시된 구체예에 있어서, 수계 유체(병원성 세포 및 PCR 혼합물을 함유함)는 주입구(A)로부터 제1 채널(101)을 거쳐 도입되는 한편, 캐리어 유체는 주입구(B) 및 주입구(B') 각각을 통하여 제2 채널, 즉 채널(102) 및 채널(102')을 거쳐 도입된다(화살표 참조).

상기 구체예에서, 제2 채널은 2개의 채널 또는 유로(102, 102')로 이루어져 있다. 이때, 미세유체 디바이스 내로 수계 유체 및 캐리어 유체 각각을 도입하기 위하여, 주입 펌프(syringe) 펌프 또는 마이크로펌프(도시되지 않음)를 사용할 수 있다. 예시적 구체예에서, 제1 채널(101)의 폭(D1) 및 제2 채널(102, 102')의 폭(D2)은, 예를 들면 각각 약 20 내지 700 ㎛(구체적으로 약 50 내지 100 ㎛) 및 약 20 내지 700 ㎛(구체적으로 약 50 내지 100 ㎛) 범위일 수 있다.

택일적 구체예에 있어서, 제1 채널(101)은 세포의 정렬을 유도하기 위하여 캐리어 유체와 만나기에 앞서(구체적으로, 제2 채널(102, 102')과의 접합 영역 이전), 이의 일부 영역에 곡선 채널(즉, 나선형 또는 나팔관 형상의 패턴으로 형성된 채널) 부위(또는 영역)을 구비할 수 있는 바, 이에 관한 세부 사항은 별도로 설명하기로 한다.

상기 도시된 구체예에 따르면, 복수의 제2 채널, 즉 한 쌍의 제2 채널(102, 102')은 캐리어 유체가 서로 대향하며(약 180°의 각을 형성함) 흐르면서 합쳐지도록 배열된다. 이때, 제1 채널(101)은 제2 채널(102, 102') 각각에 대하여 대략 수직으로 배열되어 있다. 다만, 예시적 구체예에서, 상기 한 쌍의 제2 채널(102, 102') 각각은 제1 채널(101)과 접합되기에 앞서 제1 채널(101)과 실질적으로 평행하도록(즉, 완전히 평행하거나 다소 기울어진 각도를 형성하도록) 방향이 전환되어 연장되고, 이의 단부가 만곡되면서 제1 채널(101)과 합쳐져 접합 영역(103)을 형성한다. 그 결과, 제2 채널(102, 102')의 단부가 돔(dome) 형상을 이루면서 제1 채널(101)의 단부를 둘러싸게 된다.

또한, 제2 채널(102, 102')에 의하여 형성된 돔 형상의 정상부는 부분적으로 개방되어 오리피스(또는 노즐; 104)를 통하여 제3 채널(105)과 연결(연통)된다. 이때, 제1 채널(101)의 단부와 오리피스(104) 간의 거리(D3)는, 예를 들면 약 10 내지 500 ㎛, 구체적으로 약 20 내지 450 ㎛, 보다 구체적으로 약 50 내지 350 ㎛ 범위일 수 있다. 이와 같은 형태로 제1 채널(101) 및 제2 채널(102, 102')이 배열됨에 따라, 접합 영역(103) 내에서 제1 채널(101)로부터 배출된 수계 유체는 캐리어 유체와의 비혼화성으로 인하여 라운드 형상의 수계 분산 상(dispersed phase)을 형성하고, 상기 라운드 형상의 수계 분산 상이 제1 채널(101)의 단부로부터 점차 팽창하여 오리피스(104)에 도달하거나, 또는 오리피스(104) 쪽으로 이동한다. 그 결과, 상기 수계 분산 상이 오리피스(104)를 통과하면서 미세액적을 생성한다.

이와 관련하여, "라운드 형상"은 반드시 정확한 구형(또는 원형)을 의미하는 것으로 한정되지 않고, 예를 들면 타원형 또는 이와 유사한 형상을 포함하는 넓은 의미로 이해될 수 있다.

특정 구체예에 따르면, 오리피스(104)의 직경은, 제1 채널(101) 및 제2 채널(102, 102')의 폭, 라운드 형상의 수계 분산 상의 크기 등을 고려하여 정하여질 수 있는데, 예를 들면 약 20 내지 500 ㎛, 구체적으로 약 30 내지 200 ㎛, 보다 구체적으로 약 40 내지 100 ㎛ 범위 내일 수 있고, 또한 오리피스(104) 내 유체의 흐름 길이(오리피스의 두께)는 약 40 내지 60㎛, 구체적으로 약 50 내지 55 ㎛ 범위일 수 있다.

본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 상기 구체예에서 미세액적이 형성되는 원리는 하기와 같다:

캐리어 유체 내에 형성된 라운드 형상의 수계 분산 상은 오리피스(104)로 접근함에 따라 점차 집중(focusing)되거나 스퀴징(squeezing)되는데, 이때 오리피스(104)의 내벽이 수계 분산 상의 사이즈를 제한하면서 연속 상인 캐리어 유체를 블로킹함과 동시에 캐리어 유체 흐름으로 인한 압력 빌드-업(build-up) 및 오리피스(104) 내에서 수계 분산 상의 급격한 연신(elongation)에 의하여 미세액적이 형성되는 것으로 판단된다.

이러한 미세액적의 외관 특성(예를 들면, 사이즈)은 전단력, 오리피스 치수(dimension), 계면 간 표면 장력, 점도, 유속 등의 다양한 요인에 의존할 수 있다.

전형적으로, 미세유체 디바이스 내 유체의 유속은 해당 유체에 가해지는 압력(즉, 주입 압력)이 클수록 증가하는 바, 도시된 구체예에서 수계 유체 및 캐리어 유체 각각의 주입 속도는, 예를 들면 약 0.5 내지 50 μl/min(구체적으로 약 1 내지 20 μl/min, 보다 구체적으로 약 2 내지 10 μl/min) 및 약 0.5 내지 50 μl/min(구체적으로 약 1 내지 40 μl/min, 보다 구체적으로 약 2 내지 30 μl/min) 범위일 수 있고, 각각의 유체에 대한 주입 압력은 원하는 주입 속도를 고려하여 설정될 수 있다.

