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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Testkit mit Pankreas-Elastase-1 - spezifischen Antikörpern sowie eine neue Probenvorbereitungsvorrichtung zur Dosierung und Extraktion, welche überraschenderweise einen präziseren Nachweis von Pankreas-Elastase-1 im Stuhl erlaubt.
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Stand der Technik
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Es ist bekannt, entzündliche Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse durch qualitative und quantitative Bestimmung der Pankreas-Elastase-1 (nachfolgend auch: E1) festzustellen. Die
EP 0547059 B1 (SCHEBO TECH MEDIZINISCH-BIOLOGISCHE FORSCHUNGSGESELLSCHAFT M.B.H) beschreibt u. a. einen immunologischen Testkit, welcher Antikörper gegen die Pankreas-Elastase-1 enthält. Gemäß dieser Druckschrift kann mittels verschiedener Testkits, enthaltend Anti-Pankreas-Elastase-1-Antikörper Körperflüssigkeiten auf E1 untersucht werden. Dies gelingt beispielsweise mit Blut, Plasma, Serum, aber auch Stuhl. Derartige Tests werden seit vielen Jahren zur Untersuchung von Stuhl- und Serumproben auf E1 angewandt.
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Überraschenderweise wurde gefunden, dass ein Testkit gemäß Anspruch 1 eine deutlich präzisere Bestimmung von E1 im Stuhl erlaubt, als Testkits aus dem Stand der Technik.
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Das Testkit enthält zunächst eine Probenvorbereitungsvorrichtung, mittels der z. B. enzymatisch oder immunchemisch zu analysierende Stuhlproben, für die Analyse vorbereitet werden können.
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Die erfindungsgemäße Probenvorbereitungsvorrichtung erlaubt eine exakte Dosierung und Extraktion von Stuhlproben in einem flüssigen Reagens oder/und einem flüssigen Solvens und ist abgedichtet, so dass sie auch einem Unterdruck bei einem eventuellen Flugtransport ausgesetzt werden kann.
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Die erfindungsgemäße Probenvorbereitungsvorrichtung besteht aus einem verschließbaren Gefäß zur Aufnahme eines flüssigen Reagens oder/und flüssigen Solvens und einem Probenentnahmestab, der im Bereich eines seiner Enden auf seiner Umfangsfläche wenigstens eine Schöpfvertiefung hat und mit diesem Ende durch eine mit einer Abstreifschulter versehene Einstecköffnung des Gefäßes in das Gefäß einführbar ist. Eine derartige Probenvorbereitungsvorrichtung ist prinzipiell bereits im deutschen Gebrauchsmuster
DE2032160U1 beschrieben. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass die Form der Schöpfvertiefung einen hohen Einfluss auf die Genauigkeit der Messung hat. Die Masse des Stuhls ist sehr heterogen zusammengesetzt und er besitzt einen hohen faserigen Anteil. Die zu quantifizierende E1 befindet sich nur im schleimigen (das heisst im nicht faserigen) Anteil des Stuhls. Im faserigen Anteil des Stuhls befindet sich praktisch keine E1.
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Die zu lösende technische Aufgabe bestand daher darin, den schleimigen Anteil des Stuhls vom faserigen Anteil zu trennen. Diese Aufgabe wird technisch gelöst durch die Verwendung einer Probenvorbereitungsvorrichtung, welche gemäß der nachfolgenden Beschreibung speziell entwickelte Schöpfvertiefungen aufweist. Durch deren Verwendung wird praktisch nur der Schleimanteil des Stuhls der Extraktion zugeführt. In der Masse des Extraktes befindet sich praktisch kein Faseranteil, welcher das Ergebnis bei der Berechnung verfälschen würde. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, gehen die Erfinder davon aus, dass durch die nachfolgend beschriebene Gestaltung der Schöpfvertiefungen der Faseranteil der entnommenen Stuhlprobe auf ein Minimum reduziert wird. Da die mittels der Erfindung zu bestimmende E1 überwiegend im Schleimanteil des Stuhls enthalten ist und praktisch kaum im Faseranteil, beeinflusst ein unterschiedlicher Faseranteil die Genauigkeit in erheblicher Weise. Durch die nachfolgend beschriebene Gestaltung der Schöpfvertiefung(-en) wird der Faseranteil auf ein Minimum reduziert, so dass die Messung so präzise wie möglich durchgeführt werden kann. Zudem ist aus der Literatur bereits bekannt, dass sehr wässriger Stuhl aufgrund des Verdünnungseffektes zu verminderten Elastase 1 Konzentrationen im Stuhl führen kann (niedrige E1 Konzentrationen = pathologisches Ergebnis) durch das Probenvorbereitungssystem wird nur geeigneter Stuhl aufgenommen, dies führt zu einer optimalen Stuhl - Puffer Konzentration, die optimierte Konzentration führt zu einer höheren Präzision.
