EP2707691A1 - Hintergrundfreie magnetische durchflusszytometrie - Google Patents

Hintergrundfreie magnetische durchflusszytometrie

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EP2707691A1
EP2707691A1 EP12727846.3A EP12727846A EP2707691A1 EP 2707691 A1 EP2707691 A1 EP 2707691A1 EP 12727846 A EP12727846 A EP 12727846A EP 2707691 A1 EP2707691 A1 EP 2707691A1
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EP
European Patent Office
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magnetic
channel
flow
cell
markers
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12727846.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver Hayden
Michael Johannes HELOU
Mathias Reisbeck
Sandro Francesco Tedde
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens AG
Original Assignee
Siemens AG
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Publication date
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    • Y10T29/494—Fluidic or fluid actuated device making

Definitions

  • the present invention relates to flow cytometry, in particular magnetic cell measurement
  • magnetically marked cells by magnetic resonance from a complex cell suspension, eg. B. a blood sample can be sorted out.
  • the magnetic marker he ⁇ follows particular by cell-specific markers are introduced into the complex cellular sample.
  • magnetophore magnetically marked cells or generally magnetic particles can be guided in flow, or directed and thereby sorted.
  • the object is achieved by a device according to claim 1.
  • a method for magnetic flow cytometry is specified in claim 9.
  • a manufacturing method for a device according to the invention is specified in claim 15.
  • Advantageous embodiments of the invention are the subject of the dependent claims.
  • the inventive device for magnetic flow cytometry includes a flow passage, a first magneti ⁇ specific unit for the enrichment and a second magnetic unit for alignment of magnetically labeled cells and at least one cell measuring means.
  • the magnetic units are arranged in a forward channel section with respect to the direction of flow.
  • the flow channel is respects ⁇ Lich the channel diameter and the surface finish of the passage internal wall designed such that a flow of a com plex ⁇ suspension in the flow channel in laminar currents is mung profile generated.
  • the flow channel is further designed so that the units be by the magnetic ⁇ wirkbaren and be brought about by the flow forces acting on such cells not bound to magnetic markers, that this unbound magnetic markers in front Ka nalabites are retainable.
  • This has the advantage that these unbound markers do not reach the cell measuring device, which is located further downstream in the flow channel.
  • the non-bound cells markers in the front channel portion are retained and do not flow through the cell measuring means in the further course of the channel and so eliminated as a noise component, whereby the Hin ⁇ background signal, which is pre-call ⁇ by unbound magnetic markers forth, is reduced.
  • This has the advantage that a higher specificity in the measurement of the magnetically labeled cells, in particular a single cell detection is ensured.
  • the first magnetic unit in the front ⁇ direction is arranged in the front channel section that there ⁇ by a magnetic gradient field can be generated, which enriches magnetically marked cells and not bound to cells magnetic marker within the flow channel at the channel bottom.
  • the enrichment has introduce the advantage that the magnetic ⁇ table labeled cells for measurements on the cell measuring means close to the channel floor and also has the advantage to bring the magnetic marker of the second magnetic unit is not bound to cells at the channel bottom, through which, as is described below, the retention of the unbound markers is preferably favored.
  • this second magnetic unit is arranged whose channel portion in the upstream, that magnetically characterized mar ⁇ kêt cells are aligned within the flow passage along an axis on which the measurement cell means is disposed in the further course of the channel.
  • This ⁇ An arrangement of the second magnetic unit has the advantage to be able to make a magnetophoresis guide the magnetically-labeled cells through the aligned cells, and can be performed in particular isolated over the cell measuring means.
  • This second magnetic unit is also arranged, for example, at the channel bottom so that it projects into the flow channel. This has the advantage that the magnetic ⁇ A uniform, in addition to the magnetic force on the magnetic marker, particularly the unbound magnetic markers also cause a mechanical obstruction of the flow of these magnetic Next ⁇ tables marker.
  • the guide strips could also be embedded in the channel bottom so that they do not present a mechanical obstacle to the flow. put. Then, however, the magnetic holding force acting on the unbound markers may be higher or the flow rate must be less, NEN to gron- hold back the unbound magneti ⁇ rule markers equally reliable.
  • the second magnetic unit has in particular magnetic guide strips. These are in particular made of a ferromagnetic material. Preferably, these magnetic guide strips are arranged in a herringbone pattern.
  • Guide strips thus have arrow-shaped in the middle of the channel bottom.
  • the magnetically marked cells are particularly effectively aligned on this central axis along the channel ⁇ floor, where they then flow to the cell measuring device.
  • the guide strips extend, in particular over the entire Ka ⁇ nalbreite.
  • the second magnetic unit in the device is madestal ⁇ tet, that by this second magnetic unit Magne ⁇ tical force and an additional restraining force on the not bound to cells magnetic markers are effected, the shearing force of the river Counteract the direction and amount of the complex suspension.
  • This Ausgestal ⁇ tion of the magnetic unit thus has the advantage of a combination of two forces on the unbound markers, by means of which they can be retained against the flow direction in the channel.
  • the flow channel of the device in terms of channel diameter is designed so that cell aggregates of several cells that are bound to each other via magnetic markers can protrude into the middle of the channel that caused by the cell aggregates forces these cell aggregates with the in the middle of the channel prevailing flow rate can be transported away.
  • This embodiment in terms of Channel diameter thus has the further advantage that even cell aggregates do not lead to false positive signals, as they are transported away with the highest prevailing in the channel flow rate.
  • the flow passage is designed in terms of the diameter farther from ⁇ that a distance to the cell measuring means, which is arranged in particular on or in the channel bottom, is maintainable by the cell aggregates that flow in the channel center where no detection of the cell unit be brought about.
  • the channel diameter is chosen so large that the cell aggregates of a plurality of cells, which are bound to each other via magnetic Mar ⁇ ker, at a sufficiently distant distance from the cell measuring device past this.
  • the sensitivity of a magnetoresistive sensor decreases with 1 / d 3 , where d stands for the distance to the sensor.
  • the cell measuring device is expediently realized with a magnetoresistive sensor. This can be in particular a GMR sensor (giant magneto resistance). It is advantageous to arrange several sensor elements, which z. B. bridge elements of a Wheatstone bridge circuit.
  • a laminar flow of a cell sample with magnetically marked cells and non-cell-bound magnetic markers is produced. Furthermore, the magnetically-labeled cells and the non-cell-bound magnetic markers are dynamically enriched in a magnetic gradient field. In addition, the magnetically labeled cells are magnetophorically aligned along an axis. The magnetic field strength of the magnetic Gradientenfel ⁇ of the well as the flow rate are thereby so- ⁇ selected so that the forces acting on cells not bound to magnetic markers forces retain these markers in the river. This has the advantage that any retained unbound markers can not contribute to a background signal.
  • the method adds the magnetic markers in excess to the cell sample. This is precisely what Although there is the high background signal, but also this is only guaranteed that very specific cells, which are present in about a low concentration in a sample can be reliably marked without further sample preparation and therefore can be selectively detected. Only through the
  • the method results in the generation of the laminar flow of the cell sample in a flow channel, the dynamic enrichment to the channel inner wall of the channel bottom and the magnetophore alignment along an axis, wherein the axis in
  • Flow direction along the channel inner wall of the channel bottom ver ⁇ runs. This axis course guides the magnetically marked cells over a cell measuring device. The cell sample is guided past a magnetic unit on the channel inner wall of the channel bottom so that the magnetic markers not bound to cells in this cell sample are retained at this same magnetic unit.
  • superparamagnetic markers are used as magnetic markers in the process.
  • the magnetic field strength of the magnetic gradient and the flow rate are chosen so that at the cell aggregate from several magnetic markers bound to each cell forces cause these Zellag ⁇ aggregates with prevailing in the channel center flow ⁇ speed be transported away.
