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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen von Bindungsstärken zwischen Zellen und Liganden in trüben Lösungen.
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Die Bindungsstärke zwischen Zellen mit Rezeptoren und Liganden, bzw. Zellen mit Antigenen und Antikörpern kann mittels einer Vielzahl unterschiedlicher Methoden gemessen werden. Zu den kommerziellen Methoden, welche in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden, zählen beispielsweise die Oberflächenplasmonenresonanz, der ELISA („Enzyme Linked Immunosorbent Assay) und die Mikroskopie. Die Oberflächenplasmonenresonanz ist eine optische Methode, bei der Brechungsindices bis zu einer Tiefe von 100 nm über einem Metallfilm in Gegenwart eines Analyten gemessen werden. Der ELISA basiert auf einer enzymatischen Farbreaktion, wobei ein Antikörper mit einem Enzym markiert wird, welches beim Binden an ein Antigen die Farbreaktion auslöst.
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All diesen Methoden ist gemein, dass sie nicht, oder nur eingeschränkt, in optisch dichten Medien eingesetzt werden können. Weiterhin werden häufig definierte Probenträgermedien, beispielsweise Puffer, benötigt, um diese Messungen durchführen zu können.
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Dies hat nachteilig zur Folge, dass all diese Methoden nur in-vitro eingesetzt werden. Messungen in trüben Lösungen, beispielsweise in Vollblut, sind mit den genannten Methoden nachteiligerweise nicht möglich.
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Die Durchflusszytometrie erlaubt die Analyse von Zellen oder künstlichen Perlen, die auch als „Beads“ bezeichnet werden, die in hohem Tempo nach Möglichkeit einzeln an einer elektrischen Spannung, einem Lichtstrahl oder einem magnetischen Sensor vorbeifließen. In der Literatur ist bereits bekannt, dass mittels floreszenz-markierter Liganden Bindungsstärken mittels der Durchflusszytometrie gemessen werden können. Nachteiligerweise ist das Messen niedriger Bindungsstärken durch eine starke Hintergrundfloreszenz nur eingeschränkt möglich.
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Bindungsstärken zwischen Zellen und Liganden in trüben Lösungen zu messen und die genannten Nachteile zu überwinden.
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Die Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 genannte Verfahren gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen einer Bindungsstärke wenigstens einer Zelle mit einem Liganden umfasst das Bereitstellen eines magnetischen Durchflusszytometers mit wenigstens einem ersten Paar von magnetoresistiven Sensorelementen, wobei die Sensorelemente einen ersten Abstand von wenigstens dem 1-fachen des Zelldurchmessers aufweisen. In einem nächsten Schritt wird wenigstens ein Rezeptor der Zelle an wenigstens einen Liganden zu einem ersten Komplex gebunden, wobei die Zelle und/oder der Ligand superparamagnetische Eigenschaften aufweisen. Dieser erste Komplex, der somit auch paramagnetische Eigenschaften aufweist, wird dann über die Sensorelemente in einem Kanal geführt. Während des Führens des ersten Komplexes wird dessen Laufzeit über die Sensorelemente gemessen und ein Sensorsignal erzeugt. Basierend auf dieser Laufzeit (eng. „Time-of flight“), der Amplitude des Sensorsignals und/oder dem Integral des Sensorsignals wird die Bindungsstärke berechnet.
