DE102011077905A1

DE102011077905A1 - Hintergrundfreie magnetische Durchflusszytometrie

Info

Publication number: DE102011077905A1
Application number: DE102011077905A
Authority: DE
Inventors: Michael Johannes Helou; Mathias Reisbeck; Sandro Francesco Tedde; Oliver Hayden
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2012-12-27
Also published as: CN103608660B; CN103608660A; EP2707691A1; US20140127710A1; WO2012175374A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie. Dabei werden magnetische Einheiten (22, 24) in einem Durchflusskanal (10) angeordnet, welcher hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Suspension in dem Durchflusskanal (10) mit laminarem Strömungsprofil (40) erzeugbar ist. Die durch die magnetischen Einheiten (22, 24) bewirkbaren (FM) und die durch den Fluss bewirkbaren Kräfte (FS) auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) bewirken, dass diese nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) im vorderen Kanalabschnitt (240) zurückgehalten werden und nicht über die Zellmesseinrichtung (20) im weiteren Verlauf des Durchflusskanals (10) fließen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie, insbesondere die magnetische Zellmessung
Im Bereich der Zellmessung und Zelldetektion sind neben optischen Messverfahren, wie Streulicht- oder Fluoreszenzmessung, auch magnetische Detektionsverfahren bekannt, bei denen die zu detektierende Zellsorte mittels magnetischer Labels markiert wird.
Insbesondere sind zur magnetbasierten Messung Verfahren bekannt, bei denen magnetisch markierte Zellen mittels Magnetophorese aus einer komplexen Zellsuspension, z. B. einer Blutprobe, aussortiert werden. Die magnetische Markierung erfolgt insbesondere dadurch, dass zellspezifische Marker in die komplexe Zellprobe eingeführt werden. Mittels Magnetophorese können magnetisch markierte Zellen oder allgemein magnetische Partikel im Durchfluss geführt, bzw. gelenkt und dadurch sortiert werden.
Für die Zellmessung in der Diagnostik und Wissenschaft ist es notwendig, dass gerade auch Zelltypen, die in nur sehr geringen Konzentrationen in einer Blutprobe vorliegen, wie beispielsweise disseminierte Tumorzellen, vermessen werden. Für die Quantifizierung von Zellkonzentrationen oder auch für einen verlässlichen Nachweis bestimmter Zellen ist daher eine Einzelzelldetektion anzustreben. Es ist bekannt, dass dafür eine vorhergehende Anreicherung der zu bestimmenden Zellen aus einer Suspension mit komplexem Hintergrund notwendig ist. Dies allein führt in den meisten Fällen jedoch noch nicht zu ausreichender Spezifität der Messung. Gerade da die magnetische Zellmessung mit einer sehr einfachen Probenvorbereitung durch Hinzufügen der zellspezifischen Marker einhergeht, stellt sich bei der magnetischen Durchflusszytometrie das Problem, dass ungebunden magnetische Marker stets ein Hintergrundsignal hervorrufen. Dieser Hintergrund führt beispielsweise zu falsch positiven Detektionssignalen.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein durch ungebundene magnetische Marker hervorgerufenes Hintergrundsignal in der magnetischen Durchflusszytometrie zu minimieren.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Ein Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie wird in Patentanspruch 9 angegeben. Ein Herstellungsverfahren für eine erfindungsgemäße Vorrichtung wird in Patentanspruch 15 angegeben. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie umfasst einen Durchflusskanal, eine erste magnetische Einheit zur Anreicherung und eine zweite magnetische Einheit zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen sowie wenigstens eine Zellmesseinrichtung. Die magnetischen Einheiten sind in einem bezüglich der Durchflussrichtung vorderen Kanalabschnitt angeordnet. Der Durchflusskanal ist hinsichtlich des Kanaldurchmessers und der Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet, dass ein Fluss einer komplexen Suspension in dem Durchflusskanal mit laminarem Strömungsprofil erzeugbar ist. Der Durchflusskanal ist weiter so ausgestaltet, dass die durch die magnetischen Einheiten bewirkbaren sowie die durch den Fluss bewirkbaren Kräften derart auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker wirken, dass diese ungebundenen magnetischen Marker im vorderen Kanalabschnitt zurückhaltbar sind. Dies hat den Vorteil, dass diese ungebundenen Marker die Zellmesseinrichtung, die sich in Flussrichtung weiter hinten im Durchflusskanal befindet, nicht erreichen. Somit werden die nicht an Zellen gebundenen Marker im vorderen Kanalabschnitt zurückgehalten und nicht über die Zellmesseinrichtung im weiteren Verlauf des Kanals fließen und so als Störkomponente eliminiert, womit das Hintergrundsignal, das durch ungebundene magnetische Marker hervorgerufen wird, vermindert wird. Dies hat den Vorteil, dass eine höhere Spezifität bei der Messung der magnetisch markierten Zellen, insbesondere eine Einzelzelldetektion gewährleistet ist.
