DE102013200927A1

DE102013200927A1 - Verfahren zum Anreichern und Vereinzeln von Zellen mit Konzentrationen über mehrere logarithmische Stufen

Info

Publication number: DE102013200927A1
Application number: DE102013200927.5A
Authority: DE
Inventors: Michael Johannes Helou; Lukas Richter; Oliver Hayden
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Earlybio De GmbH
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2014-07-24
Also published as: WO2014114530A1; US20150355072A1; CN105190286A; EP2932233A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (10) zur durchflusszytometrischen Messung, die eine Kammer (12), einen Kanal (14) und einen Magnetsensor (18). Der Kanal (14) und die Kammer (12) liegen in einem geschlossenen System vor, wobei sich eine Achse (A) des Kanals (14) entlang einer Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt. An einer vorbestimmten Seite des Kanals (14) ist ein Magnet (22) und eine Umlenkeinrichtung (20) angeordnet. Die Umlenkeinrichtung (20) ist in mindestens ein Segment (20-1, 20-2, 20-3) eingeteilt und jedes Segment (20-1, 20-2, 20-3) ist in einem Konzentrationsbereich (C1, C2, C3) des Kanals (14) angeordnet. Die Umlenkeinrichtung (20) weist Führungselemente (24) als Mittel zum Führen von Zellen zur Achse (A) hin auf. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur durchflusszytometrischen Messung mithilfe einer solchen Vorrichtung (10). Dazu können Zellen von komplexen Proben vollständig oder partiell markiert werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die magnetische Durchflusszytometrie.
In heute bekannten Verfahren zur Durchflusszytometrie werden Zellen mittels zusätzlicher Flüssigkeitsströme in einem Kanal in die Mitte des Hauptkanals fokussiert und auf diese Weise vereinzelt (Sheath-Flow-Prinzip). Diese Vereinzelung ermöglicht, die Zellen in einem anschließenden Messschritt (z.B. optisch oder impedometrisch) zu zählen. Mittels magnetischer Markierung der zu quantifizierenden Partikel ist es möglich, vor der eigentlichen Quantifizierung die Partikel aus einer komplexen Probe zu isolieren und anzureichern.
Um die Funktionalität dieser Technologie aufrecht zu erhalten, ist jedoch eine erhebliche Menge an zusätzlicher Flüssigkeit notwendig, welche den Sheath-Flow generiert. Dieses Verfahren ist auch mit weiteren Aufbereitungen mit z.B. Verdünnungsschritten und Zentrifugationsschritten verbunden, was auch mit einem Kontaminationsrisiko verbunden ist. Die Verdünnungsschritte sind notwendig, um eine Zählrate an die minimale und maximale Zählrate eines Magnetsensors (also des Zählers) des Zytometers anzupassen.
Die zu lösende Aufgabe ist die Bereitstellung einer Vorrichtung und eines Verfahrens, mit deren Hilfe eine zytometrische Messung, z.B. Konzentrationsbestimmung von Zellproben, schneller und bei geringem Kontaminationsrisiko durchgeführt werden kann.
Die Aufgabe wird von der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur durchflusszytometrischen Messung gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Weiterhin wird die Aufgabe von dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Patentanspruch 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
Der Erfindung liegt die Idee zugrunde, innerhalb eines geschlossenen Systems mehrere Anreicherungsschritte durchzuführen. Dies wird durch die bauliche Auslegung eines Kanals der erfindungsgemäßen Vorrichtung und die Verwendung einer Umlenkeinrichtung in dem Kanal ermöglicht. Die Erfindung erlaubt ein zielgerichtetes Anreichern und Vereinzeln von Zellen mit Konzentrationen über mehrere Zehnerpotenzen (von z.B. 10 bis 10.000 Zellen/Mikroliter). Die Erfindung erlaubt vor allem, in einem einzigen Messvorgang mehrere Zehnerpotenzen an mögliche Zellkonzentrationen messen zu können. Selbst bei begrenzter Dynamik des Zählers kann so ein großer dynamischer Bereich, in einem einzigen mikrofluidischen Kanal innerhalb einer komplexen Probe ohne die Notwendigkeit vorangegangener Verdünnungs-, Isolations- oder Anreicherungsschritte abgedeckt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur durchflusszytometrischen Messung umfasst hierzu eine Kammer und den Kanal, wobei der Kanal einen Magnetsensor umfasst und stromabwärts von der Kammer angeordnet ist. Die Kammer und der Kanal bilden ein geschlossenes System, wobei sich eine Achse des Kanals entlang einer Durchflussrichtung des Kanals erstreckt. Ein geschlossenes System liegt vor, wenn die Kammer direkt in den Kanal übergeht. Die Vorrichtung ist durch einen Magneten, insbesondere einen Permanentmagneten, und eine Umlenkeinrichtung, die beide an einer vorbestimmten Seite des Kanals angeordnet sind, gekennzeichnet. Dabei weist die Umlenkeinrichtung mindestens ein Segment auf. Jedes Segment ist in einem Konzentrationsbereich des Kanals angeordnet. Jedes Segment weist Mittel zum Führen von Zellen zur Achse hin auf. Die Umlenkeinrichtung ermöglicht so ein Anreichern magnetisch markierter Zellen, die von dem Magneten in dem jeweiligen Konzentrationsbereich auf die Kanalseite gezogen worden sind, auf der Achse und ein Führen dieser Zellen entlang der Achse zu dem Magnetsensor.
Die oben gestellte Aufgabe wird ebenfalls von dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Anreichern von Zellen eines zu detektierenden Zelltyps einer Zellprobe für eine Durchflusszytometrie gelöst. Dabei werden zunächst magnetisch markierte Zellen des zu detektierenden Zelltyps bereitgestellt. Die markierten Zellen werden in dem Kanal einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung angereichert. Dazu werden die markierten Zellen von dem Magneten in dem Kanal auf die vorbestimmte Seite des Kanals gezogen. Dort wird bei laminarer Strömung in dem Kanal zumindest ein Teil der Zellen von der Umlenkeinrichtung auf die Achse, die sich entlang der Durchflussrichtung des Kanals erstreckt, gelenkt und hierdurch auf der Achse angereichert. Dies ermöglicht eine effiziente Anreicherung von Zellen. Auch komplexe Proben, also nicht aufgereinigte Proben, die eine Vielzahl verschiedene Zellen und andere Partikel, wie z.B. Proteine, enthalten, können so ohne Zwischenschritte, insbesondere unverdünnt, für eine Durchflusszytometrie benutzt werden.
Das Bereitstellen der magnetisch markierten Zellen kann das Markieren der Zellen umfassen. Dabei können zwei Markierungsvarianten verwendet werden.
