KR20210054698A - 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 내 물질 전달 방법으로, 전달하고자 하는 물질과 세포로 이루어진 액적을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 액적에 변형을 가함으로써 상기전달하고자 하는 물질을 상기 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징을 하는 세포 내 물질 전달 방법이 제공된다.

Description

액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼{A method and platform for intracellular delivery using droplet microfluidics}

본 발명은 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼에 관한 것으로, 보다 상세하게는 액적(droplet)을 이용하여 다양한 물질을 균일하고 고효율로, 그리고 극소량의 전달물질만을 사용하여 다양한 세포 속으로 전달할 수 있는 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼에 관한 것이다.

세포 내 물질 전달은 세포공학의 가장 기본이 되는 실험 중 하나로 보통 캐리어를 이용하거나 세포막/핵막에 나노구멍(nanopore)을 만들어 물질을 전달한다.

바이러스 또는 Lipofectamine 중심의 캐리어 기법들은 최적화 시 고효율 물질 전달이 가능하나 안전성, 느린 전달 속도, 노동/비용 집약적인 캐리어 준비 과정, 낮은 재현성 등의 문제점들이 존재한다.

이에 반하여 세포막에 에너지를 가하여 나노구멍을 만드는 방법들(예: Electroporation 또는 microneedle)은 상대적으로 여러 물질을 다양한 세포주로 전달이 가능한 장점이 있다.

그러나 방법의 침습성으로 인한 낮은 세포 생존율, 전달 물질의 변성 그리고 낮은 처리량은 큰 한계로 지적되고 있다.

이러한 문제점들을 해결하고자 대량의 세포처리가 가능한 미세유체기기들의 사용이 두드러진다. 대표적으로 미세관에 병목 구간을 만들고 세포들이 병목 구간을 지날 때 세포의 물리적 변형을 통해 세포막에 나노구멍을 만드는 플랫폼이 존재한다.

그러나, 이 접근법은 실험 진행 시 병목 구간 자체가 막히고, 일정하지 못한 물질 전달 효율 등의 큰 단점들을 가진다.

따라서 상기 미체유체 기기의 높은 처리 기능을 살리면서 주요 세포 내에 다양한 물질을 균일하게 고효율로 전달할 수 있는 혁신적인 “차세대 세포 내 물질 전달 플랫폼” 개발이 시급하다.

US 2014/0287509 A1 (2014.09.25.)

본 발명은 전술한 바와 같은 종래의 여러 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 세포 내 물질 전달의 효율을 높이면서도 동시에 전달하여야 하는 물질의 사용량을 최소화하는 새로운 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 방법 및 플랫폼 을 제공하고자 한다.

본 발명은 세포 내 물질 전달 방법으로, 전달하고자 하는 물질과 세포로 이루어진 액적을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 액적에 변형을 가함으로써 상기전달하고자 하는 물질을 상기 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 액적은 상기 세포 및 물질을 포함하는 제 1 상의 유체를, 상기 제 1 상의 유체와 비혼성의 제 2 상 유체에 흘림으로써 형성될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 액적에 변형을 가하는 방법은, 직경이 유동하는 채널의 직격 크기를 좁힘으로써 상기 액적에 변형을 가할 수 있다.

다른 양태로서, 상기 액적에 변형을 가하는 방법은, 상기 액젝이 흐르는 유체에 와류를 형성시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은 세포 내 물질 전달 플랫폼으로, 전달하고자 하는 물질과 세포를 포함하는 액적을 유동시키는 채널; 및 상기 채널에 유동하는 액적에 물리적 변형을 가하여 상기 전달하고자 하는 물질을 상기 세포 내로 전달하는 변형수단을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 변형수단은 상기 채널보다 좁은 직경의 미세채널인 것을 특징으로 하며, 상기 변형 수단은 폭이 좁아지는 형태의 미세채널일 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 액적 형성 방법과 병목 채널을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 'T'자형의 세포 전달 플랫폼을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 '+'자형의 세포 전달 플랫폼을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명에 따른 관성을 기반으로 한 세포 내 전달 미세 유체 플랫폼의 바람직한 실시예를 첨부한 도면들에 의거하여 상세히 설명한다. 참고로, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어와 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석해야만 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 셀과 전달하고자 하는 물질에서 매우 좁은 채널(병목 채널)로 압박하는 셀 스퀴징(cell-squeezing) 방법과는 다르게 액적을 이용하며, 액적에 변형을 가함으로써 액적 내의 세포에 미세구멍을 발생시켜 물질을 전달한다.

