JP2005533509A - 細胞中の分子をスクリーニングするための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試薬Rと細胞Cとを反応させるための方法に関し、該方法は、:実質的に平坦な表面を含む支持体S上に細胞Cを、該表面上の水性の液滴の形態で配置する工程;該支持体Sの平坦な表面を被覆する工程(ここで、細胞Cを含む該水性の液滴が、気体を透過し支持体S上の水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFとともにセットされ、Fは、試薬Rと不混和性である);細胞Cを含む水性の液滴中に試薬Rを導入することによって試薬Rと細胞Cとの間の反応を引き起こす工程からなる。本発明は、該手順を実施するための装置及びその応用にも関する。
Description
本発明は、1つ以上の細胞または細胞組織または細胞ネットワーク上または細胞間での反応を実施するための方法及び装置に関する。
細胞への分子の侵入は、バイオテクノロジーにおいて鍵となる工程を示す。ほとんど共通して、この工程を研究するためには、分子のファミリーの生物学的効果を同じ条件下で、並行してスクリーニングしなくてはならない。細胞に対して試験するために利用可能なDNA配列及び他の分子の量の増加により、性質的に体系的であり高収量である、自動化された方法の使用が必須となっている。
文献WO 01/07159は、マイクロリアクター中での一連の生化学プロトコルを実施するための装置を開示する。しかし、この装置は、細胞に対して作用することが不可能である。
文献WO 95/34374は、一連のマイクロリアクション(microreaction)を実施するための装置及び方法を記載する。しかし、この装置及びこの方法は、試薬が細胞中へと侵入する「トランスフェクション」反応の実施を想定していない。実際には、細胞は、不均一な生きた有機体であり、その生存及び反応には、特に気体の置換に関する、特定の条件を必要とする。これらのパラメーターは、この文献においては考慮されておらず、想定さえされていない。
現在、分子をスクリーニングするためのほとんどの方法は、生きた細胞を用いることが不可能である;これらは、単離した分子のバイノーム(binomes)を用いて実施される。生きた細胞に関連するスクリーニングの場合、スクリーニングされた分子は、ほとんど細胞中へと侵入せず、これらは、表面のキャプター(captor)(例えば、レセプターなど)のみを認識する。
例えば、DNAファミリーを用いる細胞のトランスフェクションは、マトリクスの形態に分布したウェルを含むディッシュ中で現在実施される。この方法は、大量の試薬の消費すること、及び分子の相互作用を検出するための操作の面倒な(laborious)装置を必要とする欠点を有する。さらに、ウェル中の蛍光を分析するためのシステムは、サイズが大きいという欠点を有し、ウェルを含むプレート固有の蛍光を考慮しなければならず、そしてこの分析は、装置全体としての全体的視野ではなく、ウェル毎に実施しなければならない。
J.Ziauddinら、Nature、411、107−110、2001は、ガラススライド上のマトリクス状(matricial)の様式のゼラチン中にDNAを分散した形態で配置される、トランスフェクションの自動化された方法を報告している。乾燥後、DNAを含む位置を、脂質トランスフェクション試薬で処理し、次いで細胞を添加した培地へとプレートを配置する。このガラススライド上に、ゼラチン化DNAが固体形態で存在し、そしてトランスフェクションは、DNA配置近傍の細胞中へのDNAの侵入を促進する脂質にDNA分子を結合することによって、半固体相において生じる。DNA配置に対応する位置で、トランスフェクトされた細胞のマトリクスが得られる。しかし、この方法は、相対的に、不正確でありそして再現性がないという欠点を有する。ゼラチンを介する付着は、トランスフェクトされるDNAを脱着を制御するのが不可能である。トランスフェクション効率を改善することも不可能である。この方法による、十分な量のタンパク質の発現または発現のブロッキング(blocking)をもたらすことは困難である。さらに、各々のガラススライドについて、1つの細胞タイプを用いることができるのみである。
従って、トランスフェクションの方法、より一般的には、化合物と生物学的細胞とを反応させる方法であって、自動化され、最小限の量の試薬を用いて、再現性のある結果をもたらすことを可能にする方法に対する必要性がいまだ存在する。さらに、同じ細胞において一連の幾つかの反応を実施することができること、複合的な細胞系(2つのタイプの異なる細胞)、細胞組織または細胞ネットワークに対して作用することができること、及び幾つかの細胞系を並行して配置することが所望される。例えば、蛍光タンパク質遺伝子を導入することによって、分子の相互作用を検出する準備をするために、用いられる細胞のゲノムを予め改変することを可能にすることも所望される。
従って、本発明の主題は、試薬Rと少なくとも1つの細胞Cとを反応させるための方法であって、該方法は:
−細胞Cが、実質的に平坦な表面を含む支持体S上に、この表面上の水性の液滴(aqueous drop)の形態で配置されること;
−この細胞Cを含む水性の液滴が配置されている支持体Sの実質的に平坦な表面は、気体の透過を可能にしかつこの支持体S上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われ、Fは試薬Rと不混和性であること;
−細胞Cを含む水性の液滴に試薬Rを導入することによって試薬Rと細胞Cとの間の反応が引き起こされること、細胞Cへの試薬Rの導入について幾つかのバリアントが存在する
により特徴付けられる:
・第一のバリアントによれば、細胞Cを含む水性の液滴が支持体S上に配置され、任意の適切な注入手段を用いて、試薬Rを含む第二の水性の液滴が、細胞Cを含む水性の液滴中に直接注入される。そのようなバリアントを図1に例示する。
−細胞Cが、実質的に平坦な表面を含む支持体S上に、この表面上の水性の液滴(aqueous drop)の形態で配置されること;
−この細胞Cを含む水性の液滴が配置されている支持体Sの実質的に平坦な表面は、気体の透過を可能にしかつこの支持体S上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われ、Fは試薬Rと不混和性であること;
−細胞Cを含む水性の液滴に試薬Rを導入することによって試薬Rと細胞Cとの間の反応が引き起こされること、細胞Cへの試薬Rの導入について幾つかのバリアントが存在する
により特徴付けられる:
・第一のバリアントによれば、細胞Cを含む水性の液滴が支持体S上に配置され、任意の適切な注入手段を用いて、試薬Rを含む第二の水性の液滴が、細胞Cを含む水性の液滴中に直接注入される。そのようなバリアントを図1に例示する。
・第二のバリアントによれば、第一の水性の液滴が支持体S上に配置され、次いで第二の水性の液滴が同じ支持体上の、第一の液滴の近傍に配置される;これらの液滴の一方は細胞Cを含み、他方が試薬Rを含み、そして試薬Rの細胞Cとの反応、及び必要に応じて、細胞Cへのそのトランスフェクションが、これらの2つの液滴の融合によって引き起こされる。これらの液滴の移動及び融合は、支持体内の振動によって、電気的に荷電された液滴の電気泳動的移動によってまたは機械的もしくは光学的ピンセットによってもたらされる。これらは、電場または磁場の影響下での支持体の表面特性の改変によって、または光学的または熱処理によってももたらされ得る。そのようなバリアントを、図2に例示する。
・第三のバリアントによれば、この試薬Rが支持体SまたはフィルムFに付着し、細胞Cがこの支持体S上に、水性の液滴の形態で配置され、次いで試薬Rが支持体SまたはフィルムFから脱着して、細胞と反応すること、及び必要に応じて、この細胞内にトランスフェクトされることが可能となる。このバリアントを、図3及び7に例示する。
本発明において、用語「トランスフェクション」は、細胞中への試薬の分子(いずれのものでもよい)の侵入を示すために用いられる。
本発明の主題は、試薬Rと細胞Cとを反応させるための装置でもあり、この装置は、
−気体の透過を可能としかつ支持体S上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われ、Fは試薬Rと不混和性である、実質的に平坦な表面を含む支持体S;
−この表面上かつフィルムFの下に、細胞Cを含む水性の液滴を配置するための手段; −細胞Cが生存することを可能にするように支持体Sが配置されている、調整雰囲気チャンバ(controlled atomosphere chamber)
を含むことを特徴とする。
−気体の透過を可能としかつ支持体S上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われ、Fは試薬Rと不混和性である、実質的に平坦な表面を含む支持体S;
−この表面上かつフィルムFの下に、細胞Cを含む水性の液滴を配置するための手段; −細胞Cが生存することを可能にするように支持体Sが配置されている、調整雰囲気チャンバ(controlled atomosphere chamber)
を含むことを特徴とする。
好ましくは、この支持体Sは、シリコン、ガラスまたはポリマー(例えば、ポリウレタン、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロカーボン、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)またはポリスルフォン)から作製され得るプレートから構成される。
本発明に従い、これらの液滴は、毛細管現象、表面張力によって支持体に付着される。好ましくは、支持体Sは、水性の液滴を受容することが意図される少なくとも1つの手段を備える実質的に平坦な表面を有する。
好ましくは、水性の液滴の受容が意図される手段は、5μm2〜5mm2のサイズの範囲をとる支持体Sの実質的に平坦な表面の領域からなる。
第一のバリアントによれば、この支持体Sが、その平坦な表面上に疎水性の特性を示し、そしてこの受容手段を構成する1つ以上の親水性領域を備えることが想定され得る。別のバリアントによれば、支持体Sが、その平坦な表面上に、1ミクロン〜1ミリメートルの深さの範囲をとり、受容手段を構成するキャビティー(cavity)を備えることも想定され得る。支持体Sが、その表面上に配置されかつ液滴の付着を促進することが意図される1ミクロン〜1ミリメートルの厚さの薄いアウトグロース(outgrowth)を備えたプレートであることも想定され得る。最後に、支持体Sが、液滴が付着する少なくとも1つのワイヤを備えたプレートであることも想定され得る。同じ受容手段に対する2つの液滴の配置は、これら2つの水性の液滴の融合、従って、試薬Rと細胞Cとの反応を促進する。好ましくは、支持体Sは、その平坦な表面上に、疎水性の性質を示し、そして受容手段を構成する1つ以上の親水性領域を備える。この支持体の平坦な表面上に疎水性の性質を付与するために、好ましくは、この表面は、疎水性物質(例えば、ポリフルオロカーボン(例えば、ポリテトラフルオロエチレンまたはTeflon(登録商標))、シラン(例えば、パーフルオロシラン)で覆われる。この支持体の疎水性領域は、ナノメートルスケールで意図される表面構造(例えば、光学において用いられる「ブラックシリコン(black silicon)」)から構成され得る。このタイプの市販のスライドの例は、MERCK EUROLAB社 division POLYLABOにより販売されているsuperteflon 40−ウェルD2mm免疫蛍光スライドである。なおより好ましくは、この支持体は、第一のものに重ねられた、液滴を受容するための第二の手段(例えば、疎水性平坦表面及び薄い厚さの親水性アウトグロース、または疎水性平坦表面及び親水性ウェル、または疎水性平坦表面及び親水性ワイヤ)も備える。
本発明のバリアントによれば、この支持体は、その親水性/疎水性特性が、温度のようなパラメーター、電場、磁場または照射の影響下で変化し得る表面を有する。従って、この支持体は、液滴状のミクロ流体の原理を用いて、その表面上の液滴に変化を引き起こすように活性であり得る。これは、この支持体の表面特性を力学的に改変(例えば、表面張力/エネルギーにおける変化)して、制御された様式でこれらの液滴を移動させることになる。従って、細胞培養物の液滴は、この支持体において実施される種々の反応工程を経ることができる:互いに近接する2つの液滴(例えば、一方が試薬を有し、他方が細胞を有する)を融合することが可能である。
このタイプの支持体を製造するために、Shenderovら(「Electrowetting−based actuation of liquid droplets for microfluidic applicaitons」、Applied Physics Letters、vol.77、No.11、p.1725−1726、September 2000)は、電場が印加される際の、疎水性層の表面エネルギーの改変の使用を記載している:この場の強度につれて(with the intensity)表面張力は減少し、この表面は、より疎水性が弱くなるか、または親水性にさえなる。電場の制御及び移動は、この表面上の液滴の移動を可能にする。この方法は、Nanolytics社によって特許化されたが(Shenderovら、「Actuators for microfluidics without moving parts」、米国特許第6,565,727号;2003)、しかし細胞培養物を用いていない。
