CN114867556B - 将材料输送到细胞内的基于液滴变形方法和用于其的芯片 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将材料输送到细胞内的方法，其包括以下步骤：形成由待输送材料和细胞构成的液滴以及使形成的液滴经受变形从而将待输送材料输送到细胞内的步骤。

Description

将材料输送到细胞内的基于液滴变形方法和用于其的芯片
技术领域
本公开涉及用于将材料递送到细胞内的基于液滴变形的方法和用于其的芯片，并且更具体地，涉及通过使用包含含有细胞的亲水溶液的微滴实现材料的细胞内递送的改善效率、经济可行性等的用于将材料递送到细胞内的基于液滴变形的方法和用于其的芯片。
背景技术
材料的细胞内递送是细胞工程中最基本实验之一。通常使用载体或通过在细胞膜/核膜中限定纳米孔来递送材料。在以病毒或脂质体为中心的载体技术中，当技术被优化时，高效的材料递送是可能的，但是存在诸如安全性、递送速度慢、载体制备过程人工/成本密集、低重现性等问题。
另一方面，通过向细胞膜施加能量来限定纳米孔的方法(例如，电穿孔或微针)相对有利，因为各种材料能够被递送到各种细胞系。然而，由方法的侵入性导致的低细胞存活率、递送材料的变性和低吞吐量被指出为主要限制。为了解决这些问题，显著使用了能够处理大量细胞的微流体装置。通常，存在一种平台，该平台可在微管中创建窄收缩或瓶颈并且通过在细胞经过瓶颈时发生的细胞的物理变形在细胞膜中限定纳米孔。然而，这种方式具有诸如在实验期间瓶颈本身的堵塞、材料递送效率不一致等的主要缺点。
例如，第2014-0287509号美国专利(在下文中，称为现有技术)公开了用于允许细胞直接流过具有瓶颈结构的通道向细胞施加压力来诱发细胞变形的技术。然而，在这种情况下，存在细胞阻塞瓶颈结构的问题。此外，细胞直接与通道壁接触以经受由摩擦等导致的应力，从而降低了细胞存活率并且发生通道堵塞。此外，存在由于不均匀的速度导致的不均匀细胞变形而使得材料递送不均匀，并且由于仅通过扩散现象发生递送，因此材料递送效率在根本上低的问题。因此，迫切需要开发用于材料的细胞内递送的创新的下一代平台，该平台可在保持微流体装置的极大处理功能的同时将各种材料均匀且高效地递送到细胞内。
发明内容
技术目的
因此，本公开的目的在于提供通过使用微滴的材料递送方案极大地改善递送效率和系统稳定性的方法和系统。
技术方案
本公开的一个方面提供了用于将材料递送到细胞内的方法，其包括生成由待递送的材料和细胞组成的液滴和使生成的液滴变形以将待递送的材料递送到细胞内。
在一个实现方式中，通过允许包含细胞和材料的第一相的流体流动到与第一相的流体不混溶的第二相的流体来生成液滴。
在一个实现方式中，液滴的变形包括减小通道的直径。
在一个实现方式中，液滴的变形包括在液滴流动的流体中生成涡流。
本公开的另一方面提供了用于将材料递送到细胞内的平台，平台包括用于允许包含待递送的材料和细胞的液滴经过其流动的通道，和用于使流过通道的液滴物理变形以将待递送的材料递送到细胞内的变形装置。
在一个实现方式中，变形装置是具有减小的直径的微通道或由于流体的碰撞而能够发生涡流的接合部。
本公开的另一方面提供了用于将材料递送到细胞内的方法，方法包括在疏水溶液中生成包含细胞和待递送的材料的亲水溶液的液滴，允许包含生成的液滴的疏水溶液流过通道，通过允许疏水溶液流过通道以经过具有比该通道小的直径的另一通道使液滴初次变形，以及在液滴经过所述另一通道之后使通道中的液滴二次变形，其中，在液滴的初次变形和二次变形中，细胞不与通道的壁直接接触。
在一个实现方式中，在液滴的初次变形中，液滴被挤压，并且同时，在液滴中的细胞的细胞膜中限定有纳米孔。在一个实现方式中，在液滴的二次变形中，液滴恢复到液滴的初次变形之前的形状，并且同时，待递送的材料通过在液滴的初次变形中限定的细胞膜的孔递送到细胞内。