Insbesondere ist die erste magnetische Einheit in der Vorrichtung so im vorderen Kanalabschnitt angeordnet, dass dadurch ein magnetisches Gradientenfeld erzeugbar ist, welches magnetisch markierte Zellen sowie nicht an Zellen gebundene magnetische Marker innerhalb des Durchflusskanals am Kanalboden anreichert. Die Anreicherung hat den Vorteil, die magnetisch markierten Zellen zur Messung an die Zellmesseinrichtung nahe dem Kanalboden heranzuführen und hat darüber hinaus den Vorteil, die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker an die zweite magnetische Einheit am Kanalboden heranzuführen, durch die, wie im Folgenden beschrieben wird, das Zurückhalten der ungebundenen Marker vorzugsweise begünstigt wird.
Insbesondere ist diese zweite magnetische Einheit so im vorderen Kanalabschnitt angeordnet, dass dadurch magnetisch markierte Zellen innerhalb des Durchflusskanals entlang einer Achse ausgerichtet werden, auf welcher die Zellmesseinrichtung im weiteren Verlauf des Kanals angeordnet ist. Diese Anordnung der zweiten magnetischen Einheit hat den Vorteil eine magnetophoretische Führung der magnetisch markierten Zellen vornehmen zu können, durch die die Zellen ausgerichtet und insbesondere vereinzelt über die Zellmesseinrichtung geführt werden können.
Diese zweite magnetische Einheit ist außerdem beispielsweise so am Kanalboden angeordnet, dass sie in den Durchflusskanal hineinragt. Dies hat den Vorteil, dass die magnetische Einheit zusätzlich zur magnetischen Kraft auf die magnetischen Marker, besonders die ungebundenen magnetischen Marker auch eine mechanische Behinderung des Weiterflusses dieser magnetischen Marker bewirken kann. Alternativ könnten die Führungsstreifen auch in den Kanalboden eingelassen sein, so dass diese kein mechanisches Hindernis für die Strömung darstellen. Dann jedoch muss die magnetische Haltekraft, die auf die ungebundenen Marker wirkt, höher sein oder die Durchflussgeschwindigkeit geringer, um die ungebundenen magnetischen Marker gleichermaßen zuverlässig zurückhalten zu können.
Die zweite magnetische Einheit weist insbesondere magnetische Führungsstreifen auf. Diese sind insbesondere aus einem ferromagnetischen Material. Vorzugsweise sind diese magnetischen Führungsstreifen in einem Fischgrätenmuster angeordnet. Die Führungsstreifen weisen also pfeilförmig in die Mitte des Kanalbodens. Somit werden die magnetisch markierten Zellen besonders effektiv auf diese mittlere Achse entlang des Kanalbodens ausgerichtet, wo sie dann auf die Zellmesseinrichtung zufließen. Um der Filteraufgabe gerecht zu werden, erstrecken sich die Führungsstreifen, insbesondere über die gesamte Kanalbreite.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die zweite magnetische Einheit in der Vorrichtung so ausgestaltet, dass durch diese zweite magnetische Einheit eine magnetische Kraft sowie eine zusätzliche Rückhaltekraft auf die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker bewirkbar sind, die der Scherkraft des Flusses der komplexen Suspension richtungs- und betragsmäßig entgegenwirken. Diese Ausgestaltung der magnetischen Einheit hat also den Vorteil einer Kombination zweier Kräfte auf die ungebundenen Marker, mittels derer diese entgegen der Flussrichtung im Kanal zurückgehalten werden können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Durchflusskanal der Vorrichtung hinsichtlich Kanaldurchmesser so ausgestaltet, dass Zellaggregate von mehreren Zellen, die über magnetische Marker aneinander gebunden sind, soweit in die Kanalmitte ragen können, dass durch die auf die Zellaggregate bewirkbaren Kräfte diese Zellaggregate mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit abtransportierbar sind. Diese Ausgestaltung hinsichtlich des Kanaldurchmessers birgt also den weiteren Vorteil, dass auch Zellaggregate nicht zu falschpositiven Signalen führen, da diese mit der höchsten im Kanal vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit abtransportiert werden. Insbesondere ist der Durchflusskanal hinsichtlich des Durchmessers weiter so ausgestaltet, dass von den Zellaggregaten, die in der Kanalmitte fließen, ein Abstand zur Zellmesseinrichtung, die insbesondere am oder im Kanalboden angeordnet ist, einhaltbar ist, in dem keine Detektion des Zellaggregates hervorrufbar ist. D.h. also, dass der Kanaldurchmesser so groß gewählt ist, dass die Zellaggregate von mehreren Zellen, die über magnetische Marker aneinander gebunden sind, in ausreichend weitem Abstand zur Zellmesseinrichtung an dieser vorbeifließen. Die Sensitivität eines magnetoresistiven Sensors etwa nimmt mit 1/d³ ab, wobei d für den Abstand zum Sensor steht. Die Zellmesseinrichtung ist zweckdienlicherweise mit einem magnetoresistiven Sensor realisiert. Dieser kann insbesondere ein GMR-Sensor sein (giant magneto resistance). Von Vorteil ist es mehrere Sensorelemente anzuordnen, welche z. B. Brückenelemente einer Wheatstone-Brückenschaltung sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie wird ein laminarer Fluss einer Zellprobe mit magnetisch markierten Zellen sowie nicht an Zellen gebundenen magnetischen Markern erzeugt. Des Weiteren werden die magnetisch markierten Zellen sowie die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch angereichert. Zusätzlich werden die magnetisch markierten Zellen magnetophoretisch entlang einer Achse ausgerichtet. Die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes sowie die Durchflussgeschwindigkeit werden dabei so gewählt, dass die auf nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker wirkenden Kräfte diese Marker im Fluss zurückhalten. Dies hat den Vorteil, dass jeder zurückgehaltene ungebundene Marker nicht zu einem Hintergrundsignal beitragen kann.
