DE102013218807A1

DE102013218807A1 - Apparat zur Anreicherung von CTC (Circulating Tumor Cells) durch Apherese

Info

Publication number: DE102013218807A1
Application number: DE201310218807
Authority: DE
Inventors: Arne Hengerer; Daniel Sickert
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2013-09-19
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2015-03-19

Abstract

Die Erfindung ist auf dem Gebiet der in vitro Diagnostik und betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur Anreicherung und Detektion von Zellen in einer flüssigen Probe. Dazu wird die flüssige Probe in eine Detektionseinheit 10 geleitet. In der Probe, z. B. eine Blutprobe sind verschiedene Zellen, z. B. zu detektierende Tumorzellen 31, 31', Lymphozyten 33 und Erythrozyten 35 enthalten, welche entlang der Strömungsrichtung 15 durch die Detektionseinheit 10 strömen bzw. fließen. Durch eine Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 werden zu detektierende Tumorzellen 31, 31' zurückgehalten oder verlangsamt, so dass die Tumorzellen 31' im Bereich einer Mikrowaage 17 absinken und von Antikörpern auf der Oberfläche der Mikrowaage gebunden werden können. Die Lymphozyten 33 und Erythrozyten 35 hingegen können die Strömungsbegrenzungseinrichtung aufgrund ihrer geringeren Größe und/oder größeren Deformierbarkeit ungehindert passieren.

Description

Die Erfindung ist auf dem Gebiet der in vitro Diagnostik und betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur Anreicherung und Detektion von Zellen in einer flüssigen Probe. Die Erfindung dient insbesondere zur automatisierten Gewinnung und zur Analyse von zirkulierenden Tumorzellen aus Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin) bzw. mit Flüssigkeit versetzter Gewebeproben (z. B. Knochenmark) und findet somit bevorzugt Anwendung in der Tumordiagnostik.
Die Erfindung ermöglicht den automatisierten Nachweis von Zellen oder Zellbestandteilen insbesondere aus peripherem Blut. Bei den Zellen handelt es sich insbesondere um zirkulierende Tumorzellen (engl. circulating tumor cells, CTC oder (plur.) CTCs), mesenchymale Stammzellen aus peripherem Blut oder Bakterien aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, sowie disseminierte Tumorzellen aus Knochenmark (engl. disseminated tumor cells, DTC).
Das Vorkommen von CTCs in peripherem Blut ist ein Hinweis auf eine mögliche Streuung von Zellen eines soliden Tumors zu einem sehr frühen Stadium, in dem mit üblichen bildgebenden Untersuchungsverfahren noch keine Metastasierung nachgewiesen werden kann. Daher stellen sowohl der Nachweis als auch die Charakterisierung von CTCs in peripherem Blut vielversprechende Möglichkeiten dar, systemische Tumorzellausbreitung sehr frühzeitig zu erkennen und CTCs als prognostischen Marker zu nutzen. Dadurch könnten Prognosen und kontinuierliche Beobachtung von systemischen Therapien ausgesprochen bzw. durchgeführt werden. Weiterhin könnte die Charakterisierung und Bewertung von CTCs als diagnostisches Instrument genutzt werden, um eine geeignete Behandlung für solide Tumoren auszuwählen.
Für die Früherkennung, Diagnose und Therapiekontrolle von Krebs hat der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) im Blut eine immer größer werdende Bedeutung. Dabei ist auf Grund der geringen Zahl an CTCs, die im Bereich von nur 3–5 in einem Milliliter Blut liegen kann, und auf Grund des großen Hintergrundes an Leukocyten (6–10 × 10⁶ pro Milliliter) ein Verfahren zu wählen, das CTCs möglichst selektiv anzureichern oder aber vor einem großen Überschuss anderer Blutzellen darzustellen vermag. Ein Verfahren zum Nachweis von CTC umfasst das Filtrieren von Blutproben, wobei mittels entsprechender Porengrößen eine Größenselektion der Zellen stattfindet und die Isolierung der Tumorzellen erlaubt.
Eine technische Schwierigkeit dieses Verfahrens liegt darin begründet, dass die Häufigkeit von CTC im Blut gering ist. Zur Anreicherung bestimmter Blutkomponenten ist das Verfahren der Apherese bekannt. Bei der Apherese werden bestimmte Blutkomponenten aufgrund ihrer Dichte isoliert. Die Anreicherung von CTC aus dem Blut mittels Apherese ist bekannt, so z. B. Eifler et al., Cytometry B Clin Cytom. 2011 Mar; 80(2): 100-11, Enrichment of circulating tumor cells from a large blond volume using leukapheresis and elutriation: proof of concept.
