KR101515394B1 - 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤링본(herringbone) 패턴으로 형성된 미세유체 칩의 채널 내에 주입된 시료를 농축시키고, 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 시료 내 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, ① 특정 타겟 세포에 특이적인 항원-항체 결합을 이용한 방식이 아닌 자연스러운 흡착 방식을 통해 시료 내 세포를 채널 내벽에 흡착 내지 농축시키므로 시료 처리량이 늘어나더라도 처리 비용이 상당 부분 절감되어 경제적이고 시료 내 모든 세포를 대상으로 단백질이나 핵산 등을 추출할 수 있어 효율적이며, ② 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자에 레이저를 조사하여 광열 효과에 의한 열 작용으로 포획 및 농축된 세포를 용해시키므로 처리 과정이 용이하고 정확성 및 신뢰성이 향상되는 효과가 있다.

Description

세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법{MICROFLUIDIC DEVICE FOR CELL LYSIS, AND METHOD FOR CELL LYSIS USING THE SAME}

본 발명은 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤링본(herringbone) 패턴으로 형성된 미세유체 칩의 채널 내에 주입된 시료를 농축시키고, 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 시료 내 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 바이오칩(Biochip), MEMS, 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 등의 미소 유체 장치 분야를 비롯하여 생물학적 시료 분석을 요하는 약학, 의학, 미생물학 등 바이오 관련 연구 분야에 적용될 수 있는 기술에 관한 것이다.

일반적으로 병원균 검출 또는 분자 진단법 등과 같은 생물학적 분석 과정은 시료로부터 표적 세포를 분리하는 단계, 세포를 농축시키는 단계, 생분자를 분리하는 단계, 생분자를 증폭시키는 단계, 혼성화 반응을 수행하는 단계 및 검출 단계로 이루어진다.

이 중, 유전자 수준에서 질병을 진단, 치료 또는 예방하기 위하여 세포, 박테리아 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 단백질이나 핵산을 추출하는 기술이 핵산 증폭 반응 기술과 연계되어 최근 널리 활용되고 있다. 또한 질병의 진단, 치료 또는 예방 이외에도 맞춤형 신약 개발, 법 의학, 환경 호르몬 검출 등 다양한 분야에서 생물학적 시료로부터 단백질이나 핵산을 추출하는 기술이 요구되고 있는 실정이다.

종래의 방법으로는 특이적인 용해 완충액(lysis buffer) 등을 이용하는 화학적인 방법이 주를 이루었다. 일례로 도데실황산나트륨(SDS)이나 프로테이나아제(proteinase) K로 처리하여 가용화한 후 페놀로 단백질을 변성 제거함으로써 핵산을 정제하는 방법이 있었으나, 이러한 페놀 추출법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 핵산 추출 효율이 연구자의 경험과 노하우 등에 의해 크게 좌우되어 신뢰성이 떨어지는 문제가 있었다.

한편, 다른 방법으로 외부에서 열을 가하여 세포 시료를 용해시키는 방법이 대한민국 공개특허공보 제2013-0066293호("핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법", 2013.06.20. 공개) 및 미국 공개특허공보 제2011-0312749호("Microfluidic device with thermal lysis section", 2011.12.22. 공개) 등에서 제시된 바 있다. 그러나 이러한 방법들은 외부에 설치되는 가열 모듈이나 회로소자 및 온도 센서 등의 별도 가열 수단을 필요로 하여, 온도 제어가 용이하지 않아 비효율적이고, 전체 장치의 크기가 늘어나 비경제적이라는 단점이 있다.

또 다른 방법으로는 대한민국 등록특허공보 제0723424호("세포 또는 바이러스의 농축 및 용해용 미세유동장치 및 방법 및 상기 미세유동장치의 제조방법", 2007.05.23. 공개) 등에서 제시된 전기화학적 방법으로서, 이온 교환막을 통해 격리된 캐소드/애노드 챔버에 전압을 인가하여 함유된 화학물질의 전기분해를 통해 시료 내의 pH를 제어함으로써 세포를 용해하는 방법이 있다. 그러나 이러한 전기화학적인 방법은 전기적인 제어와 화학적인 제어를 동시에 조절해야 하므로 전체 공정 변수를 제어하는데 어려움이 있고, 용해 및 검출 시간이 과도하게 걸린다는 문제가 있다.