또한, 수계 유체 : 캐리어 유체의 유속 비는 예를 들면 약 1 : 1 내지 1 : 10 (구체적으로 약 1 : 3 내지 1 : 8, 보다 구체적으로 약 1 : 4 내지 1 : 6) 범위에서 조절될 수 있다. 이와 관련하여, 접합 영역(103) 내 수계 유체에 대한 캐리어 유체의 유속이 클수록 액적 사이즈는 감소하는 경향을 나타낼 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 미세액적의 사이즈는 약 50 내지 150 ㎛, 구체적으로 약 60 내지 100 ㎛ 범위 내에서 조절될 수 있다.

도시된 구체예에 따르면, 생성된 수계의 미세액적은 캐리어 유체와 함께 제3 채널(105)을 따라 배출(이송)되어 지점(C)까지 도달하게 된다. 제3 채널(105)의 폭(D4)은, 미세액적을 이송하는데 문제가 없는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 약 100 내지 700 ㎛(구체적으로 약 100 내지 300 ㎛)일 수 있다. 이때, 지점(C)는 오리피스(104)를 경유하여 접합 영역(103)으로부터 이송된 에멀션 유체(수계 미세액적을 함유하는 캐리어 유체)를 디바이스 외부로 배출하는 배출구일 수 있고, 또는 분석 장치 내에서 타겟 세포의 증폭(amplification) 영역과 직접적으로 또는 다른 구성 요소의 개재 하에 연결(연통)될 수도 있다.

한편, 또 다른 예시적 구체예에 따르면, 형성되는 액적의 특성을 조절하거나 최적화할 목적으로, 그리고/또는 생성된 미세액적의 안정성을 유지할 목적으로, 다양한 종류의 계면활성제를 추가적으로 사용할 수 있다. 전자의 경우에는 접합 영역(103)의 오리피스(104) 내로 액적을 압출하는데 요구되는 전단력을 감소시킴으로써 미세액적의 사이즈, 흐름 및 균일성을 조절하기 위하여 사용되는 한편, 후자의 경우에는 미세액적의 상호 뭉침 현상을 방지하기 위하여 사용된다. 이와 관련하여, 계면활성제는 전형적으로는 캐리어 유체 내에 첨가될 수 있는 바, 경우에 따라서는 수계 유체에 함유될 수도 있으나, 보다 다양한 종류의 계면활성제를 사용하는 것을 허용하고 계면활성제가 세포에 미치는 영향을 최소화하기 위하여는 캐리어 유체에 첨가하는 것이 유리할 수 있다.

계면활성제는 통상적으로 용해된 액체의 표면 장력을 감소시키고, 그리고/또는 다른 상과의 계면 장력을 저감시킬 목적으로 사용되는 바, 친수성 영역 및 소수성 영역을 모두 포함한다. 계면활성제는 HLB(hydrophile-lipophile balance) 값으로 특성을 나타낼 수 있는 바, 이는 물 및 오일에 대한 상대적 친화성을 나타낸다. 사용 가능한 계면활성제로서 대표적으로 상품명 Tween, Triton, Span, Krytox, Pluronic F68, Neat 008-FluoroSurfactant(RAN biotechnologies사) 등을 예시할 수 있는 바, 이때 캐리어 유체가 실리콘 및 광물유인 경우에는 Tween, Triton 및 Span 계열의 계면활성제를 사용하는 한편, 캐리어 유체가 불화 오일인 경우에는 Krytox, Pluronic F68 등을 사용하는 것이 유리할 수 있다.

상기 나열된 계면 활성제 대부분은 액적 내 세포에 대하여 생체적합성(biocompatibility)을 나타내므로 바이오물질 분석에 적용하는데 유리할 수 있다. 이와 관련하여, Fluka사에서 시판 중인 Span 계면활성제는 소르비탄계 카르복시산 에스테르 화합물로서, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트 등을 포함한다. 또한, DuPont사에서 시판 중인 Krytox 계면활성제는 과불화 폴리에테르 화합물이다. 예시적 구체예에서 계면활성제는 약 0.2 내지 10 중량%, 구체적으로 약 1 내지 3 중량%로 캐리어 유체 내에 함유될 수 있다.

한편, 예시적 구체예에 있어서, 주입구(A), 주입구(B), 그리고 배출구(C) 각각은, 예를 들면 기계적 천공, 레이저 천공, 화학적 에칭, 플라즈마 식각 등과 같이 당업계에서 공지된 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 경우에 따라서는 디바이스 제작용 기판 제조시 주입구 및 배출구가 일체적으로 형성(예를 들면, 사출 성형)된 기판을 사용할 수도 있다.

특정 구체예에 있어서, 도시된 설계도에 따라 당업계에서 공지된 방법을 통하여 미세액적 생성부를 구비한 미세유체 디바이스를 제작할 수 있다. 예를 들면, 별도로 제작된 2개의 기판(2개의 기판 중 하나 또는 모두가 패턴화됨)을 서로 결합(접합)하여 디바이스를 제작할 수 있다.

도 3은 미세유체 디바이스를 구성하는 2개의 기판 중 하나에 채널 형성용 특정 패턴을 제공하는 일련의 예시적인 공정, 구체적으로 포토리소그래피 공정을 도시한다.

먼저, 주형용 기판(201) 상에 포토레지스트 층(202)을 형성한다. 상기 포토레지스트 층(202)은 감광성 물질로 이루어지며, 바람직하게는 해상도 및 생체 적합성이 좋은 SU-8(에폭시계 네거티브 포토레지스트의 일종)을 사용할 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 주형용 기판(201)은 글래스, 투명 플라스틱, 실리콘 웨이퍼 등, 다양한 재료로부터 선택될 수 있다. 이때, 포토레지스트 층(202)은 통상의 고분자 코팅법, 예를 들면 스핀 코팅법에 의하여 주형용 기판(201) 상에 도포될 수 있다. 이와 같이 도포된 포토레지스트 층(202)은 이후 선택적 제거 과정(패턴화 과정)을 거치게 된다.