본 발명에서 액적은 세포 및 전달물질을 포함하는 유체(제 1상)과 서로 섞이지 않는 전달유체(제 2상)을 T자 형 같인 채널에 흘림으로써 형성시키며, 이 경우, 미세한 액적 내에 전달물질과 세포가 포획되어 전달물질의 사용량을 최소화시키면서 전달효율을 극대화시킬 수 있다.

본 발명에서 액적을 사용하는 이유로는 첫째, 매우 적은 액상의 액적 부피(~100 pL/세포)를 이용할 수 있는데, 본 발명의 일 실시예에서는 유상의 부피를 제외한 액적 부피에 대한 전달물질의 양이 결정되므로 극소량의 전달물질만을 이용할 수 있다는 장점이 있다.

또한 매우 적은 액적 부피로 인하여, 포획된 세포는 고농도 전달물질 환경에 놓여지게 되고, 병목이나 미세채널 등과 같이 액적에 변형을 가하는 구간을 지날 때 액적 내 발생된 이차유동으로 인하여 고농도의 전달물질이 세포내로 효과적으로 전달되고 이는 높은 전달 효율로 이루어질 수 있게 된다. 이는 종래 기술에서는 가능하지 않았던 대분자(macromolecule)(예: larger nanoparticle, plasmid DNA)의 전달을 가능하게 한다.

더 나아가, 종래 기술인 셀-스퀴징(cell-squeezing)은 병목에서의 큰 관 막힘 현상이 보이고 이를 해결하기 위해 높은 유속을 이용함. 이 경우 낮은 세포 생존율로 이어지고 높은 유속에 따른 적정량 이상의 전달 물질 사용으로 귀결된다. 그러나 액적을 이용할 경우, 미세관을 막히게 하는 여러 잔해들을 액적 속에 포획시킴으로 미세관 막힘 현상을 최소화할 수 있고 액적과 미세관 벽의 친수성/소수성 차이로 역시 막힘 현상을 최소화할 수 있다.

이하 본 발명의 일 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 추후 암 면역치료의 가능성의 이용을 위해 K562 세포주(cell line)를 대상으로 실험을 진행하였다. 전달물질은 큰 단백질을 모사한 2,000 kDa FITC-dextran을 이용하였으며, 미세 유체칩은 일반적인 포토리소그래피와 소프트리소그래피 방법을 이용해 만들었다.

본 발명의 일 실시예에 따른 액적 기반 미세유체 세포내 물질전달 플랫폼은 3가지 단계를 통하여 세포내 물질을 전달하는데, 이는 1) 액적 형성(세포 포획) 단계 2) 액적 변형 인가(세포 내 물질 전달) 3) 세포 회복이다. 이 중 핵심은 1)과 2)의 액적 형성과 액적 변형이며, 본 발명의 핵심은 이에 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 액적 형성 방법과 병목 채널을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.

도 1a를 참조하면, 세포 및 전달물질을 포함하는 제 1상의 유체와 상기 제 1상과 비혼성인 제 2 상의 또 다른 유체를 하나의 채널 지점에 흘림으로써 세포와 전달물질의 제 1 유체를 제 2 유체 내에서 액적화한다. 이것은 통상 흐름 집중(flow-focusing) 방식이며, 그 외에도 다양한 방식의 액적형성 방법이 사용될 수 있으며, 본 발명의 범위는 이에 속한다.

도 1b를 참조하면, 만들어진 액적 속에 전달 물질과 세포가 균일하게 잘 포획됨을 볼 수 있다

도 1c는 유동하는 채널보다 좁은 미세채널의 통과함으로써 액적 변형 발생을 설명하는 사진이다.

