JP7353381B2 - 細胞内物質伝達のためのマイクロ流体システムおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は細胞内物質伝達のためのマイクロ流体システムおよび方法に関する。

細胞内物質伝達は細胞工学の最も基本となる実験の一つで、普通キャリアを利用するか細胞膜／核膜にナノポア（ｎａｎｏｐｏｒｅ）を作って物質を伝達する。ウイルスまたはリポフェクタミン中心のキャリア技法は最適化時に高効率物質伝達が可能であるが、安全性、遅い伝達速度、労動／費用集約的なキャリア準備過程、低い再現性などの問題点が存在する。

これに対して、細胞膜にエネルギーを加えてナノポアを作る多数の方法（例えば：電気穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはマイクロニードル（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ））は相対的に多くの物質を多様な細胞株に伝達が可能な長所がある。しかしながら、方法の浸湿性による低い細胞生存率、伝達物質の変性、そして低い処理量は大きな限界として指摘されている。
このような諸問題を解決するために、大量の細胞処理が可能な多様なマイクロ流体デバイスの使用が目立つ。代表的に、微細管にボトルネック区間を作って細胞がボトルネック区間を通る時に細胞の物理的変形を通じて細胞膜にナノポアを作るプラットフォームが存在する。しかしながら、この接近法は実験を行うときにボトルネック区間自体が詰まり、物質伝達効率が一定でないなどの大きな短所を有する。

例えば、アメリカ特許２０１４－０２８７５０９号はボトルネック構造を有するチャンネルを通じて細胞に圧力を印加して細胞変形率を誘導する技術を開示している。しかしながら、この場合、細胞がボトルネック構造を塞ぐという問題があり、狭窄部の大きさよりも小さい細胞のみに物質伝達が可能であるという問題がある。さらに、微細な直径のチャンネルを用いる必要があるという点で費用が高くなるという問題がある。

したがって、前記マイクロ流体デバイスの高い処理機能を生かしながら細胞内に多様な物質を均一で高効率に伝達することができる革新的な次世代細胞内物質伝達プラットフォームの開発が至急である。

したがって、本発明が解決しようとする課題は、新しい能動伝達手段を用いることなく大量の細胞に高効率で物質を伝達することができるシステムおよび方法を提供することである。

上述した課題のために、本発明は慣性および慣性効果を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達するマイクロ流体システムであって、細胞と外部物質を含む溶液が連続的に流れる流体チャンネル構造を含み、前記流体チャンネル構造は一つ以上のチャンネル間連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含み、前記連結点界面付近で局所渦流が発生し、前記渦流によって細胞は変形され、前記渦流によって細胞膜の一時的不連続性が生成され、前記細胞と細胞周辺流体との間の溶液の交換によって前記外部物質が前記細胞内に導入されることを特徴とするマイクロ流体システムを提供する。

本発明の一実施例で、 また、前記一つ以上のチャンネルの間の連結点を含む流体チャンネル構造は、Ｔ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせを含む連結点を含むことができる。

本発明の一実施例で、前記流体チャンネル構造がＴまたはＹ字状のチャンネルである場合、流体停滞点付近でキャビティを含むことができる。

本発明の一実施例で、前記キャビティは円形、楕円形、長いスリット、正方形、長方形、台形、多角形およびこれらの組み合わせとその変形された形態を含むことができる。

本発明の一実施例で、前記キャビティの直径は前記細胞の直径によって決められる。

本発明の一実施例で、前記マイクロ流体システムは、前記流体チャンネル構造で溶液が流れるようにする流体制御手段をさらに含み、前記流体制御手段は前記連結点界面付近で局所渦流を発生させることができる水準の速度で前記溶液を前記流体チャンネルで流すことができる。

本発明の一実施例で、前記流体制御手段はシリンジポンプまたは空圧システムであってもよい。

本発明の一実施例で、前記溶液のレイノルズ数（Ｒｅ）は１～１０００であってもよい。

本発明の一実施例で、前記渦流特徴は前記レイノルズ数によって決められることができる。

本発明の一実施例で、前記渦流は閉開された再循環流れ形態であってもよい。

本発明の一実施例で、前記マイクロ流体システムは、上述したシステムが直列、並列またはこれらの組み合わせ方式で結合されたものであってもよい。

本発明は、また、慣性および慣性効果を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達する方法であって、前記細胞と外部物質を含む溶液を流体チャンネルで連続的に流すステップと、前記連結点の付近で渦流生成手段によって渦流を形成させるステップと、前記渦流によって前記細胞が変形されるステップと、前記細胞変形によって細胞膜に生成される穿孔を通じて前記外部物質が前記細胞内に導入されるステップと、を含むことを特徴とする慣性を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達する方法を提供する。

本発明の一実施例で、前記渦流生成手段は前記流体チャンネルの連結点構造であってもよい。

本発明の一実施例で、前記流体チャンネルは、Ｔ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせを含む連結点を含むことができる。

本発明によれば、連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を少なくとも一つ以上含む流体チャンネル構造に細胞と外部物質を流すことにより渦流を発生させて、その慣性および慣性効果で細胞を変形させて細胞膜の一時的不連続相を誘導して細胞膜を穿孔させる。その後、穿孔された細胞膜を通じて細胞と細胞周辺流体との間の溶液の交換が発生し、その結果、前記外部物質が前記細胞内に導入される。したがって、本発明はベクトルまたは能動細胞伝達手段（例えば、電場など）を必要としない。そこで、本発明は溶液とチャンネル構造特性のみで外部物質（例えば、遺伝子、プラスミド、ナノ粒子など）を細胞内に高効率で、且つ廉価な費用で直接伝達することができる。