これらの表面特性が改変され得る別の様式は、なお電位を用いる、支持体の表面層の物理化学的改変から構成される。Lahannら(「A reversibly switching surface」、Science、vol.299、p.371−374、January 2003)によって実証されたSAM層(少なくとも1つの親水性末端及び1つの疎水性鎖を含む、「自己組織化単層」(例えば、改変チオール))のコンフォメーションの変化は、それを、表面層内の分子の直線状のコンフォメーション(従って、これは、親水性の性質である)から、湾曲したコンフォメーション(それは、疎水性の性質である)にすることを可能にする。
同様に、温度が支持体の表面特性を変化させるための手段として用いられ得る。Liangら(「Preparation of Composite−Crosslinked Poly(N−Isopropylacrylamide)Gel Layer and Characteristics of Reverse Hydrophilic−Hydrophobic Surface」 Journal of Applied Polymer Science 72:1、1999)は、低温(30℃未満)で親水性であり、そしてこれより高い場合疎水性であるポリマーを記載している。基板の下の温度の局所化制御システムを集積することによって、表面特性を制御することが可能である。
光(電磁場)が適用されるか否かに従い表面層の特性が変化するような支持体を設置することも可能である。Ichimuraら(「Light−driven motion of liquids on a photoresponsive surface」、Science、vol.288、p.1624−1626、June 2000)は、そのような表面:末端基(アゾベンゼン)が非対称光照射(asymmetric photoirradiation)後に異性体コンフォメーションを変化させ得るポリマー(calyx[4]resorcinarene)の層を記載している。トランスコンフォメーション(親水層)のこれらの環式基がUV照射(365nm)に曝されると、これらは、シスコンフォメーション(疎水層)へと変化する。この反応は、青色光(436nm)を用いて逆転可能である。ポリマー層に選択的かつ漸進的に光照射することによって、制御された様式で液滴を移動させることが可能である。
本発明のバリアントによれば、試薬Rは、細胞Cを含む水性の液滴の配置の前に支持体Sに付着される。そのような装置は、他の使用について当業者に公知である:これらは:
−Eisen M.B.、Spellman P.T.、Brown P.O.、Botstein D.Cluster analysis and display of genome−wide expression patterns、Proc Natl Acad Sci USA.1998 Dec.8;95(25):14863−8;
−Haab B.B.、Dunham M.J.、Brown P.O.、Protein microarrays for highly parallel detecting and quantitation of specific proteins and anti−bodies in complex solutions、Genome Biol.2001 Jan 22;2(2):RESEARCH 0004.1−0004.13;
−Livache T.、Bazin H.、Caillat P.、Roget A.、Electroconducting polymers for the construction of DNA or peptide arrays on silicon chips,Biosens Bioelectron.1998 Sep 15;13(6):629−34。
により記載されるようなDNAチップである。
−Eisen M.B.、Spellman P.T.、Brown P.O.、Botstein D.Cluster analysis and display of genome−wide expression patterns、Proc Natl Acad Sci USA.1998 Dec.8;95(25):14863−8;
−Haab B.B.、Dunham M.J.、Brown P.O.、Protein microarrays for highly parallel detecting and quantitation of specific proteins and anti−bodies in complex solutions、Genome Biol.2001 Jan 22;2(2):RESEARCH 0004.1−0004.13;
−Livache T.、Bazin H.、Caillat P.、Roget A.、Electroconducting polymers for the construction of DNA or peptide arrays on silicon chips,Biosens Bioelectron.1998 Sep 15;13(6):629−34。
により記載されるようなDNAチップである。
同じ原理が、ポリヌクレオチド以外の分子に適用され得る。分子チップは、Kuruvillaら、Glucose signalling with small molecule microarrays、Nature(2002)、416 p.653に記載されている。全ての場合において、試薬分子が、最初に、チップに(例えば、ガラススライドへの共有結合によって)付着する。本発明に従って、この分子は、必要に応じて、分子チップ上への細胞を含む水性の液滴の配置後に脱着され得る。
試薬分子の脱着は、以下の手段:
−図5に例示されるような、支持体への試薬の光切断可能な(photocleavable)結合部位を用いるUV光切断;
そして試薬がポリヌクレオチドのみである場合:
−制限酵素または他のヌクレアーゼを用いる二本鎖DNAの切断、
−ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの改変:培地の塩濃度、温度または酸化還元条件の変化により、2つのDNA鎖の分離を可能にすること、
のうちの1つによって公知の様式で実施され得る。
−図5に例示されるような、支持体への試薬の光切断可能な(photocleavable)結合部位を用いるUV光切断;
そして試薬がポリヌクレオチドのみである場合:
−制限酵素または他のヌクレアーゼを用いる二本鎖DNAの切断、
−ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの改変:培地の塩濃度、温度または酸化還元条件の変化により、2つのDNA鎖の分離を可能にすること、
のうちの1つによって公知の様式で実施され得る。
特定の場合、試薬Rが基板に付着したままであることが想定される。
本発明によれば、支持体Sの実質的に平坦な表面が、以下の3つの機能:
−それは、水性の液滴の望まれない融合を防ぐこと、
−それは、支持体上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐこと、
−それは、気体、特にO2及びCO2の透過を可能にすること、
(後の2つの機能は、液滴中で細胞が生存することを可能にすることが意図される)を満たす分離フィルムで覆われる。
−それは、水性の液滴の望まれない融合を防ぐこと、
−それは、支持体上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐこと、
−それは、気体、特にO2及びCO2の透過を可能にすること、
(後の2つの機能は、液滴中で細胞が生存することを可能にすることが意図される)を満たす分離フィルムで覆われる。
フィルムFは、種々の性質のものであり得る:
−それは、水不混和性液体(例えば、油)であり得る。現在まで、特定の細胞を保存するためにオイルを使用する方法が知られている;しかし、それが、細胞上での反応を実施するために用いられたことはない。本発明に従う方法及び装置において用いられ得るオイルの中で、特に、鉱油及びシリコーンオイルが言及され得る。処理される化合物(細胞及び試薬)と不混和性である有機溶媒(例えば、オクタン)を液体Lとして用いることも可能であった。好ましくはライトミネラルオイル(light mineral oil)が用いられる;
−それは、水分で飽和した空気のような気体でもよい;
−次に、それは、可撓性の固体フィルム(例えば、PDMSすなわちポリジメチルシロキサンフィルムまたはニトロセルロースフィルム)でもよい;
−最後に、それは、多孔質材料から作製される硬いハニカム状カバーでもよく、そのキャビティーのサイズは、細胞(単数または複数)、及び必要に応じて試薬の、液滴を保持することができるように調整され得る。本発明のバリアントによれば、硬いハニカム状のカバーは、各々のキャビティーにおいて、試薬分子で官能化されていてもよく、したがって、細胞の液滴がキャビティーに関して対称的な様式で配置されている支持体と、接触するような分子チップまたはヌクレオチドチップを構成し得る。本発明のこのバリアントを図7に例示する。
−それは、水不混和性液体(例えば、油)であり得る。現在まで、特定の細胞を保存するためにオイルを使用する方法が知られている;しかし、それが、細胞上での反応を実施するために用いられたことはない。本発明に従う方法及び装置において用いられ得るオイルの中で、特に、鉱油及びシリコーンオイルが言及され得る。処理される化合物(細胞及び試薬)と不混和性である有機溶媒(例えば、オクタン)を液体Lとして用いることも可能であった。好ましくはライトミネラルオイル(light mineral oil)が用いられる;
−それは、水分で飽和した空気のような気体でもよい;
−次に、それは、可撓性の固体フィルム(例えば、PDMSすなわちポリジメチルシロキサンフィルムまたはニトロセルロースフィルム)でもよい;
−最後に、それは、多孔質材料から作製される硬いハニカム状カバーでもよく、そのキャビティーのサイズは、細胞(単数または複数)、及び必要に応じて試薬の、液滴を保持することができるように調整され得る。本発明のバリアントによれば、硬いハニカム状のカバーは、各々のキャビティーにおいて、試薬分子で官能化されていてもよく、したがって、細胞の液滴がキャビティーに関して対称的な様式で配置されている支持体と、接触するような分子チップまたはヌクレオチドチップを構成し得る。本発明のこのバリアントを図7に例示する。
分離フィルムが気体または液体である場合、図1に例示するように、1つ以上の細胞または試薬を含む水性の液滴は、微細なキャピラリーによって、支持体Sの上かつ分離フィルムの下に有利に配置される。好ましくは、これらのキャピラリーは、液滴の容量を制御することができるポンプまたはシリンジポンプに接続される。
これらの試薬または細胞も、DNAチップの製造のために用いられるもののような従来のシステムを用いて配置され得る。例えば、キャビティーを圧縮しそしてノズルを介して液滴を押し出すための圧電システムが言及され得る。この対象について、N.Tanakaら、Proceeding of the SID、vol.27/1、1986、31−35が参照され得る。
好ましくは、押し出された液滴は、押出しの速度及び/または重力によって、液体または気体のフィルム(この液体または気体は、配置される溶液より軽い)を透過する。この分離フィルムが固体フィルムまたは硬いカバーである場合、それは、上記と同じ手段により細胞、及び必要に応じて試薬、の水性の液滴を配置した後に、支持体上に配置される。
液滴の移動及び融合は、支持体内の振動、荷電した液滴の電気泳動もしくは電磁的移動または機械的もしくは光学的ピンセットによってもたらされ得る。それは、電磁場の適用または熱もしくは光学的処理によってもたらされる支持体の表面特性の改変によってももたらされ得る。
好ましくは、この装置の支持体Sは、第一の配置手段から第二の配置手段、及び必要に応じて他の配置手段への移動を可能にするようなモバイル(mobile)である。この支持体Sは、特定の場合において、その2つの末端でローラーに取り付けられた固体フィルムからなり得る(これらのローラーは、このフィルムの移動、従ってその上に配置された液滴の移動を可能にするようなワインディング手段を備えている)。
一般的に、本発明に従う方法は、支持体S上への第一シリーズの液滴(それが細胞の液滴または試薬の液滴のいずれであるかによらない)の配置後の、支持体Sの移動を想定する。
本発明によれば、支持体Sは、細胞の生存を可能にするように温度、湿度及びCO2含量が調整される調整雰囲気チャンバー中に配置される。
そのような装置は、特に、調整雰囲気インキュベーターである。そのような装置内の温度は、35〜42℃の範囲をとり得、好ましい温度は、36.5〜37.5℃の間である。温度のバリエーションは、特に、細胞分化を誘導するために用いられ得る。