Zur Detektion von Tumorzellen ist es bekannt, als pieozoelektrischen Resonatoren ausgebildete Mikrowaagen zu verwenden, siehe z. B. WO2013033049 A1 . Dabei ist eine Oberfläche der Mikrowaage mit Fängermolekülen beschichtet, welche Tumorzellen spezifisch binden, während andere Zellen, z. B. Blutkörperchen (z. B. Lymphozyten) nicht gebunden werden.
Die Detektion von Zellen mit Mikrowaagen setzt voraus, dass die Zellen an einer Oberfläche der Mikrowaage spezifisch anbinden. Dies ist dadurch erschwert, dass bei Überströmen der Mikrowaage – z. B. in einer Flusszelle – zwar Zellen an der Mikrowaage vorbeifließen, aber sich zu weit von der Oberfläche entfernt befinden und nicht anbinden. Es besteht zwar die Möglichkeit, durch künstliche Erzeugung von Turbulenzen die Zellen an die Oberfläche zu drücken, dabei sind jedoch die Scherkräfte zu groß, so dass die Zellen nicht an die Oberfläche binden oder sogar beschädigt werden.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Anordnung und ein Verfahren bereitzustellen, bei welcher der Nachweis von CTC bzw. deren Quantifizierung mit Mikrowaagen verbessert ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Anordnung gemäß Anspruch 1 und das Verfahren gemäß Anspruch 13.
Allgemein ausgedrückt löst die vorliegende Erfindung diese Aufgabe durch eine Strömungsbegrenzungseinrichtung, die als eine Art Mikrobarriere stromabwärts von oder um die Mikrowaage herum angebracht ist. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung hat eine Auslassöffnung, durch welche kleinere und leichter deformierbare Zellen hindurch gelangen können, während größere oder wenig deformierbare Zellen wie CTCs zurückgehalten werden. Befindet sich eine zu detektierende Zelle in oder – bezogen auf die Strömungsrichtung – vor der Strömungsbegrenzungseinrichtung, verringert sich die Flussgeschwindigkeit und die Zelle sinkt in Richtung der Mikrowaage ab. Somit kann es zu Ausbildung einer Bindung kommen und die Zelle kann detektiert werden.
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Detektion und Anreicherung von zu de-tektierenden Zellen aus einer flüssigen Probe, mit einer Detektionseinheit aufweisend

a) einen Einlass zum Einleiten der flüssigen Probe in die Detektionseinheit,
b) einen Auslass,
c) ein zwischen Einlass und Auslass definierter Strömungspfad, welcher eine Strömungsrichtung vom Einlass zum Auslass definiert,
d) eine Mikrowaage, aufweisend zumindest einen Teilbereich einer Oberfläche, auf welchen Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufbringbar sind, wobei bei Bindung oder nach Ablösen einer zu detektierenden Zelle eine Massenänderung detektierbar ist,

Der Ausdruck „Zurückhalten von zu detektierenden Zellen” bedeutet, dass diese Zellen beim Leiten der flüssigen Probe durch die Detektionseinheit am Weiterfließen gehindert werden oder in ihrer Fließgeschwindigkeit vorübergehend verlangsamt werden. Das ermöglicht ein Absinken einer zu detektierenden Zelle und Binden an Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen, welche auf der Oberfläche aufgebracht wurden. Durch das Bindungsereignis ergibt sich eine Massenänderung an der Mikrowaage, die detektierbar ist.
Die beschriebene Anordnung ist beispielsweise für die Detektion von Tumorzellen in Blutproben (CTC) geeignet. Während rote Blutkörperchen eine Größe von 6–8 μm haben, weisen im Blut zirkulierende Tumorzellen eine Größe von 12 bis 20 μm, in manchen Fällen bis 30 oder 40 μm auf. Rote Blutkörperchen sind stark verformbar und können daher auch kleinste Öffnungen durchqueren.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die Abflussöffnung einen typischen Durchmesser von 5 bis 50 μm auf, bzw. 5 bis 20 μm, 5 bis 10 μm oder ca. 10 μm auf. Bevorzugt ist ein typischer Durchmesser von ca. 8 μm.