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Bei einem magnetischen Durchflusszytometer werden Analyte mit superparamagnetischen Eigenschaften in einer Durchflusskammer oberflächennah, insbesondere durch Abrollen, über einen magnetoresistiven Sensor transportiert. Vorteilhafterweise kann die Zelldetektion in komplexen Medien, wie beispielsweise Vollblut, vorgenommen werden. Bei Überstreichen des magnetoresistiven Sensors durch eine Zelle generiert das Streufeld der Zelle eine Widerstandsänderung, die als elektrisches Signal detektiert werden kann. Dabei werden bevorzugt zwei Widerstände, die Messwiderstände, einer Wheatstone’schen Brückenanordnung mit insgesamt vier magnetoresistiven Widerständen für eine Laufzeitmessung der Analyte, also der Zellen oder Perlen (engl. „Beads“) herangezogen. Mit Hilfe der Ergebnisse der Laufzeitmessung kann vorteilhafterweise auf die Bindungsstärke zwischen Zelle und Ligand geschlossen werden. Je mehr Liganden an die Zelle binden, umso größer ist das magnetische Moment der Zelle und desto weniger schnell fließen die markierten Zellen, d.h. desto länger ist die Laufzeit zwischen den beiden Sensorelementen. Allgemein hängt das Messen der Bindungsstärke insbesondere von folgenden zwei Faktoren ab: erstens von dem Verhältnis von Rezeptoren auf der Zelle zu Liganden und zweitens von der Inkubationszeit der Zelle mit dem Liganden. Der Rezeptor ist vorteilhafterweise ein Antigen, welches an einen Antikörper des Liganden bindet. Weiterhin sind diese Rezeptoren insbesondere Lipide, Zucker, Proteine, und DNA-Stränge.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung erfolgt das Binden des Liganden an die Zelle im Kanal. Vorteilhafterweise wird eine Probe mit der Zelle dann ohne einen Verdünnungs- oder Vorbereitungsschritt in den Kanal geführt und die Markierung erfolgt in dem magnetischen Durchflusszytometer. Es kann dann insbesondere Vollblut ohne eine Verdünnung mit Puffer, bzw. ohne Probenvorbereitung analysiert werden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird ein superparamagnetischer Ligand mittels eines externen Magnetfeldes an der der Kanalinnenwand gehalten. Vorteilhaft lassen sich die Liganden dann flächig über die Kanalinnenwand verteilt anbringen. Hierdurch erfolgt die Markierung der Zelle durch Abrollen an der Kanalinnenwand in gleichmäßiger Weise. Dies ist insbesondere für schwache Zell(bzw. Rezeptor)-Ligand Wechselwirkungen vorteilhaft.
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Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Ligand an derselben Kanalinnenwand wie die Sensorelemente angeordnet ist. Vorteilhafterweise rollt die Zelle dann zunächst über den wenigstens einen, bevorzugt aber mehrere, Liganden an der Kanalinnenwand, so dass der erste Komplex entsteht. Anschließend rollt dieser erste Komplex weiter über die beiden Sensorelemente, so dass ein Sensorsignal entsteht, woraus die Laufzeit des ersten Komplexes bestimmt wird.
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Alternativ oder zusätzlich werden in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung die Zelle und der Ligand in einer Inkubationskammer, welche in Flussrichtung gesehen vor dem Kanal liegt, aneinander gebunden. Die Inkubation kann insbesondere unter Rühren erfolgen. Die Inkubationskammer umfasst typischerweise ein Volumen von 10 bis 1000 µl. Das Verhältnis von Rezeptoranzahl auf der Zelle zu Ligand liegt für schwache Bindungen in einem Bereich von 1:10 bis 1:1000 und wird lediglich durch die Größe der magnetischen Nanopartikel sterisch limitiert. Das Verhältnis von Rezeptoranzahl auf der Zelle zu Ligand für starke Bindungen, insbesondere Avidin und Biotin, liegt in einem Bereich von 1:1 bis 1:10. Die Menge der Liganden, die an die Zelle binden, hängt insbesondere auch von der Inkubationszeit ab. Nach theoretischer unendlich langer Inkubationszeit, stellt sich ein Gleichgewicht der Liganden an der Zelle ein. Zur Verkürzung der Inkubationszeit wird typischerweise reproduzierbar nach einer festen Inkubationszeit eine Messung als Kinetikmessung durchgeführt.