상기 패턴화된 포토레지스트 층(202')/주형용 기판(201)의 구조물을 주형(template)으로 사용한 몰드 내로, 예를 들면 액상 고분자를 부은 다음, 바람직하게는 진공을 가하여 기포를 모두 제거하고 냉각시킨 후에 이를 분리하여 패턴화된 고분자 층(203)을 형성할 수 있으며, 이를 디바이스 제작에 사용할 수 있다. 그 다음, 알코올(예를 들면, 메탄올) 세정을 거친 후에 건조시켜 상부 기판을 제작한다.

또 다른 구체예에 따르면, 패턴화된 고분자 층(예를 들면, PDMS 재질)을 제조하기 위하여, 단량체 : 경화제(예를 들면, Sylgard 184A, Sylgard 184A 등)를 약 5 : 1 내지 10 : 1의 중량비로 혼합한 다음, 상기 몰드 내로 부은 다음, 예를 들면 약 1 내지 5 시간, 구체적으로 2 내지 3 시간 동안 전형적으로는 약 50 내지 80℃, 구체적으로는 약 60 내지 70℃에서 중합시킨 다음, 몰드로부터 고분자 층을 분리한다. 이때, 패턴이 형성된 기판의 두께(패턴을 구성하는 요철부 아래의 기판 두께)는, 예를 들면 약 10 내지 100 mm, 구체적으로 약 20 내지 40 mm 범위일 수 있다.

이와 별도로, 설계도에 따라, 필요한 경우에는 상부 기판에서와 동일한 제작 방법에 의하여 상부 기판에 대응하는 하부 기판을 제작하고, 2개의 기판(상부 기판 및 하부 기판)을 결합(접합)하면 원하는 패턴의 채널(유로)이 형성된 미세유체 디바이스를 제작할 수 있다. 이때, 채널 내에 형성된 공간을 통하여 유체의 이송, 혼합 등의 기본적인 현상이 일어나며, 미세액적 역시 생성된다. 다만, 상부 기판과 하부 기판은 서로 동일하거나 또는 상이한 플라스틱 재질일 수 있으며, 동일 또는 동종 플라스틱 재질이라 해도 상부 기판과 하부 기판 각각의 개별 물성이 상이할 수 있다.

또한, 상부 기판 및 하부 기판의 결합(접합)을 위하여, 상부 기판과 하부 기판을 열로 이용하여 융착하는 열 융착법, 초음파를 이용한 융착법, 코로나 방전 또는 플라즈마를 이용하여 결합하는 방법 등을 이용할 수 있다.

구체적으로, 상부 기판과 하부 기판의 결합 과정에서, 예를 들면 약 50 내지 130 ℃, 보다 구체적으로 약 80 내지 130 ℃ 범위에서 결합(접합)을 실시할 수 있다. 초음파를 이용한 융착법의 경우, 상부 기판과 하부 기판을 위치시키고 지그를 사용하여 고정시킨 후에 순간적으로 초음파를 조사하여 2개의 기판을 결합할 수 있다. 코로나 방전법의 경우, 상부 기판 및 하부 기판의 결합 면에 코로나 방전을 노출시켜 표면을 순간적으로 개질시킨 후 접착하는 방식으로서, 예를 들면 약 50 내지 80 ℃, 보다 구체적으로 약 60 내지 80 ℃의 온도에서 약 5분 내지 1시간 동안 결합을 수행할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 전술한 방식으로 제작된 미세유체 디바이스 내 채널(즉, 제1, 제2 및 제3 채널)의 높이는, 예를 들면 약 20 ㎛ 내지 1 mm, 구체적으로 약 20 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 ㎛ 범위에서 정할 수 있다. 디바이스 내 채널의 높이가 지나치게 작은 경우에는 채널 상면과 하면 사이에서 발생되는 정전기로 인하여 액체(예를 들면, 바이오물질 및 PCR 혼합물을 함유하는 수계 유체 또는 캐리어 유체)의 주입이 용이하지 않을 수 있는 한편, 지나치게 큰 경우에는 샘플의 손실을 증가시키는 경향이 있기 때문에, 상술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 채널 내 표면 특성 역시 액적 형성에 영향을 미칠 수 있는 바, 미세유체 디바이스를 구성하는 고분자(예를 들면, PDMS) 기판은 선택적으로 실란화 처리 등을 통하여 탄화수소기 또는 불화탄소기로 관능화될 수 있다. 이러한 관능화 처리에 의하여, 디바이스가 비교적 장기간의 작동 중에도 성능을 유지할 수 있다.

전술한 바와 같이, 수계의 미세액적 내에는 주로 세포, 폴리머라아제, 프라이머, 표지 물질(예를 들면, 형광 물질 또는 염료) 등이 함유되어 있다. 따라서, 후속적으로 이루어지는 증폭 반응(구체적으로 PCR)에서 개별 미세액적은 일종의 반응기로 작동하며, 또한 미세액적 내에서 세포의 용해 및 증폭 반응이 일어나게 된다. 이처럼, 증폭 반응 후에 미세액적 내 증폭 반응 생성물로부터 발생되는 특성 또는 신호(구체적으로, 광학 신호, 보다 구체적으로 형광 특성)를 검출함으로써 타겟 세포(예를 들면, 병원성 세포, 암(종양) 세포 등)의 유무 및 함유 정도를 분석할 수 있다.

도 4a 및 4b는 각각 일 구체예에 따른 바이오물질 분석 장치에 의하여 복수의 세포가 포획된 미세액적의 현미경 사진 및 단일 세포가 포획된 미세액적의 현미경 사진이다.

도 2a 및 도 2b와 관련하여 설명한 바와 같이, 라운드 형상의 수계 분산 상이 연신되면서 오리피스(104)를 통과하는 동안 이에 함유된 세포 역시 함께 오리피스(104)를 통과하게 된다. 미세액적 생성부에서 유체 흐름의 조건을 조절하여 복수의 세포(도 4a)는 물론 단일 세포(도 4b)까지 포획할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 미세액적 내에 포획되는 세포의 개수는, 예를 들면 약 1 내지 10, 구체적으로 약 1 내지 5 개, 보다 구체적으로 약 1 내지 3개 범위일 수 있다. 또한, 상기 도시된 구체예에 따라 얻어지는 미세액적은 높은 단분산도(monodispersity), 예를 들면 약 4% 미만, 구체적으로 약 3% 미만, 보다 구체적으로 약 2% 미만의 분산도를 나타낼 수 있다(즉, 균일한 미세액적의 크기(사이즈) 분포를 나타냄).