＋連結点チャンネルでの螺旋形渦流形成を示す図面である。 螺旋形渦流による細胞変形模式図（１）と、回転細胞運動を示す高速顕微鏡イメージ（２）（スケールバー：１０μｍ）である。 本発明の一実施例による細胞変形による物質伝達のメカニズムを説明する図面である。 本発明の一実施例による二つの形態のチャンネル構造の模式図と各チャンネルでの細胞変形を説明する図面である。 図４の二つの形態の流体チャンネルが流体の流れ方向に直列的に連結されたマイクロ流体システムの模式図である。 ＋連結点構造チャンネルで互いに連結点（交差点）方向に対向して流入される流体のレイノルズ数による挙動を実験した結果である。 ＋連結点構造チャンネルでの細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）捕獲挙動を見せる高速顕微鏡イメージである。 レイノルズ数関数で図７の渦崩壊による細胞捕獲と細胞変形時間を正規化したグラフである。 本発明の一実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示した図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 本発明の一実施例によるＴ連結点構造チャンネルの模式図である。 キャビティ構造のＴ連結点チャンネルの細胞変形と渦流形成メカニズムを説明する高速顕微鏡イメージである。ここで、矢印のそれぞれは流体の流れ方向を意味する。 互いに異なるレイノルズ数を有する流体での渦流変形指数（ＶＤＩ）分析結果である。 本発明の一実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示した図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。 細胞内への物質伝達量の分析結果である。 細胞内への物質伝達量の分析結果である。 図１９と同一条件でレイノルズ数を異にして細胞生存率を測定した結果である。 多様なデキストランの大きさに対する伝達効率性分析結果である。 図５の複合マイクロ流体システム（＋連結点チャンネルとＴ連結点チャンネルの組み合わせ）でのデキストラン伝達効率を測定した結果である。 従来の電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、ａ Ｎｅｏｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ））と本発明による慣性基盤物質伝達方法（ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の伝達効率の比較結果である。 金ナノ粒子（ＧＮＰ）の細胞内伝達効果を分析した写真である。 金ナノ粒子（ＧＮＰ）の細胞内伝達効果を分析した散乱地点をカウントした結果である。 ＧＮＰ伝達による細胞生存率を測定した結果である。 散乱スポット個数にセル生存率を掛けて正規化された収率を計算した結果である。 金ナノ粒子の代わりに薬物、タンパク質、および核酸ナノキャリアに用いられるメソポーラスシリカナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＭＳＮ））の細胞内伝達効率を分析した結果である。 図３０の分析物質に対する時間依存的細胞生存力分析結果である。 ｍＲＮＡ（９９６－ヌクレオチドｍＲＮＡ切れ、緑色蛍光タンパク質）を外部物質として用いてＫ５６２細胞への伝達効果を測定した蛍光強度ヒストグラムである。 （Ｃ）エンドサイトーシスおよび（Ｄ）本発明によるマイクロ流体システムによってｍＲＮＡをＫ５６２に伝達した後の蛍光イメージである。 図３２および３３のようにｍＲＮＡが本発明によって伝達される場合、伝達効率（Ｅ）と生存率（Ｆ）を測定した結果である。 エンドサイトーシスと実施例２の方法でｍＲＮＡ（９９６－ヌクレオチドｍＲＮＡ切れ、緑色蛍光タンパク質）をＫ５６２細胞内に伝達した後の蛍光イメージである。 ｍＲＮＡトランスフェクション効率（ｂ）とｍＲＮＡ濃度による平均蛍光強度（ｃ）を分析した結果である。 エンドサイトーシス（ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例２の方法でプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３ｔに伝達した後の蛍光イメージである。 ＨＥＫ２９３ｔ細胞のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）トランスフェクション効率（e）とプラスミドＤＮＡ濃度による平均ＨＥＫ２９３ｔ細胞の平均強度（f）を分析したグラフである。 ＨｅＬａ細胞（インテグリン膜横断受容体のα１サブユニット）にｓｉＲＮＡを伝達してＩＴＧａ１遺伝子ノックダウン効果をウェスタンブロットで分析した結果である。 ＨｅＬａ細胞（インテグリン膜横断受容体のα１サブユニット）にｓｉＲＮＡを伝達してＩＴＧａ１遺伝子ノックダウン効果を相対的発現程度を比較した結果である。 リポフェクタミン３０００、電気穿孔方式および本発明による形質収率の分析結果である。 ヒトＭＳＣ、ヒトＡＤＳＣ、鼠ＢＭＤＣに対するトランスフェクション効率、細胞生存率および形質転換収率の分析結果である。 ヒトＭＳＣ、ヒトＡＤＳＣ、鼠ＢＭＤＣに対するトランスフェクション効率、細胞生存率および形質転換収率の分析結果である。 ヒトＭＳＣ、ヒトＡＤＳＣ、鼠ＢＭＤＣに対するトランスフェクション効率、細胞生存率および形質転換収率の分析結果である。 本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）およびリポフェクタミン３０００によって量子ドット（ｑｄｏｔ６２５）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に伝達されることを見せる共焦点顕微鏡イメージである。 細胞当たり量子ドット（Ｑｄｏｔ ６２５）のスポットカウント数分析結果である。 陰性対照群（未処理されたＫ５６２細胞、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、陽性対照群（ナノ球とともに培養されたＫ５６２細胞、実施例と同一時間、同一濃度）および本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）によってナノ球（緑色蛍光シリカナノ球、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ、ドイツ）がＫ５６２細胞に伝達された実施例（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ、サンプル当たりＮ_ｃｅｌｌ＝５，０００）の蛍光強度ヒストグラムである。 相対的平均蛍光強度測定結果である。 図４７および４８のグループの中の二つのグループに対する共焦点イメージである。 図４７および４８のグループの中の二つのグループに対する共焦点イメージである。

以下、本発明による慣性を基盤とした細胞内物質伝達システムの好ましい実施例を添付した図面を結合して詳しく説明する。参考に、本明細書および特許請求範囲に用いられた用語および単語は通常的または辞書的意味に限定して解釈されてはならなく、発明者はその自分の発明を最も最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に即して本発明の技術的思想に符合する意味と概念で解釈すべきである。また、本明細書に記載された実施例及び図面に示された構成は本発明の最も好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想を全部代弁するのではないので、本出願時点においてこれらを取り替えることができる多様な均等物と変形例があり得ることを理解すべきである。

上述した課題を果たすために、本発明は、慣性および慣性効果を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達するマイクロ流体システムであって、細胞と外部物質を含む溶液が連続的に流れる流体チャンネル構造を含み、前記流体チャンネル構造は一つ以上のチャンネル間連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含み、前記連結点界面付近で局所渦流が発生し、前記渦流によって細胞は変形され、前記渦流によって細胞膜の一時的不連続現象が生成され、前記細胞と細胞周辺流体との間の溶液の交換によって前記外部物質が前記細胞内に導入されることを特徴とするマイクロ流体システムを提供する。

また、本発明は、前記細胞と外部物質を含む溶液を流体チャンネルに連続的に流すステップと、前記連結点の付近で渦流生成手段によって渦流を形成させるステップと、前記渦流によって前記細胞が変形されるステップと、前記細胞変形によって細胞膜に生成される穿孔を通じて前記外部物質が前記細胞内に導入されるステップと、を含むことを特徴とする慣性および慣性効果を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達する方法を提供する。

本発明の一実施例による細胞内物質伝達方法およびシステムは、渦流を流体チャンネル内で生成させ、渦流によって細胞を変形して穿孔を細胞膜に発生させる技術的特徴に基づく。特に、本発明はこのような渦流に細胞が流入される場合、渦流による細胞変形と、続く渦崩壊（ｖｏｒｔｅｘ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）による細胞変形で細胞内物質伝達効率を向上させる。本発明の一実施例で渦流は連結点のような流体チャンネルの物理的構造を通じて渦流を生成させるが、本発明の範囲はこれに制限されない。