Die Abflussöffnung kann im Wesentlichen rund, im Wesentlichen quadratisch, oder im Wesentlichen polygonal (z. B. pentagonal, hexagonal, etc.) ausgebildet sein. Der „typische Durchmesser” bezeichnet dabei die typische Größe der Abflussöffnung, auch für den Fall, dass die Abflussöffnung nicht kreisrund ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind zumindest auf einem Teilbereich der Oberfläche Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufgebracht.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aus der Gruppe gewählt, die aus Antikörper, Antikörperfragment, Peptid, Protein, Proteinfragment, Glykoprotein und Glykoproteinfragment besteht.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung erstreckt sich die Strömungsbegrenzungseinrichtung zumindest teilweise parallel oder in einem Winkel von < 90° zur Strömungsrichtung.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die Strömungsbegrenzungseinrichtung stromaufwärts eine Zuflussöffnung auf, deren typischer Durchmesser größer ist als der typische Durchmesser der Abflussöffnung.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die detektierenden Zellen zirkulierende Tumorzellen sind und die flüssige Probe ist eine Probe, die Blut oder Blutbestandteile enthält.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die Detektionseinheit eine Mehrzahl von Mikrowaagen auf, wobei der Mehrzahl von Mikrowaagen eine gemeinsame Strömungsbegrenzungseinrichtung zugeordnet ist, oder wobei jeder Mikrowaage der Mehrzahl von Mikrowaagen eine eigene Strömungsbegrenzungseinrichtung zugeordnet ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der Detektionseinheit eine Quantifizierungseinheit zugeordnet, die zur Quantifizierung einer Mehrzahl von Bindungsereignissen oder Ablösungsereignissen ausgelegt bzw. geeignet ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die Mikrowaage einen Piezokristall auf.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der zumindest eine Teilbereich der Oberfläche der Mikrowaage mit Gold beschichtet ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist die Anordnung ferner eine der Detektionseinheit vorgeschaltete Anreicherungseinheit auf. Die Anreicherungseinheit kann z. B. eine Aphereseeinheit oder eine Filtriereinheit sein.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion von zu detektierenden Zellen in einer flüssigen Probe, aufweisend folgende Schritte:

a) Zuleiten der flüssigen Probe in Anordnung mit einer Detektionseinheit, welche eine Mikrowaage aufweist, die zumindest auf einen Teilbereich einer Oberfläche der Mikrowaage Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufweist, wobei die Anordnung eine der Mikrowaage zugeordnete Strömungsbegrenzungseinrichtung in Strömungsrichtung stromabwärts von der Mikrowaage mit einer den Strömungspfad verengende Abflussöffnung aufweist, die so dimensioniert ist, dass zu detektierende Zellen zurückgehalten werden,
b) Detektieren einer Massenänderung an der Mikrowaage bei Bindung oder nach Ablösen einer zu detektierenden Zelle.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist das Verfahren den zusätzlichen Schritt (c) Quantifizieren von in Schritt (b) detektierten Bindungsereignissen und/oder Ablösungsereignissen auf.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird das Zuleiten der flüssigen Probe nach Erreichen einer vorbestimmten Anzahl von Bindungsereignissen gestoppt.
Die Erfindung wird in Zusammenhang mit den angehängten 1 bis 11 beispielhaft beschreiben, welche zeigen:
1: eine schematische Darstellung einer beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
2: eine schematische Darstellung eines Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
3: eine schematische Darstellung eines Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
4: eine schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
5: eine schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
6: eine schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
7: eine schematische Darstellung der Detektion einer zu detektierenden Zelle entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens,
8: eine schematische Darstellung eines weiteren Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
9: eine schematische Darstellung eines weiteren Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
10: eine schematische Darstellung eines weiteren Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung,
und
11: eine schematische Darstellung eines weiteren Detailaspekts einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung.
In 1 ist schematisch eine Anordnung 1 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung gezeigt. Die Anordnung umfasst eine Detektionseinheit 10, welche eine Einlassöffnung 11 und eine Auslassöffnung 13 aufweist. Im Betrieb strömt Probenflüssigkeit durch die Einlassöffnung 11 im Wesentlichen entlang der Strömungsrichtung 15, wird über eine Mikrowaage 17 geleitet und durchströmt danach die Auslassöffnung 13. Stromabwärts von der Mikrowaage 17 ist eine Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 angeordnet. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 begrenzt eine Abflussöffnung 21, durch welche die Probenflüssigkeit nach Überströmen der Mikrowaage 17 abfließt. Dabei ist die Abflussöffnung 21 so dimensioniert, dass zu detektierende Zellen zurückgehalten werden.
