CN105190286A - 用于富集和分离具有的浓度在若干对数级上的细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于流式细胞术的装置（10），其具有室（12）、通道（14）和磁传感器（18）。通道（14）和室（12）存在于闭合系统中，通道（14）的轴线（A）沿通道（14）的流动方向（P）延伸。磁体（22）和偏转装置（20）布置在通道（14）的预定侧上。偏转装置（20）被分成至少一个区段（20-1、20-2、20-3）且每个区段（20-1、20-2、20-3）布置在通道（14）的浓度区域（C1、C2、C3）中。偏转装置（20）具有作为用于引导细胞朝向轴线（A）的装置的导向元件（24）。本发明还涉及一种借助于此类装置（10）用于流式细胞术的方法。为此目的，能够完全或部分地标记来自复杂样本的细胞。

Description

用于富集和分离具有的浓度在若干对数级上的细胞的方法

技术领域

本发明涉及磁性的流式细胞术。

背景技术

在用于流式细胞术的目前已知方法中，借助于通道中的额外的液体流来使细胞集中在主通道的中心中并且因此被分离（鞘流原理）。此分离使得有可能在后续测量步骤中计数细胞（例如通过光学或阻抗滴定装置）。通过磁性标记待定量的颗粒，有可能在实际定量之前从复杂样本中分离和富集所述颗粒。

然而，为了维持此技术的功能性，需要产生鞘流的大量的额外液体。此方法还与具有例如稀释步骤和离心步骤的进一步制备相关，这些制备也与污染风险相关。稀释步骤对于使计数率与细胞计数器的（即计数器的）磁传感器的最小和最大计数率匹配而言是必要的。

待实现的目标在于提供一种装置和一种方法，通过所述装置和所述方法能够更快速地且以更小的污染风险进行细胞术测量，例如，确定细胞样本的浓度。

发明内容

此目标通过根据本申请权利要求1的根据本发明用于流式细胞术测量的装置来实现。此外，所述目标通过根据申请权利要求10的根据本发明的方法来实现。本发明的有利改进由从属权利要求详细说明。

本发明是基于在闭合系统内进行多个富集步骤的概念。这通过根据本发明的装置的通道的结构设计和通过使用所述通道中的偏转装置而变得可能的。本发明使能进行具有多于10的数次幂的浓度（例如10至10000个细胞/微升）的细胞的靶向富集和分离。特别地，本发明使得有可能能够在单个测量过程中测量可能的多于10的多次幂的细胞浓度。即使在计数器的受限制的动态响应的情况下，这也允许在复杂样本内的单个微流体通道中覆盖较大的动态范围，而无需先前稀释、分离或富集步骤。

为此目的，根据本发明的用于流式细胞术测量的装置包括室和通道，其中所述通道包括磁传感器并且设置在所述室的下游。所述室和所述通道形成闭合系统，其中所通道的轴线沿着所述通道的流动方向延伸。如果所述室直接汇合至所述通道中，则存在闭合系统。所述装置特征在于磁体，更具体地在于永磁体和偏转装置，所述磁体和所述偏转装置两者均布置在所述通道的预定侧处。在此，所述偏转装置具有至少一个区段。每个区段布置在通道的浓度区域中。每个区段具有用于引导细胞朝向轴线的装置。偏转装置由此能够实现磁性标记细胞的富集，所述细胞通过各个浓度区域中的磁体被拉至通道的一侧，至所述轴线上且这些细胞沿着所述轴线被引导至磁传感器。

以上论述的目标同样由根据本发明的用于富集对于流式细胞术的细胞样本中待检测的细胞类型的细胞的方法来实现。在此首先提供待检测的细胞类型的磁性标记细胞。标记细胞被富集在根据本发明的装置的实施例的通道中。为此目的，标记细胞借助于通道中的磁体被拉至所述通道的预定侧上。在通道中的层流的情况下，那里的细胞中的至少一些通过偏转装置被引导至轴线，所述轴线沿所述通道的流动方向延伸，并且由此富集在所述轴线上。这使能实现细胞的有效富集。因此，即使复杂样本（即含有许多不同细胞和其它颗粒（例如蛋白质）的未纯化样本）也能够用于无中间步骤的流式细胞术，特别是以未稀释的方式。

提供磁性标记细胞能够包括标记所述细胞。在此，可使用两种标记变型。

在第一种变型中，待检测的细胞可在培养步骤中通过在装置的室中混合和/或搅拌标记物（具体地，对于待检测的细胞类型具有特异性的至少一种抗体，所述抗体连接至至少一种磁性标记物）和细胞样本来进行标记。此变型优选地在达10⁴个细胞/微升的较小总细胞浓度的情况下使用。在这种情况下，布置在所述室的侧上的磁体能够有助于混合和/或搅拌过程。