渦流生成手段が連結点である一実施例によれば、本発明は細胞内に細胞外の外部物質を伝達するためのシステムであって、少なくとも二つ以上のチャンネルが連結される連結点（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を一つ以上含む流体チャンネル構造のマイクロ流体システム（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）を提供する。本発明で「連結点」とは二つ以上のチャンネルがＴ、Ｙ、＋またはこれらの組み合わせ形態で連結される時に各チャンネルが会う地点を意味し、本発明での連結点は流体の入口と出口に定義される単一チャンネルで少なくとも一つであり得る。

本発明の一実施例によるマイクロ流体システムで、細胞と外部物質を含む溶液が前記連結点に流入されることによって連結点界面では渦流（Ｖｏｒｔｅｘ）が発生し、この時、渦流と渦崩壊（Ｖｏｒｔｅｘ Ｂｒｅａｋｄｏｗｍ）を連続的に経験する細胞は慣性および慣性効果によって連続的に捕獲、変形され、その後、細胞内物質伝達の通路となる細胞膜穿孔が変形が進行されることにつれて順次形成される。つまり、本発明によるマイクロ流体システムは、レイノルズ数（１～１０００）のような流体特性と、Ｔ、Ｙ、＋またはこれらの組み合わせ形態のチャンネル構造を活用して細胞内物質伝達効率を大きく向上させることができる。

本発明の下記実施例のマイクロ流体システムは、まず、普通フォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）工程を通じてＳＵ－８モールドまたはシリコンウェハーを蝕刻（ｅｔｃｈｉｎｇ）して本発明によるチャンネルが形成されたモールドを作った。その後、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を通じてＰＤＭＳ基盤チップを作り、この時に作られたチップに入口（ｉｎｌｅｔ）と出口（ｏｕｔｌｅｔ）を作って、一般的なスライドガラスとプラズマ処理を利用して（Ｃｕｔｅ、Ｆｅｍｔｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）結合してプラットフォーム機器を製造した。その後、作られたチップに浮遊状態の細胞と伝達しようとする物質を混合した後、シリンジポンプを用いて注入する。この時、シリンジポンプの流量の調節を通じて細胞内物質伝達をコントロールすることができ、伝達した後、遠心分離機を利用して細胞のみを分離した後再培養するか、分析するか、目的に合わせて利用するようにした。しかし、本発明の範囲は実施例自体に制限されない。

実施例１：＋連結点構造マイクロ流体システム
図１は＋連結点チャンネルでの螺旋形渦流形成を示す図面である。

図１を参照すれば、＋チャンネル両端で互いに対向する方向に流体を流すことによって、前記チャンネルと交差するまた他の２つのチャンネルで前記流体は流出されるようになるが、この時、停滞点付近での流体不安性は強い螺旋形の局所渦流（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｖｏｒｔｅｘ）を隣接点隣近で誘導する。このような局所渦流は以下で説明する細胞変形と細胞内物質伝達現象の理由を説明する。本発明で、「隣近（ｎｅａｒ）」とは、連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に導入される流体が連結点構造によって渦流が発生可能な領域である。

図２は螺旋形渦流による細胞変形模式図（１）と、回転細胞運動を示す高速顕微鏡イメージ（スケールバー：１０μｍ）である。

図２を参照すれば、本発明は中間程度のレイノルズ数（１－１０００）で流体を連結点構造チャンネル（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）に流す場合、細胞は対称的な細胞伸長（ｃｅｌｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）の代わりに螺旋形に動く。この時、前記細胞は渦流の流れの停滞点に近付くことにつれて大きい変形を見せる。

図３は本発明の一実施例による細胞変形による物質伝達のメカニズムを説明する図面である。

図３を参照すれば、左側の細胞変形によって細胞膜でナノポアが生成され、前記細胞と細胞周辺流体との間の溶液の交換によって前記外部物質が前記細胞内に導入される。その後、１分～１０分以内に細胞膜は自ら回復されて閉まるが、このような回復時間は溶液のカルシウムのような電解質の濃度を調整して制御することができる。

図４は本発明の一実施例による二つの形態のチャンネル構造の模式図と各チャンネルでの細胞変形を説明する図面である。

図４での二つの形態のチャンネル構造は、互いに反対に流れる流体は連結点の付近で衝突して連結点の付近で渦流が形成される＋構造と、流入される細胞がチャンネル壁に衝突するＴ字構造である。

図５は図４の二つの形態の流体チャンネルが流体の流れ方向に直列に連結されたマイクロ流体システムの模式図である。

図５を参照すれば、本発明のマイクロ流体システムは、（１）＋連結点構造チャンネル（Ｃｒｏｓｓ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と、（２）前記＋連結点構造チャンネルから渦流を通過しながら誘導された流体がチャンネル壁と衝突するＴ連結点構造チャンネル（Ｔ－Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を有する。

このようなシステムの場合、＋連結点構造チャンネル（Ｃｒｏｓｓ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）での停滞点を逸脱した細胞は再び慣性によってチャンネルの中心に誘導されてチャンネル壁と再び衝突するようになる。即ち、本発明によるＴ、Ｙ、＋形態のマイクロ流体構造は、流体の流れに対して直列、並列またはその組み合わせ形態に設計されることができ、これは何れも本発明の範囲に属する。この場合、細胞基準入口と出口に定義される単一チャンネル上に複数の単位チャンネルが連結された複数の連結点が形成されることができる。

図６は＋連結点構造チャンネルで互いに連結点（交差点）方向に対向して流入される流体のレイノルズ数による挙動を実験した結果である。

図６を参照すれば、最低レイノルズ数で、二つの流体の流れの間の界面は対称的で明らかな形態に保持され、３次元渦運動はレイノルズ数３７．９（臨界レイノルズ数）で明白に始まる。その後、レイノルズ数の増加につれて二つの流体の流れの間の交差はより強くて複雑になる（１）。

図６の（２）、（３）は共焦点顕微鏡イメージで、レイノルズ数が増加するにつれて反時計回り方向の螺旋形渦が臨界レイノルズ数以上に発展し、螺旋形が垂直および水平に拡張される。以上の結果は連結点付近での渦流の発生と、その形態、パターン、速度などは流体のレイノルズ数によって可変されることを意味する。これはまた所望の細胞種類、伝達すべき物質の種類によってレイノルズ数を可変させる方式で伝達効率を向上させることができることを暗示する。