Die beschriebene Anordnung ist insbesondere für die Detektion von Tumorzellen in Blutproben geeignet. Während rote Blutkörperchen eine Größe von 6–8 μm haben, weisen im Blut zirkulierende Tumorzellen (CTC) eine Größe von 12 bis 20 μm, in manchen Fällen bis 30 oder 40 μm auf. Aufgrund ihrer Verformbarkeit können Erythrozyten und Lymphozyten auf kleine Öffnungen gut passieren, während Tumorzellen zurückgehalten und detektiert werden können.
Bevorzugt weist die Abflussöffnung 21 daher einen typischen Durchmesser von 5 bis 50 μm, 5 bis 20, 5 bis 10, oder bevorzugt ca. 10 μm auf. Besonders bevorzugt ist ein typischer Durchmesser von ca. 8 μm, dieser typische Durchmesser hat sich zum Nachweis von CTC aus Blutproben als besonders geeignet erwiesen.
Die Mikrowaage bzw. das Messfeld der Mikrowaage sollte quer zur Strömungsrichtung eine größere Ausdehnung als die die Abflussöffnung 21 aufweisen, beispielsweise 20 μm bei einer 10 μm großen Abflussöffnung 21. Die Mikrowaage bzw. das Messfeld der Mikrowaage kann z. B. Abmessungen von 20 × 20 μm groß sein. Aufgrund der Größe von nachzuweisenden Tumorzellen sollte für den Zweck der CTC Detektion die Größe der Mikrowaage bzw. des Messfelds der Mikrowaage ca. 10 × 10 μm nicht unterschreiten. Die Mikrowaage bzw. das Messfeld der Mikrowaage können dabei verschiedene Geometrien aufweisen, z. B. im Wesentlichen rechteckig, im Wesentlichen kreisförmig, dreieckig, hexagonal, oder elliptisch.
Die gesamte Detektionseinheit 10 kann als auswechselbare mikrofluidische Einheit ausgebildet sein, welche nach Gebrauch aus der Anordnung entnommen wird. Die Detektionseinheit 10 kann z. B. als Grundkörper eine Kunststoff-Cartridge aufweisen. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 kann als integraler Bestandteil der Detektionseinheit 10 ausgebildet sein. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 kann ferner z. B. aus Kunststoff oder Metall, insbesondere Silizium ausgebildet sein. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 kann auch aus einem porösen Material mit entsprechender Porengröße gebildet sein, z. B. aus Nitrocellulose. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung kann aus einem Polymer durch Photostrukturierung oder mittels photolithographischen Verfahren hergestellt werden.
Die Mikrowaage 17 ist zumindest auf einem Teilbereich ihrer Oberfläche so beschaffen, dass Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen auf diesem Teilbereich ihrer Oberfläche aufgebracht werden können. Z. B. kann dieser Teilbereich eine Goldbeschichtung aufweisen, auf welche dann Fängermoleküle aufgebracht werden können, die in der Lage sind, zu detektierende Zellen spezifisch zu binden. Optional kann dieser Teilbereich mit einem Bindungspartner von üblich verwendeten Bindungspaaren funktionalisiert sein, z. B. Streptavidin/Biotin, um entsprechend mit dem anderen Bindungspartner derivatisierte Fängermoleküle zu binden. Solche Fängermoleküle können z. B. Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide, Proteine, Proteinfragmente, insbesondere Glykoproteine und Glykoproteinfragmente sein, welche die zu detektierenden Zellen spezifisch binden. Mit dem Ausdruck „spezifisch Binden” ist gemeint, dass zu detektierende Zellen gebunden werden, während andere Zellen nicht gebunden werden.
Durch die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 werden zu detektierende Zellen daran gehindert, weiter zu fließen, und Verlangsamen ihre Geschwindigkeit im Bereich über der Mikrowaage 17, so dass sie auf der Mikrowaage 17 gebunden werden und damit detektiert werden können. Um nachzuweisen, dass eine zu detektierende Zelle spezifisch an einem Oberflächenbereich der Mikrowaage gebunden hat, ist es möglich die Strömungsrichtung umzukehren. Dadurch können Zellen abgespült werden, die von der Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 zurückgehalten wurden und auf der Mikrowaage 17 zu liegen kamen, ohne spezifisch gebunden zu sein. Dazu kann im laufenden Messvorgang die Strömungsrichtung umgekehrt werden oder es kann mit einer Spülflüssigkeit (z. B. Pufferlösung) gegenspült werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Zellen um Tumorzellen. Tumorzellen können z. B. durch Antikörper oder Antikörperfragmente gebunden werden, die spezifisch bestimmte Tumorantigene binden. Eine lediglich beispielhafte und nicht abschließende Liste derartiger Tumorantigene umfasst die folgenden Antigene:

– Carcino-Embryonales Antigen (CEA) bei Darmkrebs, Pankreaskarzinom sowie Adenokarzinom der Lunge
– CA-125 beim Eierstockkrebs (Ovarialkarzinom)
– EpCAM (Marker für epitheliale Zellen, wird von vielen CTC exprimiert, aber nicht von Lymphozyten)
– MAGE Antigene (melanoma specific antigene) bei Hautkrebs
– MUC1 beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC)
– Tumor-assoziiertes Glykoprotein 12 (TAG 12).