Insbesondere werden bei dem Verfahren die magnetischen Marker im Überschuss zu der Zellprobe gegeben. Gerade dadurch entsteht zwar das hohe Hintergrundsignal, aber auch dadurch wird erst gewährleistet, dass sehr spezifische Zellen, die etwa nur in geringer Konzentration in einer Probe vorliegen, ohne weitere Probenvorbereitung zuverlässig markiert werden und demnach selektiv detektiert werden können. Erst durch das Konzept der Herausfilterung bzw. Retardierung der überschüssigen magnetischen Marker kann eine zufriedenstellende spezifische Einzelzelldetektion in Zellproben, wie etwa Blut, realisiert werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt in dem Verfahren die Erzeugung des laminaren Flusses der Zellprobe in einem Durchflusskanal, die dynamische Anreicherung zur Kanalinnenwand des Kanalbodens hin und die magnetophoretische Ausrichtung entlang einer Achse, wobei die Achse in Flussrichtung entlang der Kanalinnenwand des Kanalbodens verläuft. Durch diesen Achsenverlauf werden die magnetisch markierten Zellen über eine Zellmesseinrichtung geführt. Die Zellprobe wird dabei so an einer magnetischen Einheit an der Kanalinnenwand des Kanalbodens vorbei geführt, dass die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker in dieser Zellprobe an eben dieser magnetischen Einheit zurückgehalten werden.
Vorzugsweise werden in dem Verfahren superparamagnetische Marker als magnetische Marker verwendet.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit so gewählt, dass die auf Zellaggregate von mehreren über magnetische Marker aneinander gebundene Zellen wirkenden Kräfte bewirken, dass diese Zellaggregate mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit abtransportiert werden. Dies hat den weiteren Vorteil, dass auch die Zellaggregate nicht zu falschpositiven Signalen führen. Insbesondere ist die Kanalmitte, in der sich die Zellaggregate bewegen, so weit von der Zellmesseinrichtung, insbesondere dem magnetoresistiven Sensor an oder in der Kanalwand, entfernt, dass das magnetische Streufeld der Marker in oder um die Zellaggregate nicht detektiert wird.
Bei dem Verfahren wird also insbesondere eine Zellprobe in eine Ausführungsform der oben beschriebenen Vorrichtung injiziert.
Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie wird die zweite magnetische Einheit zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen im Durchflusskanal am Kanalboden angeordnet und ragt insbesondere in den Durchflusskanal hinein. Dies hat den Vorteil, gegenüber einer Anordnung im Kanalboden, zusätzlich zur magnetischen Haltekraft auch eine mechanische Rückhaltekraft durch ein Strömungshindernis zu realisieren.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass durch die Retardierung ungebundener Marker zur Reduzierung des Hintergrundsignals die Einfachheit der Probenvorbereitung für die magnetische Durchflusszytometrie erhalten bleibt. Diese ist ein wesentlicher Vorteil der magnetischen Messung überhaupt. Da für eine ausreichend zuverlässige Markierung der zu detektierenden Zellen ein Überschuss an magnetischen Markern der Probe zugegeben werden muss, ist diese Reduktion des Hintergrunds für eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses von noch wesentlicherer Bedeutung. Als magnetische Marker kommen insbesondere superparamagnetische Label in Frage, die Antikörper aufweisen, über die die superparamagnetischen Label an die Isotope auf der Zelloberfläche selektiv anbinden können. An die Antikörper ist dann z. B. jeweils ein superparamagnetischer Nanopartikel angebunden. Die Nanopartikel weisen insbesondere Durchmesser zwischen 20 und 200 nm auf.
Magnetische Label sind typischerweise sehr klein. Sind diese nicht an Zellen gebunden, weisen sie hydrodynamische Durchmesser von weniger als 500 nm auf. Die einmal am Kanalboden angereicherten derart kleinen magnetischen Einheiten können daher gut über die magnetischen Kräfte retardiert werden, besonders, da am Kanalboden die geringsten Durchflussgeschwindigkeiten herrschen. Gewählte Durchflussgeschwindigkeiten liegen typischerweise unter 5 mm/s. Im Gegensatz zu den ungebundenen Markern weisen markierte Zellen oder größere Magnetbeads Durchmesser von beispielsweise 3 bis 20 µm auf, Zellaggregate weisen dementsprechend noch größere hydrodynamische Durchmesser auf. Je weiter die Partikel in den Mikrofluidikkanal hineinreichen, desto höher die Flussgeschwindigkeit und desto eher werden sie von der laminaren Strömung mitgerissen.