한편, 미세유체 장치(microfluidic device)를 기반으로 하는 세포 용해 장치의 경우 세포 내벽이나 금속 나노 입자와 같은 열 전달 매체로 시료 내 타겟 세포를 농축 내지 포획시키는 과정이 필수적이다. 이에 종래에는 타겟 세포에 특이적인 친화성을 갖는 항체를 채널 내벽이나 열 전달 매체 표면에 코팅하였으나, 이는 다양한 타겟 세포 각각에 대한 항체가 요구되어 처리량이 늘어날수록 공정 비용이 기하급수적으로 늘어나며, 시료 내 복수의 세포군 중 특정 세포군만을 선택적으로 용해시킬 수 있어 비효율적이라는 문제가 있다.

대한민국 공개특허공보 제2013-0066293호("핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법", 2013.06.20. 공개) 미국 공개특허공보 제2011-0312749호("Microfluidic device with thermal lysis section", 2011.12.22. 공개) 대한민국 등록특허공보 제0723424호("세포 또는 바이러스의 농축 및 용해용 미세유동장치 및 방법 및 상기 미세유동장치의 제조방법", 2007.05.23. 공개)

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 창안된 것으로, 본 발명의 목적은 헤링본(herringbone) 패턴으로 형성된 미세유체 칩의 채널 내에 주입된 시료를 농축시키고, 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 시료 내 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법을 제공하는데 있다.

상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따라 일 측에는 시료 주입구가, 타 측에는 시료 배출구가 구비되어 상기 시료 주입구로 공급된 시료를 내부에서 이동시키면서 상기 시료 내 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 용해 미세유체 장치에 있어서, 상기 세포 용해 미세유체 장치의 내부에는 상기 시료 주입구 및 시료 배출구와 소통되어 상기 시료가 상기 시료 주입구로부터 상기 시료 배출구로 이동되는 경로를 마련하는 복수 개의 미세 채널(micro channels)이 구비되되, 상기 복수 개의 미세 채널은 내부에 다수의 꼭지점을 가지는 V자형 또는 S자형의 수평 띠 모양이 나란하게 배열된 형태의 헤링본(herringbone) 패턴을 이루도록 공동(void)이 형성되고, 상기 시료는 상기 헤링본 패턴 형성 방향에 수직한 방향으로 이동되며, 상기 복수 개의 미세 채널 내벽에는 금 나노 입자(gold nanoparticle)가 삽입된 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치를 제공한다.

이때 세포 용해 미세유체 장치의 재질은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cyclo olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르술폰(polyether sulfone, PES), 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화 에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP) 및 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 단일 재질 또는 둘 이상이 조합된 복합 재질인 것이 바람직하며, 미세 채널의 내벽에 소수성(hydrophobic) 물질이 코팅된 것이 더욱 바람직하고, 상기 금 나노 입자의 평균 직경은 5~100㎚ 범위일 수 있다.

또한 상기 헤링본 패턴은 다수의 꼭지점을 가지는 V자형 또는 S자형의 수평 띠 모양이 나란하게 배열된 것이고, 상기 미세 채널 내에서 시료는 상기 헤링본 패턴 형성 방향에 수직한 방향으로 이동되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 상기 다수의 꼭지점은 25~150㎛ 범위 내의 간격과 150~300㎛ 범위 내 혹은 25~75㎛ 범위 내의 간격과 75~125㎛ 범위 내의 간격을 교대로 가질 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 다수의 꼭지점 부근의 미세 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자의 밀도가 다른 영역에서의 밀도보다 높을 수 있다.

한편, 본 발명은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 바람직한 두 번째 실시예로서, 전술한 세포 용해 미세유체 장치; 상기 세포 용해 미세유체 장치를 통해 시료 내 세포가 용해되어 시료 배출구로 배출되는 세포 내 유전 물질 중 목적하는 부분을 대량으로 증폭시키는 중합효소 연쇄반응기(Polymerase chain reactor, PCR); 및 상기 중합효소 연쇄반응기를 통해 증폭된 유전 물질을 정성/정량 분석하는 분광 장치(spectroscopy); 를 포함하는 유전 물질 검출 시스템을 제공한다.