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In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung und Ausgestaltung der Erfindung ist die Zelle eine erste biologische Zelle. Insbesondere ist sie eine Tumorzelle, eine Blutzelle oder eine Stammzelle. Zu den typischen Liganden zählen insbesondere monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Proteine des Komplementsystems. Weiterhin können synthetische Stoffe, deren Wechselwirkung man insbesondere mit Blut untersuchen möchte, als Liganden verwendet werden. Auch sogenannte „Biosimilars“, also „Bio-ähnliche“, können als Liganden fungieren. Diese „Bio-ähnlichen“ Stoffe sind typischerweise pharmazeutische Produkte umfassend Antikörper oder Antikörperfragmente. Die jeweiligen Zelltypen sind dabei typischerweise in ihrer nativen Umgebung gelöst, insbesondere in Vollblut, Urin oder Liquor. Für den Fall, dass die erste biologische Zelle im Labor gezüchtet wurde, ist diese insbesondere in Pufferlösung oder im Nährmedium gelöst.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Zelle eine künstliche Perle, bzw. engl. „bead“. Vorteilhafterweise können hier insbesondere Parameter wie Größe, Form und magnetische Eigenschaften definiert hergestellt werden. Dadurch ist es Möglich den Einfluss dieser Parameter auf die Laufzeit zu untersuchen. Weiterhin können diese künstlichen Perlen als Standard, insbesondere Größenstandard, zu insbesondere natürlichen biologischen Proben wie Vollblut hinzugefügt werden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst die Kanalinnenwand eine Schicht mit wenigstens der ersten und/oder einer zweiten biologischen Zelle. Insbesondere lässt sich dadurch das Abrollverhalten der ersten Zelle über natürliche Oberflächen, insbesondere vaskuläre Oberflächen, untersuchen. Die zweite Zelle in der Schicht ist insbesondere eine Tumorzelle oder eine Endothelzelle.
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Weitere Ausgestaltungsformen sowie weitere Merkmale der Erfindung werden anhand der folgenden Figuren näher erläutert. Hierbei handelt es sich um rein exemplarische Darstellungen, die keine Einschränkung des Schutzbereiches für sich genommen darstellen. Dabei zeigen:
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1 zeigt schematisch ein magnetisches Durchflusszytometer mit an einer Kanalinnenwand heftenden Liganden.
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2 zeigt schematisch das Sensorsignal über der Zeit für magnetisch markierte Zellen und deren Laufzeit.
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3 zeigt schematisch ein magnetisches Durchflusszytometer mit einer Inkubationskammer, in welcher die Liganden und Zellen vorliegen.
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4 zeigt schematisch ein magnetisches Durchflusszytometer mit einer Zellschicht auf einer Kanalinnenwand.
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5 zeigt schematisch ein typisches Messsignal über steigender Inkubationszeit oder Ligandenkonzentration.
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6 zeigt schematisch den Aufbau einer magnetischen Durchflusszytometermesszelle mit Probenzugabe.
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Das magnetische Durchflusszytometer 1 umfasst einen Kanal 5 mit einer Kanalinnenwand 6. Die Kanalinnenwand 6 umfasst ein erstes Sensorelement 7 und ein zweites Sensorelement 8 eines Sensorpaares. In diesem Beispiel sind dies GMR Sensoren. Die Kanalinnenwand 6 wird durch ein Substrat 10 gebildet. Das Substrat 10 stellt ebenfalls das Substrat 10 für die Sensorelemente 7 und 8 dar. Unterhalb des Substrats 10 ist ein Permanentmagnet 11 angeordnet.
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Durch den Kanal 5 des magnetischen Durchflusszytometers 1 fließt eine Probe mit einer biologischen ersten Zelle 2 und einer ersten künstlichen Perle 3. Diese werden im Kanal 5 magnetisch markiert, damit die Sensorelemente 7, 8 das Überrollen der Zellen (2, 3) wahrnehmen können. Zur Markierung werden die Liganden 4 an die Kanalinnenwand 6 geheftet. Dieses Anheften, bzw. Fixieren, erfolgt magnetisch. Dies ist möglich, da die Liganden 4 supermagnetische Eigenschaften umfassen. Die Liganden 4 sind flächig über die erste Kanalinnenwand 6 verteilt. Während des Überrollens der Zellen 2, 3 in Fließrichtung 9 rollen diese auf der Kanalinnenwand 6 entlang und nehmen dabei Liganden 4 auf.