好ましくは、CO2レベルは、3〜5%の間で維持される。好ましくは、酸素O2レベルは、周囲空気のレベルである。
例えば、37℃、95%の空気、5%CO2及び97%の湿度でインキュベーター中の支持体S上の水性の液滴中の細胞を維持することを想定することが可能である。
反応装置全体:支持体、分離フィルム、配置手段、検出手段等が調整雰囲気チャンバー中に配置されることを想定することも可能である。
細胞の液滴及び分離フィルムが配置されている支持体のみが調整雰囲気チャンバー中に配置されることを想定することもまた可能である。
有利には、1つ以上の細胞、細胞組織または細胞ネットワークが培養培地を含むことを想定することも可能である。
実際、細胞培養物の確立は、細胞がその増殖を維持する能力、従って、これらの増殖に対して必須の条件に依存する。
有利には、細胞の水性の液滴が、カタログ番号No.12000−022の下でGIBCO BRL社により販売されている、MEM、すなわち最小必須培地を含むことが想定される。
培養培地は、他の成分(例えば、ウシ血清、または培地の無菌状態を制御することが意図される1つ以上の抗生物質(例えば、ペニシリン))を含んでいてもよい。
培養培地中に、細胞分化を誘導する化学薬品(例えば、ブロモデオキシウリジン)を用いることを想定することも可能である。
細胞Cが培養物中に存在する水性の液滴が、公知のゲル化剤(例えば、寒天またはゼラチン)によってゲル化されていることを想定することも可能である。
有利には、細胞(単数または複数)もしくは細胞組織もしくは細胞ネットワークを含む水性の液滴、及び/または試薬を含む水性の液滴は、トランスフェクションを促進することが意図される1つ以上の成分(例えば、リポソーム)を含む。そのようなトランスフェクション試薬は、特に、文献WO 01/20015及びWO 98/33932に記載されている。
トランスフェクションを促進することが意図される他の手段は、本発明の装置(例えば、エレクトロポレーションまたは微量沈降)においても用いられ得る。当業者に周知のこれらのトランスフェクションの方法は、特に、http://opbs.okstate.edu/〜melcher/MG/MGW4/MG43.html中に記載されている。
本発明によれば、その装置が:
−支持体上に配置された1つ以上の液滴にエネルギーを供給するための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴の光学的処理のための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴に、特にエレクトロポレーションを可能にするために、磁場または電場を印加するための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴に対して焦点が合わせられる検出手段、
を含むことを想定することも可能である。
−支持体上に配置された1つ以上の液滴にエネルギーを供給するための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴の光学的処理のための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴に、特にエレクトロポレーションを可能にするために、磁場または電場を印加するための手段;
−支持体上に配置された1つ以上の液滴に対して焦点が合わせられる検出手段、
を含むことを想定することも可能である。
好ましくは、本発明に従う装置において用いられる手段は、本発明に従う装置及び方法を自動化することを可能にする制御装置に接続される。
エネルギーを供給するための手段の中で、特に、例えば、支持体Sの近傍に配置され得るかまたはこの支持体に取り付けられ得、そして液滴を適切な温度にすることが意図される加熱装置から構成され得る熱処理の手段が言及され得る。例えば、これらの加熱手段は、液滴を受容するための手段としての役割も果たす導電性ワイヤから構成され得る。
検出手段は、特に、1つ以上の液滴または1つ以上の液滴に含まれる細胞の蛍光または放射活性を測定することが意図される装置である。
光学的処理手段は、特に、紫外線を用いる処理手段であり、後者は、DNAの相補鎖間及びDNAとタンパク質との間の架橋を誘導することが知られている。
本発明に従う装置及び/または方法の使用は、多くの利点を有する:非常に少量の物質が用いられ得る:液滴当り単一の細胞によってトランスフェクション実験を実施することが可能である。1〜500個の細胞を含む、1マイクロリットル未満、好ましくは、0.1〜1000ナノリットル、なおより好ましくは1〜10個の細胞を含む0.1〜10ナノリットルの、非常に小さい容量の液滴を用いて実施することが可能である。有利には、1〜100個の細胞を含む液滴が用いられる。より大きな、特にマイクロリットルより大きな容量(500〜100000個の細胞を含む、10〜100μl)で作用させることを想定することも可能である。この方法は、少量の試薬を用いることも可能にする。分離フィルムFは、細胞の培養培地のガス交換及びその無菌状態を制御することを可能にする。それは、互いに反応することが意図されない液滴を分離することも可能にする。最後に、この方法は、トランスフェクション効率を改善することを可能にする:この方法において用いられる各々の細胞がトランスフェクトされ得る。分離フィルム下の液滴の形態の細胞培養物は、観察されるこれらの細胞活性を特に改変することなく(細胞の増殖及び成長に対して顕著な影響を与えることなく)、少なくとも24時間、そして数日間まで保存され得る。
本発明に従う方法及び装置は、一連の反応を実施することも可能にする:
各々少なくとも1つの細胞を含むいくつかの水性の液滴が支持体S上に配置され得、これらの液滴が互いに離される。好ましくは、これら液滴の各々は、異なる受容手段中に配置される。全ての細胞は同一でもよいが、種々の液滴中に異なる細胞(少なくとも2種類の異なる細胞)を配置することを想定することも可能である。試薬(単数または複数)を含む液滴を、細胞を含む各々の液滴の近傍に配置して、適切な試薬を含む1つの液滴と標的化された細胞を含む液滴との融合を可能にする。有利には、一連の反応を実施するために、この方法を自動化することを可能とするような、マトリクスの形態で均一にアレンジされた受容手段を備える支持体が想定される。
各々少なくとも1つの細胞を含むいくつかの水性の液滴が支持体S上に配置され得、これらの液滴が互いに離される。好ましくは、これら液滴の各々は、異なる受容手段中に配置される。全ての細胞は同一でもよいが、種々の液滴中に異なる細胞(少なくとも2種類の異なる細胞)を配置することを想定することも可能である。試薬(単数または複数)を含む液滴を、細胞を含む各々の液滴の近傍に配置して、適切な試薬を含む1つの液滴と標的化された細胞を含む液滴との融合を可能にする。有利には、一連の反応を実施するために、この方法を自動化することを可能とするような、マトリクスの形態で均一にアレンジされた受容手段を備える支持体が想定される。
有利には、細胞及び試薬の水性の液滴を配置することが意図される支持体及びキャピラリーは、この方法を自動化することを可能とするために、制御手段に接続される。
従って、本発明に従う方法及び装置は、試薬及び細胞の性質を変化させて、細胞に対する試薬の多数の反応を、非常に小さい容量で同時に作用させながら、同時かつ自動化された様式で実施することを可能にする。
この方法を用いて研究するために有利であり得る細胞の中で、特に、
−初代培養細胞
−ハイブリドーマ
−細胞株:これらの細胞は、際限なく永続し得、従って株を形成する、
−幹細胞:これらは、動物または生検から採取したサンプルから得られる、
−細胞組織片(これらの細胞は、個別化されていない)、
−上で規定した種々のタイプの細胞の混合物、
が言及され得る。
−初代培養細胞
−ハイブリドーマ
−細胞株:これらの細胞は、際限なく永続し得、従って株を形成する、
−幹細胞:これらは、動物または生検から採取したサンプルから得られる、
−細胞組織片(これらの細胞は、個別化されていない)、
−上で規定した種々のタイプの細胞の混合物、
が言及され得る。
これらの細胞を、公知の様式で培養培地(水性)中で培養する。異種細胞を数日間培養すること及びこの混合物を使用することも可能である。
本発明のバリアントによれば、同じ支持体上で反応させる全ての細胞が同一である場合、その手順は、以下の様式で実施され得る:支持体は、親水性領域を備える疎水性プレートであり、細胞を含む水溶液中にそれを浸漬し、次いで、それをこの溶液から取り出し、過剰の液体を流出させる。細胞を含む培地の液滴は、親水性領域中に保持される。この工程に引き続き、分離フィルムFの層を配置し、そして試薬または他の細胞を含む液滴を配置する。フィルムFの性質(流体または固体)に従い、それを、試薬または他の細胞の液滴の配置の前または後に、配置する。
本発明に従う方法及び装置において用いられ得る試薬Rの中で:
全ての性質の化学分子、特に天然の有機分子、有機合成及びコンビナトリアル合成から誘導される分子、生物学的サンプルから抽出された分子ならびに合成によって改変された、生物学的サンプルから抽出された分子、が言及され得る。特に、以下のポリヌクレオチド:一本鎖及び二本鎖RNA分子、特にsiRNA(低分子干渉RNA(small interfering RNA))分子;一本鎖及び二本鎖DNA分子;ペプチド−核酸キメラであるPNA(ペプチド核酸)分子;リボザイム;二本鎖干渉RNAまたはタンパク質及びペプチドが言及され得る。タンパク質の中で、最も著しくは、転写因子が言及され得る。
全ての性質の化学分子、特に天然の有機分子、有機合成及びコンビナトリアル合成から誘導される分子、生物学的サンプルから抽出された分子ならびに合成によって改変された、生物学的サンプルから抽出された分子、が言及され得る。特に、以下のポリヌクレオチド:一本鎖及び二本鎖RNA分子、特にsiRNA(低分子干渉RNA(small interfering RNA))分子;一本鎖及び二本鎖DNA分子;ペプチド−核酸キメラであるPNA(ペプチド核酸)分子;リボザイム;二本鎖干渉RNAまたはタンパク質及びペプチドが言及され得る。タンパク質の中で、最も著しくは、転写因子が言及され得る。
試薬分子が、配置用の溶液中に処方され得る。これらは、支持体上への配置の直後に、例えば、インサイチュでの合成、特に、有機合成、または液滴中でのインビトロでの転写によっても調製され得る。プリオンタイプ分子を、細胞へのそのトランスフェクションの前に、ペプチドポリメラーゼ連鎖反応(すなわちPCR)によって、液滴として得ることもできる。核酸分子が用いられる場合、これらは、核酸PCRによって調製され得る。既に上に開示されるように、この試薬も支持体に付着され得る。
DNAが試薬として用いられる場合、有利には、それは、沈降形態である。例えば、リン酸カルシウムが、公知の様式で用いられ得る。DNA沈降は、支持体上に配置された水性の液滴中で、適切な試薬の液滴との融合によって実施され得る。
本発明に従う装置及び方法のバリアントによれば、融合させることを意図して幾つかの連続的な配置をもたらすことが想定され得る:
同じ細胞をトランスフェクトすることを意図して、いくつかの試薬を連続的に配置し、そしてこれらの累積的な効果を観察することが想定され得る;
同一または異なる細胞の細胞ネットワークを再構成し、インビボで遭遇する条件に可能な限り近づけるために、細胞のいくつかの液滴を配置し、そしてこれらを融合させることも想定され得る。例えば、ニューロンに遭遇する(encounter)グリア細胞を用いることによって、同じ液滴中でこれらを連絡させるように、数個の細胞のスケールで、ニューロンのネットワークを再構成すること、または皮膚を構成する種々のタイプの細胞の間の相互作用を、細胞スケールでその挙動(behavior)を模倣するように再構成することが可能である。
同じ細胞をトランスフェクトすることを意図して、いくつかの試薬を連続的に配置し、そしてこれらの累積的な効果を観察することが想定され得る;
同一または異なる細胞の細胞ネットワークを再構成し、インビボで遭遇する条件に可能な限り近づけるために、細胞のいくつかの液滴を配置し、そしてこれらを融合させることも想定され得る。例えば、ニューロンに遭遇する(encounter)グリア細胞を用いることによって、同じ液滴中でこれらを連絡させるように、数個の細胞のスケールで、ニューロンのネットワークを再構成すること、または皮膚を構成する種々のタイプの細胞の間の相互作用を、細胞スケールでその挙動(behavior)を模倣するように再構成することが可能である。
コラーゲン層上でケラチノサイトを、同じ液滴中で、一緒に培養することによって、表皮の挙動を模倣することが意図される細胞組織を再構成することも可能である。毛包細胞の存在下で皮膚の幹細胞を一緒に培養して、これらの相互作用を研究することも可能である。
例えば、細胞性反応(例えば、組換えタンパク質の生成)を引き起こすために第一のタイプの細胞への試薬のトランスフェクションを用いること、次いで別の液滴との融合によってこの第一の細胞集団と別のタイプの細胞集団とを反応させることが可能である。