Die magnetische Einheit zur magnetophoretischen Ausrichtung der magnetisch markierten Zellen weist vorteilhafterweise eine fischgrätenartige Struktur auf. Derartige Strukturen haben sich als besonders effektiv erwiesen, magnetisch markierte Zellen zweidimensional an einem Kanalboden so auszurichten, dass sie entlang einer Achse vereinzelt nacheinander verlaufen und somit auch vereinzelt über eine Sensoreinheit, wie beispielsweise einen magnetoresistiven Sensor, geführt werden können. Die Zellmesseinrichtung ist beispielsweise als Wheatstone'sche Brückenschaltung ausgeführt und weist mindestens einen, insbesondere mehrere magnetoresistive Sensoren als Brückenelemente auf.
Darüber hinaus ist die fischgrätenartige Struktur nicht ungeeignet, auch ein dementsprechend mechanisches Hindernis für den Fluss der ungebundenen magnetischen Partikel darzustellen und die Retardierung dadurch noch zu unterstützen. Insbesondere bedecken die "Fischgräten" der magnetischen Einheit die gesamte Kanalbreite.
Der Durchflusskanal ist insbesondere ein Mikrofluidikkanal. Der Durchmesser des Kanals ist insbesondere auf die jeweilige Zellprobe angepasst. Je nach zu detektierender Zellart variiert der charakteristische Zelldurchmesser, der jedoch für den Einfluss des Strömungsprofils auf Zellen und Partikel der Suspension von Bedeutung ist.
Ein wesentlicher Bestandteil des Verfahrens ist also insbesondere eine gezielt dynamische Anreicherung von Zellen in einem kleinen Suspensionsvolumen. Die Anreicherung erfolgt in Richtung Mikrofluidikboden über einen externen Magneten. Die wesentlichen Parameter für die stringente Anreicherung der magnetisch markierten Zellen sind neben der Art der magnetischen Marker und deren magnetischem Streufeld, die Durchflussgeschwindigkeit sowie die Mikrofluidikdimensionierung, außerdem die Ausführung der magnetophoretischen Führungslinien, wie beispielsweise deren Winkel zur Flussrichtung und deren magnetisches Moment, sowie das externe magnetische Gradientenfeld.
Durch den vorteilhaften Einsatz einer fischgrätenartigen Magnetophorese wird eine Einzelzelldetektion gewährleistet, indem die Anreicherung in drei Dimensionen erfolgt sowie die zeitgleiche in-situ-Filterung nicht gebundener Marker aus der Suspension. Grenzbedingungen für die in-situ-Filterung sind die Rückhaltekräfte der ferromagnetischen Linien, das externe Magnetfeld sowie die Durchflussgeschwindigkeit und der hydrodynamische Durchmesser der Marker in Relation zum hydrodynamischen Durchmesser des Analyts, d.h. der magnetisch markierten Zelle oder etwa eines magnetischen Beads.
Von besonderem Vorteil ist die Kombination der magnetischen Retardierung der ungebundenen Marker mit der Filterung der Marker an den ferromagnetischen Linien, die sich insbesondere über die gesamte Breite des Kanalbodens erstrecken. Dadurch können die ungebundenen Marker an keiner Stelle an diesen mechanischen Hindernissen vorbeifließen ohne dass sie sich entgegen des externen Magnetfeldes bewegen müssen. Dadurch ist eine dynamische Filterung der ungebundenen Marker gewährleistet.
In einer alternativen Ausführungsform sind die ferromagnetischen Führungsstreifen z. B. so angeordnet, dass sie beidseitig an den Kanalwänden beginnen und schräg zur Mitte des Kanals hinlaufen, z. B. in einem Winkel zwischen 0° und 90° relativ zur Kanalwand. Dabei weisen die Führungsstreifen, insbesondere in Richtung der Durchflussrichtung. In der Mitte des Kanals berühren sich die Führungsstreifen jedoch nicht wie im Fall der Fischgrätestruktur, sondern greifen leicht versetzt ineinander.
Des Weiteren können der Magnetophorese beispielsweise noch weitere ferromagnetische Streifen als Filterstreifen vorgeschaltet sein. D.h. in Durchflussrichtung vor der Magnetophorese verlaufen ferromagnetische Filterstreifen quer über den Kanalboden von einer zur anderen Kanalwand. Diese können senkrecht oder auch in einem beliebigen Winkel zwischen 0° und 90° zu den Kanalwänden angeordnet sein.