  • the channel center, in which the cell aggregates move so far from the cell measuring device, in particular the magnetoresistive sensor on or in the channel wall, removes the fact that the stray magnetic field of the markers in or around the cell aggregates is not detected.
  • a cell sample is injected into an embodiment of the device described above.
  • the second magnetic unit for aligning magnetically marked cells is arranged in the flow channel at the channel bottom and projects in particular into the flow channel.
  • a particular advantage of the present invention is that the delay of unbound markers to reduce the background signal preserves the simplicity of sample preparation for magnetic flow cytometry.
  • magnétique markers which have antibodies via which the superparamagnetic labels can selectively bind to the isotopes on the cell surface.
  • the nanoparticles in particular have diameters between 20 and 200 nm.
  • Magnetic labels are typically very small. If these are not bound to cells, they have hydrodynamic diameters of less than 500 nm.
  • the magnetic unit for magnetophoretic alignment of the magnetically marked cells advantageously has a fishbone-like structure.
  • Such structures have proved to be particularly effective to align magnetically marked cells two-dimensionally on a channel bottom so that they individually along an axis duri ⁇ fen fen and thus occasionally via a sensor unit, such as a magnetoresistive sensor, can be performed.
  • the cell measuring device is for example as
  • Wheatstone bridge circuit see executed and has Minim ⁇ least one, in particular several magnetoresistive sensors as a bridge elements.
  • the fishbone-like structure is not unge ⁇ suitable to represent a correspondingly mechanical obstacle to the flow of unbound magnetic particles and thereby support the retardation yet.
  • the "fishbones" of the magnetic unit cover the entire channel width.
  • the flow channel is in particular a microfluidic channel.
  • the diameter of the channel is particularly adapted to the particular cell sample. Depending on the type of cell to be detected, the characteristic cell diameter varies, but this is important for the influence of the flow profile on the cells and particles of the suspension.
  • ⁇ sondere an essential part of the process is a dynamic targeted enrichment of cells in a small volume of suspension. The enrichment takes place in the direction of the microfluidic bottom via an external magnet.
  • the essential parameters for the stringent accumulation of the magnetically marked cells are, in addition to the type of magnetic markers and their magnetic stray field, the flow rate and the microfluidic dimensioning, as well as the execution of the magnetophoretic guide lines, such as their angle to the flow direction and their magnetic moment, and the external magnetic field Gra ⁇ serves.
  • herringbone magnetophoresis ensures single-cell detection by enrichment in three dimensions as well as simultaneous in situ filtering of unbound markers from the suspension.
  • Boundary conditions for in-situ filtering are the retention forces of the ferromagnetic lines, the external magnetic field and the flow velocity and the hydro ⁇ dynamic diameter of the marker in relation to the hydrodynamic diameter of the analyte, ie the magnetically labeled cell or about a magnetic bead.
  • the combination of the magnetic retardation of the unbound markers with the filtering of the markers on the ferromagnetic lines, which extend in particular over the entire width of the channel bottom. As a result, the unbound markers can not flow past these mechanical obstacles without having to move against the external magnetic field.
  • the ferromagnetic guide strip z. B. arranged so that they begin both sides ⁇ tig on the channel walls and run obliquely to the center of the channel, z. B. at an angle between 0 ° and 90 ° relative to the canal wall.
  • the guide strips in particular in the direction of the flow direction.
  • the guide strips do not touch each other as in the case of the herringbone pattern, but engage in a slightly offset manner.
  • magnetophoresis example still be further ferromagnetic strips and filter strips pre ⁇ on. That is, in the direction of flow in front of the Magnetopho Rese ferromagnetic filter strip run transversely across the channel bottom from one to the other channel wall. These can be arranged vertically or at any angle between 0 ° and 90 ° to the channel walls.
  • the described device for magnetic flow cytometry has the additional particular advantage that their filter effect can be renewed after use by the cytometer is regenerated.
  • their filter effect can be renewed after use by the cytometer is regenerated.
  • the exter nal magnetic field which is pre-call ⁇ by the first magnetic unit forth, removed or turned off.
  • a rinse can be performed at a very high flow rate that washes out the filtered particles.
  • FIG. 1 shows a cross section through the flow channel of the device
  • Figure 2 shows a section of the cross section through the
  • Figure 3 shows a plan view of the arrangement of the magnetic ⁇ tables guides
  • Figure 4 shows a plan view of the arrangement of the sensor units with the flow channel
  • Figure 5 shows a first example of a distribution of forces on an unbound magnetic marker
  • Figure 6 shows a further example of ascribedvertei ⁇ lung to a non-bound magnetic Mar- ker.
  • FIG. 1 shows a cross section through a schematic representation of a flow channel 10. This has a obe ⁇ re boundary and a channel bottom 11. On the left side a channel inlet 12, on the right side a channel outlet 13 is shown. The arrows 44 indicate the direction of flow ⁇ .
  • the channel bottom 11 two rectangles are shown, which represent the cell measuring device, ie the magnetic sensors 20.
  • a permanent magnet 22 is drawn along the entire channel length. This can also be only half the length and limited only to the front left channel section.
  • ellipsoidal cells 30, 32 are drawn. Here ⁇ the unlabeled cells 30 in the drawing of labeled cells 32 distinguished by different hatching.
  • FIG. 2 shows a section of the cross section through the flow channel 10.
  • the flow profile 40 is illustrated schematically drawn ⁇ .
  • the arrows 41 represent the flow velocities, which decrease from the center to the edge of the channel 10. The highest flow rate 41 thus prevails in the sewer center.
  • the so-called enrichment and alignment section 240 is shown in the left area of the channel section. This is thus connected in the flow direction 44 in front of the detection area 20.
  • the magnetic units In this front channel section 240 so the magnetic units, the permanent magnet 22 and the mag ⁇ netic guide lines 24 are arranged.
  • the magnetic guide lines 24 are in particular ferromagnetic metal strips ⁇ , z. B. of nickel.
  • these Strei ⁇ fen 24 are placed on the channel bottom 11 that they protrude into the flow channel 10.
  • the magnetic sensors 20 are shown, over which the magnetically marked cells 32 are guided.
  • the magnetically marked cells 32 are shown hatched again. However, it is to be distinguished whether it is a so to speak correctly magnetically marked cell 32, which has a plurality of magnetic markers 26 and moves as a single ⁇ marked cell 32 in the complex suspension or whether cells 30 erroneously to a single magnetic marker
  • Such an agglomerate of multiple cells 34 bound together by magnetic markers 26 has a much larger hydrodynamic diameter than a single labeled cell 32. This is crucial for the different flow behavior of individual cells 32 and cell aggregates 34. Due to the much larger hydrodynamic diameter, such an aggregate 34 always far into the middle of the channel, where the higher flow rate 41 prevails.
  • the large units 34 are entrained and thus further away from the channel bottom 11, so that they pass in an excessively far distance 200 from the sensor 20 at this and therefore can not be detected. This, then, eliminates false positive signals by cell ⁇ agglomerate 34th Thus, so by parameters such as the flow channel diameter and the flow profile 40 and the flow rate 41, the cell measurement can be specified.
  • the sensitivity of the sensor 20 decreases with 1 / d 3 , where d stands for the distance from the sensor.
  • the magnetic markers 26 are superparamagnetic labels that bind to isotopes on the cell surface via antibodies.
  • the magnetic sensors 20 are, for example, GMR sensors, GMR standing for Giant Magneto Resistance.
  • FIG. 2 shows schematically the filter principle of the device.
  • the small unbound markers 26 have only very small hydrodynamic diameters and, due to the magnetic enrichment, approach near the channel bottom 11. There they can be filtered from the ferromagnetic strips 24 so to speak from the river and stopped.