본 개시 내용에 있어서, 미세액적 내에 단일의 병원체 세포를 포획할 경우의 장점을 주목할 필요가 있다. 즉, 미세액적 내에 단일 세포 또는 이에 준하는 적은 개수의 세포를 포획하여 분석할 경우, 복수의 세포가 포획될 때 야기될 수 있는 상이한 세포 간 상호-오염(cross-contamination) 가능성을 현저히 감소시킬 수 있고 분석 정확도를 개선할 수 있기 때문에 분석에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있다. 특히, 미세액적의 사이즈 및 균일성을 제어하여 수계 액적의 내용물을 조절할 수 있기 때문에 개별 세포 반응에 최적화된 미세환경을 제공할 수 있다.

이와 관련하여, 도 5a는 미세액적 내에 세포, 특히 단일 세포를 포획하기 위하여 캐리어 유체와 만나기 앞서 세포-함유 수계 용액이 이송되는 미세 채널 또는 유로(제1 채널)의 예시적 패턴을 도시하는 도면이고, 도 5b는 미세 채널 내에 세포가 정렬되어 있는 형태를 나타내는 현미경 사진이다.

일정한 크기를 갖는 세포(예를 들면, 박테리아 세포, 암(종양) 세포 등)의 채널 내 유동 환경에서 세포의 크기, 채널 직경, 유속, 세포 농도, 세포와 채널 내 벽과의 상호 작용 등이 특정 조건을 만족할 때 세포가 하나의 유선(streamline)을 따라 일정한 간격을 유지하며 정렬되어 흐르도록 유도할 수 있다. 이때, 채널 내 유체는 채널 벽과의 상호 작용(예를 들면, 전단력)에 의하여 유체의 진행 방향으로 포물선 형태의 속도 분포를 나타내는데, 채널(관) 내 중앙에서 속도가 가장 빠르며, 벽면으로 가까울수록 속도가 감소한다. 즉, 전단력은 채널 중심에서 실질적으로 0이며, 반경에 비례하면서 채널 벽까지 직선적으로 증가하며 채널 벽에서 최대가 된다. 이때, 유체(상기 구체예에서는 수계 유체)와 함께 이동하는(흐르는) 세포는 각 지점에서 유체의 유속 차이로 인하여 채널 벽면으로부터 힘을 받게 되며, 채널의 단면 기준으로 세포에 작용하는 힘이 0이 되는 지점에서 정렬한 상태로 흐르게 된다.

이와 관련하여, 채널 사이즈(또는 직경)는, 예를 들면 세포 사이즈(또는 직경)의 약 5배 이하, 구체적으로 약 4배 이하, 보다 구체적으로는 3배 이하로 조절될 수 있는 바, 세포 사이즈, 채널 직경, 유속 등의 조건에 따라 세포가 정렬하기 시작하는 유동 방향의 길이 및 단면 내 위치가 달라질 수 있다.

상기 예시된 구체예에 있어서, 채널의 단면이 정사각형(또는 원형)인 직선 채널인 경우에 세포가 하나의 유선을 따라 정렬한다고 할 때, 전형적으로 채널 내 중심을 따라 정렬하면서 흐르게 된다. 이때, 도시된 바와 같이, 세포-함유 유체를 회전하는 곡선 채널(즉, 나선형(스파이럴 또는 헬리컬) 또는 나팔관 형상의 패턴으로 형성된 채널)을 통하여 흘리게 되면, 곡면의 외부 방향으로 작용하는 원심력을 받게 되며, 이러한 원심력과 기존에 세포에 작용하던 힘이 조합되어 보다 빠른 시간 내에 세포의 표면에 작용하는 힘이 평형을 이루면서 정렬된 상태로 흐르게 된다. 이러한 현상을 이용하여 미세 액적 형성 과정에서 개별 미세 액적 내에 단일 세포를 보다 용이하게 포획할 수 있게 된다.

상술한 원리를 이용하여, 분산 상에 상당하는 수계 유체의 샘플 주입구부터 미세 액적이 형성되는 오리피스에 이르는 지점까지의 경로에 세포가 정렬될 수 있는 조건을 만족하는 회전형의 미세채널 구조를 설계할 수 있다. 이때, 분산 상의 유속을 조절함으로써 정렬된 세포가 흐르는 속도 역시 조절할 수 있다. 또한, 오리피스를 통과하는 세포의 주기에 맞추어 미세액적이 생성되도록 연속 상(캐리어 유체)의 유속을 조절할 경우, 개별 미세 액적 내에 용이하게 단일 세포를 포획할 수 있다.

상기 구체예의 경우, 세포의 정렬을 유도하여 접합 영역에서 세포의 급격한 유입을 방지함으로써 동일한 크기의 미세액적 제조 및 세포 포획에 기반한 단일 세포 수준의 분석을 용이하게 구현하는 추가적인 장점을 제공한다. 특히, 미세액적 내에 포획되는 세포 개수가 증가할수록 미세액적의 크기가 불균일하게 되고, 미세액적 내 반응 시료의 부족으로 인하여 분석 정확도가 낮아지는 현상을 방지할 수 있다.

또 다른 예시적 구체예에 따르면, 수계 유체(분산 상)이 도입되는 제1 채널(201) 중 나선형 또는 나팔관 형상의 패턴으로 형성된 일 영역(구체적으로 수계 유체의 주입구 또는 이에 근접한 영역) 내에 특정 형상의 구조물을 선택적으로 도입(또는 형성)할 수 있다. 이때, 특정 형상의 구조물로서 도시된 바와 같이 반원 형상의 구조가 일정 간격(A)을 유지하며 반복하여 연결된 구조물을 예시할 수 있다. 이때, 세포-함유 수계 유체(분산 상)의 주입구로부터 나선형 패턴의 채널 내벽으로부터 유체 내 세포가 이동할 수 있는 공간을 두고 배열된 특정 형상의 구조물을 도입할 경우, 나선형 패턴의 채널(예를 들면, 직사각형 또는 원형 단면을 가짐) 내에서 세포에 보다 큰 힘을 가함으로써 보다 빠른 시간 내에 세포를 정렬시킬 수 있다. 구체적으로, 제1 채널(201) 중 구조물이 배열된 지점에서는 채널 내 공간의 사이즈가 감소하게 되며, 그 결과 유체 내 세포에 보다 큰 힘이 가해짐으로써 더욱 신속하고 정확하게 세포의 정렬이 이루어질 수 있는 것이다. 이처럼 세포 정렬이 이루어진 후에는 구조물이 도입(또는 형성)되지 않은 직선 패턴의 채널 공간을 흐르게 된다.