本発明によるシステムは、渦流形成による細胞変形および物質伝達後の渦崩壊（Ｖｏｒｔｅｘ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）によって細胞が捕獲されて変形を誘導する特異的な追加効果がある。

図７は＋連結点構造チャンネルでの細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）捕獲挙動を見せる高速顕微鏡イメージである。

図７を参照すれば、第一、渦流による細胞変形領域を逸脱することによって細胞の特異な捕獲（ｔｒａｐｐｉｎｇ）現象が一定時間観察された。すなわち、停滞点のやや上側で約３０μｓ間細胞が繰り返し的に上下に動いた後、さらに出口方へ出た。これは渦流領域を逸脱した直後に渦崩壊による慣性によって細胞は一定時間変形された後連結点隣近領域（停滞点付近領域）に滞留し、それにより、細胞内物質伝達効率が大きく向上されることができることを意味する。

図８はレイノルズ数関数で図７の渦崩壊による細胞捕獲と細胞変形時間を正規化したグラフである。

図８を参照すれば、レイノルズ数が増加するにつれて細胞捕獲および変形時間は増加し、このような渦流形成後の所定時間の細胞変形は細胞内物質伝達効率を大きく向上させることができる。

より具体的には、本発明による＋連結点構造マイクロ流体システムを説明する。

図９は本発明の一実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示した図面である。

図９を参照すれば、本発明の一実施例による細胞内物質伝達プラットフォームは、細胞および伝達物質を含む流体が流動する第１チャンネル１００と、前記第１チャンネル１００と垂直交差する第２チャンネル２００と、前記第１チャンネル１００の一側に備えられて前記第１チャンネル１００での流体速度を第１方向に制御する第１流体制御手段３００とを含む。

本発明の一実施例によれば、前記第１チャンネル１００での流体は前記第２チャンネル２００と垂直交差する地点に対向して流動し、前記第１流体制御手段３００は前記第１チャンネル１００と第２チャンネル２００が垂直交差する地点に形成された渦流によって前記細胞にナノポアが形成される水準の細胞膜変形を加える運動エネルギーを前記第１チャンネル１００上の細胞に印加することを特徴とする。

それに加えて、前記第１チャンネル１００の他側には第１チャンネル１００での流体速度を第２方向に制御する第２流体制御手段３００`をさらに含むことができる。

特に、第１チャンネル１００で互いに反対方向で制御される第１流体制御手段３００、第２流体制御手段３００`によって第１チャンネル１００と第２チャンネル２００が互いに垂直交差する地点で渦流が形成されることができ、それによって発生される慣性力と慣性流動現象によって細胞に物理的な変形が加えられて細胞膜が変形されることができる。

一方、本発明による細胞内物質伝達プラットフォームは、核酸、タンパク質、転写因子、ベクトル、プラスミド、遺伝子はさみ物質、ナノ粒子などを伝達することができる。ただ、これに限定されるのではない。

さらに、前記細胞内物質伝達プラットフォームは再生医学、がん免疫治療、遺伝子編集や他の分野への適用に制限されない。

図１０～１２は本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。

図１０を参照すれば、前記第１チャンネル１００に前記細胞および伝達物質を含む流体が第１流体制御手段３００によって流動される。この時、前記第１チャンネル１００の他側に形成された第２流体制御手段３００`も作動して、第１流体制御手段３００で制御される流体と対向する方向に伝達物質を流動させることができる。

本発明の一実施例で、前記伝達物質は細胞内に伝達されることができる全ての物質を含み、具体的には、遺伝子はさみ物質、プラスミド、核酸、タンパク質、ナノ粒子などが全部これに対応することができる。

図１１を参照すれば、前記第１流体制御手段３００によって加速された流体は連結点の付近で対向する流体との界面によって渦流を形成し、渦流によって捕獲された細胞は変形される。その後、細胞の変形によって細胞にはナノポアが形成され、このナノポアを通じて前記伝達物質が前記細胞内に伝達される。よって、第１流体制御手段３００、第２流体制御手段３００`は流体が連結点の付近で渦流が形成される水準のレイノルズ数を有する運動エネルギーを印加することが好ましい。

本発明のまた他の一実施例によれば、流体に形成される渦流を経た後に形成される渦崩壊（ｖｏｒｔｅｘ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）によるまた他の細胞変形を発生させる。

図１２を参照すれば、渦流を通過する細胞は渦崩壊を経験し、慣性によって再び細胞変形が発生する。この時に発生するまた他の細胞変形によって前記細胞膜に形成されたナノポアを通じて前記伝達物質が細胞内に再び伝達されて細胞内物質伝達効率が大きく向上される。

実施例２：ＴまたはＹ連結点構造マイクロ流体システム
本発明のまた他の一実施例はキャビティを備えたＴまたはＹ連結点構造チャンネルを利用した、細胞内物質伝達システムを提供する。本発明でキャビティとは停滞点地点にチャンネルに形成された空いた空間で、前記連結点で前記溶液の細胞とチャンネル壁とが衝突した時に前記細胞とチャンネル壁との間の衝突面積を無くしたり減少させる構造である。

この場合、上述した＋連結点チャンネルと同様に局所渦流がＴ字連結点の付近で形成され、その後、細胞変形－細胞膜ナノポアの形成－外部物質の細胞内伝達－細胞膜ナノポアの閉まりが進行される。

図１３は本発明の一実施例によるＴ連結点構造チャンネルの模式図である。

図１３を参照すれば、Ｔ字チャンネルの連結点の付近にチャンネル型のキャビティ１が形成されたことが分かる。本発明の一実施例では細胞内に伝達される外部物質が混合された細胞を適当なレイノルズ数で通常のシリンジポンプ（ＰＨＤ２０００、アメリカハーバード装置）を流体を流す流体制御手段として用いて、図１３のマイクロ流体チャンネルに注入した。

注入によって、細胞は慣性によってチャンネル中心に集中され、細胞はチャンネル壁と衝突した。各細胞は上述したキャビティ（図１３の（１））の一部を貫通して変形された（図１３の右側写真参照）。その後、衝突によって始めて細胞変形された後、細胞は停滞点（図１３の（２）地点）付近の局所渦流内で捕獲され、流体力学的に変形されて、細胞膜のナノポアが形成され、これは図３で説明された通りである。

その後、渦流領域を通過した細胞は再び渦崩壊によって捕獲された後変形される（図１３の（３））。このような追加的な細胞捕獲と変形の長所は、図７で上述したように細胞内物質伝達効率の向上である。