図8に例示される本発明のバリアントによれば、支持体が、2つの異なる細胞タイプを分離することが可能であるがこれらの細胞の間の低分子の通過を可能にする分離手段を備えることも想定し得る。そのような分離手段は、生物学的障壁(例えば、血液および頸部細胞の間に存在する障壁)を模倣することが意図される。そのような分離手段は、有利には、支持体上の受容手段上で構成される。これらを使用するために、分離手段の一方のサイド上に少なくとも1つの第一のタイプの細胞を含む水性の液滴、そして分離手段の他方のサイド上に少なくとも1つの第二のタイプの細胞を含む水性の液滴を配置することが想定される。これらの分離手段の各々のサイド上の液滴の融合は、分離手段を通って拡散することができる分子による、これらの細胞間の連絡を可能にする。次いで、この連絡は、任意の手段、特に、細胞液滴の融合前または後の、水性の液滴形態での試薬の添加によって研究され得る。これらの液滴の自動化されたトランスフェクションを介して、生物学的多層内にトランスフェクトされた因子の生物学的役割を解析することが可能である。
本発明のこのバリアントに従い用いられ得る分離手段は、人工膜(例えば、ニトロセルロースフィルター、ナノホールの開いたシリコン、ブロッティングペーパー、クロスフィルター)であり;固体ゲル(例えば、アガロース、コラーゲンまたはゼラチンゲル)の使用も想定され得る。
本発明に従う装置及び方法は、細胞へのコーディングDNAの侵入によって得られた組換えタンパク質の発現を自動化すること、細胞内の遺伝子発現を改変すること(ブロックすること、または一方で、増加させること)が意図される核酸分子のスクリーニングを実施すること、及びプロモーターゲノム配列(promoter genomic sequences)を検索することを可能にする。本発明は、異なるタイプの細胞間での相互作用(この相互作用は、これらの液滴の混合によって引き起こされる)を研究することも可能にする。本発明に従う装置及び方法は、全ての種類の分子の細胞との反応、特に、細胞への全ての種類の分子の自動化された侵入、の生物学的効果の概観を得ることを可能にする。
有利には、細胞への分子の侵入によって発生する細胞表現型の全体的な検出は、標識分子(即ち、これらを含む培地の完全性に影響することなく検出され得る分子)を用いて実施される。これは、特に、蛍光もしくは放射性標識または当業者に公知の任意の他の標識手段を含む。
本発明に従う方法及び装置の1つの利点は、トランスフェクション及び細胞相互作用の操作の全ての工程が、栄養培地中での細胞培養及び酵素反応を促進する液体層中で実施されるという事実にある。
一般的に、本発明に従う方法及び装置は、以下の利点を有する:
−培養ウェル中で慣用的に実施されるトランスフェクションと比較したトランスフェクション効率の改善;
−いくつかの細胞タイプが、同じ反応シーケンスの間に、同じ支持体上で試験され得る;
−いくつかの分子タイプが、同じ反応シーケンスの間に、同じ支持体上で試験され得る;
−試薬を、融合前の液滴中で直接的に得ることができる;
−全ての試薬が独立して、細胞培養物の調製と並行して調製される。
−培養ウェル中で慣用的に実施されるトランスフェクションと比較したトランスフェクション効率の改善;
−いくつかの細胞タイプが、同じ反応シーケンスの間に、同じ支持体上で試験され得る;
−いくつかの分子タイプが、同じ反応シーケンスの間に、同じ支持体上で試験され得る;
−試薬を、融合前の液滴中で直接的に得ることができる;
−全ての試薬が独立して、細胞培養物の調製と並行して調製される。
本発明の装置及び方法の応用の中で、アンチセンス活性を有する配列の検索が言及され得る。細胞及び動物中でのタンパク質の合成をブロックするための小さいDNAまたはRNA配列の使用は、Deanら、Current Opinion in Biotechnology、12、622(2001)を介して知られている。この遺伝子療法は、ヒトにおいて新規の抗ウイルス剤を試験するために用いられてきた。しかし、1つ以上のオリゴヌクレオチドの使用は、タンパク質の発現をブロックすることを可能にせず、この遺伝子工学的アプローチは、非常に多くの回数、失敗してきた。これらのアッセイにおいて、適切なスクリーニング手段がなく、用いられるオリゴヌクレオチドの配列は、アクセス可能なゲノム配列から、わずかに、ランダムに選択されていた。用いられるオリゴヌクレオチドは、標的RNAに対して十分な親和性を有さず、そして細胞中でのその翻訳をブロックすることは不可能であった。合成DNA分子は真核細胞に対して有毒であるので、これらの最小限の量で用いることが所望される。細胞中で標的遺伝子の発現をブロックするためには、以下の4つのレベルで介在する必要がある:
−そのRNA上の最適な結合位置、RNAの四次構造においてより折りたたまれていない部分に一般的に対応する位置、を見出す;
−そのRNAに対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチド配列を見出す;
−真核細胞へと侵入することができるオリゴヌクレオチド配列を見出す;
−これらのオリゴヌクレオチドが、細胞中で数日間分解されないように維持する。
−そのRNA上の最適な結合位置、RNAの四次構造においてより折りたたまれていない部分に一般的に対応する位置、を見出す;
−そのRNAに対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチド配列を見出す;
−真核細胞へと侵入することができるオリゴヌクレオチド配列を見出す;
−これらのオリゴヌクレオチドが、細胞中で数日間分解されないように維持する。
最初の2つの過程は、蛍光標識された標的RNAを用いるオリゴヌクレオチドのファミリーのハイブリダイゼーションが試験される従来のオリゴヌクレオチドチップを用いて実施され得る(例えば、Olejnikら、NAR、26、3572(1998)の研究が参照され得る)。本発明に従う方法は、細胞へのオリゴヌクレオチドの侵入及びこれらの安定性を試験することを可能にする。
細胞中での標的タンパク質の発現を低減させるための最適な配列を実証するために、改変オリゴヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート誘導体)が用いられる(この改変は、問題とするオリゴヌクレオチドに数日間のヌクレアーゼ耐性を付与する)。
アンチセンス分子は、干渉RNA(interfering RNA)(iRNA)と呼ばれる、RNA二重鎖(これは、メッセンジャーRNAにハイブリダイズして、RNA三重螺旋を形成する)も構成し得る(このアプローチに関して、Elbashirら、Nature、411、494−498(2001)が参照され得る)。本発明に従う方法及び装置は、長い(プラスミド)及び短い(合成)iRNAをスクリーニングすることを可能にする。
本発明に従う方法及び装置の別の応用は、液滴中での組換えタンパク質の自動化された生成に関する。自動化トランスフェクションは、種々のコーディングDNAフラグメント及び同じDNAの種々の変異体の発現を試験することを可能にする。本発明に従う装置での組換えタンパク質の自動化された発現は、プロテインチップの代替物であり得る。従って、タンパク質を生成すること、これらを精製すること及び固体支持体にこれらを付着させることはもはや必要なく、これらのタンパク質は、この装置上で、de novo生成される。
本発明の方法及び装置の別の応用は、siRNAの調製及びスクリーニングである。siRNA(低分子干渉RNA)は、細胞中、培養物中及び動物中での遺伝子発現を特異的そして効果的にブロックすることができる二本鎖RNA分子である。siRNAは、Science誌によって「molecules of the year 2002」に選出された:これらの分子は、特に、癌腫学及びウイルス学において革新的な治療を可能にした。これらは、既に、これまで知られていなかった遺伝子の機能を特徴付けることを可能にする(T.Tuschi、Nature Biotechnology、vol.20、May 2002、p.446−448)。
これらのsiRNAを生成するための4つのアプローチが記録されている。第一は、化学を使用し、2つのsiRNA鎖の各々を、核酸合成機において生成し、次いで合成後に会合させる(S.M.Elbaschirら、Nature、411、May 24、2001、494−498、に記載されるホスホロアミダイトRNAから産生される合成分子)。第二は、インビトロでRNAポリメラーゼを使用し、siRNAの各々の鎖を、DNA鎖に対して相補的な様式で生成し、次いで合成後に2本の鎖を会合させる(例:Ambion社により販売されているpSilencer commercial kit及びNEB Biolabs社により販売されているHiScrib commercial kit)。第三は、真核細胞または細菌中でのインビボでの合成を使用し、インビボで存在するRNAポリメラーゼを用いて二本鎖を産生する。第四は、トランスフェクトされた細胞のヌクレアーゼによって低分子(siRNA)へと変換される一本鎖または二本鎖の長鎖RNA(インビトロまたはインビボで産生される)を使用する(R.Agami、Current Opinion in Chemical Biology、2002、6、829−834)。
本発明において、試験管内に含まれるDNA分子からsiRNAを生成する努力をすることが、適用され得る第二のアプローチである。このアプローチは化学的にsiRNAを生成することからなるアプローチより費用がかからないので、特に用いられる。インビトロで合成されたsiRNAの構造が化学的に得られたsiRNAの構造と異なることが報告されており;それは、インビトロで得られたsiRNAのハイブリダイゼーションの場合、トランスフェクトされた細胞の標的RNAとの、より高い親和性を得ることを可能にする。従って、遺伝子発現のブロッキングは、化学的siRNAを用いるより、インビトロで得られたsiRNAを用いたほうが良好である:効率がより高く、そしてあまり高いsiRNA濃度を必要としない。
本発明のこのバリアントは、固体支持体上でsiRNAを生成する方法に基づく。本発明は、(例えば、SP6またはT7タイプの)RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含む2つのDNAマトリクスを用いて液滴中でsiRNAを生成し、そして液滴の融合によって、液滴中または固体基板上で培養された細胞中に二本鎖siRNA分子をトランスフェクトするためにこの液滴のフォーマットを用いることを提唱する。これらのDNAマトリクスは、固体支持体に共有結合または非共有結合によって付着され得る。
遺伝子発現のブロッキングを最適化するために、遺伝子に沿っていくつかの(少なくとも10程度の)siRNA配列を試験する必要があり、そしていくつかの遺伝子の体系的なスクリーニングに非常に興味が集まっている(例えば、ミミズにおいて5600より多い遺伝子がブロックされている:S.S.Leeら、Nature Genetics、33、January 2003、40−48)。
特定のsiRNA配列の品質は、既に、例えば、GCヌクレオチドのパーセンテージ、または対応するオリゴヌクレオチドのTm、または分子のサイズ(21マー)に関して提唱されている。しかし、実験に代わるものはない;スクリーニングは、遺伝子の発現をブロックするための最適な配列を見出すためだけでなく、その濃度及び細胞培養においてそれが作用する時間を決定するために必要である。
これらの種々の表現型スクリーニングを実施するために、プラスチックウェル(96−ウェルまたは384フォーマット)を使用することが可能である;しかし、本発明者らは、液滴中の細胞培養物においてトランスフェクション効率が、より高いこと(液滴中の細胞培養物において、ウェル中の細胞培養物におけるものより5倍低い濃度のsiRNAを用いて、同じ効率のトランスフェクション及び遺伝子発現のブロッキングを得た)を示した。さらに、遺伝子発現のブロッキングの表現型分析は、細胞がガラススライド上の液滴中で培養された場合に、非常に重要である:これらの細胞がトランスフェクトされた後、これらは、小さな別個のパイル(pile)においてガラススライドに付着し、そしてこれらの遺伝子発現レベルが、蛍光免疫細胞化学によって明らかにされ、そしてスキャナーによって直接的に分析される(抗体で標識された細胞により放出された光子の数の直接的な検出)。
潜在的な応用:
・遺伝子機能の特徴付け(特に、トランスジェニックマウスのKOによって「アクセス可能でない」遺伝子の(KOマウスが生まれる前に死亡した)場合)
・いくつかのタイプの細胞におけるいくつかの遺伝子の機能の特徴付け:高スループットスクリーニングの必要性。これは、遺伝子欠損のインビボでの分析の場合である。
・遺伝子機能の特徴付け(特に、トランスジェニックマウスのKOによって「アクセス可能でない」遺伝子の(KOマウスが生まれる前に死亡した)場合)
・いくつかのタイプの細胞におけるいくつかの遺伝子の機能の特徴付け:高スループットスクリーニングの必要性。これは、遺伝子欠損のインビボでの分析の場合である。
・癌腫学:新脈管形成及び特定の癌の増殖における遺伝子の役割の分析。さらに、細胞修復に必須の遺伝子のブロッキングは、特定の細胞に化学的感受性を付与することを可能にする。化学的感受性は、チップ上で分析され得る。