또, 본 발명은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 바람직한 세 번째 실시예로서, 미세유체 칩(microfluidic chip) 내 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 세포를 용해(lysis)시키는 방법에 있어서, 전술한 바와 같은 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구를 통하여 시료를 주입하는 단계(S10); 및 레이저 광원을 통해 상기 세포 용해 미세유체 장치 내 금 나노 입자가 삽입된 미세 채널에 레이저를 조사하는 단계(S20);를 포함하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법을 제공한다.

이때 상기 레이저 조사 단계(S20)에서, 조사되는 레이저의 파장은 500~600㎚ 범위인 것이 바람직하며, 조사되는 레이저 광원의 전력이 100~300mW 범위인 것이 바람직하고, 시료의 주입을 중단시킨 후 레이저를 조사하는 회분식 공정(batch process)으로 이루어지는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 바람직한 네 번째 실시예로서, 미세유체 칩(microfluidic chip) 내 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 용해(lysis)된 세포 내 유전 물질을 검출하는 방법에 있어서, 전술한 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구를 통하여 시료를 주입하는 단계(S100); 레이저 광원을 통해 상기 세포 용해 미세유체 장치 내 금 나노 입자가 삽입된 미세 채널에 레이저를 조사하는 단계(S200); 상기 세포 용해 미세유체 장치를 통해 시료 내 세포가 용해되어 시료 배출구로 배출되는 세포 내 유전 물질 중 목적하는 부분을 중합효소 연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)으로 대량 증폭시키는 단계(S300); 및 대량 증폭된 상기 유전 물질을 분광 장치(spectroscopy)를 통해 정성/정량 분석하는 단계(S400);를 포함하는 유전 물질 검출 방법을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법은, ① 특정 타겟 세포에 특이적인 항원-항체 결합을 이용한 방식이 아닌 자연스러운 흡착 방식을 통해 시료 내 세포를 채널 내벽에 흡착 내지 농축시키므로 시료 처리량이 늘어나더라도 처리 비용이 상당 부분 절감되어 경제적이고 시료 내 모든 세포를 대상으로 단백질이나 핵산 등을 추출할 수 있어 효율적이며, ② 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자에 레이저를 조사하여 광열 효과에 의한 열 작용으로 포획 및 농축된 세포를 용해시키므로 처리 과정이 용이하고 정확성 및 신뢰성이 향상되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 대한 전체적인 개념도이다.
도 2는 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 내 미세 채널의 모습을 보여주는 모식도이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 내 미세 채널의 패턴 일례를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 내 미세 채널의 패턴 일례를 상세하게 설명하기 위한 개념도이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 금 나노 입자가 삽입된 PDMS 채널의 HAuCl₄ 농도 별 색 변화를 보여주는 비교 사진이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 금 나노 입자가 삽입된 PDMS 채널의 HAuCl₄ 농도별 광열 효과의 비교 실험 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

"제 1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.

각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

먼저, 본 발명은 바람직한 일 실시예에 따라 세포를 농축 및 용해시키기 위한 미세유체 장치로서, 헤링본(herringbone) 패턴으로 형성되는 복수 개의 미세 채널 내벽에 금 나노 입자가 삽입된 세포 용해 미세유체 장치를 제공한다. 본 실시예에 따른 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 관한 개략도가 도 1에 도시되어 있다.

상기 미세 채널의 재질은 다양한 재질을 차용하여 사용할 수 있지만, 바람직하게는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cyclo olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르술폰(polyether sulfone, PES), 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화 에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP) 및 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 단일 재질 또는 둘 이상이 조합된 복합 재질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 PDMS로 구성할 수 있다. 상술한 바와 같이 미세 채널을 고분자 플라스틱 수지 재질로 구성하게 되면, 채널의 높이나 폭 등의 조절이 용이하여 제작 공정이 단순하고, 제조 비용을 크게 절감시킬 수 있다는 장점이 있다.