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Erfindungsgemäß wird die Schöpfvertiefung durch ein oder mehrere ringförmige oder ringsegmentförmige Ausnehmungen aus einem zylinderförmigen Probenentnahmestab gebildet. Der Probenentnahmestab hat typischerweise einen Durchmesser d von 1-2 mm. An dem Ende des Probenstabes, welches in den Stuhl gestochen wird läuft der Zylinder spitz zu (in den Figuren nicht dargestellt). An dem entgegengesetzten Ende befinden sich der Handgriff und die Verschlusselemente (in den Figuren nicht dargestellt).
Grundsätzlich kann der Probenentnahmestab eine ringförmige Ausnehmung enthalten (1). Dabei hat sich herausgestellt, dass der Winkel α zwischen der Mantelfläche des Probenentnahmestabes und der Ausnehmung in etwa rechtwinklig sein sollte. Ferner sollte der Winkel β zwischen der Ausnehmungsbasisfläche und dem Kernzylinder ebenfalls in etwa rechtwinklig sein. Die Tiefe t der Ausnehmung sollte nicht tiefer sein als 0,1 mm, die Höhe h der Ausnehmung sollte nicht höher sein als 0,5 mm. Das Gesamtvolumen einer derartigen Vertiefung sollte 20 µl nicht überschreiten.
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Es hat sich ferner herausgestellt, dass eine komplett ringförmige Ausnehmung der Schöpfvertiefung nicht optimal ist, weil der durch die Ausnehmung verbleibende Kernzylinder durch die beim Wiedereinführen des Probenentnahmestabes in das Gefäß entstehenden Kräfte leicht verbogen werden oder sogar abbrechen kann, es entsteht gewissermaßen eine Sollbruchstelle. Durch eine nicht komplett ringförmige Ausnehmung, sondern durch eine ringsegmentförmige Ausnehmung (2) gewinnt der Probenentnahmestab an mechanischer Stabilität, während gleichzeitig das Gesamtvolumen der Ausnehmung abnimmt. Das ausgenommene Ringsegment kann beispielsweise 270° (2), 180° (4) oder 90° (3) des Zylinderquerschnittes umspannen. Als optimaler Kompromiss zwischen mechanischer Stabilität des Probenentnahmestabes und Volumen der Ausnehmung hat sich ein Winkel von 180° ergeben (4).
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Das Volumen der Ausnehmung entspricht dabei natürlich dem Volumen der Probe, wenn nur eine einzige Ausnehmung realisiert wird. Sollte das gewünschte Probenvolumen größer sein als 20 µl werden zweckmäßigerweise mehrere Ausnehmungen realisiert, z.B. 2 bis 6 Ausnehmungen (siehe z.B. 5 mit 3 Ausnehmungen). Für den erfindungsgemäßen Zweck hat sich ein Probevolumen von 50 µl als optimal herausgestellt, welches durch vier Ausnehmungen zu je 12.5 µl gebildet wird.
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Die verschließbare Probenvorbereitungsvorrichtung enthält 1-2 ml einer Pufferlösung. Die Pufferlösung enthält eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einem pH Wert von 6,9-8, Tween 20 und Natriumazid < 0.05%. Um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten, ist es wichtig, dem phosphatgepufferten Extraktionspuffer das Detergenz CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1 -propansulfonat, 10 mM (Sigma) beizumischen.
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Durch die Probenvorbereitungsvorrichtung ist zudem für den Anwender eine beschleunigte und hygienischere Abarbeitung möglich; ein aufwendiger Schritt in der Abarbeitung des Testkits fällt weg, da der Stuhl nicht mehr eingewogen werden muss, sondern aufgrund der erfindungsgemäßen Geometrie der Kavitäten dosiert wird. Ein weiterer Vorteil dieser Verwendung besteht darin, dass abweichend vom bisherigen Stand der Technik nun nur noch kleinere Stuhlmengen zur Messung erforderlich sind.