  • the ferromagnetic strips 24 initially act as a mechanical obstacle in the flow.
  • the magnetic marker 26 would need to move 22 to free himself from the magnetic filter of the magnetic gradient of the counter Perma ⁇ mag- nets.
  • magnetic holding forces F M also prevail on these ferromagnetic strips 24, which see Marker 26 retard.
  • the filtration is thus a combination of a magnetic force F M and a shear force filter F s .
  • FIG. 3 now shows a plan view of the channel cutout shown in FIG.
  • the flow direction 44 is again marked with an arrow.
  • the enrichment path 240 is shown again.
  • the ferromagnetic guide lines 24 extend for the magnetophore-tonic enrichment and alignment of the magnetically marked cells 32.
  • the magnetic guide lines 24 are arranged in a particularly advantageous herringbone pattern, which tapers from the channel walls 14 towards the middle of the channel.
  • DA for it is of particular advantage for an effective filter for the unbound magnetic markers 26 that the magnetic guide strips 24 100. ⁇ cover the entire channel width and leave open no gap.
  • the permanent magnet 22 which is not explicitly shown in the figure, since it is located below the channel bottom 11, extends in particular ⁇ special over the entire channel width 100, so that on the ge ⁇ entire channel width 100, a uniform gradient field on the magnetic particles 26 acts in the suspension. It is particularly advantageous if the permanent magnet 22 extends beyond the channel width 100, for example, up to the dashed line that runs in the channel wall 14, so that it causes a uniform Gra ⁇ Dientenfeld within the channel 10.
  • FIG. 3 a centrally extending like ⁇ -magnetic guide line 24, the mar ⁇ kiert the channel center, and which can be regarded as the above-axis at which the magnetically labeled cells are aligned 32nd In intellectual extension of this axis are then in the flow channel 10, the magnetic sensors 20 through which the magnetically marked cells 32 flow.
  • FIG. 3 also shows unmarked magnetic cells 30, which are unaffected by the magnetic measures. Instead of magnetically marked cells 32, magnetic beads can also be enriched and aligned in this way. Other analytes which can be magnetically labeled are also suitable for such a measurement method.
  • FIG. 4 shows the arrangement of the magnetic sensor unit with the magnetoresistive elements 20 which are connected to one another in a Wheatone bridge circuit.
  • the electrical leads 21 to the magnetoresistors 20 are shown.
  • the arrow again indicates the flow direction 44 through the flow channel 10.
  • FIGS. 5 and 6 are intended to illustrate schematically the forces acting on the unbound magnetic marker 26.
  • FIG. 5 shows a magnetic marker 26 with an antibody and a magnetic particle which is held on the channel bottom 11 by the magnetic holding force F M caused by the ferromagnetic strip 24 together with the gradient field of the permanent magnet 22 located below the channel bottom 11 located.
  • This magnetic force F M acts on the magnetic marker 26 perpendicular to the channel bottom 11, and holds it to the strip 24.
  • the shear forces of the flow of the complex suspension F s also act on the magnetic marker 26. These engage parallel to the channel bottom 11, ie in the direction of flow 44.
  • the magic netic holding forces F M must therefore be greater than the shearing force F s to hold the magnetic marker 26.
  • FIG. 6 shows that the arrangement of the ferromagnetic strip 24 on the channel bottom 11 also contributes to the filter effect.
  • the ferromagnetic strip 24 projects into the flow passage 10 into so that magnetic Mar ⁇ ker ferromagnetic in flow direction behind the 44 26
  • the attacking shear force F s of the flow 44 of the complex suspension has so even a smaller attack surface of the magnetic Markers 26 available.
  • the ferromagnetic strip 24 provides a flow obstacle, which means an additional retention force F R for the magnetic marker 26.
  • a fluidic channel 10 of 0.105 ym 2 cross-sectional area at a flow rate of about 1 ⁇ / s the flow ⁇ speed 41 in about 1500 ym / s and the complex Suspen ⁇ sion passes over the magnetic sensors 20.
  • the nickel strips 24 hold the magnetic nanobeads 26 back , After the measurement, the nickel strip system 24 is to be freed from these nanobeads 26 again.
  • the external magnetic field can be minimized or switched off.
  • FIG. 7 shows an alternative embodiment of the channel 10 with offset ferromagnetic guide strips 24, which do not touch in the middle of the channel 10 but interlock with one another like a zipper. These are also preferably arranged at an angle of 45 ° to the channel walls 14 and point in the direction of the flow direction 44.
  • the magnetophoresis 240 regardless of the exact design, may still precede an additional filter 250. This is thus arranged in the flow direction 44 further forward in the channel 10, in Figure 7 on the left.
  • ferromagnetic strips 25 extend transversely over the channel bottom 11 from one to the other channel wall 14. These are arranged in particular perpendicular or at an angle between 0 ° and 90 ° to the channel walls 14.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie. Dabei werden magnetische Einheiten (22, 24) in einem Durchflusskanal (10) angeordnet, welcher hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Suspension in dem Durchflusskanal (10) mit laminarem Strömungsprofil (40) erzeugbar ist. Die durch die magnetischen Einheiten (22, 24) bewirkbaren (FM) und die durch den Fluss bewirkbaren Kräfte (FS) auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) bewirken, dass diese nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) im vorderen Kanalabschnitt (240) zurückgehalten werden und nicht über die Zellmesseinrichtung (20) im weiteren Verlauf des Durchflusskanals (10) fließen.

Description

Beschreibung
Hintergrundfreie magnetische Durchflusszytometrie Die vorliegende Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie, insbesondere die magnetische Zellmessung
Im Bereich der Zellmessung und Zelldetektion sind neben optischen Messverfahren, wie Streulicht- oder Fluoreszenzmessung, auch magnetische Detektionsverfahren bekannt, bei denen die zu detektierende Zellsorte mittels magnetischer Labels mar¬ kiert wird.
Insbesondere sind zur magnetbasierten Messung Verfahren be- kannt, bei denen magnetisch markierte Zellen mittels Magne- tophorese aus einer komplexen Zellsuspension, z. B. einer Blutprobe, aussortiert werden. Die magnetische Markierung er¬ folgt insbesondere dadurch, dass zellspezifische Marker in die komplexe Zellprobe eingeführt werden. Mittels Magnetopho- rese können magnetisch markierte Zellen oder allgemein magnetische Partikel im Durchfluss geführt, bzw. gelenkt und da¬ durch sortiert werden.
Für die Zellmessung in der Diagnostik und Wissenschaft ist es notwendig, dass gerade auch Zelltypen, die in nur sehr geringen Konzentrationen in einer Blutprobe vorliegen, wie beispielsweise disseminierte Tumorzellen, vermessen werden. Für die Quantifizierung von Zellkonzentrationen oder auch für einen verlässlichen Nachweis bestimmter Zellen ist daher eine Einzelzelldetektion anzustreben. Es ist bekannt, dass dafür eine vorhergehende Anreicherung der zu bestimmenden Zellen aus einer Suspension mit komplexem Hintergrund notwendig ist. Dies allein führt in den meisten Fällen jedoch noch nicht zu ausreichender Spezifität der Messung. Gerade da die magneti- sehe Zellmessung mit einer sehr einfachen Probenvorbereitung durch Hinzufügen der zellspezifischen Marker einhergeht, stellt sich bei der magnetischen Durchflusszytometrie das Problem, dass ungebunden magnetische Marker stets ein Hinter- grundsignal hervorrufen. Dieser Hintergrund führt beispiels¬ weise zu falsch positiven Detektionssignalen .