在所述装置的一个实施例中，磁体对应地布置在所述室的预定侧处，所述磁体有助于混合和/或搅拌过程。

在具有更大总细胞浓度（例如达10⁶个细胞/微升）的细胞样本的情况下，可替代地，有可能在通道中提供在制备期间对于待检测的细胞类型具有特异性的至少一种抗体，所述抗体与至少一种磁性标记物相连接。当使用布置在通道的一侧上的磁体在所述通道中产生磁场时，抗体在所述通道的所述侧处富集。紧接着，细胞样本被引入至通道中，且由此使至少一种特异性抗体与细胞样本的以层流方式流经所述通道的所述侧的那一部分相接触。因此，在此部分中包含细胞的部分标记，而无需稀释或纯化步骤。因此，在层流系统中实现所需细胞的逐层标记。可替代地，还能够借助于设置在那里的磁体在室中进行此类部分标记。

因此，在流体流的情况下，仅一层（即细胞样本的限定部分，例如所需细胞的1%）在闭合系统中被磁性标记。

偏转装置能够具有一个或多个导向元件，其作为用于引导区段中的细胞的装置，所述导向元件例如形成凹槽并且将标记细胞引导至轴线。在根据本发明的装置的尤其有利的实施例中，偏转装置的至少一个区段包括布置成与轴线成角度的导向元件，其作为用于引导细胞的装置。以一起或独立的方式，所述导向元件形成在流动方向上渐缩的至少一个漏斗形状。这使磁性标记细胞能偏转至通道的轴线，且由此使能实现富集。

以示例的方式，如果它完全或部分地包括铁磁性材料，则在装置的另一实施例中至少一个导向元件能够形成在流动方向上渐缩的V形，从而促进磁性标记细胞的磁泳导向。

额外地或者可替代地，所述导向元件中的至少两个能够配置成对于多个细胞的壁并且能够布置成在流动方向上沿轴线偏置，且由此形成朝向所述轴线的机械引导，这是凭借形成对于细胞的运动路径的边界来实现的。

额外地，磁性腹板能够沿通道的轴线布置，特别地设置在相同轴线水平处的两个导向元件之间。因此，促进在通道的轴线上的磁性标记细胞的引导。

优选地，通道的至少两个浓度区域具有不同的构型。细胞样本能够由此在多个对数级中富集。这样能够实现的是能够通过具有受限制的动态响应的计数器来测量存在的富集。

以示例的方式，所述至少两个浓度区域能够在预定侧与同所述预定侧相对的一侧之间的通道的预定高度方面有所不同。因此，在每个浓度区域中确定限定体积。不同浓度区域中的不同体积引起在偏转元件中在富集之前通过通道的磁体进行细胞的第一富集，使得统计学上有意义的和限定的细胞数量在给定浓度下的每个富集步骤中是可调整的。

相比之下，通道宽度优选地对于所有浓度区域是恒定的。在恒定通道宽度的情况下，额外地或可替代地，所述至少两个浓度区域能够在偏转装置的预定宽度（如垂直于轴线所测量的）和/或所述偏转装置沿通道的轴线的各个区段的长度方面有所不同。这些尺寸确定偏转装置的汇流面积，即影响富集的程度。

在根据本发明的方法的一个实施例中，借助于磁传感器在偏转装置下游的轴线上进行细胞术，具体地细胞计数。使用这样，有可能例如确定细胞样本的浓度。

在这种情况下，借助于偏转装置下游的细胞术确定细胞样本的浓度优选地包括借助于磁传感器对来自至少一个浓度区域且流经轴线上的富集的细胞进行计数。针对至少一个浓度区域，从在计数富集的细胞时确立的浓度区域的计数值、浓度区域的体积以及浓度区域中的偏转装置的区段的宽度来确立细胞样本的浓度。这是有效和节省时间的测量，其的评估是快速可用的。自然地，在此选择至少浓度区域，针对所述浓度区域出现对于统计学相关陈述而言足够大并且小于由计数器能够可靠记录的最大计数率的计数器值。

可能需要确立在给定时间当前计数的细胞所属的浓度区域。在所述方法的另一实施例中，针对其确立计数器值的各个浓度区域是基于磁传感器的计数过程的已确立的时间来确立的。因此有可能引起时间间隔分配至校准装置中的浓度区域。在某些情况下应考虑流速。