・ウイルス学:HIVウイルスの増殖は、siRNAの使用を介してインビボでブロックされた(N.S.Leeら、Nature biotechnology、Vol.19、May 2002、500−505)。
実施例において用いられる材料及び方法:
検出
蛍光分子を用いる、トランスフェクションの検出を、2つの工程:
−蛍光スポットの概観によって、
−複合的なイメージを作成するための個々のスポットの解析によって
実施する。
検出
蛍光分子を用いる、トランスフェクションの検出を、2つの工程:
−蛍光スポットの概観によって、
−複合的なイメージを作成するための個々のスポットの解析によって
実施する。
蛍光の概観を:
−ヨウ化プロピジウム蛍光(細胞の存在を反映する)
−緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光(緑色蛍光標識は、GFPタンパク質の発現を反映する)
のバイパラメトリック検出(biparametric detection)によって決定する。
−ヨウ化プロピジウム蛍光(細胞の存在を反映する)
−緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光(緑色蛍光標識は、GFPタンパク質の発現を反映する)
のバイパラメトリック検出(biparametric detection)によって決定する。
次いで、得られたイメージを、一連の測定点の蛍光を組み合わせることを可能にするシグナル定量システムによって解析する。
−液滴の蛍光の解析:オイルの層の下の液滴中で生存した状態で、細胞を分析することができる。これらの実験のために、本発明者らは、Olympus(登録商標)BX 51M顕微鏡及びLeica(登録商標)共焦点顕微鏡を用いた。
−固定した細胞の蛍光の分析:PFA(すなわち、パラホルムアルデヒド)で細胞を固定した後(応用No.1を参照のこと)、組換え細胞を含むガラススライドを組織学スライド(histlogy slide)として用いる。放射活性標識及び蛍光標識実験を実施することが可能である(応用No.5.2を参照のこと)。スライドの蛍光の合計を、従来の顕微鏡を用いて分析することができる。本発明者らは、DNAチップ実験において従来用いられるスキャナー(スキャナー:Axon Instrument社により販売されているGenePix 4000B)も用いた。このタイプの装置の精度は、5μmであり、従って、約10ピクセルを用いて細胞を可視化することができる。
図4は、本発明に従う装置の応用の例:グリア細胞の懸濁液における組換えタンパク質の発現及びニューロンの懸濁液の活性化、を例示する。
以下:
−水性媒体(数ナノリットル)中に、約100のグリア細胞を含む、懸濁液中の細胞の液滴;
−リン酸カルシウム塩の形態のDNA(数ピコモル)を含む水性の液滴;
−水中の懸濁液中の神経細胞の液滴、
をSigma社により販売されているライトミネラルオイル(フィルムF)を含む容器中のガラススライド(支持体S)上にインジェクトする。
−水性媒体(数ナノリットル)中に、約100のグリア細胞を含む、懸濁液中の細胞の液滴;
−リン酸カルシウム塩の形態のDNA(数ピコモル)を含む水性の液滴;
−水中の懸濁液中の神経細胞の液滴、
をSigma社により販売されているライトミネラルオイル(フィルムF)を含む容器中のガラススライド(支持体S)上にインジェクトする。
最初の2つの液滴は、第一に、ピペットの端部を用いる2滴の液滴を、機械的な移動によって融合させて、トランスフェクトされた細胞の液滴G1を得るために行われる。従って、グリア細胞は、組換えタンパク質を発現する。この液滴G1を、懸濁液中にニューロンを含む液滴G2と融合させる。次いで、これらのニューロンを活性化させる。
I.オリゴヌクレオチドのトランスフェクション、特定の遺伝子の発現をブロックすることができる配列のスクリーニング
この実施例において、本発明者らは、目的の遺伝子(本実施例において標的と呼ぶ)の発現をブロックすることができるオリゴヌクレオチド配列を選択するために調査した。これらのオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を測定するために、本発明者らは、E−GFP変異体(Clontechにより販売されている緑色蛍光タンパク質タイプE)との融合物として標的タンパク質を発現する安定した細胞株を用いた。これらの株は、種々のオリゴヌクレオチドのパフォーマンスレベルを評価するための貴重なツールである:アンチセンス活性は、レポータータンパク質の蛍光の減少によって測定される。例外的なアンチセンス活性を有するオリゴヌクレオチドを見出すために、種々の配列を有する少なくとも50のオリゴヌクレオチドを、同じ遺伝子についてスクリーニングすることが必須である。細胞におけるこのスクリーニングの過程において、本発明者らは、特に、標的RNAに対して最も強い親和性を有し、そして細胞中に侵入する能力が最も高いオリゴヌクレオチドを探した。
この実施例において、本発明者らは、目的の遺伝子(本実施例において標的と呼ぶ)の発現をブロックすることができるオリゴヌクレオチド配列を選択するために調査した。これらのオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を測定するために、本発明者らは、E−GFP変異体(Clontechにより販売されている緑色蛍光タンパク質タイプE)との融合物として標的タンパク質を発現する安定した細胞株を用いた。これらの株は、種々のオリゴヌクレオチドのパフォーマンスレベルを評価するための貴重なツールである:アンチセンス活性は、レポータータンパク質の蛍光の減少によって測定される。例外的なアンチセンス活性を有するオリゴヌクレオチドを見出すために、種々の配列を有する少なくとも50のオリゴヌクレオチドを、同じ遺伝子についてスクリーニングすることが必須である。細胞におけるこのスクリーニングの過程において、本発明者らは、特に、標的RNAに対して最も強い親和性を有し、そして細胞中に侵入する能力が最も高いオリゴヌクレオチドを探した。
本発明に従う装置を用いて実施される実験
リン酸カルシウムトランスフェクションは非常に効率的であるので、それを選択した:Cy5(シアニン5)で標識したオリゴヌクレオチド(これらのオリゴヌクレオチドは、Eurogentic社により販売されている)を用い、70%のHEK293(ヒト胎生期腎臓)細胞及び80%のCOS(チャイニーズ卵巣サルコーマ)細胞が、1日間の培養後、蛍光性(フローサイトメトリーによって測定される蛍光)となった。DNAの周辺の脂質の液滴の形成を含む他のトランスフェクション法を用いることもできる。
リン酸カルシウムトランスフェクションは非常に効率的であるので、それを選択した:Cy5(シアニン5)で標識したオリゴヌクレオチド(これらのオリゴヌクレオチドは、Eurogentic社により販売されている)を用い、70%のHEK293(ヒト胎生期腎臓)細胞及び80%のCOS(チャイニーズ卵巣サルコーマ)細胞が、1日間の培養後、蛍光性(フローサイトメトリーによって測定される蛍光)となった。DNAの周辺の脂質の液滴の形成を含む他のトランスフェクション法を用いることもできる。
実験1a:液滴融合によるトランスフェクション
標的遺伝子として、種々の配列を有する50のオリゴヌクレオチドを選択する。本発明者らは、カゼインキナーゼのβ2サブユニットの発現をブロックするために努力した。これらのオリゴヌクレオチドは、18〜21ヌクレオチド長残基の形態で合成され、そしてヌクレアーゼによるこれらの分解を制限することができるホスホロチオエート結合を含む。これらのオリゴヌクレオチドの各々を、リン酸カルシウムの形態で沈殿させる(従来の反応:水に1mMで再懸濁したオリゴヌクレオチド1μlを、0.25Mの塩化カルシウム100μl及びHBS緩衝液100μlと混合する(Chen及びOkayama、Biotechniques 1988、6、632−638))。1mlの鉱油を含むプラスチックディッシュ中でのトランスフェクションを実施するために、これらの50の沈殿物の各々1μlの液滴を、細胞培養培地(Gibco社により販売されているDMEM)中の細胞の液滴10μl(約5000個の3T3線維芽細胞)と融合させる。これらの液滴をプラスチックの支持体上のディッシュの底で、油の下に配置する。
標的遺伝子として、種々の配列を有する50のオリゴヌクレオチドを選択する。本発明者らは、カゼインキナーゼのβ2サブユニットの発現をブロックするために努力した。これらのオリゴヌクレオチドは、18〜21ヌクレオチド長残基の形態で合成され、そしてヌクレアーゼによるこれらの分解を制限することができるホスホロチオエート結合を含む。これらのオリゴヌクレオチドの各々を、リン酸カルシウムの形態で沈殿させる(従来の反応:水に1mMで再懸濁したオリゴヌクレオチド1μlを、0.25Mの塩化カルシウム100μl及びHBS緩衝液100μlと混合する(Chen及びOkayama、Biotechniques 1988、6、632−638))。1mlの鉱油を含むプラスチックディッシュ中でのトランスフェクションを実施するために、これらの50の沈殿物の各々1μlの液滴を、細胞培養培地(Gibco社により販売されているDMEM)中の細胞の液滴10μl(約5000個の3T3線維芽細胞)と融合させる。これらの液滴をプラスチックの支持体上のディッシュの底で、油の下に配置する。
2日間の培養後、その発現のブロッキングを調査している標的タンパク質と共にタンデムに発現されるGFPの蛍光の減少によって、アンチセンス活性を測定する。50の液滴の蛍光が、顕微鏡下で同時に観察される。結果が信頼性のあるものであることを確認するために、この実験を、並行して数回実施する。これらのオリゴヌクレオチドの各々のアンチセンス活性を比較するためには、これらの50の試験を並行して実施することが重要である。標的タンパク質の蛍光の減少を観察するために、トランスフェクトされた細胞を、これらの細胞が生きた状態で、顕微鏡下で観察すること、またはパラホルムアルデヒド(慣用的には4%のPFA)でこれらの細胞を固定することのいずれもが可能である。細胞を固定するために、細胞の液滴に、等容量のパラホルムアルデヒドを10分間にわたって添加し、次いでこれらの液滴及びオイルの混合物をPBSで2回リンスする。
実験1b:細胞チップからのオリゴヌクレオチドの光切断及びトランスフェクション
この実験は、図3に例示される。
この実験は、図3に例示される。
従来のDNAチップを用いた。そしてトランスフェクションが、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの脱着後にもたらされる。これらの細胞をガラススライド上の、オリゴヌクレオチド配置の近傍で培養する。
シラン処理したスライド(例えば、Motorola社により販売されているSurmodics slide)に、オリゴヌクレオチド(Eurogentec社によって販売されている)を、5’アミノ末端を介して付着させる。配置されたDNAを、リン酸カルシウム塩と複合体化させ(実施例1aに記載されるようなDNA沈降の原理と同じものに従う)、そしてスライド上を湿潤に保つ。次いで、オリゴヌクレオチドスポットの表面で、液滴中の付着性の3T3細胞を配置し、そしてこの組合せ全体を、1mlの鉱油の下、細胞インキュベーター中で、1日間維持する:これらの液滴は、DNA配置物の表面で形成され得るか、または複合表面(親水性及び疎水性、応用No.5に記載されるProLabo slide)を用いても形成され得る。リン酸カルシウムと複合体化し、そして液滴中の細胞培養物の下に配置されたオリゴヌクレオチドの脱着は、365nmでのUV照射を用いるこのスライドの照明(これは、オリゴヌクレオチドの5’位(アミノ部位の3’位)に導入された光切断可能な結合を切断することが可能である)によって、図5に例示されるように、もたらされる。
付着し、次いで光切断によって脱着され次いで最終的に近傍のHEK 293細胞へとトランスフェクトされるオリゴヌクレオチドの例:
II コーディングDNAのトランスフェクション及び組換えタンパク質の発現
本実施例において、本発明者らは、真核細胞中でのタンパク質のファミリーの発現に注目した。現在、分子生物学において、組換えタンパク質の発現は、細胞層上へのコーディングDNAのトランスフェクションによって、ウェル毎にもたらされている。並行したトランスフェクションを用いることによって、いくつかのタンパク質をコードするいくつかのDNAの発現が同時に得る。この装置は、ベクター中のいくつかの構築物を、1つ以上の遺伝子の発現について試験することを可能にする。
本実施例において、本発明者らは、真核細胞中でのタンパク質のファミリーの発現に注目した。現在、分子生物学において、組換えタンパク質の発現は、細胞層上へのコーディングDNAのトランスフェクションによって、ウェル毎にもたらされている。並行したトランスフェクションを用いることによって、いくつかのタンパク質をコードするいくつかのDNAの発現が同時に得る。この装置は、ベクター中のいくつかの構築物を、1つ以上の遺伝子の発現について試験することを可能にする。
本発明に従う装置を用いて実施される実験:
応用2a:1つの細胞タイプにおける組換えタンパク質の発現
本発明に従う装置によるヒトキネシンをコードするDNAファミリーの発現:
キネシンは、類似する生化学的特性を有するタンパク質のファミリーを形成する;これらは微小管モータータンパク質である。これらのタンパク質は、全て真核細胞中に存在する。これらは、ATP加水分解を力学的エネルギーに変換することを可能にし、そして微小管に沿ったオルガネラ、mRNA及びタンパク質複合体の輸送において基本的な役割を果たす。これらは、微小管のポジティブサイド(N−キネシン)またはネガティブサイド(C−キネシン)を移動し得る。これらは、有糸分裂及び減数分裂の間の染色体の移動にも関与し、そして細胞分裂において重要な役割を果たす。以下の文献が参照される:
参考文献1: Compton, D.A. (1999). New tools for the mitotic toolbox. Science 286, 913−914. Miki, H., Setoy, M.Kaneshira, K., Hirokawa, N. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 7004−7011。
応用2a:1つの細胞タイプにおける組換えタンパク質の発現
本発明に従う装置によるヒトキネシンをコードするDNAファミリーの発現:
キネシンは、類似する生化学的特性を有するタンパク質のファミリーを形成する;これらは微小管モータータンパク質である。これらのタンパク質は、全て真核細胞中に存在する。これらは、ATP加水分解を力学的エネルギーに変換することを可能にし、そして微小管に沿ったオルガネラ、mRNA及びタンパク質複合体の輸送において基本的な役割を果たす。これらは、微小管のポジティブサイド(N−キネシン)またはネガティブサイド(C−キネシン)を移動し得る。これらは、有糸分裂及び減数分裂の間の染色体の移動にも関与し、そして細胞分裂において重要な役割を果たす。以下の文献が参照される:
参考文献1: Compton, D.A. (1999). New tools for the mitotic toolbox. Science 286, 913−914. Miki, H., Setoy, M.Kaneshira, K., Hirokawa, N. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 7004−7011。
参考文献2: Wade, R.H., Kozielski, F. (2000). Structural links to kinesin directionality and movement. Nature Structural Biology 7, 456−460。
参考文献3: Kozielski, F., Svergun, D.I., Zaccai, G., Wade, R.H., Koch, M. (2001). The overall conformation of conventional kinesins studied by small−angle xray and neutron−scattering. J. Biol. Chem. 276, 1267−1275。
本発明に従う装置を用いて、本発明者らは、タンデムなGFP及び目的のタンパク質を発現するための発現プラスミド(In Vitrogen社により販売されているpcDNA3.1/CT−GFP−TOPO)を用い、これらのキネシンをコードする約20のDNAの発現を得た。トランスフェクションを、応用1aにおけるように実施した:1mlのオイルの下で液滴を融合させ、リン酸カルシウム沈降したプラスミド10ngを約5000個のHEK293細胞(ヒト胎生期腎臓細胞)を含む10μlの液滴と接触させる。トランスフェクションの1日後、HEK293細胞の液滴は、細胞中でのGFPタンパク質の発現を経て蛍光性となっている。共焦点顕微鏡上でオイル下のこれらの細胞の液滴を観察すること、及びこの装置において発現した各々の蛍光キネシンについて、細胞の区画化を正確に局在化させることが可能であった。
応用2b:いくつかの細胞タイプを用いる本発明に従う装置における組換えタンパク質の発現
グリア細胞によるPax6因子の組換え発現:10ngのリン酸カルシウム沈降させた(リン酸カルシウムを用いたDNAの沈降は、応用1aを参照のこと)Pax6因子及びGFPをコードする遺伝子をタンデムに含むプラスミド(InVitrogen社により販売されているpcDNA3.1/CT−GFP−TOPO)を、約5000個のグリア細胞(出生後の皮質由来の放射状グリア細胞(radial glial cell)、2分割(division))を含む10μlの液滴と接触させる。1日の培養の後、グリア細胞の液滴G1を、5000個の皮質細胞(出生後の大脳皮質から単離した皮質の初代培養物)を含む10μlの別の液滴G2と融合させる。Pax6因子を発現するG1の組換えグリア細胞は、例えば、G2に含まれる星状細胞の神経発生を誘導することができる。
グリア細胞によるPax6因子の組換え発現:10ngのリン酸カルシウム沈降させた(リン酸カルシウムを用いたDNAの沈降は、応用1aを参照のこと)Pax6因子及びGFPをコードする遺伝子をタンデムに含むプラスミド(InVitrogen社により販売されているpcDNA3.1/CT−GFP−TOPO)を、約5000個のグリア細胞(出生後の皮質由来の放射状グリア細胞(radial glial cell)、2分割(division))を含む10μlの液滴と接触させる。1日の培養の後、グリア細胞の液滴G1を、5000個の皮質細胞(出生後の大脳皮質から単離した皮質の初代培養物)を含む10μlの別の液滴G2と融合させる。Pax6因子を発現するG1の組換えグリア細胞は、例えば、G2に含まれる星状細胞の神経発生を誘導することができる。
この応用は、神経栄養に関する潜在能力を有する新規医薬品のスクリーニング(例えば、パーキンソン病により障害を負った脳におけるドパミン作動性ニューロンを再生することができる化合物の検索)に重要である。
例えば、以下の文献:
参考文献4: Heinsら、Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6, Nature Neuroscience (2002) 5, 308−315
が参照され得る。
参考文献4: Heinsら、Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6, Nature Neuroscience (2002) 5, 308−315
が参照され得る。
III−閉じ込められた(confined)培地中でウイルスまたはプリオンを用いるトランスフェクション
本発明に従う系は、容易に閉じ込められ得る:液滴の形成は、ユーザーが介入することなく機械的に実施され得、そしてこれらの液滴は、オイルの層の下に数日間保持されることによって、汚染されずに維持され得る。ウイルストランスフェクションは、以下の2つの方法:
−真核細胞の液滴とウイルスの液滴との融合
−「危険性のある」細胞サンプルでの細胞のコンタミネーション
によってもたらすことができる。
本発明に従う系は、容易に閉じ込められ得る:液滴の形成は、ユーザーが介入することなく機械的に実施され得、そしてこれらの液滴は、オイルの層の下に数日間保持されることによって、汚染されずに維持され得る。ウイルストランスフェクションは、以下の2つの方法:
−真核細胞の液滴とウイルスの液滴との融合
−「危険性のある」細胞サンプルでの細胞のコンタミネーション
によってもたらすことができる。
液滴中で、ウイルスもしくは病原性因子を産生すること(増幅及びカプセル化)、またはそれを検出すること(生物学的濃度及び抗原−抗体反応)が可能である。
IV − プロモーターゲノム配列の実証
プロモーター配列、ゲノムの比較的未知な部分:
レポーター遺伝子技術、より詳細には「プロモーター領域−レポーター活性」構築技術は、遺伝子の上流の調節領域を特徴付けるために広範に用いられている。今日、マイクロ工学は、研究されるプロモーターの数を非常に増加させることを可能にしている。これらの領域の転写調節は、GFP(緑色蛍光タンパク質)をコードするレポーター遺伝子の使用を介してリアルタイムで観察され得る。このタンパク質の蛍光は、細胞を溶解することを必要とせずに観察され得る。蛍光のバリエーションによって、多数のプロモーターの転写調節のキネティックスを並行してリアルタイムで研究することができる。
プロモーター配列、ゲノムの比較的未知な部分:
レポーター遺伝子技術、より詳細には「プロモーター領域−レポーター活性」構築技術は、遺伝子の上流の調節領域を特徴付けるために広範に用いられている。今日、マイクロ工学は、研究されるプロモーターの数を非常に増加させることを可能にしている。これらの領域の転写調節は、GFP(緑色蛍光タンパク質)をコードするレポーター遺伝子の使用を介してリアルタイムで観察され得る。このタンパク質の蛍光は、細胞を溶解することを必要とせずに観察され得る。蛍光のバリエーションによって、多数のプロモーターの転写調節のキネティックスを並行してリアルタイムで研究することができる。
本発明に従う装置を用いて実施される実験:
電離性放射線により誘導される既知の遺伝子(例えば、p53及びc−myc遺伝子)のレポーター活性を、チップ及び実験モデルのバリデーションのために用いた。p53及びc−myc遺伝子の上流の目的の配列を増殖し、次いでベクターphrGFP(Genentech)におけるGFP遺伝子の上流にクローニングした。応用1aにおけるようにトランスフェクションを実施した:オイルの下で液滴の融合をもたらし、リン酸カルシウム沈降したプラスミド(DNAプロモーター配列を保有するphrGFP)10ngを約5000個のヒトケラチノサイト細胞を含む10μlの液滴と接触させる。皮膚中というその位置によって、ケラチノサイトは、インビボで放射線に最も曝される細胞タイプの1つを示す。トランスフェクションの1日後、ケラチノサイトの液滴は、細胞におけるGFPタンパク質の発現に起因して蛍光性である。GFPレポーター活性は、CCD(電子結合素子)カメラと組み合わせた顕微鏡による蛍光の全体的な読みとりによって測定される。
電離性放射線により誘導される既知の遺伝子(例えば、p53及びc−myc遺伝子)のレポーター活性を、チップ及び実験モデルのバリデーションのために用いた。p53及びc−myc遺伝子の上流の目的の配列を増殖し、次いでベクターphrGFP(Genentech)におけるGFP遺伝子の上流にクローニングした。応用1aにおけるようにトランスフェクションを実施した:オイルの下で液滴の融合をもたらし、リン酸カルシウム沈降したプラスミド(DNAプロモーター配列を保有するphrGFP)10ngを約5000個のヒトケラチノサイト細胞を含む10μlの液滴と接触させる。皮膚中というその位置によって、ケラチノサイトは、インビボで放射線に最も曝される細胞タイプの1つを示す。トランスフェクションの1日後、ケラチノサイトの液滴は、細胞におけるGFPタンパク質の発現に起因して蛍光性である。GFPレポーター活性は、CCD(電子結合素子)カメラと組み合わせた顕微鏡による蛍光の全体的な読みとりによって測定される。
V−液滴中での新規医薬品のスクリーニング
一般的コメント:製薬産業において、過去10年の間、スクリーニングは、組換えタンパク質ターゲットに対して実施されてきた。いくつかの例(例えば、グルタメート受容体)において、単離した原形質膜中に存在する組換え受容体が、その生物学的コンフォメーションでは存在していなかったことが注目される;これらの受容体は、特に、シナプス中に存在するシャペロンタンパク質と共に共発現(coexpress)される必要がある。例えば、以下の文献が参照され得る:
参考文献5: Ohnumaら、Gene expression of PSD95 in prefrontal cortex and hippocampus in schizophrenia. Neuroreport. (2000) 11 (14):3133−7。
一般的コメント:製薬産業において、過去10年の間、スクリーニングは、組換えタンパク質ターゲットに対して実施されてきた。いくつかの例(例えば、グルタメート受容体)において、単離した原形質膜中に存在する組換え受容体が、その生物学的コンフォメーションでは存在していなかったことが注目される;これらの受容体は、特に、シナプス中に存在するシャペロンタンパク質と共に共発現(coexpress)される必要がある。例えば、以下の文献が参照され得る:
参考文献5: Ohnumaら、Gene expression of PSD95 in prefrontal cortex and hippocampus in schizophrenia. Neuroreport. (2000) 11 (14):3133−7。
より正確であり、そしてインビボでの挙動により近い結果を得るために、生きた細胞に対する一連の化学物質のスクリーニングが、ここで、想定される。この場合、スクリーニングは、その間、細胞が生存した状態で維持されている動的な(dynamic)試験を用いて実施される。参考例:
参考文献6: Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells, Satoら、Nature Biotech (2002) 20, 287−294)。