Die beschriebene Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie hat den zusätzlichen besonderen Vorteil, dass deren Filterwirkung nach Gebrauch erneuert werden kann, indem das Zytometer regeneriert wird. Dazu kann insbesondere das externe Magnetfeld, das durch die erste magnetische Einheit hervorgerufen wird, entfernt oder ausgeschaltet werden. Zusätzlich kann eine Spülung mit einer sehr hohen Durchflussgeschwindigkeit vorgenommen werden, die die gefilterten Partikel herauswäscht.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die 1 bis 6 der angehängten Zeichnung beschrieben:
1 zeigt einen Querschnitt durch den Durchflusskanal der Vorrichtung,
2 zeigt einen Ausschnitt des Querschnitts durch den Durchflusskanal mit der Anordnung der magnetischen Führungslinien und das Flussprofil,
3 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung der magnetischen Führungslinien,
4 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung der Sensoreinheiten mit dem Durchflusskanal,
5 zeigt ein erstes Beispiel für eine Kräfteverteilung auf einen nicht gebundenen magnetischen Marker und
6 zeigt ein weiteres Beispiel für eine Kräfteverteilung auf einen nicht gebundenen magnetischen Marker.
Die 1 zeigt einen Querschnitt durch eine schematische Darstellung eines Durchflusskanals 10. Dieser weist eine obere Begrenzung und einen Kanalboden 11 auf. Auf der linken Seite ist ein Kanaleinlass 12, auf der rechten Seite ein Kanalauslass 13 gezeigt. Die Pfeile 44 zeigen die Durchflussrichtung an. Im Kanalboden 11 sind zwei Rechtecke eingezeichnet, die die Zellmesseinrichtung, d.h. die Magnetsensoren 20 darstellen. Unterhalb des Kanalbodens 11 ist entlang der gesamten Kanallänge ein Permanentmagnet 22 gezeichnet. Dieser kann aber auch nur die halbe Länge betragen und sich nur auf den vorderen linken Kanalabschnitt beschränken. Im Kanal 10 sind ellipsenförmig die Zellen 30, 32 gezeichnet. Dabei werden in der Zeichnung nicht markierte Zellen 30 von markierten Zellen 32 durch unterschiedliche Schraffur unterschieden. Nur die magnetisch markierten Zellen 32 erfahren eine magnetische Kraft in dem Gradientenfeld durch den Permanentmagneten 22 und werden am Kanalboden 11 angereichert, so dass sie sich nahe über den Magnetsensor 20 hinweg bewegen. Alle anderen Zellen 30 bewegen sich wesentlich weiter vom Kanalboden 11 entfernt über den Sensor 20 hinweg. Je nach Durchflussgeschwindigkeit 41, Kanaldurchmesser und magnetischem Moment der Zellmarkierung 26 muss die Länge der Anreicherungsstrecke 240 und somit auch die Länge des Permanentmagneten 22 unterhalb des Durchflusskanals 10 gewählt werden um möglichst alle magnetisch markierten Zellen 32 aus der Suspension am Kanalboden 11 anzureichern. Bei der gezeigten Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie geht es also um eine dynamische Messung, der auch eine dynamische Anreicherung der Zellen 32 vorausgeht. Die dynamische Messung in Kombination mit der dynamischen Anreicherung und der einfachen Probenvorbereitung, die im Wesentlichen nur darin besteht, dass der Zellprobe die magnetischen Marker 26 zugesetzt werden müssen, ist einer der großen Vorteile der magnetischen Durchflusszytometrie im Gegensatz zu anderen Messmethoden der Zelldiagnostik, wie etwa der Fluoreszenzdurchflusszytometrie.
In der 2 ist ein Ausschnitt des Querschnitts durch den Durchflusskanal 10 gezeigt. Auf der linken Seite ist schematisch das Flussprofil 40 eingezeichnet. Bei einer laminaren Kanalströmung 40 stellt sich ein im Wesentlichen parabelförmiges Profil ein. Die Pfeile 41 stehen für die Fließgeschwindigkeiten, die sich von der Mitte zum Rand des Kanals 10 hin verringern. Die höchste Durchflussgeschwindigkeit 41 herrscht also im Kanalzentrum vor.
Im linken Bereich des Kanalabschnitts ist die sogenannte Anreicherungs- und Ausrichtungsstrecke 240 gezeigt. Diese ist also in Flussrichtung 44 vor den Detektionsbereich 20 geschaltet. In diesem vorderen Kanalabschnitt 240 sind also die magnetischen Einheiten, der Permanentmagnet 22 sowie die magnetischen Führungslinien 24 angeordnet. Die magnetischen Führungslinien 24 sind insbesondere ferromagnetische Metallstreifen, z. B. aus Nickel. In der 2 sind diese Streifen 24 so auf den Kanalboden 11 aufgesetzt, dass sie in den Durchflusskanal 10 hineinragen. In Durchflussrichtung 44 nach diesem vorderen Kanalabschnitt 240 sind die Magnetsensoren 20 gezeigt, über die die magnetisch markierten Zellen 32 geführt werden.