상기 구체예에 있어서, 반복되어 연결되는 구조 간의 간격(거리; A)이 적을수록 세포에 반복적으로 가해지는 힘을 증가시킬 수 있다. 예시적으로, 반원 형상의 구조의 높이(또는 반경)은, 예를 들면 약 10 내지 40 ㎛, 구체적으로 약 15 내지 35㎛, 보다 구체적으로 20 내지 30 ㎛ 범위일 수 있으며, 또한 반원 형상의 구조 간 거리(A)는, 예를 들면 약 20 내지 800 ㎛, 보다 구체적으로 약 50 내지 600 ㎛, 보다 구체적으로 약 90 내지 500 ㎛ 범위일 수 있다. 이외에도, 제1 채널(201)의 내벽 면으로부터 반원 형상 구조의 정상부(상면) 간의 간격은 적어도 유체 내 세포가 이동할 수 있어야 하는데, 예를 들면 약 10 내지 100 ㎛(구체적으로 약 12 내지 70㎛, 보다 구체적으로 약 15 내지 25 ㎛) 범위 내에서 선택될 수 있다. 다만, 반복되는 구조의 사이즈, 구조 간 거리(A)는 채널의 폭 및 높이를 고려하여 조절할 수 있고, 또한 특정 형상의 구조와 채널 내벽 면 사이의 거리와 같은 치수는 세포 사이즈 등을 고려하여 결정할 수 있는 만큼, 반드시 상술한 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.

도 5b에 도시된 바와 같이, 전술한 채널 패턴을 거쳐 이송된 분산 상(수계 유체) 내 세포는 캐리어 유체와 접합하기에 앞서 일정한 간격을 두고 배열하고, 제1 채널(201)의 잔여 구간을 통하여 이동하게 된다.

이와 관련하여, 도 6a 및 도 6b는 각각 또 다른 구체예에 따라 제1 채널 및 제2 채널이 T자 형으로 연결되고, 제1 채널을 거쳐 이송되는 수계 유체 및 제2 채널을 거쳐 이송되는 캐리어 유체가 접합하여 오리피스를 통과하면서 미세액적을 형성하고, 미세액적 내에 단일 세포 또는 복수의(가급적 적은 개수의) 세포를 포획하는 것을 나타내는 현미경 사진이다.

상기 도시된 구체예에 따르면, 일부 영역에 나선형 또는 나팔관 형상의 패턴을 갖는 유로가 형성된 제1 채널(201) 내로 분산 상(세포-함유 수계 유체)을 주입(도입)하고, 더 나아가 상기 나선형 또는 나팔관 형상의 패턴을 갖는 유로 중 일부 또는 전부에 특정 형상의 구조물을 도입할 경우, 제2 채널(202, 202')을 경유하여 도입된 캐리어 유체와 접합 영역(203)에서 만나고, 오리피스(204)를 통과하면서 형성된 개별 미세액적 내에 단일 또는 적은 수의 세포를 용이하게 포획할 수 있다. 이후, 세포가 포획된 미세액적은 제3 채널(205)을 거쳐 이송된다. 상기 도면에 도시된 구체예에서 오리피스의 폭은 제1 채널(201) 및 제2 채널(202, 202')의 폭과 실질적으로 동등한 수준이다.

미세액적 내 바이오물질의 검출을 위한 증폭 반응

일 구체예에 따르면, 전술한 바와 같이 세포가 포획된 미세액적에 대하여 PCR 테크닉을 이용한 증폭 반응을 수행한다. 상기 증폭 반응 시 또는 증폭 반응에 앞서 미세액적 내에서 상기 포획된 세포로부터 헥산 성분을 추출하기 위하여, 세포 용해(cell lysis) 과정을 거치게 된다. 이때, 헥산은 DNA 또는 RNA를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

세포 용해 과정은 당업계에서 알려진 방식, 예를 들면 화학적(효소 이용), 레이저 방식(레이저빔을 이용한 열적, 화학적 용해), 초음파, 열적 용해, 고전압 이용 방식, 마이크로파에 의한 가열 방식 등이 고려될 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 타겟 세포는 인시튜로(in-situ)로 세포 용해-증폭-검출을 일괄 수행할 수도 있는 만큼, 별도의 분리 단계를 거치지 않고도 간편하게 세포를 용해할 수 있는 히터를 이용한 직접 가열, 또는 인덕션을 이용한 유도 가열 방식이 바람직할 수 있다.

상술한 세포 용해 과정 이후에는 당업계에서 알려진 방법에 따라 추출된 핵산(DNA, RNA 등)에 대한 증폭 반응을 수행한다. 이러한 공지된 증폭 방법들 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭 기술에 의하여 진단의 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. PCR 테크닉은 미국특허번호 제4,683,195 등에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명의 참고자료로 포함된다.

일반적으로, PCR은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 량 및 농도를 증가시키는 기술인 바, 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 샘플을 3가지 온도 프로파일로 반복하여 가열 및 냉각시키는 열적 사이클을 수반한다. 따라서, 신속한 온도 응답, 정확한 온도 및 균일한 온도 분포를 정밀하게 제어하는 것이 중요하다.

예시적 구체예에 있어서, 미세액적 내 핵산은 가열 및 냉각 라인 사이에서 꾸불꾸불한 경로의 채널을 통하여 이동하면서 증폭될 수 있다. 전술한 바와 같이, 3개의 온도 영역을 통하여 핵산의 이중 스트랜드를 열변성(denaturation)시키고(고온 영역), 프라이머를 어닐링(annealing)하고(저온 영역), 그리고 단일 스트랜드 핵산을 증폭하여 이중 스트랜드의 핵산을 형성한다(중간 온도 영역).