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein durch ungebun- dene magnetische Marker hervorgerufenes Hintergrundsignal in der magnetischen Durchflusszytometrie zu minimieren.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Ein Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie wird in Patentanspruch 9 angegeben. Ein Herstellungsverfahren für eine erfindungsgemäße Vorrichtung wird in Patentanspruch 15 angegeben. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur magnetischen Durchfluss- zytometrie umfasst einen Durchflusskanal, eine erste magneti¬ sche Einheit zur Anreicherung und eine zweite magnetische Einheit zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen sowie wenigstens eine Zellmesseinrichtung. Die magnetischen Einhei- ten sind in einem bezüglich der Durchflussrichtung vorderen Kanalabschnitt angeordnet. Der Durchflusskanal ist hinsicht¬ lich des Kanaldurchmessers und der Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet, dass ein Fluss einer kom¬ plexen Suspension in dem Durchflusskanal mit laminarem Strö- mungsprofil erzeugbar ist. Der Durchflusskanal ist weiter so ausgestaltet, dass die durch die magnetischen Einheiten be¬ wirkbaren sowie die durch den Fluss bewirkbaren Kräften derart auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker wirken, dass diese ungebundenen magnetischen Marker im vorderen Ka- nalabschnitt zurückhaltbar sind. Dies hat den Vorteil, dass diese ungebundenen Marker die Zellmesseinrichtung, die sich in Flussrichtung weiter hinten im Durchflusskanal befindet, nicht erreichen. Somit werden die nicht an Zellen gebundenen Marker im vorderen Kanalabschnitt zurückgehalten und nicht über die Zellmesseinrichtung im weiteren Verlauf des Kanals fließen und so als Störkomponente eliminiert, womit das Hin¬ tergrundsignal, das durch ungebundene magnetische Marker her¬ vorgerufen wird, vermindert wird. Dies hat den Vorteil, dass eine höhere Spezifität bei der Messung der magnetisch markierten Zellen, insbesondere eine Einzelzelldetektion gewährleistet ist. Insbesondere ist die erste magnetische Einheit in der Vor¬ richtung so im vorderen Kanalabschnitt angeordnet, dass da¬ durch ein magnetisches Gradientenfeld erzeugbar ist, welches magnetisch markierte Zellen sowie nicht an Zellen gebundene magnetische Marker innerhalb des Durchflusskanals am Kanalbo- den anreichert. Die Anreicherung hat den Vorteil, die magne¬ tisch markierten Zellen zur Messung an die Zellmesseinrichtung nahe dem Kanalboden heranzuführen und hat darüber hinaus den Vorteil, die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker an die zweite magnetische Einheit am Kanalboden heranzu- führen, durch die, wie im Folgenden beschrieben wird, das Zurückhalten der ungebundenen Marker vorzugsweise begünstigt wird .
Insbesondere ist diese zweite magnetische Einheit so im vor- deren Kanalabschnitt angeordnet, dass dadurch magnetisch mar¬ kierte Zellen innerhalb des Durchflusskanals entlang einer Achse ausgerichtet werden, auf welcher die Zellmesseinrichtung im weiteren Verlauf des Kanals angeordnet ist. Diese An¬ ordnung der zweiten magnetischen Einheit hat den Vorteil eine magnetophoretische Führung der magnetisch markierten Zellen vornehmen zu können, durch die die Zellen ausgerichtet und insbesondere vereinzelt über die Zellmesseinrichtung geführt werden können. Diese zweite magnetische Einheit ist außerdem beispielsweise so am Kanalboden angeordnet, dass sie in den Durchflusskanal hineinragt. Dies hat den Vorteil, dass die magnetische Ein¬ heit zusätzlich zur magnetischen Kraft auf die magnetischen Marker, besonders die ungebundenen magnetischen Marker auch eine mechanische Behinderung des Weiterflusses dieser magne¬ tischen Marker bewirken kann. Alternativ könnten die Führungsstreifen auch in den Kanalboden eingelassen sein, so dass diese kein mechanisches Hindernis für die Strömung dar- stellen. Dann jedoch muss die magnetische Haltekraft, die auf die ungebundenen Marker wirkt, höher sein oder die Durchflussgeschwindigkeit geringer, um die ungebundenen magneti¬ schen Marker gleichermaßen zuverlässig zurückhalten zu kön- nen .
Die zweite magnetische Einheit weist insbesondere magnetische Führungsstreifen auf. Diese sind insbesondere aus einem fer- romagnetischen Material. Vorzugsweise sind diese magnetischen Führungsstreifen in einem Fischgrätenmuster angeordnet. Die
Führungsstreifen weisen also pfeilförmig in die Mitte des Kanalbodens. Somit werden die magnetisch markierten Zellen besonders effektiv auf diese mittlere Achse entlang des Kanal¬ bodens ausgerichtet, wo sie dann auf die Zellmesseinrichtung zufließen. Um der Filteraufgabe gerecht zu werden, erstrecken sich die Führungsstreifen, insbesondere über die gesamte Ka¬ nalbreite .
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die zweite magnetische Einheit in der Vorrichtung so ausgestal¬ tet, dass durch diese zweite magnetische Einheit eine magne¬ tische Kraft sowie eine zusätzliche Rückhaltekraft auf die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker bewirkbar sind, die der Scherkraft des Flusses der komplexen Suspension richtungs- und betragsmäßig entgegenwirken. Diese Ausgestal¬ tung der magnetischen Einheit hat also den Vorteil einer Kombination zweier Kräfte auf die ungebundenen Marker, mittels derer diese entgegen der Flussrichtung im Kanal zurückgehalten werden können.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Durchflusskanal der Vorrichtung hinsichtlich Kanaldurchmesser so ausgestaltet, dass Zellaggregate von mehreren Zellen, die über magnetische Marker aneinander gebunden sind, soweit in die Kanalmitte ragen können, dass durch die auf die Zellaggregate bewirkbaren Kräfte diese Zellaggregate mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit abtransportierbar sind. Diese Ausgestaltung hinsichtlich des Kanaldurchmessers birgt also den weiteren Vorteil, dass auch Zellaggregate nicht zu falschpositiven Signalen führen, da diese mit der höchsten im Kanal vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit abtransportiert werden. Insbesondere ist der Durchflusskanal hinsichtlich des Durchmessers weiter so aus¬ gestaltet, dass von den Zellaggregaten, die in der Kanalmitte fließen, ein Abstand zur Zellmesseinrichtung, die insbesondere am oder im Kanalboden angeordnet ist, einhaltbar ist, in dem keine Detektion des Zellaggregates hervorrufbar ist. D.h. also, dass der Kanaldurchmesser so groß gewählt ist, dass die Zellaggregate von mehreren Zellen, die über magnetische Mar¬ ker aneinander gebunden sind, in ausreichend weitem Abstand zur Zellmesseinrichtung an dieser vorbeifließen. Die Sensiti- vität eines magnetoresistiven Sensors etwa nimmt mit 1/d3 ab, wobei d für den Abstand zum Sensor steht. Die Zellmesseinrichtung ist zweckdienlicherweise mit einem magnetoresistiven Sensor realisiert. Dieser kann insbesondere ein GMR-Sensor sein (giant magneto resistance) . Von Vorteil ist es mehrere Sensorelemente anzuordnen, welche z. B. Brückenelemente einer Wheatstone-Brückenschaltung sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur magnetischen Durch- flusszytometrie wird ein laminarer Fluss einer Zellprobe mit magnetisch markierten Zellen sowie nicht an Zellen gebundenen magnetischen Markern erzeugt. Des Weiteren werden die magnetisch markierten Zellen sowie die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch angereichert. Zusätzlich werden die magnetisch markierten Zellen magnetophoretisch entlang einer Achse ausge- richtet. Die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfel¬ des sowie die Durchflussgeschwindigkeit werden dabei so ge¬ wählt, dass die auf nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker wirkenden Kräfte diese Marker im Fluss zurückhalten. Dies hat den Vorteil, dass jeder zurückgehaltene ungebundene Marker nicht zu einem Hintergrundsignal beitragen kann.