또한, 상기 미세 채널의 내벽에는 소수성(hydrophobic) 물질을 추가로 코팅하여, 시료 내 세포의 흡착을 보다 용이하게 유도할 수 있다. 상기 소수성 물질은 다양한 종류의 물질을 필요에 따라 채택하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 물 접촉각(water contact angle)이 70~90°로 형성되는 소수성 물질일 수 있다. 친수성 표면의 경우 세포나 바이러스와 거의 결합하지 않지만 소수성 표면, 특히 그 중에서도 물 접촉각이 상기 범위에 해당하는 경우에는 세포나 바이러스가 표면에 용이하게 흡착되도록 유도할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 소수성 물질은 옥타데실트리클로로실란(OTS), 트리데카플루오로테트라히드로옥틸 트리메톡시실란(DTS), 옥타데실디메틸(3-트리메톡시실릴 프로필)암모늄 클로라이드(OTC) 및 폴리에틸렌이민트리메톡시실란(PEIM)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 단일 물질이거나 둘 이상의 혼합 물질인 것일 수 있다.

한편, 미세 채널은 헤링본(herringbone) 패턴으로 형성될 수 있다. 본 발명자들은 카오스 혼합(Chaotic mixing)이 가능하다고 알려진 헤링본 패턴을 참고하여 넓은 면적에서 카오스 혼합이 일어날 수 있는 패턴이 형성된 채널을 착안하였다.

더욱 상세하게 설명하면, 미세 채널은 그 내부에 형성된 공동(void)이 헤링본 패턴으로 형성된 것을 특징으로 한다. 즉 채널은 미세유체 칩 구조물 내부에 형성된 미세한 공동(void), 공극(pore) 또는 공간(space)일 수 있으며 이것이 가느다란 관 형태의 채널을 이루는 것이다. (도 2 참고)

본 명세서에서 "헤링본 패턴"이라 함은 텔레비전 수상기의 스크린 상에서 가끔 볼 수 있는 간섭 무늬와 같이 밀접하게 배열된 V자형 또는 S자형의 수평 띠 모양을 의미하고, 그 중에서도 다수의 꼭지점을 가지는 V자형 또는 S자형의 수평 띠 모양이 나란하게 배열된 것일 수 있다.(도 3 및 도 4 참고)

통상적으로 미세유체 칩 내 채널에서 유체 시료는 층류 흐름(laminar flow)의 거동을 보이므로 시료 내 세포들이 채널 내벽에 흡착되도록 유도하는 것이 용이하지 않다. 그러나 본 발명의 미세 채널은 헤링본 패턴으로 형성됨으로써, 채널 내에서 유체 시료의 와류(vortex)가 발생되어 시료 내 세포들이 채널 내벽에 충돌하는 횟수가 증가하게 되며, 채널 내벽, 특히 헤링본 패턴 상의 다수의 꼭지점 부근에 자연스럽게 흡착 내지 농축되게 된다. 이러한 점에서 헤링본 패턴은 기하학적으로 활성화된 표면 상호작용을 유도하는 GASI 패턴(Geometrically activated surface interaction Pattern)이라고 할 수 있다.

미세 채널을 헤링본 패턴으로 형성하는 방법에 대해서는 특별히 제한하지 않으며, 이 기술분야에서 알려진 다양한 방법을 차용할 수 있다. 예컨대, 기계 가공을 이용하여 금형을 제작한 후, 사출을 통하여 플라스틱 칩으로 만들 수 있고, 실리콘(Si)이나 유리 웨이퍼(glass wafer)에 식각 공정으로 패턴을 제작하여 구현하는 것도 가능하다.

한편, 채널 내에서 시료의 이동 방향은 특별히 제한되지 않으나, 도 3 및 도 4에 표시된 바와 같이 상기 헤링본 패턴의 형성 방향에 수직한 방향으로 이동하는 것이 바람직하다. 헤링본 패턴의 꼭지점 부근 영역에서 표적 세포를 더욱 많이 부착시키는 것을 그 목적으로 하므로, 헤링본 패턴의 형성 방향에 수직한 방향으로 시료가 이동하는 경우에 꼭지점과의 접촉 면적 또는 빈도를 최대로 할 수 있어 유리하다.

