JP2010536565A - 目標種用のトラップ用磁気選別システム - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】磁性目標種の選別及びトラップ用のシステムは磁性粒子を受け取りモジュール内の箇所に一時的に保持するように設計された微少溶液装置から成る。モジュール内へ流入する磁性粒子は他の(非磁性）サンプル成分が連続的に部署を流通する間そこにトラップされ、それにより磁性粒子上に捕獲された種が分離され濃縮される。磁性粒子及び／或いはその有効荷重はサンプルがトラップモジュールを通過した後解放され個別に出口に於いて収集されてよい。
【選択図】図１Ｄ

Description

本出願は”Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ”の題名で２００７年８月２３日に提出された米国暫定特許出願６０／９６６，０９２号、及び”Ｔｒａｐｐｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ”の題名で２００８年３月１９日に提出された米国暫定特許出願６１／０３７，９９４号（両者ともの開示内容を本願にあらゆる目的に対して参照して組み込まれる）を基に優先権を主張するものである。

化学及び生理上の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を表面マーカーに基づいて選別することは生理学及び医学に於いて重要である。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）は多数の目標細胞の高速選択を可能とするため、細胞選別技術として使用されることがある。ＭＡＣＳの応用面は蛋白質純化から細胞に基づく療法に至る広範囲に亘るものである。典型的に、目標細胞は特別な細胞表面マーカーを認識する分子認識要素(例えば単クローンの抗体）に接合する一個以上の超常磁性粒子でラベル付けされる。

多くの場合ＭＡＣＳの応用は蛍光に基づく細胞数測定前の濃縮前に限定されて居たが、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などのその他の方法に較べて高い処理量を持つ故に、ＭＡＣＳは未だに競合的技術なのである。

まれな細胞（或いはその他の目標成分）の高度の処理量及び高度の回収を達成するために、現存のＭＡＣＳシステムの改善が必要とされて居る。

種々の実施例に於いて、流動性選別モジュールは磁性粒子を受けてから一時的にモジュール内の箇所に保持しておくように設計される。その後、粒子及び／或は捕獲された種は解放され、収集され、及び／或は更に加工される。そのような実施例に於いて、選別部署に流れ込む磁性粒子はその他のサンプル成分（非磁性）が連続的に部署に流出入する間にトラップされ、それにより磁性粒子に捕獲された種を隔離し濃縮する。非磁性的サンプル成分が選別室から流出した後に於いてのみ、磁性粒子及び／或はそれらの有効荷重は解放され、別々に選別部署の出口で収集される。

本発明はその一面に於いてサンプルを本質的目標と本質的非目標種に選別する微少溶液選別装置に関する。装置はトラップモジュール、及び加工前及び／或いは加工後部署を含む。トラップモジュールは二つの相対する壁を持つチャンネルを含み、その中の一つの壁は、サンプル中の磁性粒子を少なくとも一時的に捕獲するため、サンプルに磁力を発揮する磁界勾配生成構造体を含む。加工前及び／或いは加工後部署は微少溶液選別装置の上に於いてトラップモジュールと合体されて居る。

トラップモジュールの中の流通チャンネルは相対する壁、一つの透明な壁及び一つの不透明な壁、或いは二つの不透明な壁を有するものでよい。磁界勾配生成構造体は不透明な壁の上にあってよい。磁界勾配生成構造体はパタンとして設計されたものでもよく、その相対する壁の上のランダムな配列でもよい。パタンは平行線、直交格子、規則的或は不規則的な幾何学的形状の矩形配列、及びそれらの組み合わせでよい。強磁性構造体はニッケル、バナジウム パーメジュ（ｐｅｒｍｅｄｕｒ）、パーマロイ、或いはその他の強磁性体物質でよい。

流通チャンネルは入口領域、トラップ領域、及び出口領域を含む。トラップ領域での流通チャンネルの深さは入口及び出口領域の深さ以上、好適には入口及び出口領域の約２倍でよい。複数の独立した流通チャンネルが使用されてもよい。これらの流通チャンネルはバッファマニホールドを共用し、同じサンプル或いは異なるサンプルを処理するように構成されてもよい。或る実施例に於いて、同じ流通チャンネルに複数のトラップ領域が使用されてもよい。

微少溶液選別装置はトラップモジュールの一方の側、好適には磁界勾配生成構造体の側に磁界を生成するための外部の磁界源(外部源）を含むものでよい。或る実施例に於いては、磁界がトラップ部署の中で流体の流れに抗し、この磁界がトラップ領域に宛てられるに従って運動が止まるように進行的にこのトラップ部署に与えられる。即ち、時間的に変化する磁界をトラップ領域に生成して望まれる磁性粒子の運動を誘起するように磁界は移動されるのである。

これは、磁性ビーズに縛られた目標種がトラップ領域に亘って均一的に拡がるのに役立つかも知れない。これは更に試薬を有効的に磁性ビーズに縛られた目標種にアクセスするようにさせて解放するような分離後工程を容易にするかも知れない。進行的に磁性を与えることは、外部磁性源をトラップモジュールに対して移動することによって行われてもよい。外部源は一個以上の永久磁石、一個以上の電磁石、或いはこれらの組み合わせでよい。

加工前部署はサンプルの中の種にラベル付けされた種との親和性を有する磁性粒子でラベル付けするラベル部署を含むものでよい。ラベル付けされた種が目標種であっても非目標種であってもよいことに留意されたい。ラベル付けされた非目標種であれば、非目標種がトラップされることによりトラップモジュールを通過するサンプル中の目標種の濃度が増加する。ラベル付けされたのが目標種であれば、トラップモジュールの中で目的種がトラップされ、後に収集される。

或る実施例に於いて、加工前部署或は加工後部署の中少なくとも一つが、選別装置を通過するサンプルの中の目標種の濃度を増加する濃縮モジュール、反応モジュール、検出モジュール、及び細胞を分解し、ウイルス性蛋白質外被を崩壊し、或は別の方法で小さい生存システムを開放する分解モジュールとから成るものである。トラップモジュールはゲノム解析、ＤＮＡ或はＲＮＡオリゴマー用の検出及び／或は増幅体系、遺伝子発現、酵素的活性分析物、受容体結合分析物、及びＥＲＩＳＡ分析物を含むトラップ以外の工程を実施するように設計或は構成されたものでよい。

他の面に於いて、本発明はサンプルを本質的目標と本質的非目標種に選別する微少溶液選別装置に関するものである。この装置はトラップモジュール、上記のような加工前及び／或いは加工後部署、トラップモジュールの一方の側にある、磁界を生成する為の外部源、及び時間に亘って磁界を変化させる機構とから成る。トラップモジュールは二つの相対する壁を有し、磁界勾配生成構造体を持たない。一実施例に於いて、トラップモジュールの外部磁界源を有する側は不透明である。

更にその他の面に於いて、本発明はトラップモジュールと、トラップモジュールの二つの相対する壁の只一方の上にある磁界勾配生成構造体とを含む微少溶液選別装置の中のサンプルを選別する方法に関する。この方法は、サンプルをトラップモジュールの中へと流す工程と、トラップモジュールの中に磁界勾配を生成する工程と、トラップモジュールの中の磁性粒子をトラップする工程とから成る。サンプルは分子識別要素をその上に持つ複数の磁性粒子と目標種と非目標種とを含む。外部磁界はモジュールの一方の側から磁界勾配生成構造体へと発揮される磁性粒子はトラップモジュールの一つの壁の上の磁界勾配生成構造体の近くでトラップされる。磁界はトラップ部署の中で流体の流れに抗し、この磁界がトラップ領域に宛てられるに従って運動が止まるように進行的にこのトラップ部署に与えられてよい。即ち、時間的に変化する磁界をトラップ領域に生成して望まれる磁性粒子の運動を誘起するように磁界は移動されるのであり、これにより、磁性ビーズに縛られた目標種がトラップ領域に亘って均一的に拡がることになる。

或る実施例に於いて、選別方法は更に磁性粒子を磁界勾配生成構造体の一部分から解放してトラップされたいずれの非磁性粒子をも解放する工程と、磁性粒子を磁界勾配生成構造体の他の部分或いは他の磁界勾配生成構造体でトラップする工程とを含んでよい。選別方法はまたサンプルの中の目標種を目標種と親和性のある磁性粒子でラベル付けする工程、或いは サンプルの中の非目標種を非目標種と親和性のある磁性粒子でラベル付けする工程を更に含んでよい。選別方法はまたマイクロアレイの中の目標種を検出する工程、目標種を分解する工程、 目標種を反応させる工程、或いはトラップされた目標種を撮像する工程更に含んでよい。反応させる工程は目標種を増幅し、配列し、雑種を作り、ラベル付けをし、クロスリンクし、或は培養する工程を含んでよい。これらの加工前及び加工後の処理はトラップモジュールの中、或いは同じ微少溶液装置の別のモジュールの中で行われてもよいことに留意されたい。