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Das erfindungsgemäße Testkit enthält ferner eine Vorrichtung zur in-vitro Messung von E1 im Stuhl, wobei die Vorrichtung mindestens eine Festphase enthält an die mindestens ein Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe der bindungsfähigen Elastase 1 spezifischen monoklonalen Antikörper, „Clone 1“ gebunden ist.
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Ein besonderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen E1-spezifischen Antikörpers zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von E1. Es ist möglich, unter Verwendung des Antikörpers die Elastase 1 spezifisch in Körperflüssigkeiten und im Stuhl nachzuweisen.
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Die Erfindung betrifft daher auch einen Testkit der die erfindungsgemäßen Antikörper enthält, und zwar insbesondere immunologische Testkits zur Diagnose und zum Ausschluss einer exokrinen Pankreasinsuffizienz im Stuhl.
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Bei Versuchen zum Nachweis von E1 im Stuhl wurden indirekte, kompetitive- und Sandwich-ELISA eingesetzt. Es hat sich jedoch gezeigt, dass ein Sandwich-ELISA für die schnelle Diagnostik bei großem Probenumfang am geeignetsten ist. Hierfür sind mindestens zwei verschiedene monoklonale Antikörper nötig, die gegen unterschiedliche Epitope des Enzyms gerichtet sind. Mit solchen Tests lassen sich Enzymverschiebungen im Stuhl, insbesondere das Auftreten dieser Verschiebungen bei Veränderungen des Pankreas-Status, quantitativ nachweisen.
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Bestimmungsverfahren nach dem Prinzip des Immunoassays sind weit verbreitet. Vorteil dieser Bestimmungsmethode ist ihre Genauigkeit und Schnelligkeit (große Sicherheit und Probendurchsatz) sowie die Möglichkeit, sehr geringe Substanzmengen nachweisen zu können (im Nanogramm-Bereich). Zur Durchführung der Bestimmung sind verschiedene Verfahrensvarianten möglich, sowohl mit homogenen als auch mit heterogenen Phasen. Bei der Ausführungsform mit heterogener Phase wird einer der Rezeptoren an einen Träger gebunden. Beim Sandwich-Verfahren wird beispielsweise ein erster Antikörper als Rezeptor, bzw. als sog. Fänger oder Catcher an den Träger gebunden, die Testlösung zugegeben, wobei das in der Testlösung zu bestimmende Antigen von den Rezeptoren aus der Testlösung herausgefischt und gebunden wird. Anschließend wird ein zweiter, markierter Antikörper zugegeben, der spezifisch mit dem Antigen oder Antigen-Rezeptorkomplex reagiert. Mittels der Markierung des zweiten Antikörpers kann dann mit Hilfe einer Eichlösung (isolierte, gereinigte Human-Elastase 1) die Menge an Antigen bestimmt werden.
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In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein erster Antikörper als Rezeptor an einer Trägermatrix mit einer Membran-, Gewebs- oder Vliesstruktur derart gebunden, dass er nicht wie üblicherweise den Boden der Vertiefung einer Elisa-Immunoplatte darstellt, sondern in der Matrix gebunden vorliegt. Bevorzugte Matrizes sind mikroporöse Flachmembranen oder Hohlfaser-Mebranen, die in einer besonderen Ausführungsform mit Ionenaustauschergruppen versehen sind. Hierzu werden vorzugsweise solche mikroporösen Flachmembranen verwendet, wie sie z.B. von der Pall Corp., New Jersey, USA vertrieben werden. Die erfindungsgemäß zu verwendenden Hohlfaser-Membranen sind ebenfalls im Handel erhältlich und werden z.B. von Sepracor Inc., Ma., USA vertrieben. Mittels solcher Trägermaterialien ist es möglich besonders schnelle und unkomplizierte Nachweisverfahren bereitzustellen.
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Für dieses allgemeine Prinzip gibt es viele Variationsmöglichkeiten. So kann beispielsweise eine Bestimmung mit drei Rezeptoren erfolgen, wobei einer der drei Rezeptoren in heterogener Phase vorliegt und die anderen beiden Rezeptoren löslich sind. Einer der beiden löslichen Rezeptoren ist markiert, während der andere unmarkiert ist. Der lösliche Rezeptor ist dann gegen den nicht markierten Rezeptor gerichtet.