附图说明

下面，将基于附图以具体的示例性实施例再一次更详细地解释本发明。在附图中：

图1示出根据本发明的装置的实施例在截面中的简图，

图2示出根据本发明的装置的通道的简图，其中图1A示出示意性的截面，且图1B示出通道的示意性顶视图，

图3示出偏转装置的不同实施例的简图，其中图3A示出具有机械导向件的偏转装置的透视图，并且图3B和图3C示出具有磁泳导向件的偏转装置在每种情况下的示意性顶视图，

图4示出在根据本发明的方法的实施例中紧接着引入细胞样本之后（图4A）和施加磁场之后（图4B）通道中的细胞样本的简图，

图5示出阐明在根据本发明的方法的实施例中通道中的细胞的富集的简图，其中图5A示出在一个时间点通道的顶视图，且图5B示出在不同时间偏转装置的区段的顶视图，以及

图6示出其中在根据本发明的方法的实施例中测定细胞浓度以及在不同时间的通道的四个部段的简图。

具体实施方式

以下更详细解释的示例性实施例代表本发明的优选实施例。在图中，功能上等效的元件具有相同的附图标记。图中的坐标系K和K'帮助定向，其中竖直轴线“z”和与其垂直的水平轴线“x”简化截面中的取向（图1A），并且其中水平轴线“x”和与水平轴线“x”和竖直轴线“z”垂直的轴线“y”简化示例性通道14的顶视图中的取向（图1B）。在此，流动方向P指向x方向。

图1示出根据本发明用于进行流式细胞术测量的装置10的实施例的示意图。装置10包括室12和通道14。在细胞计数期间存在的层流的流动方向在图1和在后续的图中均由箭头P指示。在一侧上（S2），室12能够包括磁体16，在这种情况下所述磁体例如附接在室12的外部。根据流动方向P，通道14布置在室12的下游。室12和通道14形成闭合系统。通道14还包括在同一通道侧（S1）处（例如通道下侧）的偏转装置20和磁体22（特别地，永磁体）。

传感器18或用于细胞计数测量的传感器阵列（特别地，包括传感器芯片）附接至偏转装置20下游的通道14，并且它被配置用于计数磁性标记细胞。

特别地，磁阻电阻器能够用于传感器18中，优选GMR传感器。传感器18和/或传感器阵列连接至电子评估装置23，其包括例如用于评估测量结果的计算机的处理器。

使用所述装置，例如有可能来检查未稀释的血液样本的关于（例如）白细胞的浓度。

在通道14的需要富集磁性标记细胞的一侧上，通道14包括偏转装置20，所述偏转装置在这种情况下布置在（例如）通道14的底座上。磁体22布置在偏转装置20下方。以示例的方式，通道14被分成四个浓度区域C1、C2、C3、C4。然而，此处的总计四个的浓度区域的数量不是强制性的，即通道14能够配备有任何数量的浓度区域。通道的高度h能够在通道14的不同浓度区域C1、C2、C3、C4中是不同的。在图2A中所示的实施例中，通道的高度在例如浓度区域C1中最高（例如100μm），并且在每个随后的下游浓度区域C2、C3、C4中减少。在细胞的部分标记的情况下（参见下文），高度h优选地在所有浓度区域C1、C2、C3、C4中例如是逐步相等的。

图2B阐明偏转装置20的设计。在示例性通道14中，偏转装置20被分成例如三个区段20-1、20-2、20-3，其中每个区段位于浓度区域C1、C2、C3中的不同的一个中。在此，每个区段20-1、20-2、20-3能够包括布置成与轴线成角度处的多个导向元件24，其用作引导细胞的装置。为清楚起见，在图2B中导向元件24中仅一些设有附图标记。单个区段20-1、20-2、20-3各自具有宽度b和长度a，其能够在不同浓度区域C1、C2、C3的区段20-1、20-2、20-3中分别是不同的。优选地，在这种情况下宽度b在下游减小，使得宽的区段布置在上游且窄的区段布置在下游。偏转装置20的宽度b是垂直于通道的轴线A（虚线）延伸的路径，其中通道的轴线A沿通道14的流动方向P延伸。因此，宽度b是偏转装置20在通道14内沿水平“y”-轴的流域。因此，长度a是偏转装置20沿通道的轴线A的相应区段的长度。在这种情况下通道宽度（例如100μm）在每个浓度区域C1、C2、C3、C4中是恒定的。以示例的方式，区段20-3具有10μm的宽度，然后富集通道宽度的1/10的标记细胞26，即小于例如区段20-1的一个对数级，如果后者包括100μm的宽度b。

导向元件24能够布置在与轴线A成角度处，优选地在关于轴线A成0°与90°之间的锐角处，特别是在0°与45°之间，并且单独地或一起形成在流动方向P上渐缩的至少一个漏斗形状。以示例的方式，这种导向元件24包括壁，在所述实施例中所述壁在此附接至通道14的外壁的内侧且突出至通道14中。