発明のこれら及びその他の特徴及び実施例は添付された図を参照して以下詳細に説明される。

使い捨て用品である液体工学チップ及びカートリッジを使用するシステムを示す。 図１Ａのシステムを使用する処理のフロー図である。 或る実施例による磁性トラップモジュールの平面図である。 或る実施例による磁性トラップモジュールの側面図である。 本発明の種々の実施例によるサンプルを選別する方法の処理のフロー図である。 磁性粒子のトラップ領域通過中磁界生成手段がトラップ領域の一面の上を移動する実施例を示す。 ステージ的捕獲及び解放トラップシステムを示す。 ステージ的捕獲及び解放トラップシステムを示す。 ステージ的捕獲及び解放トラップシステムを示す。 サンプル用凹体及びビーズ解放試薬用凹体の液体工学入力を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 目的種の捕獲後処理用の液体工学装置の中の磁性トラップの種々の構成を示す。 ソフト磁気（例えばニッケル）パタンの中で生成された非磁性捕獲特徴の例を示す。 強磁性構造体のランダム配列の例を示す。 強磁性構造体のランダム配列の例を示す。 強磁性構造体のランダム配列の例を示す。 トラップ領域で深さの大きな液体工学チャンネル実施例の側面図を示す。 トラップ領域で深さの大きな液体工学チャンネル実施例の側面図を示す。 バッファマニホールドを共用する平行液体工学チャンネルを有する実施例を示す。 二個のトラップ領域を有する液体工学チャンネルを示す。

[序文と背景]
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムではラベル付の細胞及びその他のサンプル成分の高純度選別が可能である。或る実施例に於いて、これらのシステムでは外部磁界の適用後非目標種と目標種が順番に溶出される”トラップモード”で処理される。即ち、磁性粒子が付けられた種は、付けられない種が溶出されて居る間、その場所に保留されて居る。この第一溶出工程の完了後、磁界が付けられて溶出が阻まれた種が何かの方法で解放され、溶出され、回収される。

或る実施例に於いて、ＭＡＣＳシステムのトラップモジュールはチャンネルから成り、磁性粒子の付いた及び付かない種を含むサンプルがそれを通じて流れる。チャンネルの片側には外部の磁界源から磁界を適用することで磁界勾配を生成する磁界勾配生成構造体が含まれて居る。この磁界勾配は磁性粒子をそれに付いた種と共に引き寄せて捕獲する。サンプルがトラップモジュールを流通した後、捕獲された粒子は適用された磁界を変更したり、磁性粒子とそれに付いた種との間のリンクを切開することにより解放されてよい。

背景として、トラップ型の磁気分離システムの一例を開示する。図１Ａ及び１Ｃは或る実施例による磁性選別モジュールとシステムを示す。図１Ａは使い捨て用品である液体工学チップ及びカートリッジ１０３を使用するシステム１０１を示す。各チップ或いはカートリッジは磁性トラップモジュールを含む液体工学要素を内包する。一処理法（正選択）に於いて、少量の血液のようなサンプル１０５がカートリッジの受け口１０７に与えられ、そこでサンプルを伴ったカートリッジが処理解析器具１２１へ挿入される。チップの中でサンプルからの磁性粒子と目標種（もし存在するならば）が選別され磁性トラップモジュールで濃縮される。サンプルがこのように処理された後、トラップされた種は解放され出力チューブ１０９に回収されてもよい。このことは、トラップモジュールに与えられた外部磁界の減少或いは除去、捕獲された種を磁性粒子から解放させる試薬の使用など、各種の手段で実行することが出来る。その代わり、或るいはそれと同時に、磁性粒子に加えられる流体力学的の力を増加してもよい。図示の実施例に於いては、サンプルをトラップモジュールを通して流す主機動力を供するための加圧システム（シリンジポンプ１１１と圧力制御器１１３とを含む）を含むシステムの部分がシャッシに内包されている。言うまでもなく、連続型ポンプとか空圧システムのような他の駆動力を使用するその他のデザインを使用してもよい。バッファ貯蔵装置１１５からのバッファもバッファポンプ１１９及び流量制御モジュール１１７の制御のもとでカートリッジに供給される。

図１Ｂには処理の順序が例示されて居る。特に、処理は先ず装置に挿入する前にサンプルをチップ或いはカートリッジに載せる操作１３１で始まる。操作１３３に於いて、外部の磁石、液体工学カプリング、及び関連する器具を整列させるようにチップが挿入される。その後、回収チューブも搭載される(操作１３５）。或る実施例に於いては、これら搭載の順序が変更されてもよいことに留意されたい。次に、サンプル及びバッファが漏れなくチップに配達されることが保証されるように液体工学境界面が操作１３７でチップに固定される。最後に分離処理（１３９）が始まり、分離された細胞サンプルは回収チューブをおろす（１４１）ことによって回収することが出来る。

図１Ｃ及び１Ｄは一実施例によるトラップモジュールの平面図及び側面図である。特種実施例に於いて、図１Ａに示される如く、トラップモジュールは使い捨て用品であるカートリッジに実装される。図１Ｃに於ける磁性トラップモジュールの平面図には中央サンプル入口１４３とこのサンプル入口１４３をまたぐ二個のバッファ入口１４１とが示されて居る。バッファ入口から配達されるバッファはサンブル成分がトラップモジュールの縁に沿って引っ張られることを妨げ、圧力及び流れの安定化に貢献する。示される如く、この実施例に於いては強磁性パタン１５１を含むトラップ領域１４７が流通チャンネルの底壁の上に形成される。パタンの形成されるチャンネルの壁は透明でも、半透明でも、不透明であってもよい。

示される如く、目標種１４５はトラップ領域で捕獲される。残りの捕獲されない細胞１４９（或はその他の種）及びサンプルと共に供されたごみとは磁性粒子に付けられて居ないため、トラップ領域から奇麗に流されてしまう。

正或は負のトラップ体系が使用可能であることに留意されたい。図１Ｃ及び１Ｄに示される正のトラップ体系にあっては、例えば１４５及び１６３に示される目標種は結合子（ｌｉｎｋｅｒ）１７１によって磁性粒子１６９の表面に結合し、その後トラップ領域で磁性粒子と共にトラップされる。これによって効果的に目標種を純化し濃縮する。負のトラップ実施例にあっては、非目標種（目標種でなく）が磁性粒子でラベル付けされる。従って、ラベル付された非目標種がトラップ領域でトラップされ懸濁液から除去される間、ラベルのない目標種はトラップモジュールを通じて連続的に流れて行く。このアプローチによれば目標種は純化されるが濃縮されない。

運行中のトラップ領域の側面図が図１Ｄに示されて居る。此処に示される如く、強磁性構造体１７５が流通チャンネル１７３の下方壁１７７の内面上に形成され、これらは（以下詳細に説明される如く）磁界勾配生成（ＭＦＧ）構造体として作用する。外部磁界１６９が典型的に流体媒体を流れる磁性粒子をトラップ駆動力として使用される。ＭＦＧ構造体１７５は流動する磁性粒子の捕獲に貢献するように局地的に高い磁界勾配を生成するように外部電解を形成してよい。図１Ｄに示される実施例に於いて、外部磁界は極性を交互に配置された永久磁石１６１の配列による。一般的に、外部磁界は一個以上の永久磁石及び／或は電磁石によって供されてよい。或る実施例に於いて、図１Ｄに示されるような磁石群はトラップ領域に与えられる磁界を動力学的に変更するために独立的或は単位として移動可能のものである。

或る実施例に於いて、磁界の制御に電磁石が使用される、他の実施例に於いては、選別部署に於ける磁界勾配が局所的に増減可能であって磁性粒子の継続的捕獲や解放を容易とするように機械的に選別部署の近隣へ或はそこから移動可能な永久磁石が使用される。電磁石を使用する或る場合に於いて、磁界は強い磁界勾配が処理の初期（磁性粒子の捕獲の期間）に生成され、その後後期（粒子の解放の期間）になって減少されるように制御される。

図１Ｄの例に示される如く、磁性粒子は目標細胞１６３或は捕獲対象の他の種のマーカーに特別な一個以上の分子識別要素１７１（例えば抗体）で覆われて居る。従って一個以上の磁性粒子１６７が結合された細胞或はその他の目標種１６３と共に結合された単位としてトラップモジュールへと流される。多くの露出された結合部分を有する大きな目標種（例えば哺乳類細胞）の場合には、複数の磁性粒子が付着されるのが普通である。

或る実施例に於いて、トラップ領域は相対的に薄いかわりに幅が広く、処理量が相対的に高い。換言すれば、チャンネルの高さや幅は可成り薄くても、チャンネルの断面積は相対的に大きいと言うことである。チャンネルが薄いと言うことは、トラップ領域で流体媒体の中を流れる磁性粒子を引き寄せるのに使用される磁界の有効的到達範囲で定義されてよい。

