CN103509848A - 用于部分标记和后续定量分析细胞悬液中细胞的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于标记细胞悬液中细胞的方法，包括下述步骤：提供一个具有正好浓集在腔室内表面上的超顺磁性标记颗粒的微流体腔室；以及将细胞悬液填充进所述腔室中。

Description

用于部分标记和后续定量分析细胞悬液中细胞的方法和装置

技术领域

本发明涉及一种用于以超顺磁颗粒对细胞悬液的细胞进行标记的方法和装置，该超顺磁标记颗粒为此特别设置有特异性抗体。

背景技术

借助不同的标记法在细胞样本中标记细胞物质，能够在复杂的细胞样本中对细胞物质进行选择并定量分析。已知的方法是，基于单个细胞的计数来实现细胞物质的定量分析。多种流式细胞术容许借助荧光标记或者电磁选择标记来定量细胞。然而，不利的是，这些方法以要测量的样本的密集处理为前提。样本的处理可以例如离心分离、过滤、沉淀等工作步骤为前提。这些工作方式经常会带来分析物的部分损耗。

其中，在已知的细胞计数方法中的基本问题是，要对细胞样本内存在的极少数量的细胞进行标记并且最后进行计数。因此，已知的方法旨在由极少量经标记的细胞生成充足的信号。

已知流式细胞术的方法的不足之处在于，其很难处理包含大量要标记细胞、例如细胞密度为10⁴个/μl的细胞样本，这主要是因为由于受体浓度较高，即大量的细胞，而需要大量的标记颗粒以便足够好地进行磁性标记。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于定量分析细胞样本的细胞的方法和装置，其避免了开头所述的问题，尤其是能够处理待测细胞的浓度相对较高的细胞样本。

上述目的通过具有权利要求1所述特征的方法得以实现。另一解决方案为权利要求9所述的装置。从属权利要求则涉及本发明的有利实施方式。

在本发明的用于标记细胞悬液的细胞的方法中，作为第一步提供微流体腔室，该微流体腔室具有主要浓集在其内表面上的超顺磁标记颗粒，其中该标记颗粒特别具有用于结合细胞的特异性抗体。作为第二步，将细胞悬液填充进所述腔室中。

由此有利地实现了标记悬浮液中细胞的精确比例。只有那些在浓集有标记颗粒的内表面的区域中流动的细胞悬液中的细胞才被标记。并未在该内表面的区域中流动的细胞就不会与标记颗粒获得任何接触，由此不会被标记。

因此，换句话说，通过这种设置实现了对一定比例的细胞进行标记、并且也基本上对该一定比例的细胞进行标记。

其中重要的是，在微流体的腔室内，由于其尺寸，主要存在的是基本为层状的流体。流动的细胞悬液的不同的层几乎不互相混合，因此，基本上只有这些紧邻设着标记颗粒的内表面的细胞得到标记。在这里，实质上涉及到的是与扩散有关的步骤：只有与标记颗粒紧靠的血小板可与其结合。自该时间点起，其开始滚动并且再吸纳更多的标记颗粒。

因此，就能够由腔室的垂直于其内表面的厚度以及细胞悬液经过标记的层厚容易地确定经标记细胞的比例。

因此，本文所述的发明能够实现在微流体系统内以超顺磁性纳米颗粒或微米颗粒受控地、部分地并且无损耗地标记小容量复杂样本内的细胞物质。在此，有利的是不需要任何稀释步骤。已经大量存在的细胞物质无需预先富集或者与其他细胞类型分离。所介绍的系统有利地简化了净化、标记复杂样本如体液或者身体分泌物中的细胞的工作步骤。

在此有利的是使用其空腔基本为长方体

的腔室。因此，通过这种简单的几何结构，特别能够很好地确定经标记细胞的比例。

另外，腔室具有在10μm至1000μm之间的厚度是有利的，其中该厚度说明了垂直于有标记颗粒浓集的内表面的延伸。在该厚度的范围内，可最好地实现层流并且同时标记一定比例的细胞，这一比例以百分比或者千分比计。通过腔室的厚度来确定该比例还可避免必须稀释细胞悬液。

为了提供微流体腔室，优选实施以下步骤：

-向微流体腔室填充含有标记颗粒的悬浮液；

-借助磁体使标记颗粒浓集在腔室的内表面上。

为此优选使用永磁体。可选地，还采用电磁体。

有利地在一个泵送步骤中将细胞悬液填充进腔室中，该步骤同时从腔室中去除了含有标记颗粒的悬浮液的残留。然后，可中断填充腔室，使得细胞悬液在一个静置时间(Standzeit)内在腔室中保持静态。例如可将一秒钟或者更短的时间选定为静置时间。静置时间例如就通过起引力作用提高了在内表面区域内经标记的细胞的比例，然而也容许细胞在腔室中扩散，由此能够标记原本并不是位于靠近内表面的标记区域内的细胞。可选地，没有中断地将细胞悬液引导通过腔室。