상술한 바와 같은 헤링본 패턴의 내부 구조를 갖는 미세 채널을 구비함으로써, 별도의 특이적인 항체 등의 결합 유도 물질을 사용하지 않아도 많은 양의 타겟 세포를 채널 내벽에 부착시킬 수 있고, 비특이적으로 시료 내 모든 세포를 효율적으로 포획 및 농축할 수 있어 짧은 시간에 많은 종류의 세포군을 처리할 수 있으며, 헤링본 패턴의 꼭지점 배열 위치와 패턴이나 채널의 종 방향 또는 횡 방향 길이를 조절 조절하여 세포 분리 효율을 현저히 높일 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 헤링본 패턴이 가지는 다수의 꼭지점은 도 5에 도시된 바와 같이, 25~150㎛ 범위 내의 간격(ℓ₁)과 150~300㎛ 범위 내의 간격(ℓ₂)을 교대로 가지는 것이 바람직하며, 25~75㎛ 범위 내의 간격(ℓ₁)과 75~125㎛ 범위 내의 간격(ℓ₂)을 교대로 가지는 것이 더욱 바람직하고, 약 50㎛의 간격(ℓ₁)과 약 100㎛의 간격(ℓ₂)을 교대로 가지는 것이 가장 바람직하다.

즉, 본 발명은 미세 채널의 헤링본 패턴 상의 다수의 꼭지점 부근 영역에서 시료 내 세포를 부착 및 농축시키는 것을 특징으로 하므로, 도 3 내지 도 5에 도시된 바와 같이 소정 영역에서 꼭지점이 2개 이상 연속적으로 배열되도록 한 것이다. 이 경우 인근 꼭지점이 위치하게 되는 영역에서의 미세 채널 내벽은 다른 영역과 비교하여 더 높은 밀도로 금 나노 입자를 삽입하여 장치의 효율성을 향상시킬 수 있다.

이와 같이 다수의 꼭지점 사이 간격을 좁은 간격(ℓ₁)과 넓은 간격(ℓ₂)을 반복하여 구성하게 되면 꼭지점을 연속적으로 인접하게 배열시킬 수 있어 꼭지점 부근 영역에 대한 세포 흡착 효과를 최대로 할 수 있다. 또한, 도 3에 도시된 것 보다 도 4에 도시된 것처럼 꼭지점 부분이 더욱 밀집되도록 구성한 경우에 동일 장치 면적 대비 꼭지점 영역의 면적이 높아져 더 고효율의 세포 부착 효과를 얻을 수 있다. 다만 이 경우 상기 수치 범위보다 간격을 작게 형성하게 되면 꼭지점과 비 꼭지점 영역의 구분이 모호해지므로 오히려 꼭지점 영역에서의 부착 효과를 감소시키는 단점이 있어 부적합하다.

한편, 금 나노 입자 같은 금속 나노구조물은 주변 환경 변화에 따라 뚜렷한 플라즈몬 흡수 밴드 변화를 나타낸다. 이와 같은 금속 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명현상에 의한 주위환경에 민감하게 반응하는 특성은 고감도 광학형 면역센서, 화학물질 검출 센서 등에도 응용될 수 있다.

특히 금 나노 입자는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 현상에 의해 전자기파를 흡수할 수 있고, 흡수된 전자기파는 금속막에 존재하는 전도성 전자들을 집단적으로 진동시켜 열을 발생시킨다. 이러한 금 나노 입자는 크기와 모양에 따라서 흡수할 수 있는 빛의 영역이 다른데, 금 나노 막대(gold nano rod)의 경우, 근적외선 영역의 빛을 높게 흡수하는 특성을 가지고 있으며, 이러한 특성은 광열효과를 발생시키기 위한 도구로 응용되고 있다.

예를 들면, J. Kimling 등은 아스코르브산(Ascorbic acid)로 환원시키고 소듐 사이트레이트(Sodium Citrate)로 안정화시킨 5 내지 120 nm의 금 나노 입자를 만들어 냈고 흡수 스펙트럼을 측정하고 모양을 확인한 것을 보고하였다. 한편, Brian G. Prevo 등은 소듐 사이트레이트(Sodium Citrate)로 안정화시키고 소듐 보로하이드(Sodium borohydride)로 환원시킨 금 나노 입자에 은 나노 입자를 합금시켜 광열치료에 적용이 가능하다는 연구를 발표한바 있다.