在一个实现方式中，在液滴的二次变形中，液滴中发生扩散和对流，使得液滴中的待递送的材料在细胞内的递送效率增加。在一个实现方式中，液滴经过所述另一通道至少一次。
在一个实现方式中，在疏水溶液中生成包含细胞和待递送的材料的亲水溶液的液滴包括通过允许在第二方向上的疏水溶液流动到在第一方向上流动的亲水溶液以使亲水溶液和疏水溶液彼此接触来生成液滴。在一个实现方式中，方法还包括通过允许另一疏水溶液流动到其中具有生成的液滴的疏水溶液，使其中具有生成的液滴的疏水溶液加速。
在一个实现方式中，待递送的材料是选自由核酸、蛋白质、转录因子、介体、质粒、遗传剪材料和纳米颗粒构成的集群中的至少一种。
本公开的又一方面提供了用于实现上述用于将材料递送到细胞内的方法的微流体芯片。
在一个实现方式中，微流体芯片包括用于实现上述用于将材料递送到细胞内的方法的多个通道。在一种实现方式中，通道彼此平行地限定。
技术效果
本公开使用包括包含有细胞的亲水溶液的微滴实现材料的细胞内递送。在这种情况下，通过使微滴中的细胞以恒定速度通过具有减小的直径的瓶颈或涡流发生点而使液滴中的细胞变形，能够进行细胞内的均匀并且高效的材料递送。此外，能够在根本上防止细胞表面与微管壁面直接接触，从而在根本上避免现有技术的通道堵塞现象，并且减少由细胞与通道壁之间的摩擦而导致的应力。此外，与其中仅通过扩散递送材料的传统方案相比，在本公开中，由于外部材料可通过微滴中的在细胞恢复到其原始形状时发生的二次流、以及具有介于其间的细胞膜的流体通过扩散和对流的交换来递送，因此可确保高递送效率。此外，通过将递送到细胞内的材料制成微滴，可确保经济可行性，并且被递送材料的量也可通过液滴体积进行控制。
因此，根据本公开的用于将材料递送到细胞内的方法和系统可应用于与细胞工程相关的所有研究领域和行业，从而以具有高效率和高生产量的低廉且简单的方案实现细胞内的材料递送。
附图说明
图1是示出根据本公开的实施方式的使用具有接合部的细胞递送平台的液滴改变过程的图。
图2是示出根据本公开的实施方式的使用具有“+”形接合部的细胞递送平台的液滴改变过程的图。
图3是根据本公开的实施方式的用于将材料递送到细胞内的方法的流程图。
图4至图7是根据本公开的实施方式的用于将材料递送到细胞内的方法和系统的示意图。
图8是根据图4至图7的用于将材料递送到细胞内的方法和每个步骤的通道照片的示意图。
图9示出了对于现有技术和本公开的实验情况在经过相同时间之后拍摄的照片。
图10示出了现有技术和本公开的微管堵塞实验的结果。
图11的左侧和右侧是对本公开和现有技术的细胞内的材料递送的效率彼此进行比较的结果。
图12是根据本公开的实施方式的其中初次变形和二次变形连续重复的通道的照片。
图13示出了微滴中的细胞封装、瓶颈区段中的变形和FITC葡聚糖递送的结果。
图14是对于每个尺寸的葡聚糖的FITC荧光信号测量结果，并且图15是基于细胞系类型对存活率和递送效率进行比较的结果。
图16是基于瓶颈通道的结构和数量以及流速对递送效率进行比较的实验结果。
图17是对于K562细胞的mRNA递送和由此导致的GFP表达的实验结果。
图18是本公开(DS)、作为领域中最常使用的电穿孔(氖转染系统，EP)和脂质体(LP)的mRNA递送效率比较实验的结果。
具体实施方式
下文中，将参照附图和实施方式对根据本公开的用于将材料递送到细胞内的方法及用于其的芯片进行描述。除非另有限定，否则本说明书中的所有术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员理解的含义相同的一般含义。在术语的一般含义与本文中所使用的术语的含义冲突的情况下，术语的含义以本文中所使用的定义为基础。此外，将省略可能使本公开的主题不必要地混淆的已知功能和部件的详细描述。在整个说明书中，除非另有说明，否则当部件“包括”某个部件时，其意味着还可包括有其它元件，而非排除其它元件。