参考文献6: Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells, Satoら、Nature Biotech (2002) 20, 287−294)。
研究モデル:細胞液滴の調製
本実験を、図6に例示する。生きた細胞を、固体支持体上に、同質の液滴中で配置させる。この細胞性装置の調製は、複合的表面(親水性及び疎水性)、Teflon(登録商標)フィルムで被覆され、そして直径3mmの親水性円形ウェルを含む、ProLabo社により販売されているガラススライドを用いることによって容易になり得る。細胞懸濁液中に支持体を単純に浸漬することによって多数の同質の液滴が製造され得る。次いで、これらの液滴の乾燥を防ぐため及びスクリーニングアッセイまでの細胞の生存を促進するために、これらの液滴を、鉱油の層で覆う。細胞液滴は、細胞培養のために意図されるインキュベーター中、このタイプの支持体上で数日間保存され得る。n個の異なる分子をスクリーニングするために、予め形成した細胞液滴に対して、n滴の試験化合物を別個に配置させる。
本実験を、図6に例示する。生きた細胞を、固体支持体上に、同質の液滴中で配置させる。この細胞性装置の調製は、複合的表面(親水性及び疎水性)、Teflon(登録商標)フィルムで被覆され、そして直径3mmの親水性円形ウェルを含む、ProLabo社により販売されているガラススライドを用いることによって容易になり得る。細胞懸濁液中に支持体を単純に浸漬することによって多数の同質の液滴が製造され得る。次いで、これらの液滴の乾燥を防ぐため及びスクリーニングアッセイまでの細胞の生存を促進するために、これらの液滴を、鉱油の層で覆う。細胞液滴は、細胞培養のために意図されるインキュベーター中、このタイプの支持体上で数日間保存され得る。n個の異なる分子をスクリーニングするために、予め形成した細胞液滴に対して、n滴の試験化合物を別個に配置させる。
化合物を支持体の表面上にグラフトさせ(grafted)(オリゴヌクレオチドに関して、応用1bにおいて)次いで(例えば、UV照射によって)一緒に脱着させることを想定することも可能である。これらの分子への光切断部位の挿入は、コンビナトリアル化学によってもたらされ得る。
単純な動的スクリーニング試験(例:FRET=電子移動による蛍光共鳴)が、これらの化合物のいくつかの特性を実証するために用いられ得る。
5.1.スクリーニング例:アドレナリン受容体の活性測定:
以下の文献が参照され得る:
参考文献7:Ghanouniら、Agonist induces conformational changes in the G protein coupling domain of the beta2 adrenergic receptor, PNAS (2001) 98, 11, 5997−6002。
以下の文献が参照され得る:
参考文献7:Ghanouniら、Agonist induces conformational changes in the G protein coupling domain of the beta2 adrenergic receptor, PNAS (2001) 98, 11, 5997−6002。
β2アドレナリン受容体の1つのシステイン(cys265)にフルオレセインを結合させて、このタンパク質が細胞膜に挿入された場合に蛍光性であるようにすることが可能である。新規の潜在的医薬品のアドレナリン作動特性を試験するために、オイルの下で、溶液中にその分子を含む100nlの液滴を、組換え及び変異アドレナリン受容体を発現する500個の組換え細胞をその培養培地中に含む1μlの液滴と接触させる。顕微鏡下で、アドレナリン受容体中に含まれるフルオレセインの蛍光強度の減少を介して、アゴニストによる受容体のコンフォメーション変化の誘導が観察される。
5.2.スクリーニング例:組換え細胞に対する免疫組織化学
トランスフェクションの後、PFAを用いて、支持体上に組換え細胞を固定化することができる(応用No.1を参照のこと)。本発明に従う装置を用いたカゼインキナーゼのβ2サブユニットの組換え発現の場合、本発明者らは、3T3細胞における組換えタンパク質の発現を明らかにするために抗体を用いた(Upstate Biotechnolog社により販売されている抗体:ウサギポリクローナル抗−CK2β抗体)。参考文献8:Alexandre E. Escargueilら、Mitotic Phosphorylation of DNA Topoisomerase II by Protein Kinase CK2 Creates the MPM2 Phosphoepitope on Ser−1469, J. Biol. Chem. (2000), 275, Issue 44, 34710−347183.が参照され得る。
トランスフェクションの後、PFAを用いて、支持体上に組換え細胞を固定化することができる(応用No.1を参照のこと)。本発明に従う装置を用いたカゼインキナーゼのβ2サブユニットの組換え発現の場合、本発明者らは、3T3細胞における組換えタンパク質の発現を明らかにするために抗体を用いた(Upstate Biotechnolog社により販売されている抗体:ウサギポリクローナル抗−CK2β抗体)。参考文献8:Alexandre E. Escargueilら、Mitotic Phosphorylation of DNA Topoisomerase II by Protein Kinase CK2 Creates the MPM2 Phosphoepitope on Ser−1469, J. Biol. Chem. (2000), 275, Issue 44, 34710−347183.が参照され得る。
VI−分子チップのバリアント
図7は、このバリアントを例示する:培養培地中の細胞の液滴を、Teflon支持体上にマトリクスの形態で配置する。スクリーニングライブラリの有機分子がグラフトされ、液滴の容量と実質的に等しい容量を有するキャビティー(cavity)を備えるPDMSカバーを、この支持体上に配置する。液滴間の間隔が支持体とカバーとの間に正確に対応するように、液滴間の間隔を設計した。細胞をトランスフェクトするために、任意の適切な処理によって、これらの分子をカバーから脱着した。
図7は、このバリアントを例示する:培養培地中の細胞の液滴を、Teflon支持体上にマトリクスの形態で配置する。スクリーニングライブラリの有機分子がグラフトされ、液滴の容量と実質的に等しい容量を有するキャビティー(cavity)を備えるPDMSカバーを、この支持体上に配置する。液滴間の間隔が支持体とカバーとの間に正確に対応するように、液滴間の間隔を設計した。細胞をトランスフェクトするために、任意の適切な処理によって、これらの分子をカバーから脱着した。
VII−電場中での液滴の移動
支持体上での液滴(その表面張力が電場の印加により変化する)の移動を試験した:親水性ブロックを除いて疎水性の性質である、試験される支持体上で、電場の強度につれて表面張力が減少し;表面は、より疎水性でなくなるか、または親水性にさえなる。電場の調節及び移動は、この表面上での液滴の移動を可能にする。細胞の液滴の移動を、1000Vの電場において実施した(Hela細胞懸濁液を106細胞/mlで含む5μlの液滴:PBS中のトリパンブルー(1/5))。
支持体上での液滴(その表面張力が電場の印加により変化する)の移動を試験した:親水性ブロックを除いて疎水性の性質である、試験される支持体上で、電場の強度につれて表面張力が減少し;表面は、より疎水性でなくなるか、または親水性にさえなる。電場の調節及び移動は、この表面上での液滴の移動を可能にする。細胞の液滴の移動を、1000Vの電場において実施した(Hela細胞懸濁液を106細胞/mlで含む5μlの液滴:PBS中のトリパンブルー(1/5))。
トリパンブルーは、細胞生存マーカーである。染色された細胞の%が2%を超えなかったので、このトリパンブルーと細胞の混合反応により、この電場が細胞を殺傷していないことを実証できる。
VIII−自動化トランスフェクション
市販のスライド上で手動で実施される、液滴中に細胞を含むチップ上でのトランスフェクションの実施は、マイクロバッテリーを製造するための自動化装置に移すことができ、従って、自動化DNAトランスフェクションの特定の方法を実施することを可能にすることができる。ここで、3つの液滴の3連の連続する配置を、同じチップ上、従って、市販のスライドの同じブロック上で実施する;これらの液滴は融合して、試薬と細胞とを混合させる。
市販のスライド上で手動で実施される、液滴中に細胞を含むチップ上でのトランスフェクションの実施は、マイクロバッテリーを製造するための自動化装置に移すことができ、従って、自動化DNAトランスフェクションの特定の方法を実施することを可能にすることができる。ここで、3つの液滴の3連の連続する配置を、同じチップ上、従って、市販のスライドの同じブロック上で実施する;これらの液滴は融合して、試薬と細胞とを混合させる。
実験:
1.サンプル調製
配置される種々のサンプルを含む96ウェルを備えるプレート:DNA溶液、トランスフェクション媒体、細胞培地を調製する。
1.サンプル調製
配置される種々のサンプルを含む96ウェルを備えるプレート:DNA溶液、トランスフェクション媒体、細胞培地を調製する。
2.細胞へとトランスフェクトされるDNA(一本鎖オリゴヌクレオチド、PCR産物またはプラスミド)の配置:
ロボット装置は、96ウェルプレートから、これらのDNAのうち1つを含む2μlの溶液を取り出し、次いでそれは、種々のDNAについて、スライドのブロックのうち1つ上に、10nlの液滴を配置させるなどである。従って、本発明者らは、10nMの濃度でオリゴヌクレオチド10nl(オリゴ:5’配列番号2 CGGAGGCGATGGTGTTGGA 3’ − CY3で5’を標識されている20マー)及び1mg/mlの濃度でGFPタンパク質をコードするプラスミド(pEGFP−C1、Clonetech)の10nlの溶液を配置した。図9は、最初の3滴を配置させたプレートを示す写真である。
ロボット装置は、96ウェルプレートから、これらのDNAのうち1つを含む2μlの溶液を取り出し、次いでそれは、種々のDNAについて、スライドのブロックのうち1つ上に、10nlの液滴を配置させるなどである。従って、本発明者らは、10nMの濃度でオリゴヌクレオチド10nl(オリゴ:5’配列番号2 CGGAGGCGATGGTGTTGGA 3’ − CY3で5’を標識されている20マー)及び1mg/mlの濃度でGFPタンパク質をコードするプラスミド(pEGFP−C1、Clonetech)の10nlの溶液を配置した。図9は、最初の3滴を配置させたプレートを示す写真である。
3.トランスフェクトされるDNAのブロックに対するトランスフェクション溶液の配置
ここで、PBS中に1/20に希釈した(供給者のプロトコル)「siPORT」(Ambion)の0.2μlの液滴を、各々のブロックに配置し、そして既に配置されているDNA溶液と混合する。
ここで、PBS中に1/20に希釈した(供給者のプロトコル)「siPORT」(Ambion)の0.2μlの液滴を、各々のブロックに配置し、そして既に配置されているDNA溶液と混合する。
4.細胞の配置
本発明者らは、既にDNA及びsiPORTを含む各々のブロックに103個のHeLa細胞を含む1μlの液滴(106細胞/mlの初濃度)を配置した。
本発明者らは、既にDNA及びsiPORTを含む各々のブロックに103個のHeLa細胞を含む1μlの液滴(106細胞/mlの初濃度)を配置した。
細胞を配置した後、これらのスライドを(細胞培地の蒸発を防ぐための)PBSを含むペトリ皿中に配置する。次いで、これらを、細胞インキュベーター(37℃、5%CO2)に移して48時間EGFPタンパク質を発現させる。
この培養工程の後、これらの細胞をパラホルムアルデヒドの溶液(PBS中4%)中に20分間固定し、次いでPBSで2回リンスする。次いで、これらのスライドをPBS中に固定し、次いで顕微鏡下で蛍光を観察する。
Olympus BX52顕微鏡下での細胞の観察は、オリゴCy3でのトランスフェクションについて、細胞質中に拡散する蛍光を示す。この蛍光は、GFPでトランスフェクトされた細胞に関して、第一に、核においてより強く、次いでそれは、細胞質中に拡散する。陰性コントロール(細胞なしまたはDNAなし)は、蛍光を示さない。
Claims (59)
- 試薬Rと少なくとも1つの細胞Cとを反応させるための方法であって、該方法は:
−該細胞Cが、実質的に平坦な表面を含む支持体S上に、該表面上の水性の液滴(aqueous drop)の形態で配置されること;
−該細胞Cを含む水性の液滴が配置されている該支持体Sの実質的に平坦な表面が、気体を透過させかつ該支持体S上に配置した水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われ、Fは試薬Rと不混和性であること;
−該試薬Rと該細胞Cとの間の反応が、該細胞Cを含む水性の液滴中に該試薬Rを導入することによって引き起こされること、