In einer ersten Variante können die zu detektierenden Zellen in einem Inkubationsschritt durch Vermischen und/oder Rühren von Markern, insbesondere von mindestens einem für den zu detektierenden Zelltyp spezifischen Antikörper, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, und der Zellprobe in der Kammer der Vorrichtung markiert werden. Diese Variante wird bevorzugt bei kleinen Gesamtzellkonzentrationen von bis zu 10⁴ Zellen/Mikroliter verwendet. Ein auf einer Seite der Kammer angeordneter Magnet kann dabei den Misch- und/oder Rührvorgang unterstützen.
In einer Ausführungsform der Vorrichtung ist entsprechend an einer vorbestimmten Seite der Kammer ein Magnet angeordnet, der den Misch- und/oder Rührvorgang unterstützt.
Bei Zellproben mit größeren Gesamtzellkonzentration, z.B. von bis zu 10⁶ Zellen/Mikroliter, kann alternativ bei der Markierung der mindestens eine für den zu detektierenden Zelltyp spezifische Antikörper, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, in dem Kanal bereitgestellt werden. Bei Erzeugen eines magnetischen Felds in dem Kanal mit einem an der Seite des Kanals angeordneten Magneten wird der Antikörper an der Seite des Kanals angereichert. Danach erfolgt das Einbringen der Zellprobe in den Kanal und damit das In-Kontakt-Bringen des mindestens einen spezifischen Antikörpers mit demjenigen Anteil der Zellprobe, der an der Seite des Kanals laminar vorbeiströmt. Dadurch erfolgt ein partielles Markieren der in diesem Anteil enthaltenen Zellen, ohne dass Verdünnungs- oder Aufreinigungsschritte notwendig sind. In einem laminaren Durchflusssystem wird damit eine schichtweise Markierung der gewünschten Zellen erreicht. Alternativ kann eine solche partielle Markierung auch in der Kammer mithilfe des dort angeordneten Magneten durchgeführt werden.
Dadurch wird bei fluidischer Strömung in der Kammer nur eine Schicht, also eine definierte Fraktion der Zellprobe, wie z.B. 1% der gewünschten Zellen, in dem geschlossenen System magnetisch markiert.
Die Umlenkungseinrichtung kann als Mittel zum Führen von Zellen in einem Segment ein oder mehrere Führungselemente aufweisen, die z.B. eine Rinne bilden, die die markierten Zellen auf die Achse lenkt. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst zumindest ein Segment der Umlenkeinrichtung als die Mittel zum Führen von Zellen aber schräg zur Achse angeordnete Führungselemente. Zusammen oder alleine bilden diese mindestens eine in der Durchflussrichtung sich verjüngende Trichterform. Dies ermöglicht die Umlenkung von magnetisch markierten Zellen auf die Achse des Kanals und damit ein Anreichern.
Zumindest ein Führungselement kann, wenn es z.B. ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material besteht, in einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung eine in der Durchflussrichtung sich verjüngende V-Form bilden, was eine magnetophoretische Führung magnetisch markierter Zellen begünstigt.
Zusätzlich oder alternativ können zumindest zwei der Führungselemente als Wände für die Zellen ausgestaltet sein und in der Durchflussrichtung entlang der Achse versetzt angeordnet sein und dadurch eine mechanische Führung zu der Achse bilden, indem sie Banden für den Bewegungspfad der Zellen bilden.
Zusätzlich kann, insbesondere zwischen zwei Führungselementen auf gleicher Achsenhöhe, ein magnetischer Steg entlang der Achse des Kanals angeordnet sein. Dadurch wird die Führung der magnetisch markierten Zelle auf der Achse des Kanals begünstigt.
Vorzugsweise sind mindestens zwei Konzentrationsbereiche des Kanals unterschiedlich ausgestaltet. Eine Zellprobe kann so in mehreren logarithmischen Stufen angereichert werden. So kann erreicht werden, dass eine Anreicherung vorliegt, die mit einem in der Dynamik begrenzten Zähler gemessen werden kann.
Beispielsweise können sich die mindestens zwei Konzentrationsbereiche in einer vorbestimmten Höhe des Kanals zwischen der vorbestimmten Seite und der der vorbestimmten Seite gegenüberliegenden Seite unterscheiden. Dadurch wird in jedem Konzentrationsbereich ein definiertes Volumen bestimmt. Unterschiedliche Volumina in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen bewirken eine erste Anreicherung der Zellen durch den Magneten des Kanals vor der Anreicherung in dem Umlenkelement, sodass bei gegebener Konzentration eine statistisch aussagekräftige und eine definierte Zellzahl in jeder Anreicherungsstufe einstellbar ist.
Die Kanalbreite ist dagegen vorzugsweise für alle Konzentrationsbereiche konstant. Bei konstanter Kanalbreite können sich die mindestens zwei Konzentrationsbereiche zusätzlich oder alternativ durch eine vorbestimmte Breite der Umlenkeinrichtung (senkrecht zur Achse gemessen) und/oder durch eine Länge des jeweiligen Segments der Umlenkeinrichtung entlang der Achse des Kanals unterscheiden. Diese Maße bestimmen den Einzugsbereich der Umlenkeinrichtung, beeinflussen also den Anreicherungsgrad.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird stromabwärts der Umlenkeinrichtung auf der Achse eine Zytometrie, insbesondere eine Zellzählung, mittels des Magnetsensors durchgeführt. Damit kann z.B. eine Konzentrationsbestimmung der Zellprobe erfolgen.
Eine Konzentrationsbestimmung der Zellprobe mittels der Zytometrie stromabwärts der Umlenkeinrichtung umfasst dabei bevorzugt das Zählen der durchströmenden und auf der Achse angereicherten Zellen aus mindestens einem der Konzentrationsbereiche mittels des Magnetsensors. Zu zumindest einem der Konzentrationsbereiche wird die Konzentration der Zellprobe ermittelt mithilfe des beim Zählen der angereicherten Zellen ermittelten Zählwerts des Konzentrationsbereiches, dem Volumen des Konzentrationsbereiches und der Breite des Segments der Umlenkeinrichtung in dem Konzentrationsbereich. Dies ist eine effiziente und zeitsparende Messung deren Auswertung schnell vorliegt. Natürlich wird hierbei zumindest der Konzentrationsbereich gewählt, für den sich ein Zählwert ergibt, der groß genug für eine statistisch relevante Aussage und kleiner als die maximal vom Zähler zuverlässig erfassbare Zählrate ist.