本発明の一実施例ではＴ連結点チャンネル構造にキャビティを用いたが、その長所は硬い固体形態のチャンネル壁の代わりに流体形態で細胞が衝突することができるようにして、硬い固体チャンネル壁との衝突による細胞損傷を減少させるのである。また他の一つは停滞点を流入されるアップストリームに形成させて、複雑な流体挙動パターンを形成して、事実上細胞詰まり問題（ｃｌｏｇｇｉｎｇ）を防止するのである。したがって、このようなキャビティ構造はその形態、大きさ、形状などは細胞によって可変されることができる。例えば、図１３のように、長いスリット構造だけでなく、円形、楕円形、長いスリット、正方形、矩形、台形、多角形およびこれらの組み合わせとその変形された形態を全部含むことができ、少なくとも流入される細胞がそのままチャンネル壁と衝突しない限り、これは全部本発明のキャビティに属する。

また、キャビティの直径は細胞直径によって決められ、特に、細胞の大きさの １０％～５倍水準の直径を有することが好ましい。本発明によるキャビティの直径は少なくとも溶液を通じて連結点に流入される細胞がチャンネル壁との衝突による衝突力を減少させることができる限り、これは全部本発明の範囲に属する。

図１４はキャビティ構造のＴ連結点チャンネルの細胞変形と渦流形成メカニズムを説明する高速顕微鏡イメージである。ここで、矢印はそれぞれ流体の流れ方向を意味する。

図１４を参照すれば、停滞点付近での局所渦流による捕獲（図１４の（１））と、停滞点付近の流体の不安定性によって停滞点を通過した細胞の渦崩壊による捕獲（図１４の（２））を確認することができ、これは上述した＋構造のチャンネルと同様に渦流－渦崩壊による細胞捕獲－変形が連続的に発生することを知らせる。特に図１４の（２）で細胞は約２０μｓ間静的状態を保持してからダウンストリームで抜け出ることが分かる。

図１５は互いに異なるレイノルズ数を有する流体での渦流変形指数（ＶＤＩ）分析結果である。ここで、ＶＤＩは下記式に従い、これは細胞変形指数の程度と細胞膜透過持続時間で解釈されることができ、これは結局細胞内物質伝達効率を表す。

ここで、ｔは渦流での細胞捕獲時間、ｃは円形性
ここで、ＡとＰは面積と最大変形状態での半径）、Ｕは流体の平均速度、Ｄは細胞直径である。

図１５を参照すれば、レイノルズ数が増加するにつれて（１）渦流（２）渦崩壊時にＶＤＩが増加するが、これは高いレイノルズ数がより高い細胞内物質伝達効率を有することを表す。

以下、より具体的には、本発明によるＴ連結点構造マイクロ流体システムを説明する。

図１６は本発明の一実施例による細胞内物質伝達プラットフォームを示した図面である。

本発明による細胞内物質伝達プラットフォームは、細胞および伝達物質を含む流体が移動する経路を形成する第３チャンネル１０１と、前記第３チャンネル１０１の端部に前記第３チャンネル１０１の両側面に垂直延長された第４チャンネル２０１と、前記第３チャンネル１０１に備えられて、前記第３チャンネル１０１での流体速度を制御する流体制御手段３０１とを含む。

図１７～１９は本発明の一実施例による前記細胞内物質伝達プラットフォームを利用した細胞内物質伝達方法を説明する図面である。

図１７を参照すれば、前記第３チャンネル１０１に前記細胞および伝達物質を含む流体が流体制御手段３０１によって流動される。本発明の一実施例で前記伝達物質は細胞内に伝達されることができる全ての物質を含み、遺伝子はさみ物質、プラスミド、核酸、タンパク質、ナノ粒子などが全部これに対応する。

図１８を参照すれば、前記流体制御手段３０１によって加速された第３チャンネル１０１の細胞は連結点の付近で形成された渦流によって捕獲された後変形される。これは図１３および１４で説明した通りである。その後、前記細胞は前記第３チャンネル１０１の端部に連結された第４チャンネル２０１の隔壁と衝突するようになる。

この時、前記第４チャンネル２０１には前記第３チャンネル１０１での流体の流れ方向と同一方向に形成されるスリット形態のキャビティ４０１が備えられ、前記キャビティは、１）物理的衝突による細胞損傷防止、２）閉鎖防止、３）アップストリームでの停滞点形成の効果を発生させる。

本発明では、上述したように、複数の単位マイクロ流体システムが直列または並列またはこれらの組み合わせ方式で連結されて全体システムを構築することができる。この場合、循環方式で前記渦流は再循環される流れで発生することができるが、この場合、前記渦流は閉開された流れであり得る。

実験例
実験例１
本実験例では実施例１に基づいたマイクロ流体システムの伝達特性を分析した。

図１９は１８時間後にエンドサイトーシス作用（対照群、Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）と本発明による細胞内物質伝達方法（Ｓｐｉｒａｌ Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）による細胞内物質伝達効率を比較した結果である。ここで、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内に３－５ｋＤａ ＦＩＴＣがコンジュゲートされたデキストランを伝達させ、その結果を蛍光イメージ（スケールバー：４０μｍ）で示した。特に、ここで注目すべき点はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内にデキストランの伝達は非常に難しいと知られていることである。以下説明される実験で特に言及しない限り、細胞はＭＤＡ－ＭＢ－２３１である。

図１９を参照すれば、本発明による細胞内物質伝達効果は右側の複数のＦＩＴＣ信号を通じて確認することができる。

図２０および２１は細胞内への物質伝達量の分析結果である。本分析では５％以上の蛍光信号分率で伝達効率を定義し、これは赤色点線に対応する。

図２０および２１を参照すれば、レイノルズ数３６６で、約９６．５％の伝達効率が達成され、Ｒｅが増加するにつれて蛍光強度が増加してヒストグラムプロファイルが右側に移動することを確認することができる。これはレイノルズ数を調整することにより、細胞内物質伝達量を調整することができることを意味する。

図２２は図１９と同一条件でレイノルズ数を異にして細胞生存率を測定した結果である。

図２２を参照すれば、細胞生存率に関して、より高いレイゾルズ数で、生存率の減少が観察されるが、レイノルズ数が高いほど細胞撹乱がよほど大きくなるからであると判断される。

また細胞生存率をさらに調査するために、代謝機能を通じて標準ＭＴＴ分析を行い、これを図２２に示した。トリパンブルー除外方法とＭＴＴ分析の間の全般的傾向は互いに一致する一方、ＭＴＴ分析は高いレイノルズ数でやや低い生存率値を示した。

図２３は多様なデキストランの大きさに対する伝達効率性分析結果である。本分析には２～５５ｎｍの流体力学的直径に相応する、３～２０００ｋＤａ範囲分子量のデキストランを用いたが、同一流れ条件（Ｒｅ＝３６６）下で５つの互いに異なる大きさと同一濃度のＦＩＴＣ－デキストラン（３－５、７０、１５０、５００および２０００ｋＤａ）をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内に実施例１と同じ方法で伝達して、その効率を計算した。