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Die Verwendung der erfindungsgemäßen E1 spezifischen Antikörper zur selektiven quantitativen Bestimmung von E1 nach dem Prinzip des Immunoassays erfolgt durch Inkubation mit mindestens zwei verschiedenen Rezeptoren. Beide Rezeptoren, z. B. monoklonale Antikörper, müssen spezifisch für E1 sein, welches über jeweils unterschiedliche Epitope (Bindungsstellen) gebunden werden muss.
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Einer der beiden Rezeptoren wird an eine Festphase gebunden. Die Bindung an die Festphase erfolgt in üblicher Weise und ist dem Fachmann bekannt. Weiterhin wird mindestens ein weiterer Rezeptor verwendet, der in löslicher Form vorliegt.
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Dieser weitere Rezeptor trägt eine Markierung. Werden mehrere weitere Rezeptoren R2 verwendet, so trägt nur einer von diesen eine Markierung. Die Markierung des Rezeptors erfolgt in an sich üblicher Weise und ist dem Fachmann bekannt.
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Im erfindungsgemäßen Testkit erfolgt die Markierung in an sich bekannter Weise, insbesondere durch eine radioaktive Markierung, durch eine Bindung von Biotin (Biotin/Avidin), durch ein eine meßbare Reaktion auslösendes Enzym, bzw. durch eine chemilumineszente oder fluoreszierende Verbindung. Besonders bevorzugt ist die Markierung mit einem Enzym, insbesondere mit Peroxidase oder Phosphatase. Die Markierung mit einem Enzym erlaubt in einer besonderen Ausführungsform auch, diesen Antikörper in einem zweiten Enzymamplifikationssystem einzusetzen (Stanley, C. J., Paris, F., Plumb, A., Webb, A. Johannsson, A. American Biotechnology Laboratory: May/June; 1985; Self, C. H., J. Immunol. Meth.; 1985).
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird nun entweder ein unspezifisch mit E1 bindefähiger Rezeptor oder bevorzugt ein spezifisch mit E1 bindefähiger Rezeptor an eine Festphase gebunden. Dieser an die Festphase gebundene Rezeptor wird anschließend mit der Lösung, die das zu bestimmende E1 enthalten soll und einem Antikörper inkubiert, der spezifisch mit E1 bindefähig ist, in einer löslichen Form vorliegt und eine Markierung trägt.
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Ist der an die Festphase gebundene Rezeptor ein unspezifisch mit E1 bindefähiger, so lagern sich an der Festphase nicht nur E1, sondern auch andere Antigene an. Der zweite Antikörper, der spezifisch mit E1 bindefähig ist, lagert sich jedoch nur an E1, so dass nur E1-Moleküle spezifisch einen markierten Antikörper tragen, während die anderen Antigene nicht markiert werden. Auf diese Weise ist es nach Trennung der festen von der flüssigen Phase möglich, über die Messung der Markierung den Gehalt an E1 zu bestimmen.
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Wird an die Festphase ein an E1 spezifisch bindefähiger erster Rezeptor fixiert, so wird an der Festphase spezifisch nur E1 gebunden. Bei der Inkubation mit dem löslichen, E1-spezifischen zweiten Rezeptor bzw. Antikörper reagiert auch dieser ausschließlich mit E1. Da somit praktisch keine Bindung anderer Antigene an die Festphase erfolgt, ist dieses Verfahren hoch spezifisch und erlaubt daher sehr genaue Bestimmungen. Dabei wird an der Festphase selektiv E1 gebunden, andere Antigene bleiben in Lösung. Weiterhin lagert sich an E1 der lösliche, markierte, mit E1 bindefähige Antikörper an. Nach Trennung der festen von der flüssigen Phase kann wiederum über die Markierung der Gehalt an E1 sehr genau bestimmt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird zur weiteren Erhöhung der Selektivität ein dritter Antikörper zugegeben, der gegen den zweiten Antikörper gerichtet ist und der die Markierung trägt.
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Weitere, dem Fachmann bekannte Verfahrensvarianten mit drei Rezeptoren sind ebenfalls unter Verwendung der spezifisch mit E1 bindefähigen Antikörper möglich und bedürfen hier keiner weiteren Ausführungen.