例如，导向元件24能够是由例如光致抗蚀剂制成的屏障，其机械地引导标记细胞26且因此将这些富集在轴线A或例如铁磁性“鱼骨状结构”上，其磁性地集中且富集标记细胞。偏转装置20的区段20-1、20-2、20-3中的一个或不同几个中两者结构的组合也是可能的。图2B示出导向元件24的原理，其以放大方式描绘于图3中。以磁泳方式引导的导向元件24优选地完全或部分地由铁磁性材料制成和/或具有例如10nm至100nm的壁高度。优选地，壁高度小于待检测的细胞的平均细胞直径的20%，特别地小于10%。用于机械引导的导向元件24的壁高度优选地大于标记细胞26的直径的20%，特别地大于10%。在此，使用血小板的示例，这是基于3μm的平均细胞直径。

例如偏转装置20的区段20-1的导向元件24的示例在图3A中示出，其形成机械引导。在此示例中，多个导向元件24在流动方向P上在轴线A上偏移。传感器18也在图3A中示出在偏转装置20的下游。此外示出磁性标记细胞26和标记细胞26的运动，其由导向元件24引导，以箭头Z的方式示出。

指定为图3B和图3C的附图分别图示偏转装置20的另外的实施例，其中例如区段20-1由导向元件24形成，其引起标记细胞26的磁泳引导。导向元件24完全或部分地由磁性材料形成，即这些是例如镍条。这种导向元件24的壁高度优选地是100nm。导向元件24布置在与轴线A成一定角度处。

在图3B中示出的示例性实施例的两个导向元件24（其关于轴线A彼此相对）在图3B的示例性实施例中相对于彼此并未偏移。可完全或部分地由磁性材料（例如镍）形成的磁性腹板28（所谓的芯）在其间I上延伸，即在轴线A上延伸。在此，磁性材料优选地不暴露出来，而是由具有例如100nm的厚度的钝化层覆盖，且因此与细胞样本30分离。腹板28与指向轴线A的导向元件24的那些端部的距离优选地小于标记细胞26的直径。

在图3C的示例性实施例中示出的且关于轴线A邻近的导向元件24在流动方向P上偏移。

图4A至图6阐明在根据本发明的方法的示例性实施例中，例如在流式细胞术中借助于根据本发明的装置10的磁性标记细胞26的运动。在这些示例中，借助于根据本发明的方法确立例如全血样本的凝固性。为此目的，例如在操作之前，根据患者情况，例如基于全血样本中的血小板数量估计凝血情况以便确定止血异常。

为了给细胞样本30内的特定细胞（例如血小板或CD4+细胞）定量，特别是在复杂的样本内（如全血样本），所述细胞必须首先用细胞特异性标记来进行磁性标记，因为复杂样本含有不同细胞和颗粒，例如蛋白质。借助于例如超顺磁标记物，例如使用结合细胞特异性或颗粒特异性抗体的磁性颗粒（所谓的微珠）来进行标记。磁性颗粒能够具有小于500nm的直径，优选地具有小于300nm或在40nm与300nm之间的直径。对于将这类标记物结合至抗体和对于产生细胞特异性或颗粒特异性抗体而言，本领域的技术人员能够使用常规技术。

有可能借助于根据本发明的装置10进行具有例如1至10⁶个细胞/微升的总细胞浓度的复杂样本内的细胞特异性标记。为了标记所需细胞类型的所有细胞，将细胞样本30和标记的抗体置于装置10的室12中。所述抗体然后特定地结合至待富集的细胞。其中标记待富集的所有细胞的这一过程能够通过搅拌细胞溶液来辅助。在此，磁体16能够辅助搅拌和/或混合过程。此变型对于具有高达10⁴个细胞/微升的总细胞浓度的细胞样本而言是有利的。

可替代地，标记也能够是局部的，例如有可能仅标记等于待富集的所有细胞的1%的部分。这是有利的，特别是在具有极高的总细胞浓度（例如10⁶个细胞/微升）的细胞样本的情况下，因为否则细胞计数会使传感器18的动态范围超负荷。在此，首先将与磁性标记物连接的抗体放入装置10的通道14中。磁场能够由通道14的预定侧S1处的磁体22产生（参见图1），所述磁体的磁场将磁性标记的抗体拉至通道14的预定侧S1并且使其在此处富集。磁体16优选地附接至通道14的外侧，使得它不被通道内容物所污染。随后将细胞样本30引入至通道14中。待富集的细胞（即在此实施例中的血小板）位于由于层流的结果流经通道14的预定侧S1的细胞样本30的一部分中，由此待富集的细胞与标记的抗体相接触。在这种情况下，如果每个细胞存在大量标记物则是有利的。所有其它细胞不与标记相接触。根据例如通道14的形式和尺寸，因此有可能磁性标记限定部分的细胞，例如1%或10%的血小板，因为在细胞样本30插入之后，这些细胞在通道14中可获得均匀的空间分布。在标记之后可获得标记细胞26。