在两种情况下，细胞悬液均可例如被导向测量设备，以便对经标记的细胞进行计数。

在本发明的一个优选的实施方式中，在腔室之外、但在腔室内表面的区域中布置具有铁芯的线圈。该铁芯用于形成磁场，把标记颗粒吸引至内表面。由此可有利地实现标记颗粒均匀地位于内表面上，因为通过铁芯减小了磁场的不均匀性。由此就减少了标记颗粒向着腔室一端的积聚。有利的是，铁芯的朝向腔室内表面的外表面至少具有其内表面的尺寸。理想情况下，铁芯略大于微流体腔室。线圈产生的磁场有利地大于、尤其是明显大于磁体的磁场。

在本发明的一个扩展中，铁芯在朝向腔室内表面的外表面上具有凹口。这些凹口优选以规则的图案排列。在此，该凹口例如可以是平行的线条或者例如遵循正方形的线条图样。由此能够确定标记颗粒积聚的形状。

使用铁芯的备选方案是，其内表面本身还可设有凹口。由此同样减少了标记颗粒向腔室一端的积聚，因为标记颗粒被收集在凹口内并且在磁场的作用下完全无法在凹口之间移动。

附图说明

本发明的其它有利的实施方式和优势为本发明下文的实施例参照附图所说明的对象，其中，相同的附图标记表示具有同样作用的组件。其中：

图1：用于细胞测量的具有微流体系统装置图；

图2：准备进行细胞测量的微流体腔室图；

图3：具有部分经标记细胞的微流体腔室的剖面图；

图4：具有附加铁芯的装置的实施方式；

图5：具有铁芯的装置的实施方式，该铁芯具有凹口；

图6：在微流体腔室的壁上具有凹口的装置的实施方式。

具体实施方式

下面的实施例涉及到如图1所示的用于细胞测量的装置1，其中细胞密度非常高的细胞悬液中的细胞15、16经标记，然后被送入计数装置14，以进行定量分析。所述装置1具有被布置在共同载体上的永磁体12，在其表面上构成微流体系统。其中，所述微流体系统包括用于将流体导入微流体管线13中的样本导入装置18。

样本导入装置18将流体导入微流体腔室10中，在其中进行细胞的标记。其中，所述腔室10设置在永磁体上。所述微流体系统在输出端进一步通向计数装置14，在其中可对所标记的细胞进行计数。

在本实施例中，计数装置14基于磁场的探测，例如GMR、AMR或者TMR。向计数装置14输送的液体中标记细胞浓度过高会导致传感器饱和，进而导致测量误差。为此，对于所使用的细胞悬液，例如细胞密度为10⁵个/μl的细胞悬液，会使用一种特别的标记方法，其准备措施在下面借助图2进一步阐明。

在图2中示出了为细胞标记而准备微流体腔室10，在第一个步骤100中提供该准备。所述微流体腔室10可有利地借助压铸技术制成。在本实施例中，微流体腔室10的厚度D＝100μm。然而也可采用其他规格，例如D＝10μm、D＝50μm或者D＝980μm。所述微流体腔室10在其端面21上具有图2中未示出的入口和出口。该腔室的总容量在本实施例中为1μl，其中，在厚度如上所述为100μm的情况下，腔室长为10mm，高为1mm。

在第二个步骤110中，将含有超顺磁标记颗粒11的悬液导入微流体腔室10中。其中，标记颗粒11通常在悬液中没有任何特定的分布，而是先均匀地分布。另外，标记颗粒11在本实施例中具有特异性抗体。在备选的实施方式中，也可使用无抗体的标记颗粒11。

然后，在第三个步骤120中，标记颗粒11通过磁力作用，在本实施例中即通过永磁体12，朝向所述微流体腔室10的底部移动。

接着，在第四个步骤130中，将悬液-除由永磁体所保留的标记颗粒11之外-从所述微流体腔室10中除去。其中，在添加实际的分析物溶液之前，用空气来代替前面所述的标记颗粒11的溶剂。由此烘干标记颗粒11。这一步骤的持续时间可受到整个系统(由入口直到腔室)的容量的影响。在共同(gemeinsam)的步骤中，将含有最初未经标记的细胞15的细胞悬液填充进所述微流体腔室10中。在本实施例中，这是通过在微流体管线13的一端17进行抽吸来实现的，该微流体管线13由微流体腔室10经由细胞测量装置14。

当细胞悬液位于所述微流体腔室10内时，会在该处停留很短的时间、例如半秒。在这个时间内，细胞悬液中未经标记的细胞15就被基本静止地保留在微流体腔室10中，实际上并不会发生分层或者沉降。然而，这些靠近顺磁标记颗粒11的未标记细胞15会与这些顺磁颗粒结合并且由此成为经标记的细胞16。因此，经标记的细胞16仅存在于靠近微流体腔室10底部的明确的区域中。

图3示意性地示出了在用细胞悬液填充微流体腔室10时发生了什么。靠近具有标记颗粒11的内表面的部分细胞滚落在腔室内表面上，并且通常会吸收大量的标记颗粒11。因此，在几何上远离该内表面的部分细胞15基本保持未经标记的同时，向经标记的细胞16提供了大量的标记颗粒11。