本発明を使用するのに適当である液体工学システムの種々の詳細は２００６年１０月１８日出願の米国特許出願１１／５８３９８９号（本願にあらゆる目的に対して参照して組み込まれる）の中の流通モジュールの記述で論じられて居る。そのような詳細の例にはバッファの構成、磁性粒子の特性、外部磁石特性、ＭＦＧ用の強磁性構造体物質、流動条件、サンプルの種類、他のモジュールとの合体、液体工学及び磁性要素の制御システム、目標種と磁性粒子との間の結合機構などがある。一般的に磁性トラップモジュールの中で与えられた外部磁界は米国特許出願１１／５８３９８９号に記載されたタイプの連続的流動選別装置に使用されるものよりも相対的に（モジュールの全体的構成を考慮して）高いものである。いずれにせよ、目標種にかかる磁力は（磁性粒子に結合した）目標種が捕獲され流動体に抗してその位置にあることが保証されるように水力学的牽引力より十分大きくなくてはならない。

図２に示される典型的な正選択例に於いて、磁性トラップ処理２００は以下のようになる。第一に操作２０１に於いて、目標細胞を含むかも知れない生理学的標本のようなサンプルが目標細胞の表面マーカーに特別な捕獲部分（例えば抗体）で覆われた小さい磁性粒子でラベル付けされる。このラベル付け処理は微少溶液選別装置の上或は離れて行われてよい。このラベル付けの後、操作２０３に於いて、同時にバッファ溶液が流されるか否かを問わず、サンプルが選別部署（トラップ領域から成る）へ流される。バッファは一個以上を通して一個以上の入口とサンプルを通じて配達される。操作２０７に於いて選別部署は外部磁界で活性化され、操作２０９に於いて流動流体によって与えられる水力学的牽引力に対抗して磁気的にラベル付けされた目標細胞及び他の種をその位置に保持する。これは操作２１１に於いてラベルのない非目標種を連続的に溶出する間に行われる。上記の如く、磁界は典型的に選別部署近くに位置された外部磁石で引加される。選別部署からサンプル溶液の大部分或はすべてが流出してしまった後、操作２１３に於いて磁性成分は磁界勾配の変化及び／或は水力学的力の増加を含む多くの異なる機構のいずれかにより解放されてよい。例えば、室内の磁界が減少、除去、或は方向変化され、同時にサンプルの流入を解放剤（捕獲された種を解放するため）及び／或はバッファの流れが置換されてもよい。最後に前回不動化された磁性成分或はそれらに捕獲された種（今純化されて居る）が室内からバッファ溶液の中へ流出する。目標種から成る純化されたサンプル成分は操作２１５に於いて選別室の出口で収集される。選別室の出口は或る実施例に於いてはトラッブ室の直接下流側に位置して居る。

（恐らく細胞に付けられた一個或は少数の細胞に付けられた磁性粒子のみが磁界勾配生成構造体に影響される理由で）水力学的力に対して強力に、磁力に比較的弱く反応する哺乳類細胞のような大きい目標種の場合、捕獲及び解放プロトコルは殊に有利である。微少溶液選別装置内の流動の場の境界層に引き寄せられる傾向を有するウイルスのような相対的に小さい目標種を使用する場合にも、捕獲及び解放プロトコルは有益かもしれない。

トラップ型の選別モジュールの使用には種々の利点がある。以下はその例である。

１． トラップされた目標種を解放するのに少量のみの溶出体積を必要とするため、目標種は高度に濃縮可能である。時間に亘って低濃度のサンプルからの目標種は抽出され、全体のサンプルが処理されるまで保持される。捕獲された種はそこで相対的に小体積のキャリヤ媒体に解放され、それにより高純度、高濃度の溶液或は懸濁液が得られる。

２． 相対的に大きな磁界を使用し、選別モジュールの中で相対的に長距離に亘って磁性粒子に影響を与えるため、選別装置は物理的次元が相対的に大型である。一例として、流動チャンネルの高さは２０ミクロメータ以上でもよい。これにより、相対的に処理量が大きくなる（例えば１０ｍｌ／ｈ、５０ｍｌ／ｈ、１００ｍｌ／ｈ、或は１ｌ／ｈ）。

３． 単層（或はサブ単層）の捕獲された種が製造出来る。代行的に、単に少数のサブレイヤー（例えばバイレイヤー或はトライレイヤー）から成る層が製造可能である。いずれの場合にせよ、流路を圧縮したり、それ以外の様相でトラップを干渉したりする大型の”塊”が避けられる。これは下記の如く、外部磁界が動力学的に制御可能だからである。代行的或は追加的に、短距離のみに亘って非常に強い磁力が磁性粒子に引加されることを制限するのにＭＦＧが使用され得る。捕獲される種を単層に限定することには種々の利点がある。その一つは、モノレイヤーの上に障碍のない流路を供することにある。従って、トラップモジュールを流通する間に非目標種が大量の目標種に引き寄せられることは起こり難い。その他の利点はモノレイヤーの別個の種をよく定義された焦点の深さで撮像する能力にある。

４． 外部磁石の配列を使用してもよいことである。（例えば図１Ｄを参照）。これにより、選別モジュールの領域に亘って磁界の精密調整が可能となる。或る実施例に於いて、これは必要なことではないが、磁石の配列は図１Ｄに示されるように磁石の極性を行き違いに配列される。或る実施例に於いては磁石は只二個のみ使用される（両方ともＭＦＧの下に置かれる）。

５． 選別モジュール中の流通チャンネルの次元及び形状は磁性粒子（及び関連する目標種）に働く水力学的力を制御するために流路に亘って変更可能である。このようにして、磁気泳動的及び水力学的力のバランスが仕立てられ、高度の作用分離が得られる。

本発明の実施例は生物学的或は有機物質の解析に限定されるものでなく、非生物学的及び無機物質にも延長されることに留意されたい。従って、上記の装置及び方法は広範囲に亘る液体中の生物学的及び非生物学的物質の遮断、解析、或はそれ以外の処理に使用可能である。目標種及び／或は非目標種は化学的化合物、超分子集合、小器官、フラグメント、ガラス、セラミクスなどのような天然及び合成による大小の化学的物質から成るものでよい。或る実施例に於いて、これらは単量体、オリゴマー、及び／或はあらゆる分枝の程度でもよいポリマーである。これらは細胞或はウイルスの上に表現されてもよく、或は独立のものでもよい。完全な細胞でもよく、ウイルスそのものであってもよい。

外部磁石（或は磁石のシステム）は磁性粒子捕獲の間可変的に位置されてよく、上記の如く永久磁石或は電磁石或はこれらの複数或は永久磁石と電磁石の組み合わせでもよい。

分離に使用される本発明の磁性捕獲粒子は多くの異なる形態でよい。或る実施例に於いて、これらは超常磁性粒子或はナノ粒子であるが、或る場合には強磁性的或は常磁性的である。一般的に、磁性粒子は微少溶液装置の中で磁界に曝された時流体の流動方向から（水力学的及び磁気学的効果をバランスして）容易に転換出来るようにサイズ、質量，及び磁化率を選択すべきものである。或る実施例に於いて、磁界が除去されると粒子は磁気を保持しない。典型的な例に於いて、磁性粒子は直径が約１０ナノメートルから約１００ミクロメートルの範囲の酸化鉄（Ｆｅ₂Ｏ₃及び／或はＦｅ₃Ｏ₄）である。しかし実施例に於いてはより大きな磁性粒子の使用が考慮されて居る。

磁性粒子はこれらを液体工学環境と互換性のあるものとし、特種の目標成分とカプリングを可能とする物質でコーティングされてもよい。コーティングの例には重合体殻、ガラス、セラミクス、ゲルなどが含まれる。或る実施例ではコーティング自身が目標とのカプリング或は物理的交流を容易にする物質でコーティングされる。例えば微小磁性粒子の上の重合体コーティングは抗体、核酸シクエンス、アビジン或はビオジンでコーティングされてよい。

磁性粒子の一部類としてＢｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， ＧｅｒｍａｎｙのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能であるナノ粒子がある。これらはコーティングされた単領域酸化鉄粒子から成る相対的に小さい粒子であり、直径は典型的に約１０から１００ナノメートルの範囲にある。これらは特別の抗体、核酸、蛋白質などと連結する。別のタイプの磁性粒子はポリスチレンのような重合体マトリクスに埋め込まれた磁性ナノ粒子から成る。これらは典型的に平滑であり、一般的に球形であり、直径は約１から５ミクロメートルである。好適なビーズはＣａｒｌｓｂａｄ，ＣＡのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。これらのビーズも特別の抗体、核酸、蛋白質などと連結する。