図２３を参照すれば、比較的小さいデキストラン（＜７０ｋＤａ）は大きいデキストランよりも高い伝達効率を有することと現われた。これは小さいデキストランの場合、細胞膜を横切るデキストランの対流および拡散輸送が発生する一方、大きいデキストランの輸送は対流輸送が支配するからである。

図２４は図５の複合マイクロ流体システム（＋連結点チャンネルとＴ連結点チャンネルとの組み合わせ）でのデキストラン伝達効率を測定した結果である。

図２４を参照すれば、連続的な細胞変形が行われる図５の複合マイクロ流体システムは相対的に単独（ｓｔａｎｄ ａｌｏｎｅ）よりも高い伝達効率を見せることが分かる。

図２５は従来の電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、ａ Ｎｅｏｎ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ））と本発明による慣性基盤物質伝達方法（ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の伝達効率の比較結果である。本実験例では５００および２０００ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストランを外部物質として用いた。

図２５を参照すれば、２０００ｋＤａのＦＩＴＣ－デキストランの場合、本発明は電気穿孔法に比べて４倍ほど高かった。特に本発明による方法は、電気穿孔方式では細胞内浸透が難しい巨大分子の伝達効率を大きく向上させ、これは従来の電気穿孔技術が到底果たすことのできない分子量物質の細胞内伝達可能性を示唆する。

図２６および２７はそれぞれ金ナノ粒子（ＧＮＰ）の細胞内伝達効果を分析した写真、散乱地点をカウントした結果である。ここで、（Ａ）は本発明による流体力学的穿孔法（ＳＨ）、（Ｂ）電気穿孔法（ＥＰ）、（Ｃ）エンドサイトーシス（ＥＣ）の結果である。

図２６および２７を参照すれば、非常に大きいＧＮＰ（直径２００ｎｍ）が本発明による流体システムを通じてＭＤＡＭＢ－２３１細胞内に成功的に伝達されたことが分かる（Ａ）。一方、電気穿孔法ではＧＮＰを伝達することができるが、少数の散乱地点のみが検出されることが分かる（Ｂ）。さらに、エンドサイトーシスメカニズムの場合、電気穿孔よりも低い粒子伝達効率を示した（Ｃ）。

図２８はＧＮＰ伝達による細胞生存率を測定した結果である。

図２８を参照すれば、電気穿孔法に比べて本発明による細胞内物質伝達方法とシステムがより生存率が高いことが分かる。

図２９は散乱スポット個数にセル生存率（図５Ｆ）を掛けて正規化された収率を計算した結果である。

図２９を参照すれば、本発明による物質伝達効率は電気穿孔法やエンドサイトーシスに比べて効率がおおよそ３倍以上であることが分かる。

図３０は金ナノ粒子の代わりに薬物、タンパク質、および核酸ナノキャリアに用いられるメソポーラスシリカナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＭＳＮ））の細胞内伝達効率を分析結果である。本実験では抗がん薬物であるドキソルビシン（ＤＯＸ）がＭＳＮにローディングされ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞内にこれを伝達した。

図３０を参照すれば、本発明による方法（Ｓｐｉｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の場合、エンドサイトーシスに比べて多数の明るい蛍光点を表すことが分かる。これは本発明による方法で機能性物質を担持したキャリアが細胞内に効果的に伝達されることができることを示唆する。

図３１は図３０の分析物質に対する時間依存的細胞生存力分析結果である。

図３１を参照すれば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＤＯＸ細胞毒性をトリパンブルー除外方法で測定し、６時間後にがん細胞の約８５％が死滅されたことが分かる。このような結果から、本発明によるマイクロ流体システムは従来の表面配位子基盤ＤＯＸ伝達方法を用いなくてもＤＯＸ－誘導細胞死滅を調査することができるという点を表す。

図３２はｍＲＮＡ（９９６－ヌクレオチドｍＲＮＡ切れ、緑色蛍光タンパク質）を外部物質として用いて、Ｋ５６２細胞への伝達効果を測定した蛍光強度ヒストグラムである。図３２で（Ａ）はエンドサイトーシス、（Ｂ）は本発明によるマイクロ流体システム結果で、フローサイトメトリーを用いてｍＲＮＡ伝達（２μｇ／ｍＬ）に基づいてＥＧＦＰタンパク質発現を評価した。

図３２を参照すれば、本発明による方法の場合、非常に高いタンパク質発現量を見せることが分かる。これは本発明による細胞内物質伝達方法とシステムがベクトルやワクチンを用いなくてもＣＡＲ－Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ）に用いられることができることを意味する。

図３３は（Ｃ）エンドサイトーシスおよび（Ｄ）本発明によるマイクロ流体システムによってｍＲＮＡをＫ５６２に伝達した後の蛍光イメージである。

図３３を参照すれば、エンドサイトーシスに比べて本発明による方法はより高いｍＲＮＡ伝達効率結果である強いＥＧＦＰ信号が検出された。

図３４は図３２および３３のようにｍＲＮＡが本発明によって伝達される場合、伝達効率（Ｅ）と生存率（Ｆ）を測定した結果である。

図３４を参照すれば、細胞生存力を犠牲しないながら～９２％水準の伝達効率が達成され、これは追後ヒト免疫細胞を試験するための追加調査が必要であるが、免疫療法研究に用いるためのプラットフォームが有する高い潜在力を表す。

実験例２
本実験例では実施例２に基づいたマイクロ流体システム（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）の伝達特性を分析した。

図３５はエンドサイトーシスと実施例２の方法でｍＲＮＡ（９９６－ヌクレオチドｍＲＮＡ切れ、緑色蛍光タンパク質）をＫ５６２細胞内に伝達した後の蛍光イメージである。

図３５を参照すれば、エンドサイトーシス（ｃｏｎｔｒｏｌ）と違って実施例２の方法でｍＲＮＡを細胞内に伝達した場合、緑色蛍光が検出されることが分かる。これは上述した実施例１と同様に本発明によるＴ－連結点チャンネルシステム（実施例２）がｍＲＮＡの細胞内伝達を高い効率で可能にさせることを証明する。

図３６はｍＲＮＡトランスフェクション効率（ｂ）とｍＲＮＡ濃度による平均蛍光強度（ｃ）を分析した結果である。

図３６を参照すれば、フローサイトメトリー分析に基づいて、互いに異なる濃度のｍＲＮＡが評価され、２ｕｇ／ｍｌの場合、形質感染効率を約９３％まで達成した。これは従来のボトルネック構造のような圧縮基盤マイクロ流体システムでは不可能な効率である。