在本实施例中，所有那些位于距腔室10底部5μm的区域内的未标记细胞15都可能经标记。因为可以认为几乎所有停留在该范围内的细胞15在流过所述腔室10时实际上也会经标记，因此，在简单计算下，5％的细胞15会变成经标记的细胞16。其中，为了提高精确度，也可将细胞的直径计算在内。

因为只有相对较少、但比例很好确定的细胞16经标记，所以计数装置14就能够没有任何问题地进行细胞计数并且能够推算出实际的细胞密度。

其中，所述微流体系统可有利地这样设计，使得能够容易地更换具有标记颗粒11的腔室10。因此，可通过选择标记颗粒11或腔室的几何结构使标记适合于细胞悬液的种类。

微流体腔室10在永磁体12上的布置可能带来问题：因为标记颗粒11根据磁场定向，朝向腔室10的靠近永磁体12中心44的末端积聚。为了处理这种情况，有多种可能的方案：

实施例2：

如图4中所示，在微流体腔室10的一侧上远离永磁体12布置具有铁芯的线圈41。该线圈一方面生成了磁场，该磁场通过磁场线43表示。只要该磁场在微流体腔室10的长度上是均匀的并且明显强于永磁体12的磁场，那么标记颗粒11就均匀地向着微流体腔室10的相应壁移动，即便在本实施例中微流体腔室10明显远离永磁体12的中心44布置时也如此。线圈所需要的能量取决于其与磁体的间距，因为磁力随着距离递减。通过调整与磁体的距离，能够节省能量并且例如也能够向线圈提供更低能量的电池。

实施例3：

图5示出了铁芯的实施方式：在第一种实施方式51中，铁芯具有凹口52，其中留在所述凹口52之间的、横向于微流体腔室10中的流动方向的搭接(Steg)构成了直线。标记颗粒11就向着留下的搭接移动，由此在微流体腔室10的表面上形成了直线。

在铁芯的第二种实施方式53中，铁芯具有更小的凹口54，其中留下的搭接在本实施方式53中构成了正方形的线条图样。标记颗粒11由此以正方形的图样沉积在微流体腔室10的表面上。

实施例4：

图6示出了微流体腔室10的一个可选的实施方式。在这种情况下，使用了小的线圈41。在此，取而代之的是，使微流体腔室10的表面结构化。颗粒向着永磁体12的中心44移动，但是可能由于这种表面结构而不沿着腔室表面移动。颗粒由此被固定在一定的位置上。为此，微流体腔室10的内表面具有凹槽61，在上面沉积有标记颗粒11。凹槽61沿着微流体腔室10的长度均匀地分布。

Claims (14)

1.一种用于标记细胞悬液中细胞(15)的方法，包括以下步骤：

-提供(100、110、120)微流体腔室(10)，其具有主要浓集在所述腔室(10)内表面上的超顺磁性标记颗粒(11)；

-将所述细胞悬液填充(130)至所述腔室(10)中。

2.权利要求1所述的方法，其中，使用空腔为长方体并且具有10μm至1000μm厚度的腔室(10)，其中该厚度说明了垂直于浓集有标记颗粒(11)的内表面的延伸。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述提供微流体腔室(10)包括以下步骤：

-向所述微流体室腔(10)填充含有标记颗粒(11)的悬液；

-借助磁体(12)使得标记颗粒(11)浓集在所述腔室(10)的内表面上。

4.上述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过共同的泵送步骤，将含有标记颗粒(11)的悬液从所述腔室(10)中除去并且向腔室(10)填充细胞悬液。

5.上述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过所述腔室(10)引导细胞悬液，使得在所述腔室(10)内基本上形成层流。

6.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述细胞悬液在填充进所述腔室(10)之后经过静置时间后被导向测量装置(14)。

7.权利要求6所述的方法，其中，使用少于1秒的时间作为静置时间。

8.上述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述测量装置(14)中对经标记的细胞(16)进行计数。

9.一种用于标记细胞悬液的细胞(15)的装置(1)，其被配置为用于执行上述权利要求中任一项所述的方法，该装置(1)包括：

-微流体腔室(10)，和

-用于向所述腔室(10)填充流体的手段。

10.权利要求9所述的装置(1)，其具有布置在所述腔室(10)的区域中的永磁体(12)。

11.权利要求10所述的装置(1)，具有布置在腔室(10)外部的线圈，该线圈在所述腔室(10)的内表面的区域中具有铁芯。

12.权利要求10所述的装置(1)，其中，所述铁芯在朝向所述腔室(10)内表面的外表面上具有凹口(52，54)。

13.权利要求9所述的装置(1)，其中，所述内表面具有凹槽(61)。

14.权利要求9至13中任一项所述的装置，其具有用于对经标记的细胞(16)进行计数的测量装置(14)，所述测量装置以及所述永磁体(12)和所述腔室(10)布置在共同的载体上。

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