Insbesondere werden bei dem Verfahren die magnetischen Marker im Überschuss zu der Zellprobe gegeben. Gerade dadurch ent- steht zwar das hohe Hintergrundsignal, aber auch dadurch wird erst gewährleistet, dass sehr spezifische Zellen, die etwa nur in geringer Konzentration in einer Probe vorliegen, ohne weitere Probenvorbereitung zuverlässig markiert werden und demnach selektiv detektiert werden können. Erst durch das
Konzept der Herausfilterung bzw. Retardierung der überschüssigen magnetischen Marker kann eine zufriedenstellende spezifische Einzelzelldetektion in Zellproben, wie etwa Blut, realisiert werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt in dem Verfahren die Erzeugung des laminaren Flusses der Zellprobe in einem Durchflusskanal, die dynamische Anreicherung zur Kanalinnenwand des Kanalbodens hin und die magnetophore- tische Ausrichtung entlang einer Achse, wobei die Achse in
Flussrichtung entlang der Kanalinnenwand des Kanalbodens ver¬ läuft. Durch diesen Achsenverlauf werden die magnetisch markierten Zellen über eine Zellmesseinrichtung geführt. Die Zellprobe wird dabei so an einer magnetischen Einheit an der Kanalinnenwand des Kanalbodens vorbei geführt, dass die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker in dieser Zellprobe an eben dieser magnetischen Einheit zurückgehalten werden.
Vorzugsweise werden in dem Verfahren superparamagnetische Marker als magnetische Marker verwendet.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit so gewählt, dass die auf Zell- aggregate von mehreren über magnetische Marker aneinander gebundene Zellen wirkenden Kräfte bewirken, dass diese Zellag¬ gregate mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchfluss¬ geschwindigkeit abtransportiert werden. Dies hat den weiteren Vorteil, dass auch die Zellaggregate nicht zu falschpositiven Signalen führen. Insbesondere ist die Kanalmitte, in der sich die Zellaggregate bewegen, so weit von der Zellmesseinrichtung, insbesondere dem magnetoresistiven Sensor an oder in der Kanalwand, entfernt, dass das magnetische Streufeld der Marker in oder um die Zellaggregate nicht detektiert wird.
Bei dem Verfahren wird also insbesondere eine Zellprobe in eine Ausführungsform der oben beschriebenen Vorrichtung injiziert .
Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie wird die zwei- te magnetische Einheit zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen im Durchflusskanal am Kanalboden angeordnet und ragt insbesondere in den Durchflusskanal hinein. Dies hat den Vor¬ teil, gegenüber einer Anordnung im Kanalboden, zusätzlich zur magnetischen Haltekraft auch eine mechanische Rückhaltekraft durch ein Strömungshindernis zu realisieren.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass durch die Retardierung ungebundener Marker zur Reduzierung des Hintergrundsignals die Einfachheit der Probenvorbereitung für die magnetische Durchflusszytometrie erhalten bleibt.
Diese ist ein wesentlicher Vorteil der magnetischen Messung überhaupt. Da für eine ausreichend zuverlässige Markierung der zu detektierenden Zellen ein Überschuss an magnetischen Markern der Probe zugegeben werden muss, ist diese Reduktion des Hintergrunds für eine Verbesserung des Signal-Rausch- Verhältnisses von noch wesentlicherer Bedeutung. Als magnetische Marker kommen insbesondere superparamagnetische Label in Frage, die Antikörper aufweisen, über die die superparamagne- tischen Label an die Isotope auf der Zelloberfläche selektiv anbinden können. An die Antikörper ist dann z. B. jeweils ein superparamagnetischer Nanopartikel angebunden. Die Nanoparti- kel weisen insbesondere Durchmesser zwischen 20 und 200 nm auf . Magnetische Label sind typischerweise sehr klein. Sind diese nicht an Zellen gebunden, weisen sie hydrodynamische Durchmesser von weniger als 500 nm auf. Die einmal am Kanalboden angereicherten derart kleinen magnetischen Einheiten können daher gut über die magnetischen Kräfte retardiert werden, besonders, da am Kanalboden die geringsten Durchflussgeschwindigkeiten herrschen. Gewählte Durchflussgeschwindigkeiten liegen typischerweise unter 5 mm/s. Im Gegensatz zu den unge- bundenen Markern weisen markierte Zellen oder größere Magnet- beads Durchmesser von beispielsweise 3 bis 20 ym auf, Zellag¬ gregate weisen dementsprechend noch größere hydrodynamische Durchmesser auf. Je weiter die Partikel in den Mikrofluidik- kanal hineinreichen, desto höher die Flussgeschwindigkeit und desto eher werden sie von der laminaren Strömung mitgerissen.
Die magnetische Einheit zur magnetophoretischen Ausrichtung der magnetisch markierten Zellen weist vorteilhafterweise eine fischgrätenartige Struktur auf. Derartige Strukturen haben sich als besonders effektiv erwiesen, magnetisch markierte Zellen zweidimensional an einem Kanalboden so auszurichten, dass sie entlang einer Achse vereinzelt nacheinander verlau¬ fen und somit auch vereinzelt über eine Sensoreinheit, wie beispielsweise einen magnetoresistiven Sensor, geführt werden können. Die Zellmesseinrichtung ist beispielsweise als
Wheatstone ' sehe Brückenschaltung ausgeführt und weist mindes¬ tens einen, insbesondere mehrere magnetoresistive Sensoren als Brückenelemente auf. Darüber hinaus ist die fischgrätenartige Struktur nicht unge¬ eignet, auch ein dementsprechend mechanisches Hindernis für den Fluss der ungebundenen magnetischen Partikel darzustellen und die Retardierung dadurch noch zu unterstützen. Insbesondere bedecken die "Fischgräten" der magnetischen Einheit die gesamte Kanalbreite.
Der Durchflusskanal ist insbesondere ein Mikrofluidikkanal . Der Durchmesser des Kanals ist insbesondere auf die jeweilige Zellprobe angepasst. Je nach zu detektierender Zellart vari- iert der charakteristische Zelldurchmesser, der jedoch für den Einfluss des Strömungsprofils auf Zellen und Partikel der Suspension von Bedeutung ist. Ein wesentlicher Bestandteil des Verfahrens ist also insbe¬ sondere eine gezielt dynamische Anreicherung von Zellen in einem kleinen Suspensionsvolumen. Die Anreicherung erfolgt in Richtung Mikrofluidikboden über einen externen Magneten. Die wesentlichen Parameter für die stringente Anreicherung der magnetisch markierten Zellen sind neben der Art der magnetischen Marker und deren magnetischem Streufeld, die Durchflussgeschwindigkeit sowie die Mikrofluidikdimensionierung, außerdem die Ausführung der magnetophoretischen Führungsli- nien, wie beispielsweise deren Winkel zur Flussrichtung und deren magnetisches Moment, sowie das externe magnetische Gra¬ dientenfeld.