광열 효과를 발생시키기 위해 미세 채널 내벽에 삽입되는 금속 나노 입자은 전자기파 조사 시 표면 플라즈몬 공명에 의해 열을 발생할 수 있는 금속이라면 특별히 제한하지는 않으며, 바람직하게는 근적외선 영역에서 흡광도를 갖는 금 나노 입자일 수 있다.

금 나노 입자의 형태는 원형을 비롯하여 다양한 형태를 가질 수 있으며, 예컨대 납작한 프리즘(prism) 형태를 나타낼 수 있고, 삼각형이나 삼각형에서 꼭지점 부분이 잘려나간 육각형일 수 있으며, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 금 나노 입자는 레이저 조사에 따른 광열 효과를 높이고, 미세 채널 내벽에의 삽입 용이성을 고려하여 평균 직경이 5~100㎚ 범위인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 언급된 "광열 효과"란 특정 파장의 빛을 쏘여주었을 때 빛에너지가 열에너지로 전환되는 효과를 의미하며, 레이저 조사 시 금 나노 입자의 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 열을 발생되고 발생된 열을 통해 미세 채널 표면에 흡착 및 농축된 시료 내 세포를 용해(lysis)하는데 사용하게 된다.

상기 금 나노 입자를 제조하기 위한 전구체(precursor)는 목적에 따라 다양한 금 함유 화합물을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 HAuCl₄, AuCl, AuCl₃, Au₄Cl₈, KAuCl₄, NaAuCl₄, NaAuBr₄, AuBr₃, AuBr, AuF₃, AuF₅, AuI, AuI₃, KAu(CN)₂, Au₂O₃, Au₂S, Au₂S₃, AuSe, Au₂Se₃, AuTe₂ C₅H₅AuCl₃N 및 [(C₆H₅)₃P]AuCl로 이루어진 군 중에서 선택되는 단일 물질이거나 둘 이상의 복합 물질일 수 있다.

한편 본 발명은 바람직한 다른 실시예에 따라 전술한 바와 같은 세포 용해 미세유체 장치, 중합효소 연쇄반응기(PCR) 및 분광 장치(spectroscopy)를 포함하는 유전 물질 검출 시스템 및 이를 이용한 유전 물질 검출 방법을 제공한다.

상기 상세히 언급한 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구로 주입하는 단계(S100)를 거친 후 레이저 광원을 통해 미세 채널에 레이저를 조사하여 미세 채널 내벽에 흡착 및 농축된 시료 내 세포를 용해시키는 단계(S200)를 거친다.

그 후 미세 유체 장치의 시료 배출구로 배출되는 시료 내에 세포 용해로 인해 포함유전 물질 중 목적하는 부분을 중합효소 연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)으로 대량 증폭시키는 단계(S300)를 거친 후 분광 장치(spectroscopy)를 통해 증폭된 유전 물질을 정성 및 정량 분석하는 단계(S400)를 수행한다.

상기 분광 장치는 질량 분석기(Mass Spectroscopy), 적외선 분석기(IR Spectroscopy) 및 핵 자기공명 분석기(Nuclear Magnetic Resonance) 등이 이에 해당될 수 있으며, 필요에 따라 다양한 분광 장치를 통해 용해 처리된 시료 내 유전 물질을 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은 바람직한 또 다른 실시예에 따라 전술한 바와 같은 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구를 통하여 시료를 주입하는 단계(S10) 및 레이저 광원을 통해 미세 채널에 레이저를 조사하는 단계(S20)를 포함하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법을 제공한다. 전체 공정을 개략적으로 표현한 모식도가 도 1에 도시되어 있다.

이때 상기 레이저 조사 단계(S20)에서는 금 나노 입자의 광열 효과를 보다 효과적으로 발현시키기 위하여 조사되는 레이저의 파장을 500~600㎚ 범위에서 제어하는 것이 바람직하며, 조사되는 레이저의 광원의 전력이 100~300mW 범위에서 제어되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 광원 전력의 수치 범위의 하한값 미만인 경우에는 미세 채널 내벽에 부착 및 농축된 시료 내 세포의 용해를 효과적으로 수행하기에 부족하며, 상한값을 초과하는 경우에는 불필요한 전력 낭비로 인해 비경제적이다.