Die Mikrowaage 17 kann einen aus einem Piezokristall gebildeten Resonator aufweisen, dessen Resonanzfrequenz sich bei Massenänderungen ändert, z. B. wenn eine zu detektierende Zelle auf der einem Oberflächenbereich bindet. Dabei wird die piezoelektrische Eigenschaft von Quarz genutzt, die zu einer Frequenzänderung eines Schwingquarzes führt, welche in Abhängigkeit zur Masse des auf einer Oberfläche des Quarzes adsorbierten Materials steht. Auf diese Weise können Massenänderungen bei Binden oder Ablösen einer Zelle an der Oberfläche der Mikrowaage 17 detektiert und quantifiziert werden.
Optional weist die Anordnung der Erfindung eine Steuerung (in 1 nicht gezeigt) auf. Diese Steuerung kann bevorzugt einen oder mehrere der folgenden Parameter steuern: Strömungsgeschwindigkeit, Strömungsrichtung durch die Detektionseinheit (d. h. in Richtung der Strömungsrichtung 15 oder im Gegenstrom), Spülen der Detektionseinheit mit einer Spülflüssigkeit, Leiten eines Flüssigkeitsvolumens aus der Detektionseinheit wahlweise in einen Probenbehälter zur weiteren Untersuchung oder in einen Abfallsammelbehälter. Optional kann die Steuerung auch den Betrieb der optionalen Anreicherungseinheit, z. B. eine Aphereseeinheit steuern.
Der Detektionseinheit 10 kann eine Quantifizierungseinheit 51 zugeordnet sein. Diese kann mit der optionalen Steuerung verbunden sein, welche den Zustrom von Probenflüssigkeit in die Detektionseinheit 10 regelt. Die Steuerung kann z. B. so ausgelegt sein, dass bei Erreichen einer bestimmten Zellzahl (d. h. wenn eine vorbestimmte Zahl von Bindungsereignissen oder eine vorbestimmte Massenänderung an der Mikrowaage 17 detektiert wurde) der Zustrom von weiterer Probenflüssigkeit gestoppt wird. Dadurch kann eine Bestimmung der Zellzahl relativ zum Probenvolumen erfolgen. Ferner ist es denkbar, dass die Detektionseinheit nach Erreichen einer bestimmten Zellzahl mit einer Reinigungsflüssigkeit gespült wird. Der Spülvorgang kann in Strömungsrichtung 15 oder in Gegenstromrichtung erfolgen. Ferner kann die Anordnung eine Volumenmesseinheit (nicht gezeigt) aufweisen, mit welcher ein Volumen, dass bei einem Messvorgang durch die Detektionseinheit geleitet wird, bestimmt werden kann. Die Steuerung kann so ausgelegt sein, dass ein Messvorgang solange dauert, bis ein bestimmtes Volumen Probenflüssigkeit durch die Detektionseinheit durchgeleitet wurde. Dadurch wird es möglich die Zahl von zu detektierenden Zellen bezogen auf ein Probenvolumen zu bestimmen.
Gemäß der in 1 gezeigten beispielhaften Anordnung 1 ist der Detektionseinheit 10 eine Anreicherungseinheit, z. B. eine Aphereseeinheit 41 vorgeschaltet. Die Anreicherungseinheit ist ein optionaler Bestandteil der Erfindung gemäß dieser lediglich beispielhaften Ausführungsform. Die Aphereseeinheit 41 erlaubt es über einen Zugangsleitung 43 Blut aus einem Patienten durch eine fraktionierende Zentrifugation im Bypassverfahren aufzutrennen. Dabei werden bestimmte Zellfraktionen mit einer Zentrifuge 47 aufgrund ihrer Dichte abgetrennt und für die weitere Analyse zur Detektionseinheit 10 geleitet. Nicht benötigte Bestandteile des Bluts können über eine entsprechende Leitung 45 direkt wieder in den Blutkreislauf des Patienten zurück geleitet werden.