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Von den für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Antikörpern ist vorzugsweise zumindest einer ein monoklonaler Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nur monoklonale Antikörper als Rezeptoren verwendet.
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Der E1-spezifisch-bindefähige Antikörper kann entweder an die Festphase gebunden vorliegen oder aber als löslicher, markierter oder unmarkierter Rezeptor verwendet werden. Vorzugsweise ist dieser Rezeptor ein monoklonaler Antikörper. Besonders bevorzugt sind alle verwendeten Rezeptoren monoklonale Antikörper.
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Das erfindungsgemäße Verfahren sowie der Testkit sind besonders für automatisierte Analysensysteme geeignet, insbesondere für solche Systeme, die auf einem Biosensor basieren und von der Chiptechnologie Gebrauch machen.
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Beispiele:
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
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Herstellung monoklonaler Antikörper mittels gereinigter E1:
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Gereinigte menschliche E1, deren Gewinnung aus menschlichem Pankreas beschrieben ist (Sziegoleit A., Purification andCharacterization of a cholesterol binding protein from human pancreas. Biochem. J. 207:573-582;1982), wird in PBS gelöst und zu gleichen Teilen mit Freund's-Adjuvans gemischt. Jeweils 100 µg dieses Gemisches werden in 6 bis 8 Wochen alte Balb/c Mäuse i.p. und s.c. injiziert. Diese Injektionen werden zweimal im Abstand von 3 bis 4 Wochen wiederholt. Nach obengenanntem Schema mit gereinigter E1 immunisierte Mäuse erhalten 3 Tage vor der Entnahme der Milz eine i.v. Injektion von 100 µg gereinigter E1, welche in PBS gelöst ist.
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Etwa 100 Mill. Zellen von der Milz einer immunisierten Maus werden mit 50 Mill. Myelomazellen (x 63-Sp8-653, eine Zellinie, die kein Immunglobulin synthetisiert; zu beziehen bei The Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego CA 92112, USA) in Gegenwart von Polyethylenglykol (MG 3400) fusioniert. Fusionierte Zellen werden auf 8 Platten, die jeweils 24 Vertiefungen enthalten, ausgesät. Jede dieser Vertiefungen enthält 50 Mill. Milzzellen unimmunisierter syngener Mäuse in Nährmedium, welches Hypoxantin, Aminopterin und Thymidin enthält.
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Die Antikörper enthaltenden Überstände dieser fusionierten Zellen (Hybridoma) werden 10 bis 14 Tage später mittels ELISA, Westernblott, Gefrierschnitt, Paraffinschnitt bezüglich ihrer Spezifität gegen hochgereinigte, menschliche E1 getestet.
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Um monoklonale Antikörper zu erhalten, die nur gegen E1 gerichtet sind, werden Hybridomazellen, deren Überstände keine gegen andere Antigene gerichteten Antikörper enthalten, zweimal kloniert. Es werden nur Hybridomazellen kloniert, ohne AK Sezernierung, die keine Kreuzreaktion mit Pankreaselastase von Schwein und Rind zeigten.
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Hierdurch kann sichergestellt werden, dass die Einnahme von Substitutionspräparaten das Testergebnis nicht verfälscht.
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Beispiel 1
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Bestimmung von E1 im Stuhl mit monoklonalen E1-spezifischen Antikörpern.
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Es wird E1 im Stuhl mit einem ELISA bestimmt. Hierzu werden erhaltene monoklonale, E1-spezifische Antikörper, in PBS, pH 7,2 gelöst und, an Polystyrol als Träger immobilisiert. Nach einem Waschschritt wird extrahierter Stuhl, welcher E1 enthält, dazugegeben. Der Extrakt wird in einem Puffer der PBS, 5 mmol EDTA und 0,2% Tween 20 enthält, verdünnt.
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Nach einem Waschschritt in PBS, 0,2% Tween 20, wird die an den Antikörper gebundene E1 mit einem monoklonalen Antikörper, der auch E1 bindet und an den Phosphatase gekoppelt ist, der gelöst ist in PBS, das 0,2% Tween 20 enthält und einen pH von 7,2 hat, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wird durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphatdinatriumhexahydrat eine Änderung der optischen Dichte in den Reaktionsgefäßen gemessen, in denen die monoklonalen Antikörper mit E1 reagiert haben.