예시적 구체예에서는 각각 95 ℃(고온 영역), 64 ℃(저온 영역) 및 72 ℃(중간 온도 영역)로 설정할 수 있다. 이때, 증폭 과정에서 미세액적 내에 세포와 함께 함유된 프라이머는 타겟 분자 내의 상보적 염기 서열로 어닐링되며, 이후 프라이머는 폴리머라아제를 이용하여 연장되어 새로운 쌍의 상보적 스트랜드를 형성한다. 이러한 열 변성, 어닐링 및 폴리머라아제 연장으로 이루어지는 사이클은 복수회 반복되어 타겟 염기서열의 증폭된 세그먼트를 고농도로 형성할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 증폭 과정 중 미세액적 내 핵산은 액적이 채널을 통과함에 따라 열적 사이클을 거치게 되며, 열적 영역을 연장함으로써 열적 사이클의 회수를 조절할 수 있다. 택일적 구체예에서는 미세액적을 미세유체 디바이스로부터 꺼내어 물리적으로 분리된 증폭 영역(예를 들면, 코니컬 관)으로 이송하여 증폭 반응을 수행할 수 있다.

한편, 본 명세서에 기재된 구체예에서는 PCR 테크닉에 속하는 다양한 증폭 방법, 예를 들면 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR 등을 적용할 수 있다.

타겟 병원체(병원성 세포)의 검출

본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 전술한 바와 같이 PCR 프로토콜에 따른 증폭 반응을 거친 미세액적은 검출 영역에서 개별적으로 분석되고 검출될 수 있다. 이때, 검출 장치는 광학 또는 전기적 검출기 또는 이들의 조합일 수 있다. 적절한 검출 장치로서 광도파관, 현미경, 다이오드, 레이저 등, 당업계에서 공지된 검출 장치를 사용할 수 있는 바, 이러한 장치를 이용하여 증폭 생성물로부터 발생하는 일련의 신호(signal)를 검출한다.

예시적 구체예에 따르면, 증폭된 생성물은 라벨화된 프로브, 구체적으로는 형광 라벨화된 프로브를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 형광 라벨화된 프로브의 대표적인 예로서, 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알 렉사플로어계 (alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광 물질 등을 들 수 있으며, 이중 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있다. 다만, 본 발명이 상기 예시된 형광 물질로 한정되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 형광 물질은 특정 파장의 광에 의하여 여기된 후, 또 다른 파장의 광을 방출하여 잉여 에너지를 배출하는 바, FITC와 같은 형광 물질은 550 nm 파장의 광을 방출한다

또 다른 구체예에 있어서, 분자 비콘 프로브 또는 TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법을 이용할 수 있다. 이와 관련하여, 분자 비콘 프로브는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 형광체(fluorescent dye)로, 3' 말단을 소광제(quencher)로 결합시킨 것이다. 올리고뉴클레오타이드 스트랜드는 타겟서열에 상보적인 루프형 프로브 부분과 그 양쪽 끝에 5 내지 6개의 뉴클레오타이드의 자기상보(Self-complementary) 영역으로 구성되는데, 타겟이 없을 경우에는 프로브의 상보부분이 인접된 머리핀 형태로 형광체와 소광제가 인접하여 강한 소광 효과를 나타낸다. 반면, 타겟과 반응하면 루프형의 배열이 펴지며 직선으로 되어 형광체와 소광제의 거리가 멀어지게 되어 형광이 관찰된다. 또한, TaqMan 프로브의 경우, 5' 말단은 형광체(FAM 등)로, 3' 말단은 소광제(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 중합효소가 갖는 5' → 3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.

다만, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직하다.

전술한 바와 같은 원리에 의하여 얻어진 형광 발현 여부 및 형광 정도를 통하여 타겟 분자의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 상기 검출에 있어서, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같은 당업계에 알려진 장치를 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

미세액적 형성용 미세유체 디바이스의 제작

미세액적 형성용 미세유체 디바이스는 스탠더드 소프트 리소그래피(standard soft lithography)를 이용하여 제작되었다. 이와 관련하여, 마스터 몰드로서 포토레지스트 SU-8 2050, 그리고 현상액(developer)은 MicroChem사(메사츄세츠, 뉴턴)로부터 구입하였으며, PDMS 프리폴리머 혼합물(Sylgard 184)은 Dow Corning(미주리, 미들랜드)사로부터 구입하였다.

이후, 도 2a에 나타난 설계도에 따라 상부 기판 및 하부 기판을 각각 제조하여 접합하였다. 상기 설계된 바에 따라 기판에 채널을 형성하기 위한 절차는 하기와 같다.

먼저, SU-8 2050을 4-인치 실리콘 웨이퍼(LG 실트론사) 상에 스핀코팅하였고, 통상의 포토리소그래피 테크닉에 따라 마스터 몰드를 제작하였다. 그 다음, 가스가 제거된 PDMS 프리폴리머 혼합물(베이스 : 경화제의 중량비는 10:1임)인 마스터 몰드 상에 캐스팅(몰딩)하여 PDMS 리플리카를 제조한 후, 80?에서 2시간 동안 베이킹한 다음, 분리하였다(peeling off). 상기 PDMS 리플리카의 표면을 산소 플라즈마(10.5 W, 60초)로 처리하였다(상부 기판). 이와 별도로, 동일한 방식으로 제작된 기판(하부 기판)을 상기 상부 기판과 60 ℃에서 1 시간 동안 접합(bonding)하여 미세유체 디바이스를 제작하였다.

상기 제작된 디바이스에서, 제1 채널(D1), 제2 채널(D2) 및 제3 채널(D4) 각각의 폭은 120 ㎛, 150 ㎛ 및 390 ㎛ 이었고, 채널 높이는 100 ㎛이었다. 또한, 접합 영역 중 제1 채널의 단부와 제2 채널에 의하여 형성된 돔 형상의 정상부 간의 거리(D3)는 300 ㎛이었다. 또한, 오리피스의 직경 및 두께는 각각 50 ㎛ 및 50 ㎛이었다.