Durch den vorteilhaften Einsatz einer fischgrätenartigen Magnetophorese wird eine Einzelzelldetektion gewährleistet, indem die Anreicherung in drei Dimensionen erfolgt sowie die zeitgleiche in-situ-Filterung nicht gebundener Marker aus der Suspension. Grenzbedingungen für die in-situ-Filterung sind die Rückhaltekräfte der ferromagnetischen Linien, das externe Magnetfeld sowie die Durchflussgeschwindigkeit und der hydro¬ dynamische Durchmesser der Marker in Relation zum hydrodynamischen Durchmesser des Analyts, d.h. der magnetisch markierten Zelle oder etwa eines magnetischen Beads . Von besonderem Vorteil ist die Kombination der magnetischen Retardierung der ungebundenen Marker mit der Filterung der Marker an den ferromagnetischen Linien, die sich insbesondere über die gesamte Breite des Kanalbodens erstrecken. Dadurch können die ungebundenen Marker an keiner Stelle an diesen me- chanischen Hindernissen vorbeifließen ohne dass sie sich entgegen des externen Magnetfeldes bewegen müssen. Dadurch ist eine dynamische Filterung der ungebundenen Marker gewährleistet . In einer alternativen Ausführungsform sind die ferromagnetischen Führungsstreifen z. B. so angeordnet, dass sie beidsei¬ tig an den Kanalwänden beginnen und schräg zur Mitte des Kanals hinlaufen, z. B. in einem Winkel zwischen 0° und 90° re- lativ zur Kanalwand. Dabei weisen die Führungsstreifen, insbesondere in Richtung der Durchflussrichtung. In der Mitte des Kanals berühren sich die Führungsstreifen jedoch nicht wie im Fall der Fischgrätestruktur, sondern greifen leicht versetzt ineinander.
Des Weiteren können der Magnetophorese beispielsweise noch weitere ferromagnetische Streifen als Filterstreifen vorge¬ schaltet sein. D.h. in Durchflussrichtung vor der Magnetopho rese verlaufen ferromagnetische Filterstreifen quer über den Kanalboden von einer zur anderen Kanalwand. Diese können senkrecht oder auch in einem beliebigen Winkel zwischen 0° und 90° zu den Kanalwänden angeordnet sein.
Die beschriebene Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszyto metrie hat den zusätzlichen besonderen Vorteil, dass deren Filterwirkung nach Gebrauch erneuert werden kann, indem das Zytometer regeneriert wird. Dazu kann insbesondere das exter ne Magnetfeld, das durch die erste magnetische Einheit her¬ vorgerufen wird, entfernt oder ausgeschaltet werden. Zusätzlich kann eine Spülung mit einer sehr hohen Durchflussgeschwindigkeit vorgenommen werden, die die gefilterten Partikel herauswäscht.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 6 der ange¬ hängten Zeichnung beschrieben:
Figur 1 zeigt einen Querschnitt durch den Durchflusskanal der Vorrichtung,
Figur 2 zeigt einen Ausschnitt des Querschnitts durch den
Durchflusskanal mit der Anordnung der magnetischen Führungslinien und das Flussprofil,
Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung der magne¬ tischen Führungslinien,
Figur 4 zeigt eine Draufsicht auf die Anordnung der Sensor einheiten mit dem Durchflusskanal, Figur 5 zeigt ein erstes Beispiel für eine Kräfteverteilung auf einen nicht gebundenen magnetischen Marker und
Figur 6 zeigt ein weiteres Beispiel für eine Kräftevertei¬ lung auf einen nicht gebundenen magnetischen Mar- ker .
Die Figur 1 zeigt einen Querschnitt durch eine schematische Darstellung eines Durchflusskanals 10. Dieser weist eine obe¬ re Begrenzung und einen Kanalboden 11 auf. Auf der linken Seite ist ein Kanaleinlass 12, auf der rechten Seite ein Ka- nalauslass 13 gezeigt. Die Pfeile 44 zeigen die Durchfluss¬ richtung an. Im Kanalboden 11 sind zwei Rechtecke eingezeichnet, die die Zellmesseinrichtung, d.h. die Magnetsensoren 20 darstellen. Unterhalb des Kanalbodens 11 ist entlang der ge- samten Kanallänge ein Permanentmagnet 22 gezeichnet. Dieser kann aber auch nur die halbe Länge betragen und sich nur auf den vorderen linken Kanalabschnitt beschränken. Im Kanal 10 sind ellipsenförmig die Zellen 30, 32 gezeichnet. Dabei wer¬ den in der Zeichnung nicht markierte Zellen 30 von markierten Zellen 32 durch unterschiedliche Schraffur unterschieden. Nur die magnetisch markierten Zellen 32 erfahren eine magnetische Kraft in dem Gradientenfeld durch den Permanentmagneten 22 und werden am Kanalboden 11 angereichert, so dass sie sich nahe über den Magnetsensor 20 hinweg bewegen. Alle anderen Zellen 30 bewegen sich wesentlich weiter vom Kanalboden 11 entfernt über den Sensor 20 hinweg. Je nach Durchflussge¬ schwindigkeit 41, Kanaldurchmesser und magnetischem Moment der Zellmarkierung 26 muss die Länge der Anreicherungsstrecke 240 und somit auch die Länge des Permanentmagneten 22 unter- halb des Durchflusskanals 10 gewählt werden um möglichst alle magnetisch markierten Zellen 32 aus der Suspension am Kanalboden 11 anzureichern. Bei der gezeigten Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie geht es also um eine dynami¬ sche Messung, der auch eine dynamische Anreicherung der Zel- len 32 vorausgeht. Die dynamische Messung in Kombination mit der dynamischen Anreicherung und der einfachen Probenvorbereitung, die im Wesentlichen nur darin besteht, dass der Zellprobe die magnetischen Marker 26 zugesetzt werden müssen, ist einer der großen Vorteile der magnetischen Durchflusszy- tometrie im Gegensatz zu anderen Messmethoden der Zelldiagnostik, wie etwa der Fluoreszenzdurchflusszytometrie . In der Figur 2 ist ein Ausschnitt des Querschnitts durch den Durchflusskanal 10 gezeigt. Auf der linken Seite ist schema¬ tisch das Flussprofil 40 eingezeichnet. Bei einer laminaren Kanalströmung 40 stellt sich ein im Wesentlichen parabelför- miges Profil ein. Die Pfeile 41 stehen für die Fließgeschwin- digkeiten, die sich von der Mitte zum Rand des Kanals 10 hin verringern. Die höchste Durchflussgeschwindigkeit 41 herrscht also im Kanalzentrum vor.
Im linken Bereich des Kanalabschnitts ist die sogenannte An- reicherungs- und Ausrichtungsstrecke 240 gezeigt. Diese ist also in Flussrichtung 44 vor den Detektionsbereich 20 geschaltet. In diesem vorderen Kanalabschnitt 240 sind also die magnetischen Einheiten, der Permanentmagnet 22 sowie die mag¬ netischen Führungslinien 24 angeordnet. Die magnetischen Füh- rungslinien 24 sind insbesondere ferromagnetische Metall¬ streifen, z. B. aus Nickel. In der Figur 2 sind diese Strei¬ fen 24 so auf den Kanalboden 11 aufgesetzt, dass sie in den Durchflusskanal 10 hineinragen. In Durchflussrichtung 44 nach diesem vorderen Kanalabschnitt 240 sind die Magnetsensoren 20 gezeigt, über die die magnetisch markierten Zellen 32 geführt werden .
Die magnetisch markierten Zellen 32 sind wieder schraffiert dargestellt. Es ist jedoch zu unterscheiden, ob es sich um eine sozusagen korrekt magnetisch markierte Zelle 32 handelt, die mehrere magnetische Marker 26 aufweist und sich als ein¬ zelne markierte Zelle 32 in der komplexen Suspension bewegt oder ob sich Zellen 30 fälschlicherweise an einen einzelnen magnetischen Marker 26 anhängen und über diesen agglomerie- ren. Ein derartiges Agglomerat von mehreren Zellen 34, die über magnetische Marker 26 aneinandergebunden sind, weist einen wesentlich größeren hydrodynamischen Durchmesser auf als eine einzelne markierte Zelle 32. Dies ist entscheidend für das unterschiedliche Fließverhalten von einzelnen Zellen 32 und Zellaggregaten 34. Durch den wesentlich größeren hydrodynamischen Durchmesser weist ein solches Aggregat 34 immer sehr viel weiter in die Kanalmitte hinein, wo die höhere Durchflussgeschwindigkeit 41 vorherrscht. Von dieser hohen Durchflussgeschwindigkeit 41 werden die großen Aggregate 34 mitgerissen und somit vom Kanalboden 11 wieder weiter entfernt, so dass sie in einem zu weiten Abstand 200 vom Sensor 20 an diesem vorbeifließen und daher nicht detektiert werden können. Dies schließt also falschpositive Signale durch Zell¬ agglomerate 34 aus. Somit kann also durch Parameter wie den Durchflusskanaldurchmesser und das Durchflussprofil 40 bzw. die Durchflussgeschwindigkeit 41 die Zellmessung spezifiziert werden. Die Sensitivität des Sensors 20 nimmt mit 1/d3 ab, wobei d für den Abstand vom Sensor steht.