[トラップ領域で粒子の一様分布の生成]
トラップ領域表面でトラップされた磁性粒子の一様分布を容易とするために種々な技術及び装置デザインが使用されてよい。或る場合に於いて、層にトラップされた粒子は，サブモノレイヤー、バイレイヤー及びそのような層もトラップ領域の面積及び処理されるべきサンプルの量に依存して生成されるかも知れないが、効果的にトラップ領域の磁性粒子のモノレイヤーである。

アプローチの一例では、トラップ領域に於いて磁界勾配形成要素の整列を注意深くデザインすることに関する。或る実施例に於いて、磁界勾配生成構造体を形成する強磁性パタン間隔を下流方向で減少する。即ち、格子のデザインは位置の関数として変化されてもよい。このアプローチでは、トラップモジュールに入る粒子が最初下地層に向けて引き降ろされ、次いでモノレイヤーの中の磁界勾配生成構造体の上でトラップされる磁性粒子の軌跡が促進される。非常に強力な磁力が小距離に於いてのみ構造体の上に生成されて粒子がトラップされる。磁力が強い流れの中への距離は磁性粒子及びラベル付けされた目標粒子の一枚のモノレイヤーの長さと制御されてよい。或る場合に於いて、バイレイヤー或は同様のものがその後トラップモジュールを通過して流れる磁性粒子のための捕獲構造体として行動する捕獲された磁性粒子の自己磁化によって生成されてもよい。

別のアプローチは、磁性粒子の流通の間トラップ領域に引加する外部磁界を動力学的に変化させることに関する。これは例えばトラップ操作の間トラップ領域に亘って磁界を進行的に挿入することに関する。

これら及びその他のアプローチの利点はトラップ領域の前縁及びその他の箇所での磁性粒子の蓄積を減少或るいは防止することである。一般的に、蓄積は磁界が最強の箇所、典型的に外部磁界の引加に使用される永久磁石の縁で起こるものと観察されて来た。明白であるように、このような蓄積の結果、トラップ領域の利用が不十分となる（トラップ領域で磁界力が強くない部分は磁性粒子を多く或は全然捕獲しないかもしれない）。更に、磁性粒子の塊或は蓄積は実際更に磁性粒子のトラップ領域の下流領域への通路をブロックする事になるかも知れない。叉サンプルから非結合種を捕獲し、サンプルの捕獲成分の純度を低下することになるかも知れない。

注意深く設計されたＭＦＧ構造体及び設計を使用し、及び／或は磁界を動力学的に変化させて、相対的に一様なトラップ領域に亘って捕獲された磁性粒子の散乱層を生成することが出来る。これと同じ或は同様な結果を得る他の技術は、トラップ領域に沿って（軸方向）隣り合って極性を互い違いに配列した複数の薄い永久磁石、或は極性を互い違いにしたチェッカー盤（軸方向と横方向の両方）に関するものである。

磁性粒子のトラップ領域での相対的に均一な分布はビーズ解放のような分離後の操作に有利かも知れない。解放剤はチャンネル全体を満たし、磁性結合目標粒子の均一な広がりにより解放剤の磁性ビーズ結合目標粒子へのアクセスが増加する。

本発明の或る実施例によれば、最大磁界力の位置は粒子がチャンネルに流入する間トラップ領域を徐々に移動する。トラップの間の磁界の移動方向は、一実施例に於いてはトラップ領域内の下流側の位置から上流側の位置へである。即ち、磁界の移動方向はトラップ領域内の流体の流動方向の逆である。このような実施例は例えば永久磁石を流動チャンネル、殊にトラップ領域を成すチャンネルの底部の下で下流側の位置から上流側の位置へと移動することに関してもよい。こうして、磁性粒子が先ずトラップ領域に入り永久磁石の前縁がトラップ領域の下流側の縁を丁度超えた箇所に位置される。その後、磁性粒子がトラップ領域に流入開始すると共に、永久磁石の前縁は徐々に上流へと移動され、最終的にトラップ領域の上流側境界或はその近くに止まるに至る。或る実施例に於いて、その位置に到着するのは磁性粒子のトラップ領域に流入するのが止まるのと略同時である。

代行実施例に於いて、磁性粒子捕獲の間、外部磁石はトラップ領域の上流から下流位置へ移動される。即ち、外部磁石は流体の流動と同じ方向に移動される。この実施例に於いては以前説明された実施例に於ける如く、外部磁石の移動期間は少なくとも大まかに見て磁性粒子がトラップ領域を流通する期間に対応する。以下図３を参照して説明する如く、特別な一例に於いて、磁石を下流に向けて移動させて順番に同じ粒子を捕獲、解放、捕獲、解放し、特に結合されて居ないサンプル種を磁性粒子から除去する。

上記の如く、トラップ領域での磁界再設置制御は種々の機構で実施可能である。第一実施例に於いて、これは磁性粒子がトラップ領域を通過する間磁界生成手段（例えば永久磁石）をトラップ領域の一面の上（典型的にチャンネルの外側）で移動させて行う。図３はこの実施例の一例を示す。示される如く、永久磁石３０３は磁性粒子捕獲の間トラップ領域３０１の下を移動する。図示の実施例に於いて、磁石３０３はトラップ操作の間下流側位置３０５から上流側位置３０７に向けて移動する。これにより、効果的にトラップ領域流体体積の高さに亘る磁界反応体積３０９が生成される。こうして、トラップ領域体積を通過する磁性粒子はすべて移動する磁界生成手段３０３が生成する力を経験する。

別の実施例に於いて、外部磁石は磁性粒子がトラップ領域へ流入する間トラップ領域（永久磁石と同じ）に沿って移動するのは電磁石である。任意的に、電磁石によって生成される磁界の位置はドラップ期間中電磁石のコイルの一部或は全部を機械的に動かすような他の手段によって制御可能である。

別の実施例に於いて、トラップ操作の間の磁界の動力学的再配置は各々のサイズがトラップ領域のサイズに比較して小さいものである直列の外部磁石を順番に挿入することによって達成される。一実施例に於いて、磁石は永久磁石である。一特種実施例に於いて、これらの磁石は極性を行き違いに配列されてある（例えば第一の磁石は南極をトラップ領域に向け、第二の磁石は北極をトラップ領域に向け、第三の磁石は南極をトラップ領域に向け、第四の磁石は北極をトラップ領域に向け、等々）。図１Ｄはそのような永久磁石の配列を示す。

トラップ領域へ外部磁界を順番に引加するその他のデザイン及び方法論の詳細は米国暫定特許出願６１／０３７，９９４号（既に参照して本願に組み込んである）に記載されてある。

図４Ａ−４Ｃはステージ的トラップシステムの一例を示す。図４Ａに示される如く、磁気的にラベル付けされた目標種４７１及び非目標種４７３は先ず”ソフト”な磁気パタン（強磁性構造体の配列）から成る液体工学チャンネル４８５の最左トラップ領域４７５の上を流され、ここで少数の非目標種が非特別的にトラップされると共に、磁気的に札付けされた目標種４７１がトラップされる。非特別的なトラップは、目標種による物理的捕獲のような素因によるものであろう。この初期トラップ操作の間、外部磁石４７９（これは或る実施例の場合磁石の集まりであってもよい）はトラップ領域４７５の近くに位置されて居る。その後、外部磁石４７９は下流に向け図４Ｂの第二ステージ４８１へ移動し、トラップされた種を最左ステージ４７５から解放する。第二ステージ４８１で、磁気的に札付けされた種は再びトラップされ、流体が一本のチャンネルに沿って整列されたステージを通って流れ続ける間、余分の非目標種が流し出される図４Ｃに示される第三ステージ４８３に於いて、非目標種の最後がチャンネルから流し出され、パタン４８７上の磁気的に札付けされた目標種のみ残される。望まれるならば今や外部磁石４７９を除去して目標種を溶出することが出来る。磁気的トラップ、解放、及び再トラップ(単一のトラップステージの場合と対象)のこのステージ的システムを使用することの利点は、非特別的に結合された細胞のような非目標種がより効率的にステージ間の磁性トラップから除去され、従って溶出される目標細胞或はその他の種の純度を向上することが出来ると言うことである。
ステージ的トラップシステムに加え、強磁性パタンの可変間隔を使用することも出来る。一例に於いて、磁界勾配生成構造体はトラップ領域の上流側に設置されず、構造体は下流側にのみ使用される。その結果として、チャンネルの下面近くでの局地的磁界勾配は構造体の置かれたより下流側位置に於けるほど強くない。しかし磁界勾配生成構造体が設置されて居ない上流側領域に於いて、磁界は鉛直方向に流通チャンネルをよけい貫通することが出来、これにより入って来る磁性粒子はトラップ領域の下部分の方へ引き寄せられ、そこでは更に下流方向に流通しながら磁界勾配生成構造体による非常に強い磁界勾配の影響を受ける。非常に強い磁力が非常に短い距離に亘って生成されて粒子がトラップされる。磁力が非常に強い流れの中への距離は磁性粒子及びラベル付けされた目標粒子のモノレイヤーの長さに制御されてよい。或る場合に於いては自己磁性化によってバイレイヤー或るいはそのようなものを生成してもよく、それはその後トラップモジュールの中を流通する磁性粒子用の捕獲構造体として作用することが出来る。