Unter Umständen muss ermittelt werden, aus welchem Konzentrationsbereich die zu einem gegebenen Zeitpunkt gerade gezählten Zellen gehören. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird der jeweilige Konzentrationsbereich, zu dem ein Zählwert ermittelt wird, anhand eines ermittelten Zeitpunkts des Zählenvorgangs des Magnetsensors ermittelt. In einer kalibrierten Vorrichtung kann so eine Zuordnung von Zeitintervallen zum Konzentrationsbereich erfolgen. Unter Umständen ist die Fließgeschwindigkeit zu berücksichtigen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dazu zeigt:
1 eine Skizze einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Querschnitt,
2 Skizzen eines Kanals einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die 1A einen schematischen Querschnitt und die 1B eine schematische Aufsicht des Kanals zeigt,
3 Skizzen verschiedener Ausführungsformen von Umlenkeinrichtungen, wobei die 3A eine perspektivische Darstellung einer Umlenkeinrichtung mit mechanischer Führung zeigt und die 3B sowie die 3C schematische Aufsichten von jeweils einer Umlenkeinrichtung mit magnetophoretischer Führung zeigt,
4 eine Skizze einer Zellprobe in dem Kanal unmittelbar nach Eingeben der Zellprobe (4A) und nach Anlegen eines Magnetfelds (4B) in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
5 eine Skizze, in welcher das Anreichern der Zellen in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Kanal veranschaulicht ist, wobei die 5A eine Aufsicht des Kanals zu einem Zeitpunkt und die 5B eine Aufsicht eines Segments der Umlenkeinrichtung zu verschiedenen Zeitpunkten zeigen, und
6 eine Skizze, in welcher das Bestimmen einer Zellkonzentration in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens und vier Ausschnitte des Kanals zu verschiedenen Zeitpunkten.
Die nachfolgend näher geschilderten Ausführungsbeispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Die Koordinatensysteme K und K’ dienen in den Figuren als Orientierungshilfe, wobei eine vertikale Achse „z“ und eine dazu senkrechte horizontale Achse „x“ die Orientierung im Querschnitt erleichtern (1A), und wobei die horizontale Achse „x“ und eine zu der horizontalen Achse „x“ und zu der vertikalen Achse „z“ senkrechte Achse „y“ die Orientierung in der Aufsicht der beispielhaften Kanals 14 erleichtern (1B). Die Flussrichtung P weist hier in x-Richtung.
Die 1 zeigt eine Prinzipskizze einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 zur durchflusszytometrischen Messung. Die Vorrichtung 10 umfasst eine Kammer 12 und einen Kanal 14. Die Durchflussrichtung der während der Zytometrie gegebenen laminaren Strömung ist, sowohl in der 1 als auch in den folgenden Figuren, mit dem Pfeil P gekennzeichnet. Die Kammer 12 kann an einer Seite (S2) einen Magneten 16 umfassen, der hier z.B. außerhalb der Kammer 12 angebracht ist. Der Kanal 14 liegt, entsprechend der Durchflussrichtung P, stromabwärts von der Kammer 12. Die Kammer 12 und der Kanal 14 bilden ein geschlossenes System. Der Kanal 14 umfasst weiterhin eine Umlenkeinrichtung 20 und einen Magneten 22, insbesondere einen Permanentmagneten, an einer gemeinsamen Kanalseite (S1), z.B. der Kanalunterseite.
Ein Sensor 18 oder ein Sensorarray zur zytometrischen Messung, insbesondere mit einem Sensorchip, ist an dem Kanal 14 stromabwärts der Umlenkeinrichtung 20 angebracht und ist dazu ausgelegt, magnetisch markierte Zellen zu zählen.
Insbesondere können magnetoresistive Widerstände in dem Sensor 18 eingesetzt werden, vorzugsweise ein GMR-Sensor. Der Sensor 18 und/oder das Sensorarray ist mit einer elektronischen Auswerteeinrichtung 23 verbunden, die z.B. einen Prozessor eines Computers zur Auswertung der Messergebnisse umfasst.
Mit der Vorrichtung können z.B. Blutproben unverdünnt auf eine Konzentration z.B. der weißen Blutkörperchen hin untersucht werden.
Der Kanal 14 umfasst auf der Seite des Kanals 14, auf der eine Anreicherung von magnetisch markierten Zellen gewünscht ist, die Umlenkeinrichtung 20, die hier z.B. am Boden des Kanals 14 angeordnet ist. Unterhalb der Umlenkeinrichtung 20 ist der Magnet 22 angeordnet. Der Kanal 14 ist in z.B. vier Konzentrationsbereiche C1, C2, C3, C4 eingeteilt. Die hier gezeigte Anzahl an Konzentrationsbereichen von vier ist jedoch nicht zwingend, d.h. der Kanal 14 mit einer beliebiger Anzahl an Konzentrationsbereichen ausgestaltet sein. Die Höhe h des Kanals kann in den verschiedenen Konzentrationsbereichen C1, C2, C3, C4 des Kanals 14 unterscheiden. Im Beispiel der 2A ist die Höhe des Kanals z.B. im Konzentrationsbereich C1 am größten, z.B. 100 Mikrometer, und nimmt mit jedem stromabwärts folgenden Konzentrationsbereich C2, C3, C4 ab. Im Falle einer partiellen Markierung von Zellen (siehe unten) ist die Höhe h bevorzugt in allen Konzentrationsbereichen C1, C2, C4, C4 z.B. stufenweise gleich.
Die 2B veranschaulicht den Aufbau der Umlenkeinrichtung 20. In dem beispielhaften Kanal 14 ist die Umlenkeinrichtung 20 in z.B. in drei Segmente 20-1, 20-2, 20-3 eingeteilt, wovon jedes in einem anderen der Konzentrationsbereiche C1, C2, C3 liegt. Jedes Segment 20-1, 20-2, 20-3 kann hier als ein Mittel zum Führen von Zellen mehrere schräg zur Achse angeordnete Führungselemente 24 umfassen. In der 2B sind der Übersicht halber nur einige Führungselemente 24 mit den Bezugszeichen versehen. Die einzelnen Segmente 20-1, 20-2, 20-3 haben jeweils eine Breite b und eine Länge a, die sich jeweils in Segmenten 20-1, 20-2, 20-3 unterschiedlicher Konzentrationsbereiche C1, C2, C3 unterscheiden können. Bevorzugt nimmt die Breite b dabei stromabwärts ab, so dass breite Segmente stromauf- und schmale Segmente stromabwärts angeordnet sind. Die Breite b der Umlenkeinrichtung 20 ist diejenige Strecke, die senkrecht zu einer Achse A des Kanals (gestrichelte Linie), die sich entlang der Durchflussrichtung P des Kanals 14 erstreckt, verläuft. Die Breite b ist also der Einzugsbereich der Umlenkeinrichtung 20 innerhalb des Kanals 14 entlang der horizontalen „y“-Achse. Dementsprechend ist die Länge a die Länge des jeweiligen Segments der Umlenkeinrichtung 20 entlang der Achse A des Kanals. Die Kanalbreite, z.B. 100 Mikrometer, ist dabei in jedem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 konstant. Ein z.B. 10 Mikrometer breites Segment 20-3 reichert dann die markierten Zellen 26 von 1/10 der Kanalbreite an, also eine logarithmische Stufe weniger als z.B. das Segment 20-1, wenn das eine Breite b von 100 Mikrometer umfasst.