本公开使用液滴来封装细胞和待递送材料，并且使用涡流或具有减小的直径的通道结构来诱发生成的液滴的物理变形，以在液滴中的细胞中生成微孔，从而递送材料。
在本公开的一个实施方式中，通过在通道中混合包含细胞和待递送材料的流体(第一相)和彼此不混溶的递送流体(第二相)来生成液滴。在这种情况下，待递送材料和细胞被封装在微滴中，从而在最小化待递送材料的使用量的同时使递送效率最大化。
本公开中使用液滴的第一原因在于，可使用非常小体积(～100pL/细胞)的液滴。在本公开的一个实施方式中，待递送材料的量根据排除疏水油相体积的亲水液滴的体积来确定，从而存在可使用仅非常少量的待递送材料的优点。
此外，由于非常小的液滴体积，因此封装的细胞被放置在高浓度的待递送材料环境中。当液滴经过诸如瓶颈或涡流的使液滴变形的区段时，由于液滴中发生二次流动，因此高浓度的待递送材料被有效地递送到细胞内，从而实现高递送效率。这使得大分子(例如，较大的纳米颗粒和质粒DNA)能够在细胞内递送，这在现有技术中是不可能的。
此外，作为现有技术的其中细胞本身流入瓶颈区段内的细胞挤压，具有由于瓶颈中的大管堵塞现象和通道中的轻量细胞的不同速度而难以实现均匀递送的问题。然而，本公开可使用液滴封装堵塞液滴中的微管的各种碎屑，来最小化通道堵塞现象。此外，堵塞现象也可由于液滴与微管壁之间的亲水性/疏水性的差异而最小化，并且由于液滴的重量/体积而导致的恒定速度，可实现均匀递送。
在下文中，将通过本公开的一个实施方式更详细地描述本公开。然而，本公开的范围不限于此。
在本公开的一个实施方式中，对K562细胞系进行实验，以备将来可能用于癌症免疫治疗。使用模拟大蛋白的2000kDa的FITC葡聚糖作为待递送材料，并且使用普通光刻和软光刻方法来制作微流体芯片。
根据本公开的一个实施方式的用于将材料递送到细胞内的基于液滴的平台通过三个步骤将材料递送到细胞内：1)液滴生成(细胞封装)、2)液滴变形(材料的细胞内递送)和3)细胞恢复。
在本公开中，液滴的变形是物理方案，其可为使用涡流或通道直径的方案。
图1是示出根据本公开的实施方式的使用具有接合部的细胞递送平台的液滴改变过程的图。在本公开中，“接合部”意味着当不同方向上的流体彼此碰撞时可能生成涡流的、流体通道的汇合点。接合部的形状可为T形、+形、Y形或其组合，并且本公开的范围不限于特定形状。
参照图1，根据本公开的一个实施方式的细胞递送平台包括通过流体之间的碰撞或流体与通道壁之间的碰撞生成涡流处的接合部。
在图1中，包括有用于限定供包含液滴的流体流过的路径的第一通道100、位于第一通道100的端部处并且从第一通道100的两个侧面垂直延伸的第二通道200和布置在第一通道100中以控制第一通道100中的流体速度的细胞加速装置300。也就是说，在图1中，“T”形状中的交叉点成为接合部，并且当流体和通道壁在接合部处彼此碰撞时生成涡流。
在本公开的一个实施方式中，经过第一通道100的流体的流速和惯性经由细胞加速装置300控制，以在接合部处和附近诱发涡流生成和涡流断裂，从而高效地诱发细胞递送。
更具体地，本公开可仅使用惯性和惯性流来诱发液滴注入-液滴对准-碰撞-细胞变形-材料递送，从而在无需使用单独的主动细胞递送装置和诸如病毒的介体的情况下，通过细胞膜中限定的纳米孔将各种材料(例如，遗传剪材料、质粒等)大量地(等于或超过每分钟百万)递送到细胞内。
图2是示出根据本公开的实施方式的使用具有“+”形接合部的细胞递送平台的液滴改变过程的图。