또한, 상기 레이저 조사 단계(S20)에서 시료 주입구에 유체 시료를 연속적으로 주입하면서 동시에 레이저를 조사하고, 세포가 충분히 용해 처리된 시료가 시료 배출구로 배출되도록 하는 연속 공정(continuous process)으로 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 충분한 양의 시료를 일정 시간 동안 미세유체 장치에 주입시킨 후 시료의 주입을 중단시켜 충분히 시료 내 세포가 미세 채널 내벽에 포획 및 농축되도록 체류 시간을 확보한 다음, 미세 채널에 레이저를 조사하는 회분식 공정(batch process)로 이루어지도록 하는 것이 세포 용해의 수득률 차원에서 더욱 효과적이다.

이하 본 발명의 세포 용해 미세유체 장치 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 대한 실시예를 살펴본다. 그러나 이는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

<PDMS에 금 나노 입자(gold nanoparticles)를 삽입하는 과정>

염화금(HAuCl₄)을 탈이온수(DI water)에 넣어 0.5 v/w%(용매의 질량 당 용질의 부피비)의 혼합 용액을 만든 뒤, PDMS 20g에 경화제(curing agent) 2g 및 상기 혼합 용액을 섞고, 약 15분 동안 진공 펌프를 이용하여 기포를 뺀다. 그 후 90℃의 온도에서 1시간 30분 동안 가열시킨다.

<금 나노 입자가 삽입된 PDMS의 HAuCl₄ 농도별 색 변화>

상기 실시예 1과 동일하게 금 나노 입자가 삽입된 PDMS 5개의 실험군으로 제조하되, 상기 실시예 1에서 PDMS 20g, 경화제 2g에 추가로 넣는 HAuCl₄ 0.5 v/w% 혼합 용액의 양을 조절하여 전체 혼합물에서의 HAuCl₄ 농도를 각각 0.45, 0.91, 1.36, 1.82, 2.27 v/w%에 해당하도록 하였다.

도 6에 도시된 바와 같이 HAuCl₄의 농도가 높아질수록 PDMS의 색이 삽입된 금 나노 입자의 고유의 색인 붉은색 계통으로 바뀌는 것을 볼 수 있었다. HAuCl₄의 농도가 높아질수록 PDMS에 삽입되는 금 나노 입자의 양이 증가한다는 것을 알 수 있다.

<PDMS 미세 채널의 HAuCl₄ 농도별 광열 효과 비교 실험>

상기 실시예 2에서 제작된 각각 다른 농도의 금 나노 입자가 삽입된 다섯 개의 PDMS 구조체에 대하여, 532㎚의 파장을 갖는 레이져 광원의 전력을 100, 200 및 300mW로 달리하면서 광열 실험을 수행하였다.

도 7에 도시된 그래프의 가로축은 HAuCl₄의 농도이고(각 농도마다 광원의 전력에 따른 3개의 그래프가 도시됨) 세로축은 2분 동안 최종적으로 상승한 온도 값이며 이는 적외선 카메라로 측정하였다.

실험 결과를 볼 때, 레이져 광원의 전력이 300mW이고 HAuCl₄의 농도가 1.82v/w% 이상일 때 박테리아 등의 세포를 단시간에 용해시킬 수 있는 약 100℃ 정도의 열이 발생되어 본 발명의 세포 용해 미세유체 칩 및 이를 이용한 세포 용해 방법에 적용하기에 적합하다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.