Die magnetisch markierten Zellen 32 sind wieder schraffiert dargestellt. Es ist jedoch zu unterscheiden, ob es sich um eine sozusagen korrekt magnetisch markierte Zelle 32 handelt, die mehrere magnetische Marker 26 aufweist und sich als einzelne markierte Zelle 32 in der komplexen Suspension bewegt oder ob sich Zellen 30 fälschlicherweise an einen einzelnen magnetischen Marker 26 anhängen und über diesen agglomerieren. Ein derartiges Agglomerat von mehreren Zellen 34, die über magnetische Marker 26 aneinandergebunden sind, weist einen wesentlich größeren hydrodynamischen Durchmesser auf als eine einzelne markierte Zelle 32. Dies ist entscheidend für das unterschiedliche Fließverhalten von einzelnen Zellen 32 und Zellaggregaten 34. Durch den wesentlich größeren hydrodynamischen Durchmesser weist ein solches Aggregat 34 immer sehr viel weiter in die Kanalmitte hinein, wo die höhere Durchflussgeschwindigkeit 41 vorherrscht. Von dieser hohen Durchflussgeschwindigkeit 41 werden die großen Aggregate 34 mitgerissen und somit vom Kanalboden 11 wieder weiter entfernt, so dass sie in einem zu weiten Abstand 200 vom Sensor 20 an diesem vorbeifließen und daher nicht detektiert werden können. Dies schließt also falschpositive Signale durch Zellagglomerate 34 aus. Somit kann also durch Parameter wie den Durchflusskanaldurchmesser und das Durchflussprofil 40 bzw. die Durchflussgeschwindigkeit 41 die Zellmessung spezifiziert werden. Die Sensitivität des Sensors 20 nimmt mit 1/d³ ab, wobei d für den Abstand vom Sensor steht.
Das bei der Messung störende Hintergrundsignal wird im Wesentlichen durch nicht gebundene Marker 26 verursacht, die im Überfluss der Zellprobe zugegeben werden um eine vollständige Markierung aller zu detektierenden Zellen 32 in der Probe zu gewährleisten. Bei den magnetischen Markern 26 handelt es sich beispielsweise um superparamagnetische Label, welche über Antikörper an Isotope auf der Zelloberfläche anbinden. Bei den Magnetsensoren 20 handelt es sich beispielsweise um GMR-Sensoren, wobei GMR für Giant Magneto Resistance steht.
Die 2 zeigt schematisch das Filterprinzip der Vorrichtung. Die kleinen ungebundenen Marker 26 weisen nur sehr kleine hydrodynamische Durchmesser auf und nähern sich durch die magnetische Anreicherung nahe dem Kanalboden 11 an. Dort können sie von den ferromagnetischen Streifen 24 sozusagen aus dem Fluss gefiltert und aufgehalten werden. Dabei wirken die ferromagnetischen Streifen 24 zunächst als mechanisches Hindernis im Durchfluss. Die magnetischen Marker 26 müssten sich entgegen des magnetischen Gradientenfeldes des Permanentmagneten 22 bewegen um sich aus dem Magnetfilter zu befreien. Zusätzlich herrschen auch magnetische Haltekräfte F_M an diesen ferromagnetischen Streifen 24 vor, die die magnetischen Marker 26 retardieren. Die Filtration ist also eine Kombination eines Magnetkraft- F_M und eines Scherkraftfilters F_S.
Die 3 zeigt nun eine Draufsicht auf den in 2 gezeigten Kanalausschnitt. Die Durchflussrichtung 44 ist wieder mit einem Pfeil gekennzeichnet. Im vorderen, d.h. in Durchflussrichtung vorderen Bereich des Kanals 10 ist wieder die Anreicherungsstrecke 240 gezeigt. In diesem Bereich verlaufen die ferromagnetischen Führungslinien 24 für die magnetophoretische Anreicherung und Ausrichtung der magnetisch markierten Zellen 32. Die magnetischen Führungslinien 24 sind in einem besonders vorteilhaften Fischgrätenmuster angeordnet, welches von den Kanalwänden 14 zur Kanalmitte hin spitz zuläuft. Dabei ist es von besonderem Vorteil für einen effektiven Filter für die ungebundenen magnetischen Marker 26, dass die magnetischen Führungsstreifen 24 die komplette Kanalbreite 100 abdecken und keine Lücke offenlassen. Auch der Permanentmagnet 22, der in der Figur nicht explizit gezeigt ist, da er sich unterhalb des Kanalbodens 11 befindet, erstreckt sich insbesondere über die gesamte Kanalbreite 100, so dass auf der gesamten Kanalbreite 100 ein gleichförmiges Gradientenfeld auf die magnetischen Partikel 26 in der Suspension wirkt. Besonders vorteilhaft ist es wenn sich der Permanentmagnet 22 über die Kanalbreite 100 hinaus erstreckt, beispielsweise bis zu der gestrichelten Linie, die in der Kanalwand 14 verläuft, so dass dieser innerhalb des Kanals 10 ein gleichmäßiges Gradientenfeld hervorruft.
Des Weiteren ist in der 3 eine zentral verlaufende magnetische Führungslinie 24 gezeigt, die die Kanalmitte markiert, und die als die beschriebene Achse angesehen werden kann, auf die die magnetisch markierten Zellen 32 ausgerichtet werden. In gedanklicher Verlängerung dieser Achse befinden sich dann im Durchflusskanal 10 die Magnetsensoren 20, über die die magnetisch markierten Zellen 32 fließen. Die Figur 3 zeigt auch unmarkierte magnetische Zellen 30, welche von den magnetischen Maßnahmen unbeeinflusst sind.