검출용 세포 배양

본 실시예에서는 E.coli O157:H7 및 Salmonella를 식중독 원인균으로 선택하였다. 샘플용 세포를 배양하기 위하여, 각각의 세포를 다른 튜브에 넣고 15mL 의 Luria-Bertani (LB) 배지와 함께 250 rpm으로 37 ℃에서 교반하면서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, UV 흡광도 측정법(600 nm)에 의한 광학 밀도(optical density; OD) 값이 1이 되었을때 배양을 종료하여 세포를 회수하였다.

민감도 높은 PCR 효율을 달성하기 위하여, 앞서 배양된 세포는 원심분리를 거쳐 증류수(DW)로 배지를 대체하였다. 회수된 세포는 세포 수에 따라 증류수로 희석하여, 10 내지 10⁵/40 ㎕의 범위에서 선정된 농도를 갖는 샘플을 준비하였다.

PCR 혼합물

PCR 버퍼(buffer), dNTP 및 폴리머라아제(Hot-start polymerase)를 함유한 2x Evagreen PCR 혼합물 (BioRad사의 제품명 QX200™ ddPCR™ EvaGreen Supermix)을 사용하였다. 이때, E.coli O157:H7 및 Salmonella 각각에 대응하는 프라이머(포워드(forward) 프라이머 및 리버스(reverse) 프라이머; 각각 0.2 μM) 및 세포를 넣어 주었고, 물을 사용하여 최종 농도를 조정하였다. 상기 2가지 세포 각각에 대한 프라이머의 염기서열은 하기 표 1 및 표 2와 같았다.

프라이머	염기서열 (E.coli O157:H7)
포워드	5’-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3’
리버스	5’-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3’

프라이머	염기서열 (Salmonella)
포워드	5’-AAA ACA TAT GCT GGA CCA ACT GGA AGC-3’
리버스	5’-GTT CGC TTA ACA AAC GCT GCA AAA CTT-3’

캐리어 유체

캐리어 유체로서 HFE-7500 불화탄소(fluorocarbon) 오일(3M사에서 시판 중)을 사용하였으며, 계면활성제(RAN biotechonlogies사의 제품명 008-FluoroSurfactant　)를 2 중량%로 첨가하여 사용하였다. 또한, 미세액적 기반 유전자 증폭 반응을 위하여는 미세액적 제조 오일인 Droplet generation oil for Evagreen (Biorad 사)을 사용하였다.

미세액적의 생성 조건

수계 유체 및 캐리어 유체는 각각 2 μl/min 및 5 μl/min의 유속이 되도록 도 2a에서 설계된 디바이스 내로 주입되었으며, 그 결과, E.coli O157:H7 세포 및 Salmonella 세포를 각각 포획하는 미세액적이 생성되었다(액적 사이즈: 약 100㎛). 미세액적을 함유하는 캐리어 유체를 배출구(C)를 통하여 회수하였다.

PCR 증폭

앞서 생성된 미세액적을 PCR 튜브에 투입하여 PCR 반응을 수행하였다. 이를 위하여, 95 ℃에서 20분 동안 미세액적 내 세포를 먼저 용해시켰고(초기 열변성 및 병원성 세포의 열 용해), 이후 95 ℃에서 30초, 그리고 64 ℃에서 1분으로 하여 40 사이클을 수행하였다. 그 다음, 펠티어 열 사이클러(peltier thermal cycler)를 이용하여 최종적으로 95 ℃에서 5분 동안 증폭 생성물을 안정화(stabilization)한 후, 4℃에 노출시켜 증폭 생성물을 얻었다.

검출

E.coli O157:H7 및 Salmonella 세포 농도(0 cell/40㎕, 10 cells/40㎕, 10² cells/40㎕, 10³ cells/40㎕, 10⁴ cells/40㎕ 및 10⁵ cells/40㎕) 각각에 따른 PCR 생성물에 대하여 ZEISS LSM 510 META 공초점 현미경을 사용하여 FITC 형광을 이미징하여 각각의 미세액적 내 형광 변화를 관찰하였다. 상기 관찰 결과를 도 7에 나타내었다.

또한, 미세액적 내에 포획된 E. coli O157:H7 및 Salmonella 세포 각각의 개수에 따른 형광 비드 유무 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 미세액적 내에 식중독 원인균(E.coli O157:H7 및 Salmonella)이 포획될 경우, 이의 증폭 생성물을 함유하는 미세액적은 녹색 형광을 발현함을 알 수 있다. 반면, 미세액적 내 식중독 원인균이 포획되지 않은 경우에는 형광색을 나타내지 않았다.

실시예 2

실시예 1에서 수계 유체 및 캐리어 유체 각각의 흐름 특성을 변경한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 미세액적을 제조하였으며(도 4a 참조), 이때 개별 미세액적이 단일 세포에서 복수의 세포까지 포획하도록 조절하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 미세액적의 크기는 포획되는 세포의 개수에 따라 상이하고, 생성된 미세액적 간 크기 분포 역시 균일하지 않음을 알 수 있다. 특히, 도 6b와 관련하여, 제1 채널이 나선형 패턴의 영역을 구비하도록 하여 얻어진 미세액적과 대비하면, 보다 명확한 차이를 확인할 수 있다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (24)