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Auf der Oberfläche der ersten Zelle 2 befinden sich erste Rezeptoren 12. Diese ersten Rezeptoren 12 binden spezifisch an die Liganden 4. Auch die künstliche Perle 3 umfasst zweite Rezeptoren 13, welche an die Liganden 4 binden. Die Liganden 4 sind derart aufgebaut, dass sie einen Antikörper 19 umfassen, welcher an die jeweiligen Rezeptoren 12 und 13 binden kann. Weiterhin umfassen sie eine superparamagnetische Nanoperle 18, welche von den Sensorelementen 7 und 8 detektiert werden kann.
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Rollen diese Zellen 2, 3 nun über die Sensorelemente 7 und 8, wird ein Sensorsignal 27 erzeugt. Die Sensorelemente haben bevorzugt einen Abstand von wenigstens dem 1,5-fachen des Zelldurchmessers. Das Sensorsignal 27 zeigt 2. Dort ist ein Messsignal 20 über der Zeit t aufgetragen. Bei einer Zeit t1 rollt die erste künstliche Perle 3 über das erste Sensorelement 7. Ist die Hälfte der Strecke des Sensorelementes 7 in Fließrichtung 9 erreicht, zeigt sich dies im Sensorsignal 27 zum Zeitpunkt t2. Zum Zeitpunkt t3 rollt die erste künstliche Perle 3 über das zweite Sensorelement 8. Nach Überqueren der halben Strecke längs des Sensorelementes 8 ist Zeitpunkt t4 erreicht. Der Abstand der beiden Maxima zwischen den Zeiten t1 und t2 und den Zeiten t3 und t4 ist die sogenannte Laufzeit oder „time-of-flight“. Basierend auf dieser Zeit können Rückschlüsse auf insbesondere die Größe der ersten künstlichen Perle 3 gezogen werden. Je stärker die Bindungsstärke zwischen Ligand 4 und Rezeptor 12, 13, desto mehr Liganden 4 binden an die erste künstliche Perle 3, und desto größer wird der magnetische Moment der Perle 3 beim Abrollen im Kanal 5 sein. Ein größerer magnetischer Moment geht mit einer längeren Laufzeit über die beiden Sensorelemente 7, 8 einher. Das bedeutet, je größer die Laufzeit ist, desto größer ist das magnetische Moment der Zelle, welche über die Sensorelemente 7, 8 rollt, bei konstanter Größe der Zelle, und desto größer ist die Bindungsstärke zwischen Ligand 4 und Rezeptor 12, 13 nach einer definierten Inkubationseit. Bei einem konstanten magnetischen Moment bewegen sich große Zellen schneller durch den Kanal als kleine Zellen, das heißt größere Zellen haben in diesem Fall die kürzere Laufzeit.
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Die Wechselwirkung, insbesondere die Bindungsstärke, zwischen Rezeptor 12, 13 und Ligand 4, kann in Abhängigkeit unterschiedlicher Parameter untersucht werden. Zu diesen Parametern zählen die Ligandenkonzentration auf der Kanalinnenwand 6, die Rezeptorkonzentration auf einer künstlichen Perle 3 bzw. auf einer biologischen Zelle 2, die laminaren Fließbedingungen insbesondere Scherspannung, Scherrate und Flussrate, die Stärke des externen magnetischen Feldes, der Durchmesser der Zelle, die Temperatur der Probe und die Viskosität der Probe, insbesondere einer biologischen Probe.
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In 1 ist zu sehen, dass, zeitlich gesehen, die erste Zelle 2 nach der ersten künstlichen Perle 3 über die Sensorelemente 7, 8 rollt. Es ist möglich, das Sensorsignal 27 dieser ersten Zelle 2 mit dem der künstlichen Perle 3 zu vergleichen. Die erste Zelle 2 kann einen anderen Rezeptor umfassen als die künstliche Perle 3. Somit können Bindungsstärken unterschiedlicher Rezeptoren mit dem Ligand in einer Messung aus derselben Probe untersucht werden.