In 2 ist schematisch ein Detailaspekt einer weiteren beispielhaften Anordnung gemäß der Erfindung dargestellt. Alternative Ausführungen dieses Teilaspekts sind in 3, 8, 9, 10 und 11 dargestellt. Gemäß der beispielhaften Anordnung von 2 erstreckt sich die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 zumindest teilweise parallel 23 (vgl. 2, 3) oder in einem Winkel α von 0 ≤ α ≤ 90° zur Strömungsrichtung (vgl. 8, 9, 10, 11) zur Ausdehnung des Messfelds in Strömungsrichtung. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 kann dabei so ausgestaltet sein, dass sie die Mikrowaage zumindest teilweise relativ zur Strömungsrichtung 15 auf gegenüberliegenden Seiten begrenzt (vgl. 2, 8, 9, 10, 11). Dadurch werden zu detektierende Zellen besonders effektiv im Bereich der Mikrowaage 17 verlangsamt und können besser gebunden werden.
Bevorzugt erstreckt sich die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 zumindest Teilweise senkrecht (19) zur Strömungsrichtung und zumindest teilweise in einem Winkel α von 0 ≤ α < 90° (23) zur Strömungsrichtung (vgl. 2, 3, 8, 9, 10, 11). Gemäß dieses Aspekts der Erfindung wird die Mikrowaage stromabwärts von der Strömungsbegrenzungseinrichtung umrahmt, wobei jeweils eine Abflussöffnung 21 im Wesentlichen mittig stromabwärts von der Mikrowaage vorgesehen ist.
Ein weiterer Aspekt der beispielhaften Anordnung gemäß 2 ist in 3 dargestellt: Gemäß diesem Aspekt weist die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 eine Zuflussöffnung 25 auf, deren typischer Durchmesser größer ist als der typische Durchmesser der Abflussöffnung 21. Dadurch wirkt die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 wie ein Trichter, bei welchem die Mikrowaage stromaufwärts von der durch die Abflussöffnung 21 gegebene Verengung angeordnet ist.
Wie in 4 dargestellt, können auch eine Mehrzahl von Mikrowaagen 17, 17' vorgesehen sein. Diese können stromaufwärts von einer gemeinsamen Strömungsbegrenzungsvorrichtung 19 angeordnet sein.
Die Abflussöffnung 21 ist stromabwärts von der Mikrowaage vorgesehen. Dabei kann die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 kann sich vollständig stromabwärts von der Mikrowaage (oder den Mikrowaagen) befinden (wie in 4 dargestellt). Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 kann sich bis zu einem Punkt stromaufwärts erstrecken, der zwischen dem stromaufwärts und den stromabwärts liegenden Erstreckung der Oberfläche der Mikrowaage liegt, auf welcher zu detektierende Zellen gebunden werden können kann sich vollständig stromabwärts von der Mikrowaage (oder den Mikrowaagen) befinden (wie in 2, 8, 9, 10, 11 dargestellt). Die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 23 kann sich jedoch auch bis zu einem Punkt stromaufwärts erstrecken, der auf der Höhe des stromaufwärtigen Endes der Erstreckung der Oberfläche der Mikrowaage (wie in 5 dargestellt) oder noch weiter stromaufwärts liegt (wie in 3 dargestellt).
Bevorzugt weist der Strömungspfad im Bereich der Mikrowaage oder der Mehrzahl von Mikrowaagen einen im Wesentlichen flachen Querschnitt auf, d. h. dass die Flüssigkeitshöhe über dem Boden der im Bereich der Mikrowaage oder der Mehrzahl von Mikrowaagen gering sein sollte. Dadurch ist ein guter Kontakt von zu detektierenden Zellen und der/den Oberfläche(n) der Mikrowaage(n) gewährleistet. Die Höhe des Strömungspfades ist bevorzugt kleiner als 1 mm, 0,5 mm, 0,2 mm, 0,1 mm oder auch kleiner als 0,05 mm. Die Breite des Strömungspfades beträgt bevorzugt mindestens das Doppelte der Höhe des Strömungspfades, bevorzugt mindestens das Fünffache, das 10-fache, das 50-fache oder das 100-fache. So kann die Detektionskammer z. B. als Kartenartige oder Flachgebildeartige Einheit ausgebildet sein, z. B. im Scheckkartenformat, die einen flachen und breiten Strömungspfad über der/den Mikrowaage(n) definiert. Es sind aber auch andere Geometrien denkbar. Insbesondere muss der Strömungspfad nicht linear verlaufen, er kann auch gekrümmt, geschlängelt oder mäandernd verlaufen. Ferner kann die Detektionseinheit eine Mehrzahl von im Wesentlichen parallel verlaufenden Kanälen aufweisen, die nebeneinander und/oder – bezogen auf den durch die Mikrowaage vorgegebenen Boden der Kanäle – übereinander angeordnet sind. Die Strömungsbegrenzungseinrichtung kann in Form Wänden vorgesehen sein, welche senkrecht zu der Ebene stehen, die durch die Oberfläche der Mikrowaage vorgegeben wird, auf welcher die zu detektierenden Zellen gebunden werden.