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Beispiel 2
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Bestimmung von E1 im Stuhl mit polyklonalen E1-spezifischen Antikörpern.
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Es wird E1 im Stuhl mit einem ELISA bestimmt. Hierzu werden erhaltene polyklonale, E1-spezifische Antikörper, in PBS, pH 7,2 gelöst und, an Polystyrol als Träger immobilisiert. Nach einem Waschschritt wird extrahierter Stuhl, welcher E1 enthält, dazugegeben. Der Extrakt wird in einem Puffer der PBS, 5 mmol EDTA und 0,2% Tween 20 enthält, verdünnt.
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Nach einem Waschschritt in PBS, 0,2% Tween 20, wird die an den Antikörper gebundene E1 mit einem polyklonalen Antikörper, der auch E1 bindet und an den Phosphatase gekoppelt ist, der gelöst ist in PBS, das 0,2% Tween 20 enthält und einen pH von 7,2 hat, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt wird durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphatdinatriumhexahydrat eine Änderung der optischen Dichte in den Reaktionsgefäßen gemessen, in denen die monoklonalen Antikörper mit E1 reagiert haben.
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Beispiel 3
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Bestimmung von E1 in Serum mit zwei verschiedenen E1-spezifischen Antikörpern
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Ein monoklonaler Antikörper, der gegen E1 gerichtet ist, wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, an einen Träger fixiert. Nach einem Waschschritt wird Serum, das E1 enthält, mit dem monokonalen Antikörper unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird die Bindung von E1 durch einen zweiten erfindungsgemäßen E1-spezifischen monoklonalen Antikörper detektiert. Dieser zweite E1-spezifische Antikörper trägt Peroxydase kovalent gebunden. Nach einem Waschschritt wird nach Zugabe von ABTS als Substrat für Peroxydase eine Änderung der optischen Dichte gemessen.
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Beispiel 4
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Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben verfahren, jedoch wird an den zweiten E1-spezifischen Antikörper statt eines Enzyms Biotin gekoppelt. Vor Substratzugabe wird dann Peroxidase-konjugiertes Avidin oder Peroxydasekonjugiertes Streptavidin zugesetzt. Die so gewählte Bestimmung von E1 erlaubt ganz spezifisch nur E1 zu bestimmen. Andere Antigene, die in der Lösung enthalten sind, stören die erfindungsgemäße Bestimmung der E1 nicht.
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Beispiel 5
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Herstellung der Probenvorbereitungsvorrichtung zur Dosierung und Extraktion
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Die Herstellung der Probenvorbereitungsvorrichtung zur Dosierung und Extraktion erfolgt wie in 6 dargestellt.
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Beispiel 6
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Herstellung des ELISA-Systems
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Die Herstellung des ELISA-Systems erfolgt wie in 7 dargestellt.
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Beispiel 7
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Testdurchführung
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Die Testdurchführung erfolgt wie in 8 dargestellt. Die wesentlichen Schritte sind:
- • Vorbereitung des Proben-/Waschpuffers
- • Stuhl mit Probenvorbereitungsvorrichtung dosieren und extrahieren Stuhlextrakt in Proben-/Waschpuffer verdünnen
- • je 50 µl Blank, Standards, positive Kontrolle und Proben als Doppelbestimmung in ELISA-Platte pipettieren - 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren - waschen
- • je 50 µl anti E1-bio-POD-Streptavidin-Komplex (gebrauchsfertig) - 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren - waschen
- • 100 µl Substratlösung (gebrauchsfertig) - 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren
- • Zugabe von 100 µl Stopplösung (gebrauchsfertig)
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Testauswertung
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Die OD-Messung erfolgt bei 405 nm in der Zeit von 5 bis 30 min. nach Zugabe der Stopplösung. Vor der Messung muss die ELISA - Platte gut geschüttelt werden. Wird gegen eine Referenzwellenlänge gemessen, sollte diese 492 nm betragen.