Anstelle magnetisch markierter Zellen 32 können auch Magnetbeads auf diese Weise angereichert und ausgerichtet werden. Auch andere Analyte die magnetisch markiert werden können, kommen für eine derartige Messmethode in Frage.
Auch in der Fluoreszenzdurchflusszytometrie werden in der Probenvorbereitungsphase fluoreszente Marker im Überfluss zugegeben, welche dann durch Zentrifugations- und Waschschritte dekantiert werden müssen. Derartige Schritte sind für die magnetische Durchflusszytometrie nicht notwendig, wenn die Parameter der magnetischen Einheiten sowie des Durchflussverhaltens auf die Größe der zu detektierenden magnetischen Zelle geeignet eingestellt werden.
Die 4 schließlich zeigt die Anordnung der magnetischen Sensoreinheit mit den magnetoresistiven Elementen 20, die in einer Wheastone'schen Brückenschaltung miteinander verbunden sind. Dabei sind auch die elektrischen Zuleitungen 21 zu den Magnetowiderständen 20 gezeigt. Der Pfeil zeigt wieder die Durchflussrichtung 44 durch den Durchflusskanal 10 an.
Die 5 und 6 schließlich sollen noch schematisch die auf den nicht gebundenen magnetischen Marker 26 wirkenden Kräfte darstellen. Dafür ist lediglich ein Ausschnitt des Kanalbodens 11 mit einem ferromagnetischen Streifen 24 gezeigt. In der 5 ist ein magnetischer Marker 26 mit einem Antikörper und einem magnetischen Partikel gezeigt, der über die magnetische Haltekraft F_M am Kanalboden 11 gehalten wird verursacht durch den ferromagnetischen Streifen 24 zusammen mit dem Gradientenfeld des Permanentmagneten 22, der sich unterhalb des Kanalbodens 11 befindet. Diese magnetische Kraft F_M wirkt auf den magnetischen Marker 26 senkrecht in Richtung Kanalboden 11, und hält diesen an dem Streifen 24 fest. Auf den magnetischen Marker 26 wirken aber auch die Scherkräfte des Flusses der komplexen Suspension F_S. Diese greifen parallel zum Kanalboden 11, also in Flussrichtung 44, an. Die magnetischen Haltekräfte F_M müssen daher größer als die Scherkraft F_S sein um den magnetischen Marker 26 festzuhalten.
Die 6 zeigt schließlich, dass auch die Anordnung des ferromagnetischen Streifens 24 am Kanalboden 11 zur Filterwirkung beiträgt. Der ferromagnetische Streifen 24 ragt in den Durchflusskanal 10 so hinein, dass sich magnetische Marker 26 in Flussrichtung 44 hinter den ferromagnetischen Streifen 24 verfangen können. Dort wirkt die magnetische Kraft F_M des Permanentmagneten 22, der sich unterhalb des Kanalbodens 11 befindet, senkrecht zum Kanalboden 11 auf den magnetischen Marker 26. Die angreifende Scherkraft F_S des Durchflusses 44 der komplexen Suspension hat so schon eine geringere Angriffsfläche des magnetischen Markers 26 zur Verfügung. Zusätzlich bietet der ferromagnetische Streifen 24 ein Strömungshindernis, was eine zusätzliche Rückhaltekraft F_R für den magnetischen Marker 26 bedeutet.
In einem Fluidikkanal 10 von 0,105 µm² Querschnittsfläche bei einer Durchflussrate von etwa 1 µl/s beträgt die Durchflussgeschwindigkeit 41 in etwa 1500 µm/s und die komplexe Suspension überstreicht die Magnetsensoren 20. Die Nickelstreifen 24 halten die magnetischen Nanobeads 26 zurück. Nach der Messung soll das Nickelstreifensystem 24 von diesen Nanobeads 26 wieder befreit werden. Dazu wird der Durchflusskanal 10 z. B. mit einer Durchflussrate von 4 µl/s gespült. Dann bewegen sich auch die ungebundenen magnetischen Nanobeads 26 aus dem Filter 24 durch den Kanal 10 hindurch. Zusätzlich zur höheren Durchflussrate kann dazu das externe Magnetfeld minimiert oder ausgeschalten werden.
Die 7 schließlich zeigt noch eine alternative Ausführungsform des Kanals 10 mit versetzten ferromagnetischen Führungsstreifen 24, die sich in der Mitte des Kanals 10 nicht berühren, sondern wie ein Reißverschluss ineinandergreifen. Auch diese sind bevorzugt in einem Winkel um die 45° zu den Kanalwänden 14 angeordnet und weisen in Richtung der Durchflussrichtung 44. Der Magnetophorese 240, unabhängig von der genauen Ausgestaltung, kann noch ein zusätzlicher Filter 250 vorangehen. Dieser ist also in Durchflussrichtung 44 weiter vorne im Kanal 10 angeordnet, in der 7 weiter links. Dazu verlaufen ferromagnetische Streifen 25 quer über den Kanalboden 11 von einer bis zur anderen Kanalwand 14. Diese sind insbesondere senkrecht oder in einem Winkel zwischen 0° und 90° zu den Kanalwänden 14 angeordnet.