[トラップされた種の処理]
或る実施例に於いて、トラップされた種はトラップ領域内に閉じ込められたまま関連磁性粒子から解放される。上記の如く、この目的には種々の機構が使用可能である。或るアプローチによれば、ビーズ解放剤がトラップされた磁性粒子に与えられる。このような試薬はビーズと捕獲された種との間の結合子を破壊するように作用してもよく、或は結合している種を完璧に結合させる作用をしてもよい。当業者に理解される如く、その他の破壊或は解放剤を使用してもよいことは勿論である。

或る実施例に於いて、サンプル用液体工学的入力とビーズ解放剤とは別個に与えられる。分離処理の間、サンプルはサンプル源からポンプでトラップ領域へ汲み込まれる。分離処理が完了すると、ビーズ解放剤が解放剤源からトラップ領域へ汲み込まれる。解放細胞を溶出するため、バッファがこれらの源のいずれかから或は別個のバッファ入口から汲み込まれてよい。汲み込み操作には例えばガス（例えば空気）、或は液体（例えば緩衝水）を使用してよい。

トラップされた目標種は上記の如く単に濃縮され、純化され、及び／或は解放されてもよい。代行的に、更に解析及び／或は処理がされてもよい。この更に行われる解析及び／或は処理はトラップモジュール内部、或はトラップモジュールから解放の後の別のモジュール内で行われてもよい。図５は捕獲された種の捕獲後処理用の液体工学装置５０５の中に位置される磁性トラップ５０１の構成例を示す。示される如く、このトラップ５０１は未処理サンプル流を受け取るための入口ライン５０７と出口ライン５０９を有する。トラップ５０１には更に一種以上の他の試薬を供給するために補助ライン５１１及び５１３がある。これらライン５０７，５０９，５１１及び５１３には夫々バルブ５１７、５１９，５２１及び５２３がある。トラップ５０１の中には種々のトラップ要素５２５がある。これらの中には磁界を形成して供する強磁性要素もある。ラインやバルブは図５ではトラップ要素を四方から囲んで居るように見えるが、発明はそのように限定されるものではない。例えば他の構成として入力がトラップ領域を流通する前に収斂する図１Ｃのものも含まれる。

磁界或はその他の捕獲用の刺激をトラップ特性５２５に引加される図５を参照して、トラップ５０１に流入する粒子は捕獲される。十分な数の粒子が捕獲された後（これは決められた時間の間サンプル流を装置５０５内へ流すだけで示される）、バルブ５１７及び５１９が閉じられる。その後、一実施例によれば、バルブ５２１及び５２３が開けられ、バッファがライン５１１からトラップ５０１を通りライン５１３の外へと通過させられる。これで捕獲された粒子が洗浄される。洗浄が十分の時間行われた後、洗浄された粒子は溶出により（例えばバッファが流れて居る間に外部磁界或は電界を除去することにより）、トラップ５０１からピペットを使用することにより、或はトラップ上の蓋或は覆い、或は装置全体を除去することにより、洗浄された粒子が回収されてもよい。最後の方法の場合、或る実施例に於いては装置は使い捨て用であり、覆いの頂点部分が例えば引き剥がすように容易に除去出来る設計とすることが出来ると留意されたい。

その他の実施例として、上記の如くトラップで捕獲され洗浄された粒子はサンプル内の目標細胞或は他の目標種用の一個以上のマーカー（例えばラベル付けされた抗体）に曝される。例えば検出対象の或る腫瘍細胞は二個以上の特種な表面抗原を表すものである。この抗原の結合は非常に特別な腫瘍に限って起こるものである。磁性粒子と結合したそのような細胞の存在を検出するのに、トラップ５０１での捕獲が完了した後、バルブ５１７及び５２３が閉じられ、バルブ５２１が開かれる。次に第一ラベルがトラップ５０１へライン５１１から流入され、ライン５０９によって流出される。ラベルの幾つかはトラップ５０１内で不動化した細胞に結合する。その後、バルブ５２１が閉じられ、バルブ５２３が開かれ、ライン５１３を通って第二ラベルがトラップ５０１に入る。ラベルが十分な時間の間トラップを流通した後、捕獲された粒子／細胞は上記のように洗浄されてもよい。その後、粒子／細胞は更なる解析のためにトラップ５０１から除去されてもよく、その場所で解析されてもよい。例えばこのラベルが蛍光標識試薬であるような場合、トラップ５０１の内容は第一及び第二ラベル用励起プローブ線で走査されてよい。放射光線は第一及び第二ラベルを特徴つける波長で検出される。或る実施例に於いて、個々の細胞或は粒子が撮像されてトラップ５０１の内容が特徴つけられ、こうして、目標腫瘍細胞の存在（或はその量）が決定される。勿論腫瘍細胞以外の種々の目標成分も検出可能である。その例には或るバクテリヤ或はウイルスのような病原体が含まれる。

その他の実施例に於いて、サンプルからの核酸がライン５０７を通ってトラップ５０１に入り、適当な機構（以下に例示される）で捕獲される。その後、バルブ５１７が閉じられ、ＰＣＲ試薬（適宜なバッファの中のヌクレオチド、ポリメラーゼ、及びプライマー）がライン５１１及び５１３を経由してトラップ５０１に流入する。その後、すべてのバルブ（５１７、５１９，５２１及び５２３）が閉じられ、適宜なＰＣＲ熱サイクルプログラムがトラップ５０１上で実施される。熱サイクルは適当な程度の増幅が達成されるまで継続される。その後、増幅された目標核酸のその場所での検出が例えば遺伝子型解析の為に実施される。代行的に、検出はトラップ５０１の下流側、例えば核酸マイクロアレイ或は電気泳動媒質を含む別室で実施されてもよい。別の実施例に於いては、リアルタイムＰＣＲがトラップ５０１で例えば目標シークエンス用の適宜にラベル付けされた挿入プローブ或はドーナ抑制プローブを導入して実施することが出来る。プローブはライン５１１或は５１３を通じて他のＰＣＲ試薬（例えばプライマー、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド）と共に導入されてよい。その場所でのリアルタイムＰＣＲは表現レベルが解析される解析に好適である。リアルタイムＰＣＲでもエンドポイントＰＣＲでも、増幅されたシークエンスの検出は或る実施例に於いてはトラップ５０１の中でトラップの領域に焦点をおかれた蛍光顕微鏡のような検出装置を使用して実施することが出来る。

増幅反応用に捕獲要素５２５は核酸サンプルを捕獲して反応室５０１に閉じ込める。その後、流通ライン５０７は閉じられ、分解剤（例えば食塩或は洗剤）が例えばライン５１１或は５１３を経由して室５０１に配達される。分解剤は溶液の栓の中で配達され、不動化された細胞が時期が至るにつれて分解される室１０１の中に拡散されてもよい。これにより、その後の増幅用に細胞遺伝子物質が抽出される。或る実施例では、分解剤はＰＣＲ試薬と一緒に配達されてもよく、これによって分解剤が細胞を分解し核酸を除去するに十分の時間が経過した後、熱サイクルのプログラムを開始し目標核酸を検出することが出来る。

他の実施例に於いて、サンプル核酸は未処理サンプルの中に準備され、適当な異種交配シークエンスを含む磁性粒子と結合される。磁性粒子は次にトラップ５０１の中で選別され不動化される。ＰＣＲ試薬が室５０１に配達されて全部のバルブが閉じられた後、ＰＣＲは熱サイクルによって進行出来る。温度移動の初期に於いて、捕獲されたサンプル核酸は磁性粒子から解放される。

此処に記載された核酸増幅技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかし或る実施例に於いて、例えばリアルタイム鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、及び多重置換増幅法（ＭＤＡ）のような種々な等温核酸増幅技術のような非ＰＣＲ増幅技術が使用されてもよい。

[磁気トラップ構造体の例]
最も基本的に、トラップ部署は液体工学装置の中の領域或はチャンネルの境界によって定義される。流体はトラップ部署を通過して一個以上のトラップ部署の近くにある外部磁石が生成する磁界に遭遇する。更に、トラップ部署は任意的に磁界勾配生成構造体（ＭＦＧ）を使用してもよい。ＭＦＧ要素（例えば細長片、ピン、点、格子、ランダム配列など）は外部磁界を形成し、局地的に強い磁界勾配をトラップ部署の中に形成する。

図６は本発明の磁気トラップ部署に使用可能の異なるタイプの強磁性ＭＦＧ構造体を示す。図には８種類の異なる強磁性要素パタンが示されて居る。これらは磁界の外部源（図示せず）に起原する磁界勾配の形成に使用される。示される如く、強磁性構造体は例えば平行線、直交格子、規則的或は不規則的な幾何学的形状の矩形配列のような組織的或はランダムなパタンで供されてよい。示される如く、構造体は規則的或は網状でよい。