参照图2，具有“+”形接合部的细胞递送平台包括供包含液滴的流体流动经过的第一通道100、与第一通道100垂直相交的第二通道200和布置在第一通道100的一侧上以在第一方向上控制第一通道100中的流体速度的第一细胞加速装置300。
根据本公开的一个实施方式，第一通道100中的流体朝向第一通道100与第二通道200垂直相交的点流动，并且第一细胞加速装置300向第一通道100上的细胞施加能够通过在第一通道100和第二通道200彼此垂直相交的接合部处生成的涡流使细胞膜以在细胞的细胞膜中限定有纳米孔的水平变形的动能。
此外，在第一通道100的另一侧上还可包括有用于在第二方向上控制第一通道100中的流体速度的第二细胞加速装置300'。
特别地，通过第一细胞加速装置300和第二细胞加速装置300'控制第一通道100中在相反方向上的流体速度，在第一通道100和第二通道200彼此垂直相交的点处生成涡流。由于惯性力和由此导致的惯性流，细胞可能物理变形以使细胞膜变形。
与上述“T”形细胞递送平台类似，“+”形细胞递送平台可仅使用惯性和惯性流来诱发液滴注入-液滴对准-碰撞-细胞变形-材料递送，从而在无需使用单独的主动细胞递送装置的情况下，通过纳米孔将各种材料(例如，遗传剪材料、质粒等)大量地(等于或超过每分钟百万)递送到细胞内。此外，由于涡流生成之后发生的涡流断裂，因此液滴中的细胞二次变形，从而将待递送到液滴中的材料递送到细胞内。
在本公开的另一实施方式中，与传统挤压方案不同，首先在诸如油的疏水溶液中生成包含细胞和待递送材料的亲水溶液的液滴，并且然后，液滴经过直径减小的通道区段(压缩孔或瓶颈区段)以将材料递送到细胞内。因此，外部材料可通过在恢复至细胞的原始形状期间微滴中的二次流的扩散和对流以及具有介于其间的细胞膜的流体之间的交换进行递送。
图3是根据本公开的实施方式的用于将材料递送到细胞内的方法的流程图。
参照图3，根据本公开的实施方式的用于将材料递送到细胞内的方法包括：在疏水溶液中生成包含细胞和待递送材料的亲水溶液的液滴；允许包含生成的液滴的疏水溶液流过通道；通过允许疏水溶液流过通道以经过具有比该通道小的直径的另一通道，使液滴初次变形；以及在液滴经过所述另一通道之后，使通道中的液滴二次变形。在液滴的初次变形和二次变形中，细胞不与通道壁直接接触。
因此，通过在根本上防止细胞表面与通道(微管)壁面直接接触，本公开可在根本上避免现有技术的通道堵塞现象，并且可减少由细胞壁摩擦等导致的应力。
图4至图7是根据本公开的实施方式的用于将材料递送到细胞内的方法和系统的示意图。
参照图4，在根据本公开的用于将材料递送到细胞内的方法中，包含作为待递送到细胞内的材料的待递送材料20和细胞10的亲水溶液(例如，水溶液)100在第一方向上在通道300中流动。
参照图5，此后，诸如油的疏水溶液200以高速在第二方向上流动到亲水溶液100。因此，当亲水溶液100与疏水溶液200碰撞并且混合时，亲水溶液(包含细胞和待递送材料)的液滴D在疏水溶液200中生成并且在通道100中流动(流聚焦方案)。
在这种情况下，与允许待递送材料流动到整个流体的现有技术不同，本公开不需要响应于流速的增加而使用额外的待递送材料，从而显著减少待递送的外部材料的使用量。
必要时，通过注入疏水溶液并且允许疏水溶液以比初始速度v1高的速度v2再次流动到包含亲水液滴的疏水溶液，可加速液滴D以具有足够的流速。
参照图6，液滴D以恒定速度从通道100经过具有比通道100的直径小的直径的另一通道区段(瓶颈区段)110，从而使液滴D初次变形。
在初次变形步骤中，液滴被挤压。此时，在液滴中细胞的细胞膜中限定有纳米孔，从而将待递送材料递送到细胞内。
与将细胞与变窄瓶颈通道壁直接接触的现有技术相比，本公开允许封装细胞和待递送材料的液滴在疏水溶液中流动，以防止细胞与通道壁直接接触，从而防止变窄瓶颈通道中的堵塞，并且减少因细胞与通道壁之间的接触而导致的应力。