により特徴付けられる。 - 前記液滴が、キャピラリーによって前記支持体Sに付着することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記支持体Sが、シリコン、ガラスまたはポリマーから選択される材料から作製されるプレートから構成されることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記支持体Sが、その平坦な表面上に、前記水性の液滴を受けるための少なくとも1つの手段を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞Cを含む水性の液滴が前記支持体S上に配置され、任意の適切な注入手段を用いて、該細胞Cを含む液滴中に、前記試薬Rを含む第二の水性の液滴が直接的に注入されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の水性の液滴が前記支持体S上に配置され、次いで第二の液滴が同じ支持体上の第1の液滴の近傍に配置され、これらの液滴の一方が前記細胞Cを含み、他方が前記試薬Rを含み、そして該試薬Rと該細胞Cとの反応が、2つの液滴の融合によって引き起こされることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試薬Rが前記支持体Sまたは前記フィルムFに付着し、前記細胞Cが水性の液滴の形態で該支持体S上に配置され、次いで該試薬Rが、該支持体Sまたは該フィルムFから脱着されて該細胞と反応することが可能になることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離フィルムFがオイル及び有機溶媒から選択される液体であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離フィルムFが鉱油及びシリコーンオイルから選択されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記分離フィルムFが水分で飽和した空気であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離フィルムFが可撓性の固体フィルムであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分離フィルムFがポリジメチルシロキサンまたはニトロセルロースから作製されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記分離フィルムFが多孔質材料から作製される硬いハニカム状カバーであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の細胞または試薬を含む前記水性の液滴が、微細なキャピラリーによって前記支持体S上に配置されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の細胞または試薬を含む水性の液滴が、ノズルによって前記支持体S上に配置されることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 第一のシリーズの液滴が前記支持体S上に配置された後に、該支持体Sを移動させるための工程を含むことを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 水性の液滴の形態の細胞培養物が少なくとも24時間保存されることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 各々少なくとも1つの細胞を含む複数の水性の液滴が、前記分離フィルムFの下、前記支持体S上に配置され、該液滴が互いに離れていることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 1つの液滴が1〜100個の細胞を含むことを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる細胞が種々の液滴中に配置されることを特徴とする、請求項18及び19のいずれか一項に記載の方法。
- 同一の細胞が種々の液滴中に配置されることを特徴とする、請求項18及び19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体が、親水性領域を含む疎水性プレートであること、及び前記細胞を含む水性の液滴の注入工程が、該細胞を含む水溶液中への該プレートの浸漬で置換されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- 前記試薬分子が前記支持体上への配置後に、インサイチュ合成、液滴中でのインビトロ転写、ペプチドポリメラーゼ連鎖反応及び核酸ポリメラーゼ連鎖反応から選択される方法によって、直接的に調製されることを特徴とする、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試薬がDNA分子であることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAが特に、リン酸カルシウムの形態で沈降している形態であることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 前記試薬が、転写因子であることを特徴とする、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 同じ細胞と反応することが意図される複数の試薬が連続的に配置されることを特徴とする、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を含むいくつかの水性の液滴が配置され、そしてこれらの液滴が融合されることを特徴とする、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 同じ液滴中でグリア細胞とニューロンとを連絡させるように、これらが配置されることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 試薬が第一の細胞タイプ中で反応して、組換えタンパク質の産生のような細胞性反応を引き起こし、次いで該第一の細胞が、別の液滴との融合によって、別のタイプの細胞と反応することを特徴とする、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 第一のタイプの少なくとも1個の細胞を含む水性の液滴が該分離手段の一方のサイドに配置され、そして第二のタイプの少なくとも1つの細胞を含む水性の液滴が該分離手段の他方のサイドに配置され、次いで細胞液滴が融合されることを特徴とする、前記支持体が分離手段を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試薬が、標識分子、特に蛍光放射活性標識から選択されることを特徴とする、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が:初代培養細胞、ハイブリドーマ、細胞株、幹細胞、細胞組織片、及びこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬Rと細胞Cとを反応させるための装置であって、該装置は:
−実質的に平坦な表面を含む支持体S(該支持体Sは、気体の透過を可能にし、かつ該支持体S上に配置された水性の液滴の蒸発を防ぐ分離フィルムFで覆われており、Fは、試薬Rと不混和性である)、
−該表面の上かつ該フィルムFの下に、該細胞Cを含む水性の液滴を配置するための手段、
−該細胞Cが生存することを可能にするように該支持体Sが配置される、調整雰囲気(controlled atomosphere)チャンバ、
を備えることを特徴とする。 - 前記支持体Sが、シリコン、ガラスまたはポリマーから選択される材料から製造されるプレートにより構成されることを特徴とする、請求項34に記載の装置。
- 前記支持体Sが、その平坦な表面上に、水性の液滴の受容が意図される少なくとも1つの手段を有することを特徴とする、請求項34及び35のいずれか一項に記載の装置。
- 前記水性の液滴の受容が意図される手段が、5μm2〜5mm2の範囲のサイズである該支持体Sの平坦な表面の領域から構成されることを特徴とする、請求項36に記載の装置。
- 前記支持体Sが以下のa)〜d)の特徴:
a)該支持体Sがその平坦な表面上に疎水性の性質を示し、そして前記受容手段を構成する1つ以上の親水性領域を含むこと;
b)該支持体Sがその平坦な表面上に、該受容手段を構成する1ミクロン〜1ミリメートルの範囲の深さのキャビティー(cavity)を含むこと;
c)該支持体Sが、その表面上にアレンジされかつ前記液滴の付着を促進することが意図された1ミクロン〜1ミリメートルの範囲の厚さのアウトグロース(outgrowth)を備えたプレートであること;
d)該支持体Sが、該液滴が付着する少なくとも1つのワイヤを備えるプレートであること、
の少なくとも1つを有することを特徴とする、請求項36または請求項37に記載の装置。 - 前記支持体Sがその平坦な表面上に疎水性の性質を示し、かつ1つ以上の親水性領域を含む請求項38に記載の装置であって、それが、第一の手段上に重ねられた、前記液滴を受容するための第二の手段も含むことを特徴とする装置。
- 前記支持体S上に水性の液滴を配置するための手段が微細なキャピラリーから構成されることを特徴とする、請求項34〜39のいずれか一項に記載の装置。
- 前記支持体S上に水性の液滴を配置するための手段がノズルを備えた圧電システムから構成されることを特徴とする、請求項34〜40のいずれか一項に記載の装置。
- 前記装置の支持体Sがモバイル(mobile)であることを特徴とする、請求項34〜41のいずれか一項に記載の装置。
- 前記支持体Sがその2つの末端でローラーに取り付けられた固体のフィルムから構成され、該ローラーが、該フィルム及びその上に配置された液滴の移動を可能にするワインディング手段(winding means)を備えていることを特徴とする、請求項34〜42のいずれか一項に記載の装置。
- 請求項34〜43のいずれか一項に記載の装置であって、それが:
−前記支持体上に配置された1つ以上の液滴にエネルギーを供給するための手段;
−該支持体上に配置された1つ以上の液滴の光学処理のための手段;
−該支持体上に配置された1つ以上の液滴に磁場または電場を印加するための手段;
−該支持体上に配置された1つ以上の液滴上に焦点が合わせられる検出手段;
−トランスフェクションを促進することが意図される手段、
から選択される少なくとも1つの手段も含むことを特徴とする。 - 前記装置において用いられる手段が、それを自動化することを可能にする制御装置に接続されていることを特徴とする、請求項34〜44のいずれか一項に記載の装置。
- 前記支持体がマトリクスの形態で均一にアレンジされた受容手段を含むことを特徴とする、請求項34〜45のいずれか一項に記載の装置。
- 前記支持体が、2つの異なる細胞タイプを分離することを可能にするが、該細胞の間の低分子の通過を可能にする分離手段を備えることを特徴とする、請求項33〜45のいずれか一項に記載の装置。
- 前記分離手段が、前記支持体上の受容手段上にアレンジされていることを特徴とする、請求項47に記載の装置。
- 前記1つ以上の細胞を含む水性の液滴が培養培地を含むことを特徴とする、請求項34〜48のいずれか一項に記載の装置。
- 前記支持体が、その親水性/疎水性特性が温度のようなパラメーター、及び電場、磁場または照射の影響下で変化し得る表面を有することを特徴とする、請求項34〜49のいずれか一項に記載の装置。
- 試薬及び細胞の性質を変化させて、該細胞に対する該試薬の多数の反応を、同時かつ自動化された様式で実施するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 生きた細胞に対する一連の化合物のスクリーニングを実施するための、請求項51に記載の使用。
- 神経ネットワーク及び表皮から選択される細胞系を研究するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 核酸分子、タンパク質、ペプチド及びペプチド核酸分子から選択される試薬の、細胞に対する作用を研究するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 組換えタンパク質を発現するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 細胞中の遺伝子発現を改変することが意図される核酸分子をスクリーニングするための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- プロモーターゲノム配列(promoter genomic sequence)を検索するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- 種々のタイプの細胞間での相互作用を研究するための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
- siRNAを調製及びスクリーニングするための、請求項34〜50のいずれか一項に記載の装置の使用。
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