一般的に、これらパタンの特徴及び要素は装置の中の流体媒質（例えばバッファ）より本質的に異なる透磁率を持つ種々の物質から作られてよい。上記の如く、要素は強磁性物質から作られてよい。特別な実施例に於いて、パタンはガラス或は重合体下地層の上のニッケル特徴で定義される。

代行的実施例に於いて、ＭＦＧ構造体は電極、特種の結合部分（例えばヌクレオチド或は抗体の領域）、物理的凸部或は凹部、などのような他のタイプの捕獲構造と結合される。図７はソフト磁気（例えばニッケル）パタン７０１の中に生成される非磁性捕獲特徴を示す。パタンはニッケル構造の上で流体の層状混合の助けとなり磁気トラップを向上させる正または負の表面特徴であってよい。図７は非磁気的捕獲特徴を有する磁界勾配生成構造体７０１を示すものである。正の特徴には円形隆起７０３及び正方形隆起７０５があり、負の特徴にはディボット７０７及び正方形孔７０９がある。これらの各々は流体混合への幾何学的効果に使用され、反応或は流動を助ける物質で覆われてもよい。

他のタイプのＭＦＧ構造体には判然と定義されない形状或は規則的特徴を形成しない強磁性物質が含まれる。その代わり、構造体はランダムに分散された粉体、充填物、細粒などを形成する。これらの構造体はトラップ部署粘着剤、圧着結合の一個以上の壁に固着される。図８Ａ−８Ｃは強磁性構造体のランダム配列の例を示す：左から右へエポキシ樹脂内のニッケル粉の量は５％（図８Ａ）、１０％（図８Ｂ）及び３０％（図８Ｃ）。このような構造体は磁性トラップ部署に於ける効率的なＭＦＧ要素であると見出されて居る。

代行的実施例に於いて、トラップ部署はＭＦＧ構造体を含まない。その代わり、磁気捕獲はＭＦＧ構造体のような磁界形成要素の援助なく、外部磁界の力のみに基づくものである。

[液体工学及び選別室設計]
本発明の或る実施例は微小規模の微少溶液システムに於いて実施されるものであるが、本発明の方法、装置、及びシステムは微少溶液システムに限定されるものではないと留意されるべきものである。より大型のトラップ室の典型的な大きさは長さ(流動方向）で約１と１００ミリメートルの間、幅方向で約１と１００ミリメートルの間、深さで約１と１０ミリメートルの間（典型的には約１ミリメートル以下）である。深さは磁界がチャンネルの中へ貫いて行く方向、典型的には外部磁石の位置と逆の方向の次元を表すものである。或る実施例の室では、アスペクト比(横に対する縦）が１以上、例えば２である。

一般的に、引加される磁界は流体媒体の中を流れる磁性粒子を捕獲或いはトラップする十分の大きさでなくてはならない。引加磁界が流動流体によって粒子に加えられる流体力学的の力より有意義的に大きくなくてはならないことは、当業者には自明であろう。このことはトラップ部署の深さの次元を限定することになるかも知れない。

或る実施例に於いて、統合液体工学システムとは微少溶液システムのことである。微少溶液システムは少なくとも一本の顕微鏡的チャンネルを有することで特徴付けられてよい。そのようなチャンネルは１ミリメートル程度或いはそれ以下(例えば約１ミリメートル以下かそれと同等）の断面的次元を一つ以上有するものであってよい。実施例によってこの次元が調節されてよいことは自明であり、或る実施例に於いてこの少なくとも一つの断面次元は約５００ミリメートル或いはそれ以下である。或る実施例に於いて、応用上可能であるならば、断面次元は約１００ミリメートル或るいはそれ以下(或いは約１０ミリメートル或るいはそれ以下であり、更に或る場合には約１ミリメートル或るいはそれ以下）である。断面次元とは一般的に中央流線に垂直の方向のことであるが、肘のように流路の方向を変える特徴に遭遇する場合には問題となる断面次元は厳密に流路に垂直である必要はない。微小チャンネルは矩形の断面での高さと幅、或いは楕円形断面の長軸と短軸のように、屡二つ以上の断面次元を有するものである。此処でのサイズにはこれら次元のどちらが比較されてもよい。本発明に使用される微小チャンネルには、例えば矩形の断面であって高さが約１００−２００ミクロメートルであり幅が１センチメートル程度或いはそれ以上のように非常に不釣合いな二つの次元を有するものがあることに留意されたい。勿論、或る装置によっては二本以上の軸が同程度或いはサイズ同一（例えば正方形或いは円形の断面）のこともある。

或る実施例の場合、液体工学チャンネルは粒子速度を減少して磁気沈殿及び捕獲を改善するためにトラップ領域で深さを増大させてもよい。図９Ａ及び９Ｂはチャンネルの入口及び／或は出口部分に比較してトラップ領域(９０３及び９０５）での深さを増加した液体工学チャンネル９０１の実施例の側面図を示す。一例(図９Ａ）に於いて、チャンネルの深さはトラップ領域で増加し（入口から流動方向に沿ってトラップ領域へ）それ以後減少する。別例(図９Ｂ）に於いて、チャンネルの深さはトラップ領域９０５の後(下流側）で減少する。トラップ領域とチャンネルの入口或いは出口に対する深さの比は約１から５の間(典型的に約２）である。トラップ領域と入口或いは出口の間の変換領域の形状は流体再循環や角に於ける物理的トラップを防止するように平滑曲線チャンネルである。或る実施例に於いて、液体工学チャンネルは入口チャンネルの近くで幅が広く、出口チャンネルの近くで幅を狭くして、深さを同じとしたものでもよい。

図９Ｃに示す或る実施例に於いて、選別装置は重合同時サンプル分離或いは処理量増加のためバッファマニホールド９１１を共用する二本以上の平行チャンネル９１９から成るものである。両方のチャンネル９１９に於いて、サンプル入口９１３からの流れがマニホールド９１１からのバッファと合体し、出口９１７へとトラップ領域内の磁界勾配生成構造体９１５を通過する。

更に別の実施例に於いて、液体工学チャンネルは捕獲及び解放プロトコル実施のため一個以上のトラップ領域を有してもよい。図９Ｄは図９Ａ−９Ｃを参照して説明された捕獲及び解放プロトコル実施のために構成された選別室を示す。図９Ｄに示される如く、二個以上のトラップ領域９１５が液体工学チャンネルに含まれてもよい。各トラップ領域は磁界を独立的に各トラップ領域に引加する対応外部磁界源を有するものであってよい。これらトラップ領域は一個の外部磁気源を共用するものでもよい。二個の外部磁気源を有する実施例の場合、これらの磁気源は独立的に或いは一緒に時間によって変更する磁界を供するように構成されたものでよい。磁界を変更する一法とは液体工学チャンネルに対して外部磁気源を移動させることである。外部磁気源は望まれる磁界変更を生成するのに流体流動の方向と平行に移動されてよい。

種々のシステム或いはサブシステムの全体的微少溶液システムの中の操作を調整するのに、制御装置が屡使用される。このような制御装置はサンプルを微少溶液流路の中で導くように設計或いは構成されて居る。これは微少溶液装置を流通する流体に引加される磁界の強度及び方向、バルブその他の流動制御機構を活性化することによる微少溶液装置内の流体流動条件の制御、添付システムの中での磁性粒子とサンプル成分との混合、サンプル（ライブラリ生成システム内のライブラリ）の生成；及び或るシステム或いは装置から別のものへ流体の誘導のようなシステムの別の特性或いは操作を制御するものでもよい。この制御装置は一個以上のプロセサを含み、ソフトウエア及び／或はハードウエアの教示による制御のもとで運行するものでよい。

[統合]
微少溶液装置内の磁性トラップ選別装置に統合されてよい操作モジュールの例には以下のものが含まれる：（ａ）蛍光性活性細胞選別装置及び洗浄モジュールのような追加的濃縮モジュール；（ｂ）サンプル増幅（例えばＰＣＲ）モジュール、酵素反応抑制モジュール、核酸配列決定モジュール、目標ラベル付けモジュール、クロマチン免疫沈殿モジュール、クロスリンクモジュール、及び一様細胞培養モジュールのような反応モジュール；（ｃ）核酸のマイクロアレイ、抗体或は他の高度に特種な結合剤、及び蛍光性分子認識モジュールのような検出モジュール、及び（ｄ）細胞を分解し、ウイルス性蛋白質外被を崩壊し、或は別の方法で小さい生存システムを開放する分解モジュール。これらモジュールの各々は磁性選別装置の前或は後に供されてよい。単一液体工学システムの中の磁性選別装置に統合された運転可能な複数の同一或は異なるタイプのモジュールがあってもよい。更に種々のその他の運転可能なモジュールと並列或は直列に一個以上の磁性選別装置が配列されてもよい。かような運転可能なモジュールの中の幾つかはその中でサンプル内の目標種が静止或は特別な体積内に抑制されて保持されるトラップとして設計或は構成されてよい。