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Beispiel 8
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- a) Das Elastase 1 Testkit wurde mit humanen Stuhlproben mit der speziell entwickelten Probenvorbereitungsvorrichtung im Vergleich mit dem Elastase 1 Testkit mit dem herkömmlichen enthaltenen Extraktionspuffer getestet. Als Sollwert wurde der mit dem ELISA und herkömmlichen Extraktionspuffer gemessene Wert angegeben. Sämtliche Literatur über das ScheBo Elastase 1 Testkit beschreibt dieses als nicht invasiven Goldstandard der Pankreasfunktionsdiagnostik, daher wurde bei unserer Austestung auch der ScheBo E1 ELISA als Goldstandard herangezogen. Es wurde nun 10 x in den Stuhl mit dem Extraktionssystem eingestochen, der Elastase 1 Wert bestimmt und daraus der Mittelwert gebildet. Dieser Mittelwert wurde anschließend mit dem Sollwert verglichen. Die % Abweichung der Proben zum Sollwert schwankte zwischen -14 und 4 %.
Es gibt auch andere bekannte Anbieter, die solche Probenvorbereitungsvorrichtungen anbieten; dieselben Austestungen wurden mit der Probenvorbereitungsvorrichtung eines weiteren führenden Herstellers gemacht. Hierzu wurde ebenfalls 10x mit der Probenvorbereitungsvorrichtung in den Stuhl eingestochen. Die Messergebnisse sind in 10 dargestellt. Der %VarK (auch %CV) der 10 gemessenen Elastase 1 Werte schwankte zwischen 11,01 und 32,34%. Woraus sich eine % -Abweichung der Proben zum Sollwert zwischen -23 und 44% ergab. Es ist hier deutlich zu erkennen, dass die Präzision der Probenvorbereitungsvorrichtung einen sehr entscheidenden Teil zu der Testabarbeitung beiträgt. Denn die Proben, die mit der Probenvorbereitungsvorrichtung eines Mitbewerbers abgearbeitet wurden, werden niedriger verrechnet. Dies ist besonders kritisch bei Proben um den Cut-Off von 200µg/g Stuhl herum, da diese fälschlich pathologisch eingestuft/klassifiziert werden.
- b) Die beiliegenden Abbildungen (9, 10) verdeutlichen die sehr hohe Präzision der erfindungsgemäßen Probenvorbereitungsvorrichtung. Die Messungen sowohl des intra- als auch des inter-Variationskoeffizienten (VarK bzw CV)) liefern ein sehr hohe Genauigkeitsmaße. Zur Bestimmung des intra und inter VarKs wurden mit zwei Probenvorbereitungssystemen bei zwei unterschiedlichen Stuhlproben in jeder Stuhlprobe jeweils 30 mal hintereinander die mit dem System aufgenommene Menge an Stuhl gemessen. Die Probenvorbereitungsvorrichtung zeigte hier exzellente %VarK-Werte. Der intra %VarK-Wert liegt bei dem einen Röhrchen bei 2,6610 %VarK und bei dem anderen fast gleich bei 2,6440 %VarK. Der sich hieraus ergebende inter VarK zwischen beiden Röhrchen mit unterschiedlichen Stuhlproben liegt bei gerade einmal 0,3205 %VarK, was ebenso ein exzellentes Ergebnis darstellt. Die Übereinstimmung beider Röhrchen liegt somit bei 99,6795 %.
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Figurenliste
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- 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenentnahmestab mit einer ringförmigen Ausnehmung
- 2 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenentnahmestab mit einer ringsegmentförmigen Ausnehmung, umspannend 270° des Zylinderquerschnittes
- 3 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenentnahmestab mit einer ringsegmentförmigen Ausnehmung, umspannend 90° des Zylinderquerschnittes
- 4 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenentnahmestab mit einer eine ringsegmentförmigen Ausnehmung, umspannend 180° des Zylinderquerschnittes
Dabei bedeuten:
- d:
- Außendurchmesser
- d2:
- Durchmesser des durch Ausnahme der Schöpfvertiefung gebildeten Kernzylinders
- t
- Tiefe der Ausnehmung
- h
- Höhe der Ausnehmung
- α
- Winkel zwischen der Mantelfläche des Probenentnahmestabes und der Ausnehmung
- β
- Winkel zwischen der Ausnehmungsbasisfläche und dem Kernzylinder
- 5 zeigt einen erfindungsgemäßen Probenentnahmestab mit drei ringsegmentförmigen Ausnehmung, jeweils umspannend 180° des Zylinderquerschnittes.
- 6 zeigt den Ablaufplan der Herstellung der Probenvorbereitungsvorrichtung zur Dosierung und Extraktion.