是否应进行混合或是否应标记仅一部分能够在使用血细胞计数进行根据本发明的方法之前进行估计。

在富集标记细胞26的方法步骤中，例如借助于抽吸装置将含有磁性标记细胞26的细胞样本30通过层流引导至通道14中，且由此提供用于富集，如图4A中所示（方法步骤S10；为了保持清除，在图4A至图6中仅个别的标记细胞26由附图标记标示）。

在通道14的每个浓度区域C1、C2、C3、C4中的富集（或集中）程度由浓度区域C1、C2、C3、C4的体积确定，即由通道14的高度h、由浓度区域C1、C2、C3中的偏转装置20的区段20-1、20-2、20-3的宽度b和/或长度a确定。

图4A以示例性方式示出在紧接将细胞样本30引入到通道14中之后标记细胞26在偏转装置20上的随机分布。当通过磁体22产生磁场时，每个浓度区域C1、C2、C3、C4中的标记细胞在磁体22（图4B和图5A）的方向上沿z轴被拉动。被拉至相应区段20-1、20-2、20-3上的标记细胞26的数量取决于浓度区域C1（例如140至200微升）、C2（例如70至120微升）、C3（例如30至60微升）、C4（例如5至15微升）的相应体积，即取决于通道14的相应高度h。因此，有可能设定每个浓度区域C1、C2、C3、C4的标记细胞26的限定的和统计上有意义的数量。

样本30现在沿流动方向P上流动通过通道14。由于层流的结果，偏转装置20上的标记细胞26被拉至传感器18。

在富集之后，偏转装置20的漏斗形状通过机械的和/或磁泳的导向件将标记细胞26引导至轴线A上。这在图5B中以示例性方式阐明，其示出在不同连续时间t1、t2和t3的图5A的放大区段32。因此，标记细胞26被富集在轴线A上。宽度b确定各自的浓度区域C1、C2、C3、C4中的细胞样本30的标记细胞26的富集因子。

V形磁泳引导的导向元件24（如已经关于图2B所描述的）使标记细胞26由于层状的液体流沿轴线A在V形引导元件24的渐缩端部上方移动，并且在这种情况下所述标记细胞由于这些引导元件24的铁磁特性粘附在偏转装置20处。

可替代地或额外地，导向元件24（如图3B和图3C中所示）能够以磁泳方式（参见上文）引导标记细胞26。由于两个导向元件24之间的间隙，细胞26然后沿流动方向P在传感器18的方向上滑动。一旦它接近轴线，则图3B中的细胞26由腹板28吸引。然后所述流沿流动方向在传感器18的方向上继续挤压腹板28上的细胞A。

可替代地或额外地，具有机械导向件的导向元件24（例如，如关于图3A所描述的导向元件）形成屏障，通过所述屏障标记细胞26被相应地引导至下一个导向元件24并且最后至轴线A。由于通道14中的流，然后细胞26沿流动方向P（图3A，箭头Z）在轴线A上移动。

集中的标记细胞26然后直接引导至轴线A上的传感器18。能够附接在传感器前面的小型磁条能够额外地将细胞26对齐至传感器18上且结合过量的磁性颗粒。因此，富集的标记细胞26未由传感器18偏转且在测量期间由于游离标记物的背景噪声被减小。

图6以顶视图示出装置10的通道14，例如在浓度测定期间。在示例中，连续地测量细胞样本30的血小板数量。额外地，区段32以放大的方式在四个不同的连续时间t1（“t=1”）、t2（“t=2”）、t3（“t=3”）以及t4（“t=4”）处示出。能够在区段32的放大中观察到区段20-3的最后一个导向元件24，其具有例如10μm的宽度b。富集在相应浓度区域C1、C2、C3和C4中的标记细胞26流经轴线A上的传感器18。在时间t1，来自浓度区域C4的标记细胞26被引导经过传感器18上方。在此示例中，浓度区域C4不包括偏转装置20的区段。因此，仅随机位于轴线A上的那些细胞26由传感器18记录。

在随后的时间t2（“t=2”），来自浓度区域C3的富集的标记细胞26被引导经过传感器18上方，并且所述细胞借助于所述传感器通过评估装置23进行计数。

浓度区域C1、C2、C3的区段20-1、20-2、20-3越宽和/或越长，对应区段20-1、20-2、20-3的汇流区域越大，并且来自相应浓度区域C1、C2、C3的更多标记细胞26被引导经过传感器18并且由其进行计数。因此，从时间t3开始，当来自浓度区域C2的富集的标记细胞26流经传感器18时，传感器18比先前测量更多的计数事件。在时间t4，测量浓度区域C1的强烈富集的部分。