モジュールの上記の例から明らかなように、統合された液体工学装置のモジュールの中で目標種或は非目標種に実施されてよい運転操作には選別、磁性粒子との結合（此処に於いてはラベル付けとも参照される）、結合、洗浄、捕獲、増幅、不要な種の除去、沈殿、分裂、希釈、配列決定、合成、ラベル付け（例えば細胞着色）、クロスリンク、培養、検出、撮像、定量、分解などが含まれる。

統合された液体工学装置の磁性選別モジュールで実施可能な生化学運転操作の例にはプラズミド、アプタマー、蛋白質、及びペプチドの合成及び／或は選別、酵素活性の評価、及び蛋白質及び炭水化物の誘導体化が含まれる。（１）ゲノム解析(配列決定、異種交配)、ＰＣＲ及び／或は他のＤＮＡ或はＲＮＡオリゴマー用の検出及び／或は増幅体系、（２）遺伝子発現、（３）酵素的活性分析、（４）受容体結合分析、及び（５）ＥＲＩＳＡ分析を含む広範囲の生化学的及び電気生理学的分析も実施可能である。これらの分析は等質的、ビーズに基づく、表面に拘束された様式のような種々の様式で実施されてよい。更に、此処に記述された装置は特別な酵素或は触媒を使用する生体分子の連続的生成及び治療剤のような生理学的システムの中で活性の生体分子或は分子の生成及び配達を実施するのに使用されてよい。此処に記載された微少溶液装置は現在マクロ溶液量で実施されて居るようなペプチド、蛋白質、及びＤＮＡ或はＲＮＡオリゴマーの組み合わせ合成の実施に使用されてよい。

[液体工学システムの中の反応装置及び分解モジュールの例]
本発明の統合液体工学装置は種々の特徴を有する種々の反応装置を使用してよい。厳密な特徴は反応の種類に依存し、熱管理システム、微小混合器（ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒｓ）、触媒構造、及びセンシングシステムを含んでもよい。熱管理システムはヒータ、温度計及び微小熱交換器を含んでよい。これらの部品は正確に温度を制御するようにすべて統合されてよい。かような温度制御はＤＮＡ増幅用のＰＣＲに決定的である。

微小混合器は二つの溶液を混合するのに使用されてよい。微小混合器の一例は流体の一つを隔離材料の孔或は切り目を通じて圧入し、二種類の流体の間に拡散させることに関する。隔離材料は疎水性であり、隣接する二室を隔離するものである。境界面の疎水性により両方の室内に混合することなしに二種類の流体を満たすことが出来る。圧力勾配を引加して流体を疎水性の層の孔を通過させ反応を可能とすべく拡散を誘起する。

触媒構造は化学反応（例えばクロスリンキング或は配列決定）を加速するために使用される。微小反応装置の中に於いて、触媒は例えば固定ビーズ、ワイヤー、薄膜、或は穿孔面のように固定されて居ても、添加されてもよい。薄膜及び穿孔面触媒は微小反応装置の製造に容易に統合可能である。センシングシステムは例えば化学的微小センサー或はバイオセンサーを使用するものでよい。光学的センシングもガラス或はプラスティク面を通じて外部的に実施されてよい。

生物学的細胞の内容はしばしば操作及び解析の主題である。細胞の内容が解析される前に、細胞成分が分離されるように細胞は分解される。細胞内の生物学的分子を解放するために使用される細胞崩壊の方法には例えば電界、酵素、超音波処理、及び洗剤の使用が含まれる。細胞壁の切断及び炸裂に機械的の力も使用されてよい。

細胞崩壊は反応装置にトラップされた細胞を典型的に１ｋＶ／ｃｍから１０ｋＶ／ｃｍの範囲の強電界のパルスに当てることで実施されてよい。細胞を崩壊に準備するため或は細胞壁のない細胞をクローンされたＤＮＡ或いは細胞下小器官分離の導入のような他の用途に準備するため細胞壁の除去に酵素法を使用することは確立されたことである。酵素は一般的に商業的に入手可能であり、大概の場合既に生物源(例えば酵母用のカタツムリ内臓或いは鶏卵白身からのリゾチーム）から分離されたものである。普遍的に使用されて居る酵素にはリゾチーム、リゾスタフィン、チモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼなどが含まれる。

酵素安定性の問題の可能性に加えて、細胞の酵素に対する感受性が細胞の状態に依存する。例えば最大密度まで成長させた酵母(静止相）は除去が難しい細胞壁を有するが、中間成長期（ｍｉｄｌｏｇ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）細胞は細胞壁の酵素的除去に対する感受性が余程高い。酵母が使用されるならば、更なる解析の前に望まれる物質から選別し除去することが必要かもしれない。

超音波処理は力学的に細胞壁を破裂させる高周波を使用する。典型的に２０−５０ｋＨｚの超音波が高周波数で振動する金属プローブを通じてサンプルに引加される。プローブは細胞を含むサンプルの中へと位置され、高周波数の振動による局地的な高圧領域の結果としての空洞化及び衝撃で最終的に細胞を破壊する。細胞崩壊はより小さいサンプル（２００μＬ以下の微小板の凹体を含む）及び超音波処理パラメタ制御の向上された能力で可能である。

細胞崩壊の力学的方法ではガラス及びセラミクのビーズが使用され高度の攪拌によって細胞壁を切断、炸裂する。此の方法は容易に崩壊される細胞に有効であり、廉価であるが、微少溶液装置に関して統合に問題点がある。一実施例に於いて、ビーズが閉鎖された室でサンプルを保持するのに使用され電気モータで攪拌される。別例に於いては高圧が細胞サンプルを含む流体に引加され、流体が非常に狭いチャンネルを通過させられる。細胞とチャンネルの壁の間のこのような条件下での剪断力が細胞を崩壊する。

洗剤に基づく細胞分解は時として均質化及び機械的摩擦と共に使用されるが、細胞膜の物理的崩壊の代行法である。洗剤は細胞を取り巻く脂質障碍を脂質：脂質、脂質：蛋白質、及び蛋白質：蛋白質崩壊反応によって崩壊する。細胞分解に理想的な洗剤は細胞のタイプ及び源及び細胞分解後の下流側での応用に依存する。動物細胞、バクテリヤ及び酵素には細胞壁が存在するか否かによってすべて最適分解に関して異なる要件がある。動物組織はその高密度及び複雑な特徴により、効率的に細胞を分解するには洗剤と機械的分解と両方が必要である。

一般的に非イオン的及び双性イオン的洗剤はイオン的洗剤よりやさしく、その結果細胞分解にあたって蛋白質変性が少なく、蛋白質機能或は反応を維持することが重要な場合に使用される。双性イオン的洗剤であるＣＨＡＰＳ及び非イオン的洗剤のＴｒｉｔｏｎ Ｘシリーズがこの目的に一般的に使用される。対照的にイオン的洗剤は強力な可溶化剤であり、蛋白質を変性し、それによって蛋白質の活性及び機能を破壊する傾向がある。ＳＤＳ及び蛋白質と結合して変性するイオン的洗剤はゲル電気泳動及びウエスタンブロット法で蛋白質レベルを査定する研究に広範囲に使用される。

[統合された流体システムの中の検出器の例]
統合された微小システムに考慮される種々の応用に於いては、従来の実験室に於ける測定処理と同様、チャンネル内の一カ所以上の位置に存在する物質の定量が必要となろう。定量に典型的に利用される技術には 光学的吸収度、屈折率変化、蛍光発光、化学発光、ラーマン分光の種々の形態、導電性測定、インピーダンス測定（例えばインピーダンス血球計算）、電気化学アンペリオメトリック測定、及びコンピュータ使用による結像及び集計が含まれるがそれに限られるものではない。

光学的吸収度は定量されるべき物質を通過する光の強度を測定して決定される。光学的性質が知られて居るならば、物質内での衰弱の程度は物質の量を示すものである。代行的な方法として、レーザ技術を使用する光音及び光熱技術が含まれる。微少溶液装置には統合された装置のサーズを最小化するために光導波器及び例えばＬＥＤ及びダイオードレーザのような固体相光源が含まれてよい。

光学的吸収度と同様なものに屈折率がある。屈折率検出器はサンプルの量と相関するサンプル物質の屈折率を定量するものであるが、このテクニクは光学的吸収度より低感度である。レーザに基づく及び蛍光発光に基づく屈折率検出の実施も可能であり、感度も高い。レーザ及び蛍光に基づくアプローチは非常に小さい体積で使用可能なので、微少溶液装置への統合に好適である。超感度測定用の励起源はレーザ源、稀ガス放電ランプ、及び発光ダイオード（ＬＥＤ）でよい。蛍光発光は光電倍増管、フォトダイオード、或はその他の光センサで検出できる。