Claims (14)

1. 일 측에는 시료 주입구가, 타 측에는 시료 배출구가 구비되어 상기 시료 주입구로 공급된 시료를 내부에서 이동시키면서 상기 시료 내 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 용해 미세유체 장치에 있어서,
   상기 세포 용해 미세유체 장치의 내부에는 상기 시료 주입구 및 시료 배출구와 소통되어 상기 시료가 상기 시료 주입구로부터 상기 시료 배출구로 이동되는 경로를 마련하는 복수 개의 미세 채널(micro channels)이 구비되되,
   상기 복수 개의 미세 채널은 내부에 다수의 꼭지점을 가지는 V자형 또는 S자형의 수평 띠 모양이 나란하게 배열된 형태의 헤링본(herringbone) 패턴을 이루도록 공동(void)이 형성되고, 상기 시료는 상기 헤링본 패턴 형성 방향에 수직한 방향으로 이동되며, 상기 복수 개의 미세 채널 내벽에는 금 나노 입자(gold nanoparticle)가 삽입된 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
2. 제1항에 있어서,
   상기 세포 용해 미세유체 장치의 재질은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cyclo olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르술폰(polyether sulfone, PES), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화 에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP) 및 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나의 단일 재질 또는 둘 이상이 조합된 복합 재질인 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
3. 제1항에 있어서,
   상기 미세 채널 내벽에 소수성(hydrophobic) 물질이 코팅된 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 헤링본 패턴에서 다수의 꼭지점은 25~150㎛ 범위 내의 간격과 150~300㎛ 범위 내의 간격을 교대로 가지는 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
6. 제1항에 있어서,
   상기 헤링본 패턴에서 다수의 꼭지점은 25~75㎛ 범위 내의 간격과 75~125㎛ 범위 내의 간격을 교대로 가지는 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
7. 제1항에 있어서,
   상기 헤링본 패턴에서 다수의 꼭지점 부근의 미세 채널 내벽에 삽입된 금 나노 입자의 밀도가 다른 영역에서의 밀도보다 높은 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
8. 제1항에 있어서,
   상기 금 나노 입자의 평균 직경은 5~100㎚ 범위인 것을 특징으로 하는 세포 용해 미세유체 장치.
9. 상기 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포 용해 미세유체 장치;
   상기 세포 용해 미세유체 장치를 통해 시료 내 세포가 용해되어 시료 배출구로 배출되는 세포 내 유전 물질 중 목적하는 부분을 대량으로 증폭시키는 중합효소 연쇄반응기(Polymerase chain reactor, PCR); 및
   상기 중합효소 연쇄반응기를 통해 증폭된 유전 물질을 정성/정량 분석하는 분광 장치(spectroscopy);
   를 포함하는 유전 물질 검출 시스템.
10. 미세유체 칩(microfluidic chip) 내 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 세포를 용해(lysis)시키는 방법에 있어서,
    상기 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구를 통하여 시료를 주입하는 단계(S10); 및
    레이저 광원을 통해 상기 세포 용해 미세유체 장치 내 금 나노 입자가 삽입된 미세 채널에 레이저를 조사하는 단계(S20);
    를 포함하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 레이저 조사 단계(S20)에서,
    조사되는 레이저의 파장은 500~600㎚ 범위인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법.
12. 제10항에 있어서,
    상기 레이저 조사 단계(S20)에서,
    조사되는 레이저 광원의 전력이 100~300mW 범위인 것을 특징으로 하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법.
13. 제10항에 있어서,
    상기 레이저 조사 단계(S20)가,
    시료의 주입을 중단시킨 후 레이저를 조사하는 회분식 공정(batch process)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치를 이용한 세포 용해 방법.
14. 미세유체 칩(microfluidic chip) 내 금 나노 입자의 광열 효과(photothermal effect)를 이용하여 용해(lysis)된 세포 내 유전 물질을 검출하는 방법에 있어서,
    상기 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 세포 용해 미세유체 장치의 시료 주입구를 통하여 시료를 주입하는 단계(S100);
    레이저 광원을 통해 상기 세포 용해 미세유체 장치 내 금 나노 입자가 삽입된 미세 채널에 레이저를 조사하는 단계(S200);
    상기 세포 용해 미세유체 장치를 통해 시료 내 세포가 용해되어 시료 배출구로 배출되는 세포 내 유전 물질 중 목적하는 부분을 중합효소 연쇄반응법(Polymerase chain reaction, PCR)으로 대량 증폭시키는 단계(S300); 및
    대량 증폭된 상기 유전 물질을 분광 장치(spectroscopy)를 통해 정성/정량 분석하는 단계(S400);
    를 포함하는 유전 물질 검출 방법.

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