도 1c를 참조하면, 세포가 유동하는 채널보다 급격히 좁은 직경의 미세 채널을 통과함에 따라 액적 변형이 발생한 후 다시 반대쪽으로 흐르는 것을 알 수 있다. 이때 세포가 병목구간이나 도 1b에서 도시된 좁아지는 직경의 채널을 지날 때 세포 변형에 따라 세포막에 나노포어들이 생성되고 액적 내 강한 이차유동과 세포막 내외의 유체교환(solution exchange)을 통해 세포속으로 타겟 물질이 들어가게 된다.

이후 도 1d를 참조하면, 세포막에 생성된 나노포어들은 약 1분 내로 모두 닫히게 되며 이를 통해 전체 세포내 물질전달 과정이 완성된다. 이 후, 액적 ㅍ파파괴 과정을 통해 세포들이 회수되며, 유세포분석기를 이용하여 정량적으로 전달 효율을 측정하였다.

도 1e 내지 1g는 각각 유세포분석기를 이용한 정량분석 결과, 전달효율 및 세포생존율의 비교 실험 결과이다.

도 1e 내지 1g를 참조하면, 극소량의 2,000 kDa FITC-dextran만을 사용하면서도, 분당 수만개를 처리하여 성공적으로 최대 95%의 전달 효율로 세포내 물질 전달이 가능함을 보였다. 추후 연구로 줄기세포나 면역세포를 이용하고, 미세관 내의 병목 간격 크기, 유속, 더불어 병목 구간의 길이 및 개수 등의 조정과 최적화를 통해 대량으로 동시에 고효율의 물질전달을 구현할 수 있다.

본 발명의 플랫폼을 이용하여 세포가 좁은 틈(gap)을 지날 때, 생성된 나노 구멍들을 통해 다양한 물질을 전달할 수 있다. 이때 다양한 물질이라고 함은 유전자 가위 물질, 플라스미드, 나노입자, 단백질, 핵산 등에 한정하지 않으며, 세포와 관련된 생물학에서 세포 속에 넣을 수 있는 모든 나노바이오물질을 포함한다. 따라서 본 발명의 미세유체기기는 바이러스와 같은 벡터의 사용하지 않음에도 불구하고 대량으로(분당 수만 개 이상) 세포 속으로 전달하는 것을 의미한다.

상술한 실시예에서 상기 액적 변형 수단은 채널 구조(미세 채널, 병목 채널, 좁아지는 직경 채널)이었으나, 그 외에도 상기 액적 변형 수단은 와류(vortex)와 같은 관성 효과일 수도 있다.

즉, 이 경우 채널벽 또는 유체벽에 충돌한 액적은 관성유도효과에 따라 변형을 일으키게 되며, 이후 와류 붕괴에서도 다시 액적 변형이 일어나게 된다. 이를 통하여 액적 내 물질이 세포 내로 전달된다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 'T'자형의 세포 전달 플랫폼을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.

도 2를 참조하면, 세포 전달 플랫폼은 액적을 포함하는 유체가 이동하는 경로를 형성하는 제 1 채널(100); 상기 제 1 채널(100)의 단부에 상기 제 1 채널(100)의 양 측면으로 수직 연장된 제 2 채널(200); 및 상기 제 1 채널(100)에 구비되어 상기 제 1 채널(100)에서의 유체 속도를 제어하는 세포가속수단(300)을 포함한다.

본 발명은 상기 세포가속수단(300)을 통하여 상기 제 1 채널(100)을 지나는 유체의 유속 및 관성을 제어하여 격벽 충돌 및 와류 형성을 유도하여 고효율의 세포 전달을 유도할 수 있다.

보다 구체적으로, 액적 주입- 액적 정렬- 충돌- 세포 변형- 물질 전달을 관성과 관성 유동현상만을 이용하여 유도하며, 이로써 별도의 능동 세포 전달 수단을 사용하지 않고서도, 나노구멍들을 통해 다양한 물질(예:유전자 가위 물질, 플라스미드 등)을 바이러스와 같은 벡터의 사용하지 않음에도 불구하고 대량으로(분당 수백만 개 이상) 세포 속으로 전달할 수 있다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 '+'자형의 세포 전달 플랫폼을 이용하여 액적 변화 과정을 나타내는 도면이다.