此外，在现有技术中，细胞在微通道内以不同速度接近并且经过瓶颈区段，使得细胞膜打开，因此外部材料递送不均匀。然而，在本公开中，细胞被封装在液滴中并且在微管的中心处流动，因此细胞以等于液滴速度的恒定速度流动和变形。因此，本公开具有均匀的递送效率。
参照图7，已经经过具有减小的通道直径的所述另一通道110的液滴再次流动到通道100中。此时，液滴D和细胞10中发生二次变形，因此细胞恢复到其原始尺寸。在本文中，“原始尺寸”是指在至少瓶颈区段未物理变形的状态下的细胞的尺寸。
基于二次变形，外部材料通过微滴中的二次流的扩散和对流以及具有介于其间的细胞膜的流体之间的交换来递送。因此，通过以液滴的形式集中的待递送材料与细胞之间的空间，极大地改善了递送效率，这将在下文更详细地描述。
在本公开的另一实施方式中，初次变形和二次变形中的每一个可至少执行两次。为此目的，在一个通道中可布置有多个其它通道(参见图13)。
图8是根据图4至图7的用于将材料递送到细胞内的方法和每个步骤的通道照片的示意图。
参照图8，通过允许细胞和待递送材料流过微流体芯片，可在无需使用诸如单独电穿孔的人工细胞侵入方式的情况下实现材料的细胞内优异递送。此外，当诸如油的疏水溶液在液滴生成之后以比初始注入速度v1高的速度v2注入时，液滴可加速以具有期望速度。根据本公开的用于将材料递送到细胞内的方法可在其中限定有微通道的芯片中实现。在这种情况下，存在不需要单独的微元件(例如，用于穿孔目的的微针或类似物)的优点。
实验例
流速比较
图9示出了对于现有技术和本公开的实验情况在经过相同时间之后拍摄的照片。
参照图9，可看出，由于现有技术中的流速不同，细胞位置不同。然而，可看出，本公开示出了恒定并且均匀的流速。
换句话说，在现有技术中，流速是不均匀的，因为细胞在通道中广泛地扩散流动。然而，根据本公开的液滴在通道的中心处生成，这意味着液滴以非常均匀的形状和速度流动。这意味着，在本公开以液滴的形式封装细胞的情况下，尽管有微流体行为，但是流速几乎没有改变。这因而导致细胞内的均匀材料递送。
微管堵塞比较
图10示出了现有技术和本公开的微管堵塞实验的结果。
参照图10，在其中细胞通过与通道壁直接接触而经过瓶颈通道的现有技术中，细胞膜与微管壁直接接触，导致通道堵塞。然而，在本公开中，细胞通过微滴的使用而不直接接触壁面，因此通道堵塞被最小化，这可从图8的结果中看出。
递送效率和存活率比较
图11的左侧和右侧是对本公开和现有技术的细胞内的材料递送的效率彼此进行比较的结果。
参照图11，与其中仅通过扩散发生细胞内的材料递送的现有技术相比，由于通过扩散和对流以及在微滴经过瓶颈之后发生的额外二次流的外部材料的递送，本公开示出了比现有技术的效率高的效率。
特别地，根据本公开的用于将材料递送到细胞内的方法对于相同的量具有良好的效率，并且在相同浓度下效率更好。这是因为在其中待递送材料和细胞被限制在窄液滴中的状态下，通过在窄液滴中发生两步变形时的扩散和对流而在细胞与待递送材料之间交换的可能性增加。
对于各种免疫细胞系的递送效率实验
图12是根据本公开的实施方式的其中初次变形和二次变形连续重复的通道的照片。
参照图12，通过在一个通道中连续构成具有减小的直径的瓶颈区段，能够增加细胞内的材料递送效率。
图13示出了微滴中的细胞封装、瓶颈区段中的变形和FITC葡聚糖递送的结果。
图14是对于每个尺寸的葡聚糖的FITC荧光信号测量结果，并且图15是基于细胞系类型对存活率和递送效率进行比较的结果。
参照图14和图15，可看出存活率等于或高于80％，并且递送效率达到99％。
基于通道结构和流速的递送效率的比较
图16是基于瓶颈通道的结构和数量以及流速对递送效率进行比较的实验结果。