Die Führungselemente 24 können schräg zur Achse A angeordnet sein, bevorzugt in einem spitzen Winkel zwischen 0° und 90° zur Achse A, insbesondere zwischen 0° und 45°, und alleine oder zusammen mindestens eine in der Durchflussrichtung P sich verjüngende Trichterform bilden. Ein solches Führungselement 24 umfasst z.B. eine Wandung, die hier im Beispiel auf der Innenseite der Außenwand des Kanals 14 angebracht ist und in den Kanal 14 hineinragt.
Die Führungselemente 24 können sowohl z.B. Barrieren aus z.B. Fotolack sein, die die markierten Zellen 26 mechanisch führen und so auf der Achse A anreichern, oder z.B. ferromagnetische „Fischgrätenstrukturen“, die die markierten Zellen magnetisch fokussieren und anreichern. Auch eine Kombination beider Strukturen in einem oder verschiedenen der Segmente 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrichtung 20 ist möglich. Die 2B zeigt das Prinzip der Führungselemente 24, die in der 3 vergrößert dargestellt sind. Ein magnetophoretisch führendes Führungselement 24 ist vorzugsweise ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material gebildet und/oder hat eine Wandhöhe von z.B. 10 Nanometer bis 100 Nanometer. Bevorzugt ist die Wandhöhe kleiner als 20%, insbesondere kleiner als 10 % des durchschnittlichen Zelldurchmessers der zu detektierenden Zellen. Die Wandhöhe eines Führungselements 24 zur mechanischen Führung ist vorzugsweise größer 20%, insbesondere 10%, als der Durchmesser der markierten Zelle 26. Dabei wird im Beispiel von Thrombozyten ein durchschnittlicher Zelldurchmesser von 3 Mikrometer zugrunde gelegt.
Ein Beispiel für Führungselemente 24 z.B. eines Segments 20-1 der Umlenkeinrichtung 20, die eine mechanische Führung bilden, ist in der 3A gezeigt. In diesem Beispiel sind mehrere der Führungselemente 24 in der Durchflussrichtung P auf der Achse A versetzt. Stromabwärts der Umlenkeinrichtung 20 ist in der 3A auch der Sensor 18 gezeigt. Weiterhin sind eine magnetisch markierte Zelle 26 und die Bewegung der markierten Zelle 26, die durch die Führungselemente 24 gelenkt wird, durch den Pfeil Z gezeigt.
Die Figuren 3B und die 3C veranschaulichen jeweils eine weitere Ausführungsform der Umlenkeinrichtung 20, bei der z.B. ein Segment 20-1 aus Führungselementen 24 gebildet wird, die eine magnetophoretische Führung der markierten Zelle 26 bewirken. Die Führungselemente 24 werden ganz oder teilweise aus einem magnetischen Material gebildet, sind also z.B. Nickel-Streifen. Die Wandhöhe eines solchen Führungselements 24 beträgt vorzugsweise 100 Nanometer. Die Führungselemente 24 sind schräg zur Achse A angeordnet.
Zwei Führungselemente 24 des in der 3B gezeigten Ausführungsbeispiels, die sich in Bezug auf die Achse A gegenüberliegen, sind im Ausführungsbeispiel der 3B nicht gegeneinander versetzt. Zwischen ihnen, also auf der Achse A, verläuft ein magnetischer Steg 28, eine sogenannte Seele, die ganz oder teilweise aus einem magnetischen Material, z.B. Nickel gebildet sein kann. Dabei liegt das magnetische Material bevorzugt nicht frei vor, sondern ist von einer z.B. 100 Nanometer dicken Passivierungsschicht überzogen und so von der Zellprobe 30 getrennt. Der Abstand des Stegs 28 zu denjenigen Enden der Führungselemente 24, die zu der Achse A zeigen, ist vorzugsweise kleiner als der Durchmesser der markierten Zelle 26.
Die in dem Ausführungsbeispiel der 3C gezeigten und in Bezug auf die Achse A benachbarten Führungselemente 24 sind in der Durchflussrichtung P versetzt.
Die 4A bis 6 veranschaulichen Bewegungen magnetisch markierter Zellen 26 bei Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Verfahrens, z.B. einer Durchflusszytometrie, mithilfe einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 10. In diesen Beispielen wird mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens z.B. die Gerinnungsfähigkeit einer Vollblutprobe ermittelt. Dazu wird z.B. vor einer Operation bei einem Patienten eine Einschätzung der Gerinnungssituation z.B. anhand der Thrombozytenzahl der Vollblutprobe vorgenommen, um Hämostasestörungen festzustellen.
Um spezifische Zellen, z.B. Thrombozyten oder CD4+-Zellen, innerhalb einer Zellprobe 30, insbesondere einer komplexen Probe wie einer Vollblutprobe, zu quantifizieren, müssen diese zuvor mit einer zellspezifischen Markierung magnetisch markiert werden, da eine komplexe Probe unterschiedliche Zellen und Partikel, z.B. Proteine, enthält. Die Markierung erfolgt mittels z.B. superparamagnetischem Markern, z.B. mit Magnetpartikeln (sogenannte Micro-Beads), die an zell- oder partikelspezifische Antikörper gebunden sind. Die Magnetpartikel können einen Durchmesser von kleiner als 500 Nanometer, vorzugsweise kleiner als 300 Nanometer oder zwischen 40 und 300 Nanometer haben. Zur Verbindung von solchen Markern an Antikörper sowie die Herstellung zell- oder partikelspezifischer Antikörper können dem Fachmann geläufige Techniken genutzt werden.
Mithilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 kann eine zellspezifische Markierung innerhalb einer komplexen Probe mit einer Gesamtzellkonzentration von z.B. 1 bis 10⁶ Zellen/Mikroliter durchgeführt werden. Zur Markierung aller Zellen des gewünschten Zelltyps werden die Zellprobe 30 und die markierten Antikörper in die Kammer 12 der Vorrichtung 10 gegeben. Die Antikörper binden dann spezifisch an die anzureichernden Zellen. Durch Rühren der Zelllösung kann dieser Prozess, bei dem alle anzureichernden Zellen markiert werden, unterstützt werden. Der Magnet 16 kann dabei den Rühr- und/oder Mischvorgang unterstützen. Diese Variante ist vorteilhaft für Zellproben mit einer Gesamtzellkonzentration von bis zu 10⁴ Zellen/Mikroliter
Die Markierung kann alternativ auch partiell erfolgen, z.B. kann nur eine Fraktion von 1% aller anzureichernden Zellen markiert werden. Dies ist vor allem bei einer Zellprobe mit einer sehr hohen Gesamtzellkonzentration, z.B. 10⁶ Zellen/Mikroliter, vorteilhaft, da ansonsten eine Zellzählung den Dynamikbereich des Sensors 18 überfordern könnte. Hierbei werden die mit dem magnetischen Marker verbundenen Antikörper zuerst in den Kanal 14 der Vorrichtung 10 gegeben. Durch den Magneten 22 an der vorbestimmten Seite S1 des Kanals 14 (siehe 1) kann ein Magnetfeld erzeugt werden, dessen Magnetfeld die magnetisch markierten Antikörper an die vorbestimmte Seite S1 des Kanals 14 zieht und dort angereichert. Der Magnet 16 ist bevorzugt an der Außenseite des Kanals 14 angebracht, sodass er nicht mit dem Kanalinhalt kontaminiert wird. Die Zellprobe 30 wird anschließend in den Kanal 14 eingebracht. Die anzureichernden Zellen, also in diesem Beispiel die Thrombozyten, die sich in demjenigen Anteil der Zellprobe 30 befinden, der aufgrund der laminaren Strömung an der vorbestimmten Seite S1 des Kanals 14 vorbeiströmt, kommt so in Kontakt mit den markierten Antikörpern. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn eine hohe Anzahl an Markern pro Zelle vorliegt. Alle anderen Zellen treten mit der Markierung nicht in Kontakt. Je nach z.B. Form und Größe des Kanals 14 kann so eine definierte Fraktion von Zellen, z.B. 1% oder 10 % der Thrombozyten, magnetisch markiert werden, da diese Zellen nach Eingeben der Zellprobe 30 in einer gleichmäßigen räumlichen Verteilung in dem Kanal 14 vorliegen. Nach der Markierung liegen die markierten Zellen 26 vor.