Das bei der Messung störende Hintergrundsignal wird im We¬ sentlichen durch nicht gebundene Marker 26 verursacht, die im Überfluss der Zellprobe zugegeben werden um eine vollständige Markierung aller zu detektierenden Zellen 32 in der Probe zu gewährleisten. Bei den magnetischen Markern 26 handelt es sich beispielsweise um superparamagnetische Label, welche über Antikörper an Isotope auf der Zelloberfläche anbinden. Bei den Magnetsensoren 20 handelt es sich beispielsweise um GMR-Sensoren, wobei GMR für Giant Magneto Resistance steht.
Die Figur 2 zeigt schematisch das Filterprinzip der Vorrichtung. Die kleinen ungebundenen Marker 26 weisen nur sehr kleine hydrodynamische Durchmesser auf und nähern sich durch die magnetische Anreicherung nahe dem Kanalboden 11 an. Dort können sie von den ferromagnetischen Streifen 24 sozusagen aus dem Fluss gefiltert und aufgehalten werden. Dabei wirken die ferromagnetischen Streifen 24 zunächst als mechanisches Hindernis im Durchfluss. Die magnetischen Marker 26 müssten sich entgegen des magnetischen Gradientenfeldes des Perma¬ nentmagneten 22 bewegen um sich aus dem Magnetfilter zu befreien. Zusätzlich herrschen auch magnetische Haltekräfte FM an diesen ferromagnetischen Streifen 24 vor, die die magneti- sehen Marker 26 retardieren. Die Filtration ist also eine Kombination eines Magnetkraft- FM und eines Scherkraftfilters Fs. Die Figur 3 zeigt nun eine Draufsicht auf den in Figur 2 ge¬ zeigten Kanalausschnitt. Die Durchflussrichtung 44 ist wieder mit einem Pfeil gekennzeichnet. Im vorderen, d.h. in Durchflussrichtung vorderen Bereich des Kanals 10 ist wieder die Anreicherungsstrecke 240 gezeigt. In diesem Bereich verlaufen die ferromagnetischen Führungslinien 24 für die magnetophore- tische Anreicherung und Ausrichtung der magnetisch markierten Zellen 32. Die magnetischen Führungslinien 24 sind in einem besonders vorteilhaften Fischgrätenmuster angeordnet, welches von den Kanalwänden 14 zur Kanalmitte hin spitz zuläuft. Da- bei ist es von besonderem Vorteil für einen effektiven Filter für die ungebundenen magnetischen Marker 26, dass die magnetischen Führungsstreifen 24 die komplette Kanalbreite 100 ab¬ decken und keine Lücke offenlassen. Auch der Permanentmagnet 22, der in der Figur nicht explizit gezeigt ist, da er sich unterhalb des Kanalbodens 11 befindet, erstreckt sich insbe¬ sondere über die gesamte Kanalbreite 100, so dass auf der ge¬ samten Kanalbreite 100 ein gleichförmiges Gradientenfeld auf die magnetischen Partikel 26 in der Suspension wirkt. Besonders vorteilhaft ist es wenn sich der Permanentmagnet 22 über die Kanalbreite 100 hinaus erstreckt, beispielsweise bis zu der gestrichelten Linie, die in der Kanalwand 14 verläuft, so dass dieser innerhalb des Kanals 10 ein gleichmäßiges Gra¬ dientenfeld hervorruft. Des Weiteren ist in der Figur 3 eine zentral verlaufende mag¬ netische Führungslinie 24 gezeigt, die die Kanalmitte mar¬ kiert, und die als die beschriebene Achse angesehen werden kann, auf die die magnetisch markierten Zellen 32 ausgerichtet werden. In gedanklicher Verlängerung dieser Achse befin- den sich dann im Durchflusskanal 10 die Magnetsensoren 20, über die die magnetisch markierten Zellen 32 fließen. Die Figur 3 zeigt auch unmarkierte magnetische Zellen 30, welche von den magnetischen Maßnahmen unbeeinflusst sind. Anstelle magnetisch markierter Zellen 32 können auch Magnet- beads auf diese Weise angereichert und ausgerichtet werden. Auch andere Analyte die magnetisch markiert werden können, kommen für eine derartige Messmethode in Frage.
Auch in der Fluoreszenzdurchflusszytometrie werden in der Probenvorbereitungsphase fluoreszente Marker im Überfluss zu¬ gegeben, welche dann durch Zentrifugations- und Waschschritte dekantiert werden müssen. Derartige Schritte sind für die magnetische Durchflusszytometrie nicht notwendig, wenn die Parameter der magnetischen Einheiten sowie des Durchflussverhaltens auf die Größe der zu detektierenden magnetischen Zelle geeignet eingestellt werden.
Die Figur 4 schließlich zeigt die Anordnung der magnetischen Sensoreinheit mit den magnetoresistiven Elementen 20, die in einer Wheastone ' sehen Brückenschaltung miteinander verbunden sind. Dabei sind auch die elektrischen Zuleitungen 21 zu den Magnetowiderständen 20 gezeigt. Der Pfeil zeigt wieder die Durchflussrichtung 44 durch den Durchflusskanal 10 an.
Die Figuren 5 und 6 schließlich sollen noch schematisch die auf den nicht gebundenen magnetischen Marker 26 wirkenden Kräfte darstellen. Dafür ist lediglich ein Ausschnitt des Kanalbodens 11 mit einem ferromagnetischen Streifen 24 gezeigt. In der Figur 5 ist ein magnetischer Marker 26 mit einem Antikörper und einem magnetischen Partikel gezeigt, der über die magnetische Haltekraft FM am Kanalboden 11 gehalten wird verursacht durch den ferromagnetischen Streifen 24 zusammen mit dem Gradientenfeld des Permanentmagneten 22, der sich unterhalb des Kanalbodens 11 befindet. Diese magnetische Kraft FM wirkt auf den magnetischen Marker 26 senkrecht in Richtung Kanalboden 11, und hält diesen an dem Streifen 24 fest. Auf den magnetischen Marker 26 wirken aber auch die Scherkräfte des Flusses der komplexen Suspension Fs . Diese greifen parallel zum Kanalboden 11, also in Flussrichtung 44, an. Die mag- netischen Haltekräfte FM müssen daher größer als die Scherkraft Fs sein um den magnetischen Marker 26 festzuhalten.
Die Figur 6 zeigt schließlich, dass auch die Anordnung des ferromagnetischen Streifens 24 am Kanalboden 11 zur Filterwirkung beiträgt. Der ferromagnetische Streifen 24 ragt in den Durchflusskanal 10 so hinein, dass sich magnetische Mar¬ ker 26 in Flussrichtung 44 hinter den ferromagnetischen
Streifen 24 verfangen können. Dort wirkt die magnetische Kraft FM des Permanentmagneten 22, der sich unterhalb des Ka¬ nalbodens 11 befindet, senkrecht zum Kanalboden 11 auf den magnetischen Marker 26. Die angreifende Scherkraft Fs des Durchflusses 44 der komplexen Suspension hat so schon eine geringere Angriffsfläche des magnetischen Markers 26 zur Ver- fügung. Zusätzlich bietet der ferromagnetische Streifen 24 ein Strömungshindernis, was eine zusätzliche Rückhaltekraft FR für den magnetischen Marker 26 bedeutet.