单独的浓度区域C1、C2、C3、C4的体积和相对应区段20-1、20-2、20-3的宽度b是已知的或能够容易测量的。能够借助于针对每个浓度区域C1、C2、C3、C4确立的细胞数量计算对于每个浓度区域C1、C2、C3、C4的细胞样本浓度。理想地，所述值应当是相同的。

另外，能够确立计数过程的时间t1、t2、t3或t4。因此，能够使用校准的装置来确立浓度区域C1、C2、C3、C4，当前正在计数来自这些浓度区域的细胞26。能够基于所测量的时间在校准的装置10中确定浓度区域C1、C2、C3、C4。确立的计数频率f，即标记细胞26之间的距离取决于磁力、流速和细胞浓度。计数频率f随样本的浓度降低而减小。以示例的方式，频率“f=1”、“f=2”、“f=3”和“f=4”在图6中确立。计数频率f同样能够用于确立细胞样本30的浓度。

额外地或可替代地，有可能确立持续时间t*，其中存在预定的计数频率f。持续时间t*取决于偏转装置20的相应区段20-1、20-2、20-3的选定长度a。

通过使用具有已知细胞浓度的参照样本，本领域的技术人员能够针对从所有浓度区域C1、C2、C3、C4至流速和磁力校准计数频率f或时间t1、t2、t3、t4。

在可能的校准过程中，有可能例如设定一定范围的流速。然后，当测量细胞样本30时，确立时间周期t，在该时间周期t中实施标记细胞26的限定体积且由此特定的浓度区域C1、C2、C3、C4。

根据细胞浓度，频率f在每个浓度区域C1、C2、C3、C4中在相对应时间t1、t2、t3或t4处设定。优选地对每个浓度区域进行校准。理想地，用于当前传感器的每个浓度区域被校准至1000计数事件以便获得稳定统计。

当测量具有未知浓度的所需细胞样本30时，然后能够优选地使用所述浓度区域C1、C2、C3、C4的测量，其中计数频率位于1000附近，优选地另外低于1000。

总之，本发明也能够如下进行描述：

为了定量复杂样本30内的特定颗粒（特别地，细胞），这些必须首先使用对所述细胞具有特异性的标记进行标记。所需的标记物包括例如超顺磁材料并且通过在其表面上的抗体进行修改。此标记能够特定地结合至目标颗粒。此标记步骤例如将在复杂样本30内进行并且不需要样本的后续纯化。此文中所描述的标记例如使用超顺磁标记物来产生。

借助于搅拌过程，标记能够标记样本30内的所有所针对的细胞，即100%的所针对的细胞。然而，标记也能够是部分地产生（例如1%）。在所述过程中，标记的抗体例如最初引入至通道14中并且通过外部磁场富集在通道14的一侧处。当具有颗粒或细胞的样本30随后被引入至通道14时，仅当前位于通道14的所述侧的那些细胞或颗粒达到与标记物相接触。在随机分布的情况下，能够借助于通道14的适合设计来标记特定的部份（例如1%）。所有其它颗粒均不与标记相接触。

在层流条件下通过磁力和/或机械力集中：

在所需颗粒的超顺磁标记的前提之下，例如借助于磁力（此文中显示在z方向上：参见图2A）与借助于合适结构的机械集中（y轴方向：参见图2A和2B）的组合产生富集。永磁体16或电磁体16（图2）能够定位在需要颗粒的富集的侧处。如果细胞悬浮液30被引入至通道14（图4A）中，标记细胞或颗粒26随机地分布。磁力使标记细胞或颗粒26移动至通道14的一侧（图4B），在此情况下是沿着z方向。

由于在所利用的通道14的内侧中的一个处偏转装置20的合适设计（长度a和宽度b）（图2B），有可能沿着y方向在通道球的任何位置处（此处：在y=1/2处）富集或集中细胞或颗粒26。

例如，偏转装置20能够是由例如光致抗蚀剂制成的屏障，所述偏转装置机械地引导细胞或颗粒26，或者否则它能够由铁磁性鱼骨状结构制成，其磁性地富集且集中标记细胞或颗粒26。两种方法的组合也是可能的。图5示出此类富集路径的示例。图5A以示例性方式示出在紧接着引入样本30之后标记细胞26在偏转装置20上的随机分布。图3B示出在时间t1-t3，在通道14的中间集中标记细胞26的原理。