電荷結合装置（ＣＣＤ）検出器のような配列検出器が検出された分析物の空間分布の結像に使用できる。画像の解析にコンピュータが使用されてもよい。上記の如く本発明の特徴の一つは目標粒子の単層を形成し焦点の均一な深さを提供することである。コンピュータプログラムが或る大きさ或いは色の粒子を数えて解析しサンプルを定量してよい。

ラーマン分光は非弾性散乱、即ち単色光のフォノンとの反応からのラーマン散乱或いは結果としてレーザ光子のエネルギが上下に変化させられるシステム内の励起に依存するものである。エネルギ変化から分子振動のようなシステム内のフォノンモードに関する情報が得られる。微小体積について感受性が向上した種々のラーマン分光が可能である。

電気的或いは電気化学的検出アプローチは容易に微少溶液装置に統合され、その他のアプローチより感受性の高いものとなる可能性がある。電気的或いは電気化学的アプローチにはイオン化された分析物の導電率の測定及び電極に於ける分子の還元或いは酸化による与えられた電気ポテンシャルでの電極を通過する電流の測定が含まれる。測定された電子の数は存在する分子の数と同じである。分子がその酸化−還元工程からのエネルギを検出可能光子を発射する分析物分子に移送する場合、電極は化学発光工程を開始するのにも使用可能である。

一種以上の試薬の添加或いは混合を要する検出工程は容易に微少溶液システムに統合することが出来る。誘導体化反応は生化学分析に一般的に使用される。例えばアミノ酸、ペプチド及び蛋白質は一般的にダンシレイチング（ｄａｎｓｙｌａｔｉｎｇ）試薬或いはｏ−フタルジアルデヒドでラベル付けされて容易に検出可能な蛍光性分子を生成する。代行的に、酵素が下地層を含めて分子及び試薬のラベル付けに使用可能であり、酵素増幅検出計画を提供するのに加えられ、即ち酵素は検出可能なものを生成する。統合される混合方法で有利な検出方法の第三例は化学発光検出である。このようなタイプの検出シナリオに於いて、試薬及び触媒は適当な目標分子と混合され、検出可能光子を発する励起分子を生成する。

これらの検出及び定量の方法の多くはサンプルの多少の変更を必要とする。或る場合に於いては酸化或いは還元のような反応が起こる。他の場合に於いては光束がサンプルを分解する可能性がある。定量されるべきサンプルの量及びサンプルを例えば反応或いは記録保存のようなその他の処理のために保存する必要性によって、これらの方法はサンプルに関する情報を出すように選択されてよい。

[結論]
本発明の数々の実施例が記述されたが、本発明の意向及び範囲から逸脱することなしに種々の変更が可能であることは理解されるべきことである。例えば上記の記述は生物学的応用、特に動物学的細胞検出及びトラップに焦点が置かれたものであるが、同じ原則が無機或いは非動物学的有機物質の粒子に応用できることに留意されたい。従って、上記の装置及び方法は液体内の非動物学的物質に使用可能であり、その他の実施例は以下の請求項の範囲内に入る。

Claims (31)

1. サンプルを本質的目標と本質的非目標種に選別する微少溶液選別装置であって、
   （ａ）二つの相対する壁を持つチャンネルと、サンプル中の磁性粒子を少なくとも一時的に捕獲するため、サンプルに磁力を発揮する、相対する壁の只一方の上にある磁界勾配生成構造体とから成るトラップモジュール、及び
   （ｂ）微少溶液選別装置の上に於いてトラップモジュールと合体された加工前及び／或いは加工後部署、から成る微少溶液選別装置。
2. 磁界勾配生成構造体を有する相対する壁が不透明壁の上にあるものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
3. 磁界生成用のトラップモジュールの一側にある外部源から更に成る、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
4. 外部源がトラップモジュールの磁界勾配生成構造体と同じ側に位置するものである、請求項３に記載の微少溶液選別装置。
5. 磁界の外部源をトラップモジュールに関して移動する機構から更に成る、請求項３或いは４に記載の微少溶液選別装置。
6. 磁界の外部源が一個以上の永久磁石からなるものである、請求項３或いは４に記載の微少溶液選別装置。
7. 永久磁石は極性を互い違いにするものである、請求項６に記載の微少溶液選別装置。
8. 磁界の外部源が一個以上の電磁石からなるものである、請求項３に記載の微少溶液選別装置。
9. 磁界勾配生成構造体がそれに相対する壁にパタンとして設計された強磁性構造体である、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
10. パタンが平行線、直交格子、規則的或は不規則的な幾何学的形状の矩形配列、及びそれらの組み合わせから成るグループから選ばれるものである、請求項９に記載の微少溶液選別装置。
11. 磁界勾配生成構造体が強磁性構造体のランダム配列である、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
12. 強磁性構造体の物質がニッケル、バナジウム パーメンジュ、或はパーマロイである、請求項９或は１１に記載の微少溶液選別装置。
13. チャンネルがトラップ領域で深さがより大きいものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
14. トラップモジュールが二つ以上のトラップ領域を有する段階的トラップシステムから成るものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
15. 第二平行独立トラップモジュールと、これらのトラップモジュールを連結する共通バッファマニホールドから更に成る、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
16. 加工前部署がサンプルの中の種にラベル付けされた種との親和性を有する磁性粒子でラベル付けするラベル部署から成るものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
17. 加工後部署が目標種を検出ための検出部署から成るものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
18. 加工前部署或は加工後部署の中少なくとも一つが、（ａ）選別装置を通過するサンプルの中の目標種の濃度を増加する濃縮モジュール、（ｂ）反応モジュール、（ｃ）検出モジュール、及び（ｄ）細胞を分解し、ウイルス性蛋白質外被を崩壊し、或は別の方法で小さい生存システムを開放する分解モジュールとから成る、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
19. トラップモジュールが（１）ゲノム解析、（２）ＤＮＡ或はＲＮＡオリゴマー用の検出及び／或は増幅体系、（３）遺伝子発現、（４）酵素的活性分析、（５）受容体結合分析、及び（６）ＥＲＩＳＡ分析から成るグループから選ばれる工程を実施するように設計或は構成されたものである、請求項１に記載の微少溶液選別装置。
20. トラップモジュールと、トラップモジュールの二つの相対する壁の只一方の上にある磁界勾配生成構造体とを含む微少溶液選別装置の中のサンプルを選別する方法であって、
    分子識別要素をその上に持つ複数の磁性粒子と目標種と非目標種とから成るサンプルをトラップモジュールの中へと流す工程と、
    モジュールの一方の側から磁界勾配生成構造体へと外部磁界を発揮させることによりトラップモジュールの中に磁界勾配を生成する工程と、
    トラップモジュールの中の磁性粒子を、トラップモジュールの一つの壁の上の磁界勾配生成構造体の近くでトラップする工程とから成る方法。
21. サンプルに伴ってバッファをトラップモジュールへと流す工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
22. 各運転に於いてバッファはトラップモジュールへと連続的に流すものである、請求項２１に記載のサンプルを選別する方法。
23. 磁性粒子が流体媒体の中をモジュールを通じて流れる間、磁界の外部源をトラップモジュールに関して移動させ、それにより磁性粒子を本質的に均一的にトラップする工程から更に成るものである、請求項２０或は２２に記載のサンプルを選別する方法。
24. 磁性粒子を磁界勾配生成構造体の一部分から解放してトラップされたいずれの非磁性粒子をも解放する工程と、
    磁性粒子を磁界勾配生成構造体の他の部分でトラップする工程とから更に成るものである、請求項２０或は２２に記載のサンプルを選別する方法。
25. サンプルの中の目標種を目標種と親和性のある磁性粒子でラベル付けする工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
26. サンプルの中の非目標種を非目標種と親和性のある磁性粒子でラベル付けする工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
27. マイクロアレイの中の目標種を検出する工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
28. 目標種を分解する工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
29. 目標種を反応させて目標種を増幅し、配列し、雑種を作り、ラベル付けをし、クロスリンクし、或は培養する工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
30. トラップされた目標種を撮像する工程から更に成るものである、請求項２０に記載のサンプルを選別する方法。
31. サンプルを本質的目標と本質的非目標種に選別する微少溶液選別装置であって、
    （ａ）二つの相対する壁を持つチャンネルを有し、磁界勾配生成構造体を持たないトラップモジュール、
    （ｂ）微少溶液選別装置の上に於いてトラップモジュールと合体された加工前及び／或いは加工後部署、
    （ｃ）トラップモジュールの一方の側にある、磁界を生成する為の外部源、及び
    （ｄ）時間に亘って磁界を変化させる機構とから成る微少溶液選別装置。