1. (i) 타겟 세포 및 (ii) 폴리머라아제, dNTP, 프라이머 및 표지 물질을 함유하는 PCR 혼합물을 포함하는 수계 유체를 도입하기 위한 제1 채널;
   상기 제1 채널과 접합 영역(junction)을 형성하되 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 유체의 미세액적을 형성하도록 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널;
   상기 접합 영역과 연통되어 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 유체의 미세액적을 이송하기 위한 제3 채널;
   상기 수계 유체의 미세액적 내 타겟 세포에 대한 PCR을 수행하기 위한 PCR 영역; 및
   상기 PCR 생성물을 함유하는 미세액적으로부터 표지 물질에 기인하는 신호(signal)를 검출하기 위한 검출 영역;
   을 포함하며,
   상기 제1 채널은 제2 채널과 접합 영역을 형성하기 전의 일부 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 유로를 구비하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 접합 영역은 미세액적을 형성하기 위한 오리피스를 경유하여 제3 채널과 연통되는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
3. 제2항에 있어서, 상기 제2 채널은 서로 대향하며 배열되는 한 쌍의 채널을 포함하며,
   상기 한 쌍의 제2 채널 각각은 상기 제1 채널과 접합하기 전에 제1 채널과 평행한 방향으로 전환 연장되고 이의 단부가 만곡되어 돔 형상을 형성하면서 제1 채널을 둘러싸고, 그리고
   상기 돔 형상의 정상부는 부분적으로 개방되어 오리피스를 경유하여 제3 채널과 연통되는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
4. 제2항에 있어서, 상기 제1 채널과 상기 한 쌍의 채널을 포함하는 제2 채널은 T자 형태를 형성하는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1 채널은 수계 유체의 주입구 또는 이에 근접한 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
6. 제5항에 있어서, 상기 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역은 수계 유체 내 세포에 보다 큰 힘을 가할 수 있는 형상의 구조물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
7. 제6항에 있어서, 상기 구조물은 반원 형상의 구조가 일정 간격을 유지하며 반복하여 연결된 구조물인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
8. 제5항에 있어서, 상기 제1 채널 중 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역 이후에는 직선 패턴의 채널 영역이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
9. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 채널의 폭 및 제2 채널의 폭은 각각 30 내지 700 ㎛ 및 30 내지 700 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
10. 제3항에 있어서, 상기 제1 채널의 단부와 오리피스 간의 거리는 10 내지 500 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
11. 제2항에 있어서, 상기 오리피스의 직경은 20 내지 500 ㎛ 범위이고, 상기 오리피스 내 유체의 흐름 길이(두께)는 50 내지 700 ㎛인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
12. 제1항에 있어서, 상기 제3 채널의 폭은 100 내지 700 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 장치.
13. 제1 채널을 통하여 (i) 타겟 세포 및 (ii) 폴리머라아제, dNTP, 프라이머 및 표지 물질을 함유하는 PCR 혼합물을 포함하는 수계 유체를 도입하는 단계;
    상기 제1 채널과 접합 영역을 형성하되 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널을 통하여 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 미세액적을 형성하는 단계로서 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 미세액적은 단일 또는 복수의 타겟 세포 및 PCR 혼합물을 함유함;
    상기 접합 영역과 연통된 제3 채널을 통하여 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 미세액적을 배출하는 단계;
    상기 수계 미세액적 내 타겟 세포에 대한 PCR을 수행하는 단계로서 상기 수계 미세액적 내에서 상기 타겟 세포의 용해 및 증폭 반응이 일어남; 및
    상기 PCR 생성물을 함유하는 미세액적으로부터 표지 물질에 기인하는 신호(signal)를 검출하는 단계;
    를 포함하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 캐리어 유체는, 서로 대향하며 배열되는 한 쌍의 제2 채널을 통하여 도입되며, 상기 제1 채널로부터 도입된 수계 유체와 접합되기 전에 제1 채널과 평행한 방향으로 전환 연장되며 이의 단부가 만곡되어 돔 형상을 형성하면서 제1 채널을 둘러싸는 제2 채널 각각을 통하여 이송되어 상기 접합 영역 내에서 수계 유체와 접합되고, 그리고
    상기 접합 영역 내에서 제1 채널로부터 배출되어 형성된 수계 분산 상은 부분적으로 개방된 돔 형상의 정상부로부터 오리피스를 통과하면서 캐리어 유체 내에 수계 미세액적을 형성하여 제3 채널을 통하여 배출되는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 제1 채널은 제2 채널과 접합 영역을 형성하기 전의 일부 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 유로를 구비하며, 상기 수계 유체가 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역을 통과한 후에는 직선 패턴의 채널 공간을 통과하는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 나선형 또는 나팔관 패턴의 영역은 상기 수계 유체 내 세포에 보다 큰 힘을 가할 수 있는 형상의 구조물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
17. 제13항에 있어서, 상기 수계 유체 및 상기 캐리어 유체 각각의 주입 속도는 0.5 내지 50 μl/min 및 0.5 내지 50 μl/min 범위이며,
    수계 유체 : 캐리어 유체의 유속 비는 1 : 1 내지 1: 10 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
18. 제13항에 있아서, 상기 미세액적의 사이즈는 50 내지 300 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
19. 제13항에 있어서, 상기 캐리어 유체는 포도씨유, 올리브유, 콩기름 및 캐놀라유로부터 선택되는 식물유 및 실리콘 오일, 광물유 및 불화탄소유로부터 선택되는 공업용 오일로 이루어진 군으로부터 1 또는 2 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
20. 제13항에 있어서, 상기 미세액적 내에 포획된 타겟 세포의 개수는 1 내지 5 범위인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 미세액적 내에 단일 타겟 세포가 포획되어 있는 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
22. 제13항에 있어서, 상기 PCR은 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, 또는 RT(reverse transcription)-PCR인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
23. 제13항에 있어서, 상기 표지 물질은 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite), 알 렉사플로어계 (alexa fluor), Cy3, Cy5, Cy7 및 인도시아닌그린으로 이루어지는 군으로부터 1 또는 2 이상 선택되는 형광 물질인 것을 특징으로 하는 미세액적 기반 바이오물질의 분석 방법.
24. 수계 유체를 도입하기 위한 제1 채널;
    상기 제1 채널과 접합 영역(junction)을 형성하되 상기 수계 유체와 비혼화성을 갖는 캐리어 유체를 도입하여 연속 상인 캐리어 유체 내에 수계 유체의 미세액적을 형성하도록 서로 교차된 형태로 배열된 복수의 제2 채널; 및
    상기 접합 영역과 연통되어 상기 캐리어 유체 내에 형성된 수계 유체의 미세액적을 이송하기 위한 제3 채널;
    을 포함하며
    상기 제1 채널은 제2 채널과 접합 영역을 형성하기 전의 일부 영역에 나선형 또는 나팔관 패턴의 유로를 구비하는 것을 특징으로 하는 미세액적 형성용 디바이스.

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