参照图16，可看出当流速增加到等于或高于某一水平的水平时，细胞内的材料递送效率增加，但是由于细胞没有恢复到其原始形状，因此以后效率不再增加并且存活率也下降。此外，可看出瓶颈通道区段的直径越小，递送效率越高，但是存活率越低。此外，可看出随着瓶颈区段的数量增加，递送效率增加，但是存活率也下降。
K562细胞靶向实验
图17是对于K562细胞的mRNA递送和由此导致的GFP表达的实验结果。
参照图17，mRNA递送量越高，效率越高。因此，当使用本公开时，可看出对于K562细胞可有效地诱发mRNA递送和由此导致的GFP表达。
与传统递送方法的比较
图18是本公开(DS)、作为领域中最常使用的电穿孔(氖转染系统，EP)和脂质体(LP)的mRNA递送效率比较实验的结果。
参照图18，可看出与现有技术相比，本公开展示出显著更高的表达效率。
根据本公开的递送方法可通过微流体通道的结构来实现。实现这种微流体通道的芯片也落入本公开的范围内。为了获得更高的生产成品率，可在芯片中限定有多个上述通道，并且通道可串联或并联地限定。这些内容中的所有都落入本公开的范围内。

Claims (12)

1.一种用于将材料递送到细胞内的方法，所述方法包括：
生成由待递送的所述材料和所述细胞组成的液滴；
对生成的所述液滴实施物理变形，所述液滴被压缩而所述液滴内的所述细胞变形，以将待递送的所述材料递送到所述细胞内；以及
变形的所述细胞恢复，在所述液滴内形成二次流。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液滴通过允许包含所述细胞和所述材料的第一相的流体流动到与所述第一相的所述流体不混溶的第二相的流体来生成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液滴的所述变形包括：
减小通道的直径。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述液滴的所述变形包括：
在所述液滴流动的流体中生成涡流。
5.一种用于将材料递送到细胞内的平台，所述平台包括：
通道，所述通道用于允许包含第一相的待递送的所述材料和所述细胞的液滴或第二相的流体在所述通道中流动；以及
变形装置，所述变形装置用于对流过所述通道的所述液滴实施物理变形，所述液滴被压缩而所述液滴内的所述细胞变形，以将待递送的所述材料递送到所述细胞内，
变形的所述细胞恢复，在所述液滴内形成二次流。
6.根据权利要求5所述的平台，其中，所述变形装置是具有减小的直径的微通道。
7.根据权利要求5所述的平台，其中，所述变形装置是由于流体的碰撞而能够发生涡流的接合部。
8.根据权利要求7所述的平台，其中，
所述通道包括：
第一通道，包含所述液滴的流体流过所述第一通道；
第二通道，所述第二通道在所述第一通道的端部处与所述第一通道的两侧连接；以及
第二通道壁，所述第二通道壁形成为与所述第一通道相对，以与所述液滴碰撞，
所述液滴与所述第二通道壁碰撞而发生变形。
9.根据权利要求8所述的平台，其中，在所述第二通道壁上还包括突出槽，
所述液滴与所述突出槽碰撞而发生变形。
10.根据权利要求8所述的平台，其中，所述变形装置是T形。
11.根据权利要求7所述的平台，其中，所述通道包括：
第一通道，包含所述液滴的流体流过所述第一通道；
第二通道，所述第二通道在所述第一通道的端部处与所述第一通道的两侧连接；以及
第三通道，所述第三通道形成为与所述第一通道相对，第二相的流体在所述第三通道中流动，
在所述第三通道中，所述第二相的流体在与所述第一通道中的流体的流动方向相反的方向上流动。
12.根据权利要求11所述的平台，其中，所述变形装置是+形。
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