Wie in 5 dargestellt kann gemäß einer alternativen Ausführungsform bei einer Mehrzahl von Mikrowaagen jeder Mikrowaage 17, 17', 17'' eine eigene bzw. dedizierte Strömungsbegrenzungseinrichtung 19, 19', 19'' zugeordnet sein.
Es ist ferner möglich eine Mehrzahl von Mikrowaagen 17 oder Einheiten 18 aus Mikrowaage und zugehöriger Strömungsbegrenzungseinrichtung relativ zur Strömungsrichtung hintereinander anzuordnen, wie in 6 gezeigt. Die Mikrowaagen 17 oder Einheiten 18 aus Mikrowaage und zugehöriger Strömungsbegrenzungseinrichtung können dabei z. B. in versetzten Reihen angeordnet sein (6), um eine optimale Abdeckung der gesamten Breite der Strömungspfades in der Detektionseinheit zu gewährleisten.
In 7 ist schematisch das Verfahren der Erfindung dargestellt. Dabei wird die flüssige Probe in eine Detektionseinheit 10 geleitet. In der Probe, z. B. eine Blutprobe sind verschiedene Zellen, z. B. zu detektierende Tumorzellen 31, 31', Lymphozyten 33 und Erythrozyten 35 enthalten, welche entlang der Strömungsrichtung 15 durch die Detektionseinheit 10 strömen bzw. fließen. Durch eine Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 werden zu detektierende Tumorzellen 31, 31' zurückgehalten oder verlangsamt, so dass die Tumorzellen 31' im Bereich einer Mikrowaage 17 absinken und von Antikörpern auf der Oberfläche der Mikrowaage gebunden werden können. Die Lymphozyten 33 und Erythrozyten 35 hingegen können die Strömungsbegrenzungseinrichtung 19 aufgrund ihrer geringeren Größe und/oder größeren Deformierbarkeit ungehindert passieren. Die Strömungsgeschwindigkeit ist bevorzugt dabei ausreichend gering zu wählen, dass es zu keiner Verstopfung der Strömungsbegrenzungseinrichtung kommt. Wenn eine oder mehrere Tumorzelle(n) 31' an einer Mikrowaage binden, kann eine entsprechende Massenänderung an der Mikrowaage detektiert werden.
Bindungsereignisse und/oder Ablösungsereignisse können für eine quantitative Messung quantifiziert werden. Nach Erreichen einer vorbestimmten Anzahl von Bindungsereignissen kann optional das Zuleiten der flüssigen Probe gestoppt werden.
Gemäß einem optionalen Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Detektionseinheit nach dem Durchleiten eines Probenvolumens in Gegenstromrichtung durchspült. Dies kann optional mit einer Spülflüssigkeit erfolgen, z. B. einer physiologischen Kochsalzlösung. Dadurch werden Zellen, die nicht spezifisch an der Oberfläche der mikrowaage gebunden sind, abgelöst und nur die spezifisch gebundenen zu detektierenden Zellen bleiben an der Mikrowaage gebunden. Die Differenz aus Bindungsereignissen und Ablösungsereignissen zeigt die Menge der zu detektierenden Zellen in der Probe an. Falls zusätzlich das Probenvolumen bekannt ist, kann die Anzahl von zu detektierenden Zellen pro Volumeneinheit bestimmt werden. Dies lässt sich z. B. erreichen, in dem ein vorbestimmtes Volumen durch die Detektionseinheit geleitet wird, oder indem als Teil der Anordnung der Erfindung eine Volumenmesseinrichtung vorgesehen ist, mit der ein durch die Detektionseinheit geleitetes Volumen bestimmt werden kann.
Durch Ermittlung der Zellzahl von zirkulierenden Tumorzellen im Blut lassen sich gegebenenfalls weitere Informationen Ableiten, z. B. eine Prognose der Tumorerkrankung, die Bestimmung des Risikos von Metastasenbildung, Überwachung von Therapie, etc..