細胞基質と先に結合するｍＲＮＡと違って、ＤＮＡは細胞膜を先に通過し、核ポアを通じて核膜に入らなければならない。さらに、物質伝達の側面で発現プラスミドＤＮＡはヌクレアーゼによって分解されやすく、粘度が高いという問題がある。そして、高密度細胞質は長くて巻きついたＤＮＡが純粋に拡散するだけで核まで行くのに良い条件を提供しない。このような問題点を解決するために、本発明者はプラスミドＤＮＡを核に伝達する方法として本発明による流体基盤マイクロ流体システムを提供する。このために、本実験例では橈脚類（ｃｏｐｅｐｏｄ）ＧＦＰをエンコーディングし、ＨＥＫ２９３ｔ細胞に７．９ｋｂｐプラスミドＤＮＡを伝達する実験をした。

図３７はエンドサイトーシス（ｃｏｎｔｒｏｌ）と実施例２の方法でプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３ｔに伝達した後の蛍光イメージである。

図３７を参照すれば、本発明による方法の場合、非常に強い蛍光イメージを表すことが分かる。

図３８はＨＥＫ２９３ｔ細胞のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）トランスフェクション効率（e）プラスミドＤＮＡ濃度による平均ＨＥＫ２９３ｔ細胞の平均強度（f）を分析したグラフである。

図３８を説明すれば、ｐＤＮＡ濃度が増加するほどトランスフェクション効率が増加し、平均蛍光強度も増加することが分かる。

図３９および４０はそれぞれＨｅＬａ細胞（インテグリン膜横断受容体のα１サブユニット）にｓｉＲＮＡを伝達してＩＴＧａ１遺伝子ノックダウン効果をウェスタンブロットで分析した結果と、相対的発現程度を比較した結果である。ここで、ｓｉＲＮＡ伝達方法として知られた従来の陽イオンリポフェクタミン３０００を比較例に用いてＩＴＧａ１遺伝子ノックダウン効果を比較した。

図３９および４０を参照すれば、本発明を利用する場合、ＩＴＧＡ１発現（１９７ｋＤａ）がほとんどなくなったが、比較例であるリポフェクタミン３０００の場合、部分的なノックダウンのみが観察された。この結果から本発明は少なくとも三倍大きいノックダウン効率（９７％対３０％）を有し、これは本発明が有する遺伝子編集における高い使用可能性を示唆する。

下記実験では、非機能性物質または極度に小さな分子（例えばカルセイン、ヨウ化プロピジウム物および３ｋＤａデキストラン）を細胞株に伝達する実験を行った。下記実験例でｍＲＮＡを伝達標的に選定したが、これはｍＲＮＡが伝達された後タンパク質発現は細胞質で発現されて脂肪に誘導され、またよく制御されることができ、注入量の依存的な形質転換によって比較が容易であるからである。

本実験では実施例２の方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）、リポフェクタミン３０００と電気穿孔方式のＮｅｏｎ形質転換システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を用いてＥＧＦＰ ｍＲＮＡをＭＳＣ（ｈａｒｔｏｎ`ｓ ｊｅｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＡＤＳＣ（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、そしてＢＭＤＣ（ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）に伝達した。

図４１はリポフェクタミン３０００、電気穿孔方式および本発明による形質収率の分析結果である。

図４１を参照すれば、リポフェクタミン３０００と電気穿孔方式に比べて本発明は非常に高い形質収率を見せることが分かる。本分析結果で形質収率はトランスフェクション効率と細胞生存率の倍で定義され、これは物質伝達によって形質転換された細胞が生存細胞の割合に理解されることができる。

図４２～４４はヒトＭＳＣ、ヒトＡＤＳＣ、鼠ＢＭＤＣに対するトランスフェクション効率、細胞生存率および形質転換収率の分析結果である。

図４２～４４を参照すれば、リポフェクションは全ての細胞型で本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）と電気穿孔法に比べて向上された細胞生存力を見せていたが、全ての細胞型で実質的に低いトランスフェクション効率を表すことが分かる。

また ＭＳＣとＡＤＳＣの場合、本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）よりも電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）でやや高いトランスフェクション効率が現われた。しかし、全ての細胞型に対して、本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）は電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）に必要な特殊安定化緩衝液を用いなくてもさらに高い細胞生存率を見せた。さらに、本発明の細胞生存率は単純に細胞培地にトレハロースまたはポリマーを添加して追加に増加させることもできる。

ＢＭＤＣの場合、電気穿孔法よりも本発明でさらに高いトランスフェクション効率と細胞生存率が現われ、これは本発明ががん免疫療法に用いられる可能性が高いということを見せる。

このような本発明は免疫細胞治療において従来の電気穿孔法に比べていくつかの長所を有する。まず、電気穿孔法は１次Ｔ細胞の重要な特性を変化させて（例えば非特異的なサイトカイン爆発と鈍化されたＩＦＮ－γ反応）、治療的性能を低くする副作用が知られている。しかし、電気穿孔法の低い拡張性（ラン当たり１０４－１０５細胞処理）は一般的に１０８細胞処理が必要ながん免疫療法の潜在的臨床使用に対して問題となる。

しかし、本発明は同一水準の伝達効率を保持しながら最大１×１０６細胞／分まで処理することができ、この処理量は単一マイクロチャンネルを基盤とするので、マイクロチャンネルの多重化と並列化を通じてがん免疫療法に必要な細胞処理量を達成することができる。

下記実験では、標的分子として広く用いられる量子ドット（Ｄｉｂｅｎｚｏ ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ（ＤＯＢＩ））とシリカナノ球（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）を細胞内伝達物質として決め、細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対する伝達特性を分析した。

図４５は本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）およびリポフェクタミン３０００によって量子ドット（ｑｄｏｔ６２５）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に伝達されることを見せる共焦点顕微鏡イメージである。

図４５を参照すれば、全ての方法が優れた伝達効率を見せたが、細胞質で量子ドットがよく分散された結果は本発明による方法で細胞内伝達が進行された場合である。電気穿孔とリポフェクタミン３０００によって処理された細胞は複数の赤色点が観察され、これは量子ドットの凝集またはエンドソーム捕獲の可能性を表す。このような量子ドット凝集は結局細胞内物質伝達の効率を減少させる原因となるので、本発明による細胞内物質伝達方法は微細物質の細胞内伝達にも有用であることを意味する。