도 3을 참조하면, '+'자형의 세포 전달 플랫폼은 액적을 포함하는 유체가 유동하는 제 1 채널(100); 상기 제 1 채널(100)과 수직 교차하는 제 2 채널(200); 및 상기 제 1 채널(100)에 일측에 구비되어 상기 제 1 채널(100)에서의 유체 속도를 제 1 방향으로 제어하는 제1세포가속수단(300)을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제 1 채널(100)에서의 유체는 상기 제 2 채널(200)과 수직 교차하는 지점으로 대향하여 유동하며, 상기 제 1 세포가속수단(300)은 상기 재 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 수직 교차하는 지점에 형성된 와류에 의하여 상기 세포에 나노구멍이 형성되는 수준의 세포벽 변형을 가하는 운동에너지를 상기 제 1 채널(100) 상의 세포에 인가하는 것을 특징으로 한다.

이에 더하여, 상기 제 1 채널(100)의 타측에는 제 1 채널(100) 에서의 유체 속도를 제 2 방향으로 제어하는 제 2 세포가속수단(300') 을 더 포함할 수 있다.

특히, 제 1 채널(100) 에서 서로 반대방향에서 제어되는 제 1, 2 세포가속수단(300, 300') 제 1 채널(100)과 제 2 채널(200)이 서로 수직 교차하는 지점에서 와류가 형성될 수 있고, 이에 따라 발생되는 관성력과 관성 유동 현상에 의해서 세포에 물리적인 변형이 가해져 세포막이 변형될 수 있다.

'+'자형의 세포 전달 플랫폼은 상술한 'T'자 형과 마찬가지로, 액적 주입- 액적 정렬- 충돌- 세포 변형- 물질 전달을 관성과 관성 유동현상만을 이용하여 유도하며, 이로써 별도의 능동 세포 전달 수단을 사용하지 않고서도, 나노구멍들을 통해 다양한 물질(예:유전자 가위 물질, 플라스미드 등)을 바이러스와 같은 벡터의 사용하지 않음에도 불구하고 대량으로(분당 수백만 개 이상) 세포 속으로 전달한다.

상술한 바와 같이, 채널벽 또는 유체벽에 충돌한 액적은 관성유도효과에 따라 변형을 일으키게 되며, 이후 와류 붕괴에서도 다시 액적 변형이 일어나게 된다. 이를 통하여 액적 내 물질이 세포 내로 전달될 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면들에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형, 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

Claims (7)

1. 세포 내 물질 전달 방법으로,
   전달하고자 하는 물질과 세포로 이루어진 액적을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 액적에 변형을 가함으로써 상기전달하고자 하는 물질을 상기 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징을 하는 세포 내 물질 전달 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 액적은 상기 세포 및 물질을 포함하는 제 1 상의 유체를, 상기 제 1 상의 유체와 비혼성의 제 2 상 유체에 흘림으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 액적에 변형을 가하는 방법은, 직경이 유동하는 채널의 직격 크기를 좁힘으로써 상기 액적에 변형을 가하는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 액적에 변형을 가하는 방법은, 상기 액젝이 흐르는 유체에 와류를 형성시키는 방식으로 상기 액적에 변형을 가하는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 방법.
5. 세포 내 물질 전달 플랫폼으로,
   전달하고자 하는 물질과 세포를 포함하는 액적을 유동시키는 채널; 및
   상기 채널에 유동하는 액적에 물리적 변형을 가하여 상기 전달하고자 하는 물질을 상기 세포 내로 전달하는 변형수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
6. 제 5항에 있어서,
   상가 변형수단은 상기 채널보다 좁은 직경의 미세채널인 것을 특징으로 하는 는 세포 내 물질 전달 플랫폼.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 변형 수단은 폭이 좁아지는 형태의 미세채널인 것을 특징으로 하는 세포 내 물질 전달 플랫폼.

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