Dabei bedeuten
- 1:
- Start
- 2:
- Lieferung: Entnahmestab, Konus als Abstreifschulter und Röhrchen
- 3:
- Qualitätskontrolle o.k.? (Inspektion der Dosierspitze, des Konus und des Röhrchens auf Herstellungsfehler, Staub, Flusen, Schmutz oder dergleichen. Freigabe des Materials, falls geeignet)
- 4:
- Rücksendung an Hersteller
- 5:
- Entnahmestab wird in Konus eingeführt
- 6:
- Röhrchen wird mit Extraktionspuffer gefüllt
- 7.:
- Entnahmestab mit Konus wird in Röhrchen mit Extraktionspuffer eingeführt
- 8:
- Qualitätskontrolle o.k.? (Test auf Leckagen)
- 9:
- Zurückweisung
- 10:
- Verpackung
- 11:
- Lagerung
- 12:
- Ende
- 7 zeigt den Ablaufplan der Herstellung des ELISA-Systems.
Dabei bedeuten:
- 13:
- Start
- 14:
- Beschichtung der Platten mit monoklonalem Anti-Elastase 1 Antikörper
- 15:
- Qualitätskontrolle o.k? Testung zufällig ausgewählter Platten mit Kontrollstuhlproben
- 16:
- Herstellung der Testreagentien
- 17:
- Qualitätskontrolle der Testreagentien
- 18:
- In-house Herstellung der Packungsetiketten
- 19:
- Inspektion und Herstellung der sonstigen Materialien (z.B. Folien, Flaschen, Kartons, Kappen) o.k?
- 20:
- Einfüllung der getesteten Reagentien in Fläschchen im Herstellungslabor
- 21:
- Inspektion der gefüllten und etikettierten Flaschen o.k.?
- 22:
- Verpackung der Kits und Lagerung bei 4°C
- 23:
- Qualitätskontrolle der gelagerten Kits (Quartalsweise), o.k.?
- 24:
- Stabilitätskontrolle bei 37°C, o.k.?
- 25:
- Lagerung und Versand freigegebener Kits
- 26:
- Ende
- 8.1 und 8.2 zeigen die Anwendung der Probenentnahmevorrichtung Dabei bedeuten:
- 1)
- Probenentnahmevorrichtung nach links drehen (entriegeln)
- 2)
- Probenentnahmevorrichtung herausziehen
- 3)
- Mit der Probenentnahmevorrichtung ca. 1 cm tief in die Stuhlprobe stechen (alle Schöpfvertiefungen müssen mit dem Stuhl gefüllt sein)
- 4)
- Probenentnahmevorrichtung aus dem Stuhl herausziehen
- 5)
- Probenentnahmevorrichtung durch den Konuseinsatz (Abstreifschulter) in das Röhrchen stecken und die Probenentnahmevorrichtung zum Verriegeln nach rechts drehen
- 6)
- Gut mischen (Reagenzglasschüttler)
- 7)
- Zehn Minuten extrahieren
- 8)
- Abschließend mischen Achtung! Es darf kein Stuhl mehr an der Probenentnahmevorrichtung hängen!
- 9)
- Konuseinsatz zum Öffnen des Röhrchens nach links drehen und den Konuseinsatz leicht bis zum „Knacken“ nach oben drücken
- 10)
- Konuseinsatz zusammen mit der Probenentnahmevorrichtung aus dem Röhrchen ziehen
- 11)
- Nach Absetzen der Partikel wird aus dem Röhrchen das Stuhlprobenextrakt 1:90 verdünnt: 10 µl Stuhlprobenextrakt + 900 µl Proben-/Waschpuffer 1x
Der als Abstreifschulter dienende Konuseinsatz des Röhrchens kann zur besseren Erkennbarkeit farbig eingefärbt sein (hier: rot). Die Einfärbung dient nur der leichteren Handhabbarkeit durch den Nutzer und kann auch anders ausgeführt sein. Entsprechendes gilt für die anderen Komponenten der Probennahmevorrichtung.
- 9 und 10 zeigen die Präzision bei der Stuhleinwaage. Die Erläuterungen hierzu finden sich in Beispiel 8 (s.o.).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 0547059 B1 [0002]
- DE 2032160 U1 [0006]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Stanley, C. J., Paris, F., Plumb, A., Webb, A. Johannsson, A. American Biotechnology Laboratory: May/June; 1985; Self, C. H., J. Immunol. Meth.; 1985 [0023]