解析10的多次幂：

如果通道高度h（图2A）在不同浓度区域C1、C2、C3、C4上根据需要变化（图2B），例如在通道14的此区域中的细胞数量同样变化。因此，有可能设定每个浓度区域C1、C2、C3、C4的限定的最小数量的细胞。此过程允许设定统计学上有意义的细胞数量。

在部分标记的情况下，高度h优选地在所有浓度区域C1、C2、C3、C4中是相同的。仅标记位于被标记的抗体（例如通过外部磁场）所拉至的侧上的层，且通过浓度区域C1、C2、C3、C4仅富集至不同程度。由于偏转装置20的自由可选择的宽度b和长度a（图2B），有可能在通道14的中心中富集样本30的限定的部分（例如在C3处的50%的通道宽度）。

确立细胞或颗粒浓度：

有可能通过测定两个参数确立样本30内的颗粒的浓度。第一参数是在集中的细胞26的x方向上的计数频率f，或以不同的方式表达的颗粒30之间的距离。计数频率f取决于磁力、流速和细胞或颗粒浓度。因此，有可能针对流速和磁力校准所有浓度区域C1、C2、C3、C4的计数频率f。第二参数是设定特定频率的时间t。额外地，其中计数特定频率f的持续时间t*提供关于当前浓度区域C1、C2、C3、C4的信息。时间t和持续时间t*取决于相应偏转装置20的选定长度a。通常，计数频率f越低，样本30的浓度越低。

校准的系统是前提。即设定使得在后续步骤中能够进行集中的、分离的细胞26的定量的一系列流速{v1；vn}。因此，有可能确立其中实施细胞样本30的限定体积且因此特定浓度区域C1、C2、C3、C4的时间周期。为了使得计数系统随后能够计数，能够校准应用至特定的计数频率f。取决于细胞或颗粒浓度，此频率f在相对应浓度区域C1、C2、C3或C4中在对应时间t1、t2、t3或t4处设定。如果针对每个浓度区域C1、C2、C3、C4实施校准，则这是有利的。因此，理想的校准使得有可能随后定量过程解析浓度区域C1-C4。理想地，浓度区域C1、C2、C3或C4的每个校准包括高达1000个计数细胞以便获得稳定统计。

确定浓度：

样本的浓度区域C1、C2、C3、C4能够通过特定的计数频率f和时间范围t来确定。从已知的几何形状和由其形成的此浓度区域C1、C2、C3、C4中的液体体积，有可能定量每个体积内的细胞或颗粒。在此时间窗中计数的细胞或颗粒使得有可能推导整个样本30中的细胞或颗粒的浓度。

在评估期间的步骤：

首先，有可能确立在什么时间t之后已经达到计数频率f。因此，有可能确立浓度区域C1、C2、C3、C4，其被校准至每次测量中1000个计数的细胞26颗粒。同样有可能确立对于这些浓度区域C1、C2、C3、C4的计数值。

细胞计数浓度测量的另一实施例能够基于图6来进行解释：存在样本30，其通过超顺磁标记物标记且具有未知浓度。由于所描述的几何参数（流速和/或磁场的强度），有可能出于理想定量的目的设定例如标记细胞26的所需频率f。图6示出的示例中，系统被校准至f=4。有可能观察到，所需频率f设置在时间t=3处。因此，这是具有浓度区域C2的样本30。如果频率f增加超出4，则计数完成，因为在时间t=4处富集区域C1中的细胞26已经被计数。

一些测量示例，其中浓度区域被校准至1000个细胞：

当校准浓度区域C1（例如其具有10微升的体积）时，利用例如具有10²个细胞/微升的参照样本。以示例的方式，从未知样本30计数300个细胞；因此，未知样本具有30个细胞/微升的浓度。

浓度区域C2的校准（1微升，参照样本的浓度：10³个细胞/微升）紧接着的是例如测量（例如）400个细胞。未知样本具有400个细胞/微升的浓度。

在校准浓度区域C3（例如0.1微升）的情况下，参照样本具有例如10⁴个细胞/微升的浓度。在未知样本30中计数200个细胞；所针对的浓度是2000个细胞/微升。

在校准浓度区域C4（例如0.01微升，参照样本的浓度：10⁵个细胞/微升）之后，在样本30中计数例如800个细胞；因此，未知样本具有80000个细胞/微升的浓度。

Claims (14)

1.一种用于流式细胞术测量的装置（10），所述装置包括室（12）和通道（14），其中所述通道（14）包括磁传感器（18）并且被布置在所述室（12）的下游且与所述室（12）一起存在于闭合系统中，其中所述通道（14）的轴线（A）沿所述通道（14）的流动方向（P）延伸，