Ob man Mischen oder nur eine Fraktion markieren soll, kann vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens über ein Blutbild abgeschätzt werden.
In dem Verfahrensschritt der Anreicherung der markierten Zellen 26 wird die Zellprobe 30, die die magnetisch markierten Zellen 26 enthält, durch die laminare Strömung z.B. mithilfe einer Ansaugvorrichtung in den Kanal 14 geleitet und damit, wie in der 4A gezeigt, zum Anreichern bereitgestellt (Verfahrensschritt S10; zur Wahrung der Übersichtlichkeit sind nur einzelne markierte Zellen 26 in den 4A bis 6 mit Bezugszeichen gekennzeichnet).
Der Grad der Anreicherung (oder Fokussierung) in jedem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 des Kanals 14 wird durch das Volumen des Konzentrationsbereichs C1, C2, C3, C4, also durch die Höhe h des Kanals 14, durch die Breite b und/oder die Länge a des Segments 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrichtung 20 in einem Konzentrationsbereich C1, C2, C3 bestimmt.
4A zeigt beispielhaft eine stochastische Verteilung der markierten Zellen 26 über der Umlenkeinrichtung 20 unmittelbar nach Einbringen der Zellprobe 30 in den Kanal 14. Bei Erzeugen eines Magnetfelds durch den Magneten 22 werden die markierten Zellen in jedem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 entlang der z-Achse in Richtung des Magneten 22 gezogen (4B und 5A). Die Anzahl der markierten Zellen 26, die auf das jeweilige Segment 20-1, 20-2, 20-3 gezogen wird, hängt von dem jeweiligen Volumen des Konzentrationsbereiches C1 (z.B. 140 bis 200 Mikroliter), C2 (z.B. 70 bis 120 Mikroliter), C3 (z.B. 30 bis 60 Mikroliter), C4 (z.B. 5 bis 15 Mikroliter), also von der jeweiligen Höhe h des Kanals 14 ab.
Dadurch kann eine definierte und statistisch aussagekräftige Anzahl markierter Zellen 26 pro Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 eingestellt werden.
Die Probe 30 strömt nun in Strömungsrichtung P durch den Kanal 14. Durch die laminare Strömung werden die markierten Zellen 26 auf der Umlenkeinrichtung 20 zum Sensor 18 hin gezogen.
Die Trichterform der Umlenkeinrichtung 20 lenkt die markierten Zellen 26 nach der Anreicherung entweder durch eine mechanische und/oder durch eine magnetophoretische Führung auf die Achse A. Dies ist beispielhaft in der 5B, die den vergrößerten Ausschnitt 32 der 5A zu verschiedenen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten t1, t2 und t3 zeigt, veranschaulicht. Die markierten Zellen 26 werden dadurch auf der Achse A angereichert. Die Breite b bestimmt den Anreicherungsfaktor der markierten Zellen 26 der Zellprobe 30 in dem jeweiligen Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4.
V-förmige magnetophoretisch führende Führungselemente 24, wie sie zu der 2B bereits beschrieben wurden, bewegen sich die markierten Zellen 26 entlang der Achse A aufgrund des laminaren Flüssigkeitsstrom über die sich verjüngenden Enden der V-förmigen Führungselemente 24 hinweg und bleiben dabei aufgrund der ferromagnetischen Eigenschaften dieser Führungselemente 24 an der Umlenkeinrichtung 20 haften.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Führungselement 24, wie in der 3B und der 3C gezeigt, die markierte Zelle 26 magnetophoretisch führen (siehe oben). Durch die Lücke zwischen zwei Führungselementen 24 gleitet die Zelle 26 dann in Durchflussrichtung P in Richtung Sensor 18. Die Zelle 26 in der 3B wird, sobald sie in Achsennähe ist, von dem Steg 28 angezogen. Die Strömung drückt die Zelle A dann in der Durchflussrichtung auf dem Steg 28 weiter in Richtung Sensor 18.
Alternativ oder zusätzlich bildet ein Führungselement 24 mit einer mechanischen Führung, z.B. ein Führungselement wie zur 3A beschrieben, eine Barriere, durch die die markierte Zelle 26 zu dem jeweils nächsten Führungselement 24 und schließlich auf die Achse A gelenkt wird. Durch die Strömung im Kanal 14 wird die Zelle 26 dann in Durchflussrichtung P auf der Achse A bewegt (3A, Pfeil Z).
Die fokussierten markierten Zellen 26 werden direkt zu dem Sensor 18 auf der Achse A gelenkt. Kleine Magnetstreifen, die vor dem Sensor angebracht sein können, können die Zellen 26 zusätzlich auf den Sensor 18 ausrichten und überschüssige Magnetpartikel binden. Dadurch werden angereicherte markierte Zellen 26 nicht vom Sensor 18 abgelenkt und ein Hintergrundrauschen durch freie Marker während der Messung wird reduziert.
Die 6 zeigt den Kanal 14 der Vorrichtung 10 in einer Aufsicht während z.B. einer Konzentrationsbestimmung. Im Beispiel wird die Thrombozytenzahl der Zellprobe 30 kontinuierlich gemessen. Der Ausschnitt 32 wird zusätzlich vergrößert zu vier verschiedenen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten t1 („t = 1“), t2 („t = 2“), t3 („t = 3“) und t4 („t = 4“) gezeigt. In den Vergrößerungen des Ausschnitts 32 ist das letzte Führungselement 24 des Segments 20-3 zu sehen, das eine Breite b, z.B. 10 Mikrometer, hat. Die markierten Zellen 26, die in den jeweiligen Konzentrationsbereichen C1, C2, C3 und C4 angereicht wurden, fließen auf der Achse A über den Sensor 18. Zu dem Zeitpunkt t1 werden markierte Zellen 26 aus dem Konzentrationsbereich C4 über den Sensor 18 geleitet. Der Konzentrationsbereich C4 umfasst in diesem Beispiel kein Segment der Umlenkeinrichtung 20. Es werden also nur diejenigen Zellen 26 von dem Sensor 18 erfasst, die zufällig auf der Achse A liegen.
Zu dem späteren Zeitpunkt t2 („t = 2“) werden die angereicherten markierten Zellen 26 aus dem Konzentrationsbereich C3 über den Sensor 18 gelenkt und mittels diesem von der Auswerteeinrichtung 23 gezählt.
Je breiter und/oder länger ein Segment 20-1, 20-2, 20-3 eines Konzentrationsbereichs C1, C2, C3 ist, desto größer ist der Einzugsbereichs des jeweiligen Segments 20-1, 20-2, 20-3 und desto mehr markierte Zellen 26 aus dem jeweiligen Konzentrationsbereich C1, C2, C3 werden über den Sensor 18 gelenkt und von diesem gezählt. Dementsprechend misst der Sensor 18 ab dem Zeitpunkt t3, wenn die angereicherten markierten Zellen 26 des Konzentrationsbereichs C2 über den Sensor 18 strömen, mehr Zählereignisse als zuvor. Zum Zeitpunkt t4 wird die stark angereicherte Fraktion des Konzentrationsbereichs C1 gemessen.
Die Volumina der einzelnen Konzentrationsbereiche C1, C2, C3, C4 und die Breite b des entsprechenden Segments 20-1, 20-2, 20-3 sind bekannt oder können leicht gemessen werden. Mit Hilfe der ermittelten Zellzahl jedes Konzentrationsbereichs C1, C2, C3, C4 kann die Zellprobenkonzentration für jeden Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 berechnet werden. Idealerweise sollten die Werte gleich sein.
Zusätzlich kann ein Zeitpunkt t1, t2, t3 oder t4 des Zählvorgangs ermittelt werden. Damit kann in einer kalibrierten Vorrichtung ermittelt werden, aus welchem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 gerade Zellen 26 gezählt werden. In einer kalibrierten Vorrichtung 10 kann anhand des gemessenen Zeitpunkts der Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 bestimmt werden. Eine ermittelte Zählfrequenz f, also der Abstand der markierten Zellen 26 zueinander, hängt von der magnetischen Kraft, der Flussgeschwindigkeit und der Zellkonzentration ab. Die Zählfrequenz f ist geringer, je geringer die Konzentration der Probe ist. In der 6 werden z.B. die Frequenzen „f = 1“, „f = 2“, „f = 3“ und „f = 4“ ermittelt. Die Zählfrequenz f kann ebenfalls zur Ermittlung der Konzentration der Zellprobe 30 herangezogen werden.
Zusätzlich oder alternativ kann eine Zeitdauer t* ermittelt werden, in der eine vorbestimmte Zählfrequenz f vorliegt. Die Zeitdauer t* ist abhängig von der gewählten Länge a der jeweiligen Segmente 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrichtung 20.
Es ist dem Fachmann durch Referenzproben mit einer bekannten Zellkonzentration möglich, die Zählfrequenz f oder die Zeitpunkte t1, t2, t3, t4 für alle Konzentrationsbereiche C1, C2, C3, C4 auf die Flussgeschwindigkeit und die magnetische Kraft zu kalibrieren.
Bei einer möglichen Kalibrierungsmethode kann z.B. ein Bereich von Durchflussgeschwindigkeiten eingestellt werden. Es wird dann bei der Messung der Zellprobe 30 ermittelt, in welchem Zeitraum t ein definiertes Volumen und damit ein bestimmter Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 der markierten Zellen 26 durchgeführt wurde.
In Abhängigkeit von der Zellkonzentration stellt sich die Frequenz f in jedem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 zum entsprechenden Zeitpunkt t1, t2, t3 oder t4 ein. Die Kalibration wird vorzugsweise für jeden Konzentrationsbereich durchgeführt. Idealerweise wird jeder Konzentrationsbereich für heutige Sensoren auf 1000 Zählereignisse, kalibriert, um eine stabile Statistik zu erzielen.
Bei der Messung der gewünschten Zellprobe 30 mit einer unbekannten Konzentration kann dann vorzugsweise die Messung desjenigen Konzentrationsbereichs C1, C2, C3, C4 zur Bestimmung herangezogen werden, bei der die Zählfrequenz nahe 1000, vorzugsweise zusätzlich unterhalb von 1000, liegt.
Zusammengefasst kann die Erfindung auch mit folgenden Worten beschrieben werden:
Um spezifische Partikel, insbesondere Zellen, innerhalb einer komplexen Probe 30 zu quantifizieren, müssen diese zuvor mit für die Zellen spezifische Markierung markiert werden. Die benötigten Marker bestehen z.B. aus einem superparamagnetischem Material und sind mit Antikörpern an ihrer Oberfläche modifiziert. Diese Markierung kann spezifisch an die Zielpartikel binden. Dieser Schritt der Markierung ist z.B. innerhalb einer komplexen Probe 30 durchzuführen und bedarf keiner darauf folgenden Aufreinigung der Probe. Die hier beschriebene Markierung erfolgt z.B. mit superparamagnetischen Markern.
Die Markierung kann durch Rührprozesse alle gesuchten Zellen, also 100% der gesuchten Zellen, innerhalb einer Probe 30 markieren. Die Markierung kann jedoch auch partiell erfolgen (z.B. 1%). Hierbei werden die markierten Antikörper z.B. zuerst in den Kanal 14 eingebracht und durch ein externes Magnetfeld an einer Seite des Kanals 14 angereichert. Wenn die Probe 30 mit Partikel oder Zellen im Anschluss in den Kanal 14 eingebracht wird, treten nur jene Zellen oder Partikel in Kontakt mit den Markern, welche sich gerade an der Seite des Kanals 14 befinden. Im Falle einer stochastischen Verteilung kann durch die geeignete Auslegung des Kanals 14 ein bestimmter Anteil (z.B. 1%) markiert werden. Alle anderen Partikel treten mit der Markierung nicht Kontakt.