Claims

Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie mit – einem Durchflusskanal (10), – einer ersten magnetischen Einheit (22) zur Anreicherung und – einer zweiten magnetischen Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) sowie – wenigstens einer Zellmesseinrichtung (20), wobei die magnetischen Einheiten (22, 24) in einem bezüglich der Durchflussrichtung (44) vorderen Kanalabschnitt (240) angeordnet sind und der Durchflusskanal (10) hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Suspension in dem Durchflusskanal (10) mit laminarem Strömungsprofil (40) erzeugbar ist, so dass die durch die magnetischen Einheiten (22, 24) bewirkbaren (F_M) und die durch den Fluss bewirkbaren Kräfte (F_S) derart auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) wirken, dass diese nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) im vorderen Kanalabschnitt (240) zurückhaltbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die erste magnetische Einheit (22) so im vorderen Kanalabschnitt (240) angeordnet ist, dass dadurch ein magnetisches Gradientenfeld erzeugbar ist, welches magnetisch markierte Zellen (32) sowie nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) innerhalb des Durchflusskanals (10) am Kanalboden (11) anreichert.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die zweite magnetische Einheit (24) so im vorderen Kanalabschnitt (240) angeordnet ist, dass dadurch magnetisch markierte Zellen (32) innerhalb des Durchflusskanals (10) entlang einer Achse ausgerichtet werden, auf welcher die Zellmesseinrichtung (20) im weiteren Verlauf des Durchflusskanals (10) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) am Kanalboden (11) angeordnet ist, insbesondere so dass sie in den Durchflusskanal (10) hineinragt.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) magnetische Führungsstreifen aufweist, insbesondere ferromagnetische Führungsstreifen, wobei sich die magnetischen Führungsstreifen über die gesamte Breite des Kanalbodens erstrecken.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) so ausgestaltet ist, dass durch diese zweite magnetische Einheit (24) eine magnetische Kraft (F_M) sowie eine zusätzliche Rückhaltekraft (F_R) auf die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) bewirkbar sind, die der Scherkraft (F_S) des Flusses der komplexen Suspension richtungs- und betragsmäßig entgegen wirken.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Durchflusskanal (10) hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) so ausgestaltet ist, dass Zellaggregate (34) von mehreren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30) so weit in die Kanalmitte ragen können, dass durch die auf die Zellaggregate (34) bewirkbaren Kräfte (F_M, F_S) diese Zellaggregate (34) mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit (41) abtransportierbar sind.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Durchflusskanal (10) hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) so ausgestaltet ist, dass von Zellaggregaten (34) von mehreren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30), die in der Kanalmitte fließen, ein Abstand (200) zur Zellmesseinrichtung (20) einhaltbar ist, in dem keine Detektion des Zellaggregates (34) hervorrufbar ist.
Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie bei dem – ein laminarer Fluss einer Zellprobe (40) mit magnetisch markierten Zellen (32) sowie nicht an Zellen gebundenen magnetischen Markern (26) erzeugt wird, – die magnetisch markierten Zellen (32) sowie die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch angereichert werden, – die magnetisch markierten Zellen (32) magnetophoretisch entlang einer Achse ausgerichtet werden, wobei die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit (41) so gewählt werden, dass die auf nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) wirkenden Kräfte (F_M, F_S) diese im Fluss zurückhalten.
Verfahren nach Anspruch 9 bei dem die magnetischen Marker (26) im Überschuss zu der Zellprobe gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 bei dem – die Erzeugung des laminaren Flusses der Zellprobe (40) in einem Durchflusskanal (10) erfolgt, – die dynamische Anreicherung zur Kanalinnenwand des Kanalbodens (11) hin erfolgt und – die magnetophoretische Ausrichtung entlang einer Achse erfolgt, wobei die Achse in Flussrichtung (44) entlang der Kanalinnenwand des Kanalbodens (11) verläuft, so dass die magnetisch markierten Zellen (32) entlang dieser Achse über eine Zellmesseinrichtung (20) geführt werden, wobei die Zellprobe (40) so an einer magnetischen Einheit (24) an der Kanalinnenwand des Kanalbodens (11) vorbeigeführt wird, dass die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) an dieser magnetischen Einheit (24) zurückgehalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, in dem als magnetische Marker (26) superparamagnetische Marker verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit (41) so gewählt werden, dass die auf Zellaggregate (34) von mehreren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30) wirkenden Kräfte (F_M, F_S) bewirken, dass diese Zellaggregate (34) mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit (41) abtransportiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13 bei dem eine Zellprobe in eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 injiziert wird.
Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei dem die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) im Durchflusskanal (10) am Kanalboden (11) angeordnet wird, insbesondere so dass sie in den Durchflusskanal (10) hineinragt.