Die dargestellten Beispiele und Ausführungsformen sind lediglich beispielhaft. Insbesondere können, wie andeutungsweise in 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 und 11 gezeigt die Mikrowaage(n) und die zugehörige(n) Strömungsbegrenzungseinrichtung(en) eine Vielzahl von Geometrien aufweisen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2013033049 A1 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Eifler et al., Cytometry B Clin Cytom. 2011 Mar; 80(2): 100-11, Enrichment of circulating tumor cells from a large blond volume using leukapheresis and elutriation: proof of concept [0005]

Claims

Anordnung zur Detektion und Anreicherung von zu detektierenden Zellen aus einer flüssigen Probe, mit einer Detektionseinheit aufweisend a) einen Einlass zum Einleiten der flüssigen Probe in die Detektionseinheit b) einen Auslass c) ein zwischen Einlass und Auslass definierter Strömungspfad, welcher eine Strömungsrichtung vom Einlass zum Auslass definiert d) eine Mikrowaage, aufweisend zumindest einen Teilbereich einer Oberfläche, auf welchen Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufbringbar sind, wobei bei Bindung oder nach Ablösen einer zu detektierenden Zelle eine Massenänderung detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung eine der Mikrowaage zugeordnete Strömungsbegrenzungseinrichtung aufweist, welche in Strömungsrichtung stromabwärts von der Mikrowaage eine den Strömungspfad verengende Abflussöffnung aufweist, die so dimensioniert ist, dass zu detektierende Zellen zurückgehalten werden.
Die Anordnung nach Anspruch 1, wobei die Abflussöffnung einen typischen Durchmesser von 5–50 μm hat.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zumindest auf einem Teilbereich der Oberfläche Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufgebracht sind.
Die Anordnung nach Anspruch 3, wobei die Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aus der Gruppe gewählt sind, die aus Antikörper, Antikörperfragment, Peptid, Protein, Proteinfragment, Glykoprotein und Glykoproteinfragment besteht.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich die Strömungsbegrenzungseinrichtung zumindest teilweise parallel oder in einem Winkel von < 90° zur Strömungsrichtung erstreckt.
Die Anordnung nach Anspruch 5 wobei die Strömungsbegrenzungseinrichtung stromaufwärts eine Zuflussöffnung aufweist, deren typischer Durchmesser größer ist als der typische Durchmesser der Abflussöffnung.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die detektierenden Zellen zirkulierende Tumorzellen sind und die flüssige Probe eine Probe ist, die Blut oder Blutbestandteile enthält.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Detektionseinheit eine Mehrzahl von Mikrowaagen aufweist, und wobei der Mehrzahl von Mikrowaagen eine gemeinsame Strömungsbegrenzungseinrichtung zugeordnet ist, oder wobei jeder Mikrowaage der Mehrzahl von Mikrowaagen eine eigene Strömungsbegrenzungseinrichtung zugeordnet ist.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Detektionseinheit eine Quantifizierungseinheit zugeordnet ist, die zur Quantifizierung einer Mehrzahl von Bindungsereignissen oder Ablösungsereignissen ausgelegt ist.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Mikrowaage einen Piezokristall aufweist.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der zumindest ein Teilbereich der Oberfläche der Mikrowaage mit Gold beschichtet ist.
Die Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, ferner aufweisend eine der Detektionseinheit vorgeschaltete Anreicherungseinheit.
Verfahren zur Detektion von zu detektierenden Zellen in einer flüssigen Probe, aufweisend folgende Schritte: a) Zuleiten der flüssigen Probe in Anordnung mit einer Detektionseinheit, welche eine Mikrowaage aufweist, die zumindest auf einen Teilbereich einer Oberfläche der Mikrowaage Mittel zum Binden der zu detektierenden Zellen aufweist, wobei die Anordnung eine der Mikrowaage zugeordnete Strömungsbegrenzungseinrichtung in Strömungsrichtung stromabwärts von der Mikrowaage mit eine den Strömungspfad verengende Abflussöffnung aufweist, die so dimensioniert ist, dass zu detektierende Zellen zurückgehalten werden, b) Detektieren einer Massenänderung an der Mikrowaage bei Bindung oder nach Ablösen einer zu detektierenden Zelle.
Das Verfahren nach Anspruch 13, aufweisend den zusätzlichen Schritt (c) Quantifizieren von in Schritt (b) detektierten Bindungsereignissen und oder Ablösungsereignissen.
Das Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 wobei das Zuleiten der flüssigen Probe nach Erreichen einer vorbestimmten Anzahl von Bindungsereignissen gestoppt wird.