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Zusätzlich oder alternativ zu der Laufzeit können die Amplitude des Sensorsignals 27 und das Integral des Sensorsignals 27 zwischen Zeiten t1 und t2 und t3 und t4 herangezogen werden, um die Bindungsstärke zu bestimmen.
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3 zeigt schematisch ein magnetisches Durchflusszytometer 1 mit einer davor liegenden Inkubationskammer 14. Auch dieses magnetische Durchflusszytometer 1 umfasst einen Kanal 5, eine Kanalinnenwand 6, ein Substrat 10, und einen Permanentmagneten 11. Die Probe umfasst eine erste Zelle 2 und eine erste künstlichen Perle 3. Die magnetische Markierung der ersten Zelle 2 und der ersten künstlichen Perle 3 erfolgt in diesem Beispiel in einer Inkubationskammer 14, welche vor dem Kanal 5 des magnetischen Durchflusszytometers 1 angeordnet ist. In dieser Inkubationskammer 14 befinden sich die zu markierenden erste Zellen 2 oder künstlichen Perlen 3 und die Liganden 4. Die Inkubation unter Rühren erfolgt typischerweise für eine Inkubationszeit von 30 s bis 1 h. Die Inkubationskammer wird typischerweise mit Temperaturen im Bereich zwischen 4°C und 95°C betrieben. Besonders vorteilhaft für biologische Systeme ist ein Temperaturbereich von 20°C bis 40°C. Das Konzentrationsverhältnis von Rezeptor (mehrere pro Zelle) zu Ligand variiert in der Inkubationskammer von 1:10 bis 1:1000 für schwache Bindungen und von 1:1 bis 1:10 für starke Bindungen. Für den Fall, dass ein Ligand mehrere Antikörper umfasst, sind mehrere Bindungen zu einem Rezeptor möglich. Hierdurch erscheint die Bindung überproportional gestärkt.
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Die Bindungsstärke kann in diesem Beispiel wiederum in Abhängigkeit zahlreicher Parameter untersucht werden. Dazu zählen das Liganden-zu-Zellen-Verhältnis in der Inkubationskammer, die Rezeptorkonzentration auf der Zelloberfläche, die laminaren Flussbedingungen, das externe Magnetfeld, die Zellengröße, die Temperatur und die Viskosität der Probe.
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4 zeigt beispielhaft ein magnetisches Durchflusszytometer 1, auf dessen erster Kanalinnenwand 6 sich eine erste Zellschicht 16 befindet. Die erste Zellschicht 16 umfasst typischerweise Tumorzellen oder Endothelialzellen. Die erste künstliche Perle 15 ist in diesem Fall selber superparamagnetisch. Auf ihrer Oberfläche befinden sich Liganden 4. Die magnetische künstliche Perle 15 rollt in Fließrichtung 9 über die Sensorelemente 7 und 8. Aus der sich so ergebenden Laufzeit 21 kann die Bindungsstärke des Liganden 4 zu der anheftenden ersten Zellschicht 16 bestimmt werden. Diese Zellschicht 16 dient als Modell für vaskuläre Oberflächen in beispielsweise biologischen Gefäßen. Die erste Zelle 2 wurde zuvor in einer Inkubationskammer 14 mit superparamagnetischen Liganden 17 markiert. Auch aus dieser Laufzeit 21 lässt sich die Bindungsstärke der ersten Zelle 2 zur ersten Zellschicht 16 bestimmen. Die Bindungsstärke kann in Abhängigkeit der folgenden Parameter gemessen werden: Der Stärke des externen magnetischen Feldes, der Flussrate, der Rezeptordichte auf der Oberfläche der ersten Zellschicht und der Ligandenkonzentration auf einer Zelle.