In einem Fluidikkanal 10 von 0,105 ym2 Querschnittsfläche bei einer Durchflussrate von etwa 1 μΐ/s beträgt die Durchfluss¬ geschwindigkeit 41 in etwa 1500 ym/s und die komplexe Suspen¬ sion überstreicht die Magnetsensoren 20. Die Nickelstreifen 24 halten die magnetischen Nanobeads 26 zurück. Nach der Messung soll das Nickelstreifensystem 24 von diesen Nanobeads 26 wieder befreit werden. Dazu wird der Durchflusskanal 10 z. B. mit einer Durchflussrate von 4 μΐ/s gespült. Dann bewegen sich auch die ungebundenen magnetischen Nanobeads 26 aus dem Filter 24 durch den Kanal 10 hindurch. Zusätzlich zur höheren Durchflussrate kann dazu das externe Magnetfeld minimiert oder ausgeschalten werden.
Die Figur 7 schließlich zeigt noch eine alternative Ausführungsform des Kanals 10 mit versetzten ferromagnetischen Führungsstreifen 24, die sich in der Mitte des Kanals 10 nicht berühren, sondern wie ein Reißverschluss ineinandergreifen. Auch diese sind bevorzugt in einem Winkel um die 45° zu den Kanalwänden 14 angeordnet und weisen in Richtung der Durchflussrichtung 44. Der Magnetophorese 240, unabhängig von der genauen Ausgestaltung, kann noch ein zusätzlicher Filter 250 vorangehen. Dieser ist also in Durchflussrichtung 44 weiter vorne im Kanal 10 angeordnet, in der Figur 7 weiter links. Dazu verlaufen ferromagnetische Streifen 25 quer über den Ka- nalboden 11 von einer bis zur anderen Kanalwand 14. Diese sind insbesondere senkrecht oder in einem Winkel zwischen 0° und 90° zu den Kanalwänden 14 angeordnet.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie mit
- einem Durchflusskanal (10),
- einer ersten magnetischen Einheit (22) zur Anreicherung und
- einer zweiten magnetischen Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) sowie
- wenigstens einer Zellmesseinrichtung (20),
wobei die magnetischen Einheiten (22, 24) in einem bezüg- lieh der Durchflussrichtung (44) vorderen Kanalabschnitt
(240) angeordnet sind und der Durchflusskanal (10) hin¬ sichtlich Kanaldurchmesser (100) und Oberflächenbeschaffenheit der Kanalinnenwand so ausgestaltet ist, dass ein Fluss einer komplexen Suspension in dem Durchflusskanal (10) mit laminarem Strömungsprofil (40) erzeugbar ist, so dass die durch die magnetischen Einheiten (22, 24) bewirkbaren (FM) und die durch den Fluss bewirkbaren Kräfte (Fs) derart auf nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) wirken, dass diese nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) im vorderen Kanalabschnitt (240) zurückhaltbar sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die erste magnetische Einheit (22) so im vorderen Kanalabschnitt (240) angeordnet ist, dass dadurch ein magnetisches Gradientenfeld erzeugbar ist, welches magnetisch markierte Zellen (32) sowie nicht an Zellen gebundene magnetische Marker (26) innerhalb des Durch¬ flusskanals (10) am Kanalboden (11) anreichert.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die zweite magnetische Einheit (24) so im vorderen Kanalabschnitt
(240) angeordnet ist, dass dadurch magnetisch markierte Zel¬ len (32) innerhalb des Durchflusskanals (10) entlang einer Achse ausgerichtet werden, auf welcher die Zellmesseinrichtung (20) im weiteren Verlauf des Durchflusskanals (10) ange- ordnet ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magne- tisch markierter Zellen (32) am Kanalboden (11) angeordnet ist, insbesondere so dass sie in den Durchflusskanal (10) hineinragt .
5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) magnetische Führungs¬ streifen aufweist, insbesondere ferromagnetische Führungs¬ streifen, wobei sich die magnetischen Führungsstreifen über die gesamte Breite des Kanalbodens erstrecken.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magne¬ tisch markierter Zellen (32) so ausgestaltet ist, dass durch diese zweite magnetische Einheit (24) eine magnetische Kraft (FM) sowie eine zusätzliche Rückhaltekraft (FR) auf die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) bewirkbar sind, die der Scherkraft (Fs) des Flusses der komplexen Suspension richtungs- und betragsmäßig entgegen wirken.
7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Durchflusskanal (10) hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) so ausgestaltet ist, dass Zellaggregate (34) von mehreren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30) so weit in die Kanalmitte ragen können, dass durch die auf die Zellaggregate (34) bewirkbaren Kräfte (FM, Fs) diese
Zellaggregate (34) mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit (41) abtransportierbar sind.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Durchflusskanal (10) hinsichtlich Kanaldurchmesser (100) so ausgestaltet ist, dass von Zellaggregaten (34) von mehre¬ ren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30), die in der Kanalmitte fließen, ein Abstand (200) zur Zellmesseinrichtung (20) einhaltbar ist, in dem keine Detek- tion des Zellaggregates (34) hervorrufbar ist.
9. Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie bei dem
- ein laminarer Fluss einer Zellprobe (40) mit magnetisch markierten Zellen (32) sowie nicht an Zellen gebundenen magnetischen Markern (26) erzeugt wird,
- die magnetisch markierten Zellen (32) sowie die nicht an
Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) in einem magnetischen Gradientenfeld dynamisch angereichert werden,
- die magnetisch markierten Zellen (32) magnetophoretisch entlang einer Achse ausgerichtet werden,
wobei die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit (41) so gewählt werden, dass die auf nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) wirkenden Kräfte (FM, Fs) diese im Fluss zurückhalten.
10. Verfahren nach Anspruch 9 bei dem die magnetischen Marker (26) im Überschuss zu der Zellprobe gegeben werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 bei dem
- die Erzeugung des laminaren Flusses der Zellprobe (40) in einem Durchflusskanal (10) erfolgt,
- die dynamische Anreicherung zur Kanalinnenwand des Kanalbo¬ dens (11) hin erfolgt und
- die magnetophoretische Ausrichtung entlang einer Achse erfolgt, wobei die Achse in Flussrichtung (44) entlang der Kanalinnenwand des Kanalbodens (11) verläuft, so dass die magnetisch markierten Zellen (32) entlang dieser Achse über eine Zellmesseinrichtung (20) geführt werden,
wobei die Zellprobe (40) so an einer magnetischen Einheit (24) an der Kanalinnenwand des Kanalbodens (11) vorbeigeführt wird, dass die nicht an Zellen gebundenen magnetischen Marker (26) an dieser magnetischen Einheit (24) zurückgehalten werden .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, in dem als magnetische Marker (26) superparamagnetische Marker verwendet werden .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Magnetfeldstärke des magnetischen Gradientenfeldes und die Durchflussgeschwindigkeit (41) so gewählt werden, dass die auf Zellaggregate (34) von mehreren über magnetische Marker (26) aneinander gebundene Zellen (30) wirkenden Kräfte (FM, Fs) bewirken, dass diese Zellaggregate (34) mit der in der Kanalmitte vorherrschenden Durchflussgeschwindigkeit (41) ab¬ transportiert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13 bei dem eine Zellprobe in eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 injiziert wird.
15. Herstellungsverfahren für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei dem die zweite magnetische Einheit (24) zur Ausrichtung magnetisch markierter Zellen (32) im Durchflusskanal (10) am Kanalboden (11) angeordnet wird, insbeson¬ dere so dass sie in den Durchflusskanal (10) hineinragt.
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