図４６は細胞当たり量子ドット（Ｑｄｏｔ ６２５）のスポットカウント数分析結果である。

図４６を参照すれば、本分析結果は量子ドットの凝集程度を表すが、本発明の場合、細胞当たり量子ドット数が最も低いことが分かる。つまり、電気穿孔やリポフェクションは本発明に比べて３倍および４倍水準の量子ドット数を表す。これは図４５の分析結果とも一致するもので、本発明で量子ドットのような粒子を細胞内伝達する場合、細胞変形後の細胞膜を通じた溶液の交換によって迅速な溶液の交換によって細胞質内に量子ドットがよく分散されることを表す。

図４７は陰性対照群（未処理されたＫ５６２細胞、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、陽性対照群（ナノ球とともに培養されたＫ５６２細胞、実施例と同一時間、同一濃度）および本発明（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ）によってナノ球（緑色蛍光シリカナノ球、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ、ドイツ）がＫ５６２細胞に伝達された実施例（μ－Ｈｙｄｒｏｐｏｒａｔｏｒ、サンプル当たりＮ_ｃｅｌｌ＝５，０００）の蛍光強度ヒストグラムである。

また、図４８は相対的平均蛍光強度測定結果である。

図４７および４８を参照すれば、本発明によって処理された細胞では平均的にさらに高い蛍光強度が観察されたが、流動細胞分析法による分析では共同培養グループで高い蛍光信号が検出された。短い培養時間とエンドサイトーシスにおいては過度に大きいナノ球の大きさを考えれば、陽性対照群での蛍光は細胞表面上に付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）されたナノ球から得られたことと判断される。

図４９および５０は図４７および４８のグループの中で二つのグループに対する共焦点イメージである。ここで、ＤｉＤ親油性カルボシアニン染料を用いて細胞膜を視覚化した。

図４９および５０に示されたように、陽性対照群（共同培養）からの緑色蛍光信号は細胞膜のみに存在したが、細胞質からの明るい緑色蛍光は本発明によって処理された細胞のみで観察された。これは静電気的作用によってナノ球が細胞表面に付着される作用のみが確認される陽性対照群を考えれば、細胞内にナノ球を伝達することができる技術は本発明による細胞内物質伝達システムのみが可能であるということを表す。

本発明による慣性を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達するマイクロ流体システムは、細胞内に物質伝達が必要なバイオ、医学分野での産業上利用可能性が認められる。

Claims (12)

1. 慣性を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達するマイクロ流体システムであって、
   細胞と外部物質を含む溶液が連続的に流れる流体チャンネル構造を含み、
   前記流体チャンネル構造は一つ以上のチャンネル間連結点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含み、
   前記連結点の界面付近で局所渦流及び渦の破壊が発生し、
   前記渦流によって一次的に細胞は変形され、かつ、前記渦の破壊により二次的に前記細胞は変形され、
   前記渦流によって細胞膜の一時的不連続性が生成され、前記細胞と細胞周辺流体との間の溶液の交換によって前記外部物質が前記細胞内に導入されることを特徴とするマイクロ流体システムであって、
   前記一つ以上のチャンネル間連結点を含む流体チャンネル構造はＴ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせを含む連結点を含み、
   前記渦の破壊は、流体中に形成された渦に続いて形成され、前記細胞が前記渦の破壊によって変形されると、前記外部物質は前記細胞の前記細胞膜のナノ細孔を通って再び前記細胞内に供給され、
   前記連結点は、2つ以上の流路が、前記Ｔ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせの形で接続されている場合に、前記流路は各々、別の前記流路と合流する点であり、
   前記溶液のレイノルズ数（Ｒｅ）は３７．９～１０００であり、かつ、前記レイノルズ数（Ｒｅ）が増加するにつれて、前記渦は増加する、
   マイクロ流体システム。
2. 前記流体チャンネル構造がＴまたはＹ字状のチャンネルである場合、流体停滞点付近でのキャビティを含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
3. 前記キャビティは円形、楕円形、長いスリット、正方形、矩形、台形、多角形およびこれらの組み合わせとその変形された形態を含むことを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体システム。
4. 前記キャビティの直径は前記細胞の直径によって決められることを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体システム。
5. 前記キャビティは前記連結点で前記溶液の細胞とチャンネル壁間の衝突時に前記細胞とチャンネル壁間の衝突面積を無くしたり減少させる構造であることを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体システム。
6. 前記マイクロ流体システムは、
   前記流体チャンネル構造で溶液が流れるようにする流体制御手段をさらに含み、前記流体制御手段は前記連結点の界面付近で局所渦流を発生させることができる水準の速度で前記溶液を前記流体チャンネルで流すことを特徴とする請求項１～５の何れか一項に記載のマイクロ流体システム。
7. 前記流体制御手段はシリンジポンプまたは空圧システムであることを特徴とする請求項６に記載のマイクロ流体システム。
8. 前記渦流の特徴は前記レイノルズ数によって決められることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
9. 前記渦流は閉開された再循環流れ形態であることを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載のマイクロ流体システム。
10. 前記流体チャンネルは少なくとも溶液の入口と出口との間のチャンネルで複数の連結点を有することを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載のマイクロ流体システム。
11. 前記マイクロ流体システムは、
    請求項１～１０の何れか一項に記載システムが直列、並列またはこれらの組み合わせ方式で結合されたことを特徴とする請求項８に記載のマイクロ流体システム。
12. 慣性を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達する方法であって、
    細胞と外部物質を含む溶液を流体チャンネルで連続的に流すステップと、
    連結点の付近で渦流生成手段によって渦流及び渦の破壊を形成させるステップと、
    前記渦流及び渦の破壊によって前記細胞が変形されるステップと、
    前記細胞変形によって細胞膜に生成される穿孔を通じて前記外部物質が前記細胞内に導入されるステップと、を含むことを特徴とする、慣性を利用した細胞穿孔によって外部物質を細胞内に伝達する方法であって、
    ここで、前記渦流生成手段は前記流体チャンネルの連結点構造であり、かつ、
    前記一つ以上のチャンネル間連結点を含む流体チャンネル構造はＴ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせを含む連結点を含み、
    前記渦流によって一次的に細胞は変形され、かつ、前記渦の破壊により二次的に前記細胞は変形され、前記渦の破壊は、流体中に形成された渦に続いて形成され、前記細胞が前記渦の破壊によって変形されると、前記外部物質は前記細胞の前記細胞膜のナノ細孔を通って再び前記細胞内に供給され、
    前記連結点は、2つ以上の流路が、前記Ｔ、Ｙ、十字状またはこれらの組み合わせの形で接続されている場合に、前記流路は各々、別の前記流路と合流する点であり、
    前記溶液のレイノルズ数（Ｒｅ）は３７．９～１０００であり、かつ、前記レイノルズ数（Ｒｅ）が増加するにつれて、前記渦は増加する、方法。

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