Fokussierung durch magnetische und/oder mechanische Kräfte unter laminaren Flussbedingungen:
Unter Voraussetzung einer superparamagnetischen Markierung der gewünschten Partikel erfolgt die Anreicherung z.B. mittels Kombination aus magnetischen Kräften (hier gezeigt in z-Richtung: siehe 2A) und mechanischer Fokussierung durch geeignete Strukturen (y-Richtung: siehe 2A und 2B). An der Seite, an der eine Anreicherung der Partikel gewünscht ist, kann ein Permanentmagnet 16 oder ein Elektromagnet 16 (2) positioniert werden. Wird eine Zellsuspension 30 in den Kanal 14 eingebracht (4A), sind die markierten Zellen oder Partikel 26 stochastisch verteilt. Magnetische Kräfte bewegen die markierten Zellen oder Partikel 26 an eine Seite des Kanals 14 (4B), hier in z-Richtung. Durch eine geeignete Auslegung der Umlenkeinrichtung 20 (Länge a und Breite b) (2B) an einer der Innenseiten des verwendeten Kanals 14 ist es möglich, die Zellen oder Partikel 26 in y-Richtung an einer beliebige Stelle an der Kanalwand (hier: bei y = 1/2) anzureichern bzw. zu fokussieren. Die Umlenkeinrichtung 20 kann z.B. Barrieren aus z.B. Fotolack sein, die die Zellen oder Partikel 26 mechanisch führen, als auch ferromagnetische Fischgrätenstrukturen, die die markierten Zellen oder Partikel 26 magnetisch anreichern und fokussieren. Auch eine Kombination beider Methoden ist möglich. 5 zeigt ein Beispiel einer solchen Anreicherungsstrecke. 5A zeigt beispielhaft die stochastische Verteilung markierter Zellen 26 über der Umlenkeinrichtung 20 unmittelbar nach Einbringung der Probe 30. Bild 3B zeigt das Prinzip der Fokussierung von markierten Zellen 26 in die Mitte des Kanals 14 zu den Zeitpunkten t1–t3.
Auflösung mehrer Zehnerpotenzen:
Wenn die Kanalhöhe h (2A) über den unterschiedlichen Konzentrationsbereichen C1, C2, C3, C4 (2B) beliebig variiert wird, wird die z.B. Zellzahl in diesem Bereich des Kanals 14 ebenfalls variiert. Dadurch ist es möglich, eine definierte, minimale Zellzahl pro Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 einzustellen. Diese Vorgangsweise erlaubt die Einstellung einer statistisch aussagekräftigen Zellzahl. Im Falle einer partiellen Markierung ist die Höhe h bevorzugt in allen Konzentrationsbereichen C1, C2, C3, C4 gleich. Nur die Schicht, die sich auf der Seite befindet, wo auch die markierten Antikörper durch ein z.B. externes Magnetfeld angezogen wurden, wird markiert und ausschließlich durch die Konzentrationsbereiche C1, C2, C3, C4 unterschiedlich angereichert. Durch die frei wählbare Breite b und Länge a der Umlenkeinrichtung 20 (2B) ist es möglich, eine definierte Fraktion der Probe 30 (z.B. 50% der Kanalbreite bei C3) in der Mitte des Kanals 14 anzureichern.
Ermittlung der Zell- oder Partikelkonzentration:
Die Ermittlung der Konzentration der Partikel innerhalb einer Probe 30 ist durch die Bestimmung von zwei Parametern möglich. Der erste Parameter ist die Zählfrequenz f in x-Richtung der fokussierten Zellen 26 oder anders ausgedrückt, der Abstand der Partikel 30 zueinander. Die Zählfrequenz f hängt von der magnetischen Kraft, der Flussgeschwindigkeit und der Zell- oder Partikelkonzentration ab. Es kann daher die Zählfrequenz f für alle Konzentrationsbereiche C1, C2, C3, C4 auf die Flussgeschwindigkeit und die magnetische Kraft zu kalibrieren. Der zweite Parameter ist der Zeitpunkt t, zu dem sich eine bestimmte Frequenz f einstellt. Zusätzlich gibt die Dauer t*, in der eine bestimmte Frequenz f gezählt wird, Informationen über den vorliegenden Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4. Der Zeitpunkt t und die Dauer t* sind abhängig von der gewählten Länge a der jeweiligen Umlenkeinrichtung 20. Generell ist die Zählfrequenz f geringer, je geringer die Konzentration der Probe 30 ist.
Voraussetzung ist ein kalibriertes System. Das heißt, dass ein Bereich von Durchflussgeschwindigkeiten {v1; vn} eingestellt wird, der es ermöglicht, die fokussierten, vereinzelten Zellen 26 in einem anschließenden Schritt zu quantifizieren. Es kann also ermittelt werden, in welchem Zeitraum ein definiertes Volumen und damit ein bestimmter Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 der Zellprobe 30 durchgeführt wurde. Damit ein anschließendes Zählsystem zählen kann, kann die Anwendung auf eine bestimmte Zählfrequenz f kalibriert werden. Abhängig von der Zell- oder Partikelkonzentration stellt sich diese Frequenz f bei den Konzentrationsbereichen C1, C2, C3 oder C4 zum entsprechenden Zeitpunkt t1, t2 t3 oder t4 ein. Es ist vorteilhaft, wenn die Kalibration für jeden Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 durchgeführt wird. Eine optimale Kalibration erlaubt also, dass eine anschließende Quantifizierungsmethode die Konzentrationsbereiche C1–C4 auflöst. Idealerweise besteht jede Kalibration eines Konzentrationsbereiches C1, C2, C3 oder C4 aus bis zu 1000 gezählten Zellen 26, um eine stabile Statistik zu erzielen.
Bestimmung der Konzentration:
Über eine bestimmte Zählfrequenz f und einen Zeitbereich t kann der Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 der Probe bestimmt werden. Aus der bekannten Geometrie und des daraus resultierenden Flüssigkeitsvolumens in diesem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 ist es möglich, Zellen oder Partikel pro Volumen zu quantifizieren. Die gezählten Zellen oder Partikel in diesem Zeitfenster lassen auf eine Konzentration der Zellen oder Partikel in der gesamten Probe 30 schließen.
Vorgangsweise bei Auswertung:
Zuerst kann ermittelt werden, nach welcher Zeit t eine Zählfrequenz f erreicht ist. Damit kann der Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4, der auf 1000 gezählte Zellen 26 oder Partikel pro Messung kalibriert wurde, ermittelt. Ebenfalls kann der Zählwert zu diesem Konzentrationsbereich C1, C2, C3, C4 ermittelt werden.
Eine weitere Ausführungsform der zytometrischen Konzentrationsmessung kann anhand der 6 erläutert werden: Eine mit superparamagnetischen Markern markierte Probe 30 mit einer unbekannten Konzentration liegt vor. Durch die beschriebenen geometrischen Parameter, der Flussgeschwindigkeit und/oder der Stärke des Magnetfelds) ist es möglich, eine gewünschte Frequenz f der z.B. markierten Zellen 26 für eine optimale Quantifizierung einzustellen. 6 zeigt ein Beispiel in dem das System auf f = 4 kalibriert wird. Es ist zu sehen, dass sich die gewünschte Frequenz f zum Zeitpunkt t = 3 einstellt. Es liegt daher eine Probe 30 mit einem Konzentrationsbereich C2 vor. Steigt die Frequenz f höher als 4, dann ist die Zählung abgeschlossen, da man bereits die Zellen 26 im Anreicherungsbereich C1 zum Zeitpunkt t = 4 zählt.
Einige Messbeispiele, bei denen die Konzentrationsbereiche auf 1000 Zellen kalibriert werden:
Bei der Kalibration des Konzentrationsbereichs C1, der z.B. ein Volumen von 10 Mikroliter hat, wird z.B. eine Referenzprobe mit einer Konzentration von 10² Zellen/Mikroliter verwendet. Von der unbekannten Probe 30 werden z.B. 300 Zellen gezählt, folglich hat die unbekannte Probe eine Konzentration von 30 Zellen/Mikroliter.
Einer Kalibration des Konzentrationsbereichs C2 (1 Mikroliter, Konzentration der Referenzprobe: 10³ Zellen/Mikroliter) folgt z.B. eine Messung von z.B. 400 Zellen. Die unbekannte Probe Hat eine Konzentration von 400 Zellen/Mikroliter.
Bei der Kalibration des Konzentrationsbereichs C3 (z.B. 0,1 Mikroliter) hat die Referenzprobe z.B. eine Konzentration von 10⁴ Zellen/Mikroliter. In der unbekannten Probe 30 werden 200 Zellen gezählt, die gesuchte Konzentration beträgt 2000 Zellen/Mikroliter.
Nach Kalibrierung des Konzentrationsbereichs C4 (z.B. 0,01 Mikroliter, Konzentration der Referenzprobe:
10⁵ Zellen/Mikroliter) werden in einer Probe 30 z.B. 800 Zellen gezählt, folglich hat die unbekannte Probe eine Konzentration von 80.000 Zellen/Mikroliter.

Claims

Vorrichtung (10) zur durchflusszytometrischen Messung, umfassend eine Kammer (12) und einen Kanal (14), wobei der Kanal (14) einen Magnetsensor (18) umfasst und stromabwärts von der Kammer (12) liegt und mit der Kammer (12) in einem geschlossenen System vorliegt, wobei sich eine Achse (A) des Kanals (14) entlang einer Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt, dadurch gekennzeichnet, dass an einer vorbestimmten Seite (S1) des Kanals (14) ein Magnet (22) und eine Umlenkeinrichtung (20) angeordnet sind und wobei die Umlenkeinrichtung (20) in mindestens ein Segment (20-1, 20-2, 20-3) eingeteilt ist und jedes Segment (20-1, 20-2, 20-3) in einem Konzentrationsbereich (C1, C2, C3) des Kanals (14) angeordnet ist, in welchem die Umlenkeinrichtung (20) Mittel zum Führen von Zellen (26) zur Achse (A) hin aufweist.
Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, wobei an einer vorbestimmten Seite der Kammer (12) ein Magnet (16) angeordnet ist.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Segment (20-1, 20-2, 20-3) der Umlenkeinrichtung (20) als Mittel zum Führen von Zellen (26) schräg zur Achse (A) angeordnete Führungselemente (24) umfasst, die zusammen oder alleine mindestens eine in der Durchflussrichtung (P) sich verjüngende Trichterform bilden.
Vorrichtung (10) nach Anspruch 3, wobei – zumindest eines der Führungselemente (24) eine in der Durchflussrichtung (P) sich verjüngende V-Form bildet und ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material besteht, und/oder – zumindest zwei der Führungselemente (24) in der Durchflussrichtung (P) auf der Achse (A) versetzt sind und dadurch eine mechanische Führung zu der Achse (A) bilden.
Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei ein magnetischer Steg (28) entlang der Achse (A) des Kanals (14) angeordnet ist.
Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei Konzentrationsbereiche (C1, C2, C3, C4) unterschiedlich ausgestaltet sind.
Vorrichtung (10) nach Anspruch 6, wobei sich die mindestens zwei Konzentrationsbereiche (C1, C2, C3, C4) in einer vorbestimmten Höhe (h) des Kanals (14) zwischen der vorbestimmten Seite (S1) und der der vorbestimmten Seite (S1) gegenüberliegenden Seite unterscheiden.
Vorrichtung (10) nach Anspruch 6 oder 7, wobei eine Kanalbreite konstant ist und sich die mindestens zwei Konzentrationsbereiche (C1, C2, C3) durch eine vorbestimmte Breite (b) der Umlenkeinrichtung (20) unterscheiden.
Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei jeder Konzentrationsbereich (C1, C2, C3) durch eine Länge (a) des jeweiligen Segments (20-1, 20-2, 20-3) der Umlenkeinrichtung (20) entlang der Achse (A) des Kanals (14) gekennzeichnet ist.
Verfahren zum Anreichern von Zellen eines zu detektierenden Zelltyps einer Zellprobe (30) für eine Durchflusszytometrie, umfassend die Schritte: – Bereitstellen von magnetisch markierten Zellen (26) des zu detektierenden Zelltyps, und – Anreichern der markierten Zellen (26) in dem Kanal (14) einer Vorrichtung (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die markierten Zellen (26) von dem Magneten (22) auf die vorbestimmte Seite (S1) des Kanals (14) gezogen und dort zumindest ein Teil der Zellen (26) von der Umlenkeinrichtung (20) auf die Achse (A), die sich entlang der Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt, gelenkt und hierdurch auf der Achse (A) angereichert werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Bereitstellen der magnetisch markierten Zellen (26) das Markieren der Zellen umfasst und wobei der Markierungsschritt die folgenden Schritte umfasst: – Bereitstellen mindestens eines für den zu detektierenden Zelltyp spezifischen Antikörpers, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, in dem Kanal (14), – Erzeugen eines magnetischen Felds in dem Kanal (14) mit dem an einer Seite (S1) des Kanals (14) angeordneten Magneten (22) und hierdurch Anreichern der Antikörper an der Seite des Kanals (14), – danach Einbringen der Zellprobe (30) in den Kanal (14), In-Kontakt-Bringen des mindestens einen spezifischen Antikörpers mit demjenigen Anteil der Zellprobe, der an der Seite (S1) des Kanals (14) laminar vorbeiströmt, und dadurch Markieren der in diesem Anteil enthaltenen Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei stromabwärts der Umlenkeinrichtung (20) auf der Achse (A) eine Zytometrie mittels des Magnetsensors (18) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei stromabwärts der Umlenkeinrichtung (20) eine Konzentrationsbestimmung der Zellprobe (30) mittels der Zytometrie durchgeführt wird, umfassend die Schritte: – Zählen der durchströmenden auf der Achse (A) angereicherten Zellen (26) aus mindestens einem der Konzentrationsbereiche (C1, C2, C3, C4) mittels des Magnetsensors (18), – zu zumindest einem der Konzentrationsbereiche (C1, C2, C3, C4) Ermitteln der Konzentration der Zellprobe (30) aus dem beim Zählen der angereicherten Zellen (26) ermittelten Zählwert des Konzentrationsbereiches (C1, C2, C3, C4), dem Volumen des Konzentrationsbereiches (C1, C2, C3, C4) und der Breite (b) der Umlenkeinrichtung (20).
Verfahren nach Anspruch 13, wobei anhand eines ermittelten Zeitpunkts (t1, t2, t3, t4) des Zählens des Magnetsensors (18) ermittelt wird, aus welchem Konzentrationsbereich (C1, C2, C3, C4) gerade Zellen gezählt werden.