其特征在于，

磁体（22）和偏转装置（20）布置在所述通道（14）的预定侧（S1）处，并且其中所述偏转装置（20）被分成至少一个区段（20-1、20-2、20-3）且每个区段（20-1、20-2、20-3）布置在所述通道（14）的浓度区域（C1、C2、C3）中，其中所述偏转装置（20）具有用于引导多个细胞（26）朝向所述轴线（A）的装置。

2.如权利要求1所述的装置（10），其中磁体（16）布置在所述室（12）的预定侧处。

3.如前述权利要求中任一项所述的装置（10），其中所述偏转装置（20）的至少一个区段（20-1、20-2、20-3）包括布置成与所述轴线（A）成角度的多个导向元件（24），所述导向元件（24）作为用于引导多个细胞（26）的装置，所述导向元件一起或独立地形成在所述流动方向（P）上渐缩的至少一个漏斗形状。

4.如权利要求3所述的装置（10），其中

-多个所述导向元件（24）中的至少一个形成在所述流动方向（P）上渐缩的V形，且其全部或部分地包括铁磁性材料，和/或

-多个所述导向元件（24）中的至少两个沿着所述流动方向（P）在所述轴线（A）上偏置并且由此形成朝向所述轴线（A）的机械引导。

5.如权利要求3和4中任一项所述的装置（10），其中磁性腹板（28）沿着所述通道（14）的所述轴线（A）布置。

6.如前述权利要求中的一项所述的装置（10），其中至少两个浓度区域（C1、C2、C3、C4）具有不同的构型。

7.如权利要求6所述的装置（10），其中在所述通道的（14）的预定水平（h）处的所述至少两个浓度区域（C1、C2、C3、C4）在所述预定侧（S1）与同所述预定侧（S1）相对的一侧之间是不同的。

8.如权利要求6或7所述的装置（10），其中通道宽度是恒定的并且所述至少两个浓度区域（C1、C2、C3）在所述偏转装置（20）的预定宽度（b）方面是不同的。

9.如权利要求6至8中的一项所述的装置（10），其中每个浓度区域（C1、C2、C3）特征在于所述偏转装置（20）的各自的所述区段（20-1、20-2、20-3）沿所述通道（14）的所述轴线（A）的长度（a）。

10.一种用于富集用于流式细胞术的细胞样本（30）中待检测的细胞类型的多个细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供所述待检测的细胞类型的多个磁性标记细胞（26），以及

-将多个所述标记细胞（26）富集在如权利要求1至9中的一项所述的装置（10）的所述通道（14）中，其中多个所述标记细胞（26）通过所述磁体（22）被拉至所述通道（14）的所述预定侧（S1）上，并且那里的多个所述细胞（26）中的至少一些通过所述偏转装置（20）被引导至所述轴线（A），所述轴线（A）沿所述通道（14）的所述流动方向（P）延伸，并且由此所述细胞（26）富集在所述轴线（A）上。

11.如权利要求10所述的方法，其中提供多个所述磁性标记细胞（26）包括标记多个所述细胞并且其中所述标记步骤包括以下步骤：

-在所述通道（14）中提供对于所述待检测的细胞类型具有特异性的至少一种抗体，所述抗体与至少一种磁性标记物相连接，

-使用布置在所述通道（14）的一侧（S1）处的所述磁体（22）在所述通道（14）中产生磁场，并且由此，将所述抗体富集在所述通道（14）的所述侧处，

-紧接着，将所述细胞样本（30）引入至所述通道（14）中，使所述至少一种特异性抗体与所述细胞样本的以层流方式流经所述通道（14）的所述侧（S1）的那部分相接触，并且由此标记包含在此部分中的多个所述细胞。

12.如权利要求10和11中任一项所述的方法，其中借助于所述磁传感器（18）在所述偏转装置（20）下游的所述轴线（A）上进行细胞计数。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞样本（30）的所述浓度借助于所述偏转装置（20）下游的细胞计数来确定，所述确定包括以下步骤：

-借助于所述磁传感器（18）对来自所述浓度区域（C1、C2、C3、C4）中至少一个的富集的多个所述细胞（26）进行计数，所述细胞流经所述轴线（A）上，

-对于所述浓度区域（C1、C2、C3、C4）中的至少一个，从在计数富集的所述细胞（26）时确立的所述浓度区域（C1、C2、C3、C4）的计数值、所述浓度区域（C1、C2、C3、C4）的体积以及所述偏转装置（20）的宽度（b）来确立所述细胞样本（30）的浓度。

14.如权利要求13所述的方法，其中当前正在计数所述细胞的所述浓度区域（C1、C2、C3、C4）是通过所述磁传感器（18）基于计数的确立的时间（t1、t2、t3、t4）来确立的。