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5 zeigt eine typische Ergebnisfunktion 28 mehrerer Bindungstests. In diesem Fall ist das Messsignal 20 über der Ligandenkonzentration 22 aufgetragen. Die Ligandenkonzentration ist insbesondere die Oberflächenbelegung der Zelle oder Perle mit Liganden. Eine künstliche Perle 3 hat typischerweise einen Durchmesser im Bereich von 200nm. Das Messsignal 20 ist typischerweise die Laufzeit 21. Das Messsignal 20 kann alternativ oder in einer parallelen Auswertung auch die Amplitude oder das Integral des Sensorsignals 27 darstellen. Weiterhin kann auf der X-Achse anstelle der Ligandenkonzentration 22 auch die Inkubationszeit aufgetragen sein. Die Ergebnisfunktion 28 ähnelt einer Titrationskurve. Je länger die Zelle 2, 3 mit dem Liganden 4 inkubiert wurde, bzw. je höher dadurch die Ligandenkonzentration 22 pro Zelle ist, desto höher ist das Messsignal 20, insbesondere die Laufzeit 21. Ab einer bestimmten Inkubationszeit oder Ligandenkonzentration ergibt sich ein gesättigter Bereich. Um aus diesen Messdaten die Bindungsstärke zu berechnen müssen die Konzentration der Zellen und der Liganden bekannt sein. Weiterhin muss die Geschwindigkeitskonstante des Bindens des Liganden an die Zellen bekannt sein für den Fall dass die Inkubationszeit so kurz war, dass noch kein Zustand nahe am Gleichgewicht der Reaktion vorliegt. Die Bindungsstärke kann dann insbesondere mittels kinetischer Ansätze berechnet werden.
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6 zeigt schematisch die Aufsicht auf ein magnetisches Durchflusszytometer 1. Im Kanal 5 ist die Kanalinnenwand 6 von oben zu sehen. Auf ihr befinden sich Führungselemente 24, welche die Zellen 2, 3 in die Mitte des Kanals 5 fokussieren. In Fließrichtung gesehen sind die Sensorelemente 7 und 8 nach dieser Anreicherungsstrecke angeordnet. Nach der Analyse werden die Zellen 2, 3 in einem Abfall 23 gesammelt. Weiterhin umfasst das magnetische Durchflusszytometer 1 einen Permanentmagnet 11 und das Substrat 10. Vor dem Kanal befindet sich eine Inkubationskammer 14. Diese wird aus zwei Spritzen 25, 26 heraus gefüllt. Aus einer ersten Spritze 25 werden die Liganden 4 mit magnetischen Markierungen 18 und Antikörpern 19 und aus einer zweiten Spritze 26 wird die biologische Probe mit Zellen 2, 3 zur Inkubationskammer 14 hinzugegeben. Die biologische Probe ist insbesondere Vollblut. Alternativ kann sich in dieser Spritze auch ein Standardgemisch, beispielsweise aus künstlichen Perlen mit zu untersuchenden Rezeptoren befinden. Um eine Ergebniskurve 28 nach Art einer Titrationskurve, wie in 5 gezeigt, zu erhalten, wird das Verhältnis von biologischer Probe zu magnetischen Markierungen variiert. Weiterhin wird die Inkubationszeit variiert. Je länger die Inkubationszeit ist und je höher das Verhältnis von Ligand zu Zelle, desto eher befindet sich der Messwert 20 im Bereich des Sättigungsbereichs von großen Inkubationszeiten in 5. Die Inkubationskammer 14 kann insbesondere mit einem Magnet ausgerüstet sein, um die magnetischen Markierungen in dieser Kammer zurück zu halten und lediglich die Zellen in den Kanal zu entlassen. Hierbei muss die magnetische Haltekraft durch den Rührkern gegenüber den durch die Rotation auftretenden Zentrifugalkräften aufeinander abgestimmt werden. Die Nanopartikel benötigen hierbei eine vielfach größere Zentrifugalkraft, d.h. eine schnellere Rotation des Rührkerns, als die vielfach größere Zelle mit magnetischen Partikeln, um die Inkubationskammer 14 zu verlassen. Bei einer idealen Einstellung ist es möglich, ausschließlich mit superparamagnetischen Partikeln belegte Zellen in der Flüssigkeit zu resuspendieren, während die nicht an die Zellen gebundenen magnetischen Nanopartikel